Download Determinación de la actividad transcripcional de genes candidatos

15/10/2012
El ciclo de vida de las plantas consta de dos fases.
Proyecto Pregrado 2011
MEIOSIS
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL DE GENES CANDIDATOS A SER RESPONSABLES DEL FENOTIPO Athena EN Arabidopsis thaliana.
p
MICROSPORA (N)
( )
Laboratorio de Biotecnología Vegetal Facultad de Ciencias Agronómicas Universidad de Tarapacá.
MEGASPORA (N)
( )
MITOSIS Y DIFERENCIACIÓN
ESPOROFITO (2N)
ALUMNO:
A. PATROCINANTE: VÍCTOR EDUARDO ROJAS PÉREZ
DR. WILSON HUANCA‐MAMANI
FECUNDACIÓN
Arica‐Chile.2012
El desarrollo embrionario sigue un patrón ordenado de divisiones celulares. Con la fecundación se inicia el desarrollo de la semilla.
Núcleos Espermáticos
Endospermo
Tubo Polínico
LA DOBLE FECUNDACIÓN
ES LA SEÑAL DE INICIO
ES LA SEÑAL DE INICIO
Embrión
PARA LOS PROGRAMAS DE DESARROLLO
Cubierta de la semilla
Cigoto
Identificación de Athena
1era División celular Estado globular
Estado de corazón
Estado de torpedo
Estado de cotiledón
Sitio de la mutación en el genoma de Athena Identificada por el Dr. Wilson Huanca en un escrutinio genético
Athena Desarrolla un embrión secundario
Cromosoma 5
Gen‐1
Tiene una mutación en una región Intergénica del cromosoma 5
895 pb
Gen‐2
6105 pb
1
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Objetivo
Resultados
Semillas abortadas en plantas mutantes Athena
Determinar el nivel de expresión de cinco genes candidatos de ser responsables del fenotipo Athena
en Arabidopsis thaliana
Athena
Silvestre
• Analizar fenotipos de líneas mutantes Athena e insercionales
• Realizar análisis histológico de la embriogénesis en Athena
• Determinar el nivel de expresión de los cinco genes candidatos en plantas silvestres y en Athena, en tejido reproductivo
• Analizar cruzas con marcadores moleculares del desarrollo Desarrollo embrionario normal en semillas de Arabidopsis tipo silvestre
Embriones de Athena muestran proliferación celular anormal en el suspensor y un patrón de desarrollo aberrante D
C
B
A
Proembrión
2 Células
Estado globular
Estado de corazón
Estado de
torpedo
Semillas fueron clareadas con solución de clareo y analizadas con óptica de Nomarski Embriones de Athena muestran proliferación celular anormal en el suspensor y un patrón de desarrollo aberrante E
Estado globular
Estado de corazón
En la mutante Athena existe proliferación celular anormal en el suspensor
F
B
A
◄
◄
*
Estado de corazón
Estado de torpedo
2
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Líneas mutantes que poseen una inserción en una región En Athena la mutación se inserta en una región intergénica
intergénica cercana a Athena
Salk_130478 Salk_073901 Athena Cromosoma 5
Cromosoma 5
Gen‐1
895 pb
Gen‐1
Gen‐2
895 pb
Gen‐2
Gen
2
598 pb 718 pb
6105 pb
6105 pb
Athena ¿ La región intergénica es la responsable ?
¿Algún elemento regulatorio está siendo afectado ?
Líneas insercionales muestran proliferación celular en el suspensor y desarrollo de embriones aberrantes
¿ Cuál es el gen responsable ?
Salk_130478
Salk_073901
Cromosoma 5
Athena P.F.D.
Salk_130478
ATP
sintetasa
Proteasa tipo Lon i L
P.F.D.
Proteína de unión a ribonucleasa S
Salk_073901
Se realizó análisis de expresión por RT‐PCR
Semillas fueron clareadas con solución de clareo y vistas con optica de Nomarski Reacción en cadena de la polimerasa en retrotranscripción (RT‐PCR) RT‐PCR
1 ug RNA total + DNAsa I
Extracción de RNA total Método TRIzol ( Invitrogen )
RT
AAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTT
Cuantificación del RNA total
RNAm
Oligo dT
Oligo dT
Transcriptasa Inversa
dNTP’s
AAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTT
Se colectaron muestras
RNA total
AAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTT
RNAm
cDNA
3
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PCR
TTTTTTTTTTTTT
cDNA
WT
Taq Polimerasa
dNTP’s
Athena
gen 1
gen 2
gen 1
gen 2
RT‐PCR
Productos de PCR Visualización Visualización
Gel de agarosa
GEL
Sobre expresión del gen para ATP Sintetasa en la mutante
Athena
100pb ACTINA 11
P.F.D 1
ATP Sintetasa Proteasa
tipo Lon
Sobre expresión del gen para ATP Sintetasa en la mutante
Athena
Proteína unión a Ribonucleasa S P.F.D 2
100pb ACTINA 11
400 pb
p
400 pb
p
200 pb
200 pb
P.F.D 1
ATP Sintetasa Proteasa
tipo Lon
Proteína unión a Ribonucleasa S P.F.D 2
Tamaños esperados : Tamaños esperados : Actina‐11 : 180pb
P.F.D 1 : 391pb ATP Sintetasa: 357pb Proteasa Lon: 364pb
Proteína unión a Ribonucleasa S: 342pb
P.F.D 2: 389pb
Actina‐11 : 180pb
P.F.D 1 : 391pb ATP Sintetasa: 357pb Proteasa Lon: 364pb
Proteína unión a Ribonucleasa S: 342pb
P.F.D 2 : 389pb
En Athena la región intergénica produce una sobrexpresión del gen para ATP Sintetasa( Sub‐unidadδ) ¿Que tipo de células son?.
¿ Son células del suspensor?.
P.F.D.
¿ Se está desarrollando un nuevo embrión?.
Salk_130478
Salk_073901
Cromosoma 5
ATP
sintetasa
Proteasa tipo Lon Athena Proteína de unión a ribonucleasa S
P.F.D.
¿ Hay cambios en los patrones de desarrollo?
Se analizaron cruzas de Athena con marcadores moleculares del desarrollo
4
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Athena cruzada con marcadores del desarrollo
Línea marcador
A
Athena Marcador
B
Wild‐type
PIN 1:: GFP
F1
F 1
Resultados esperados
E
F
I
J
WOX‐5:: GFP
ó
Expresión normal de marcadores moleculares del desarrollo embrionario
WOX‐8 :: GFP
Expresión de marcadores para desarrollo embrionario en la mutante Athena
A
C
E
Línea marcador
Línea marcador
A
Athena
B
C
D
G
E
Wild‐type
H
Athena
I
J
F
Athena
WOX‐5:: GFP
PIN 1:: GFP
Conclusiones
Athena
Línea marcador K
WOX‐8 :: GFP
L
M
N
• La mutante Athena y las líneas insercionales Salk_130478 y
Salk_073901 presentan fenotipos asociados a la semilla en
desarrollo.
• En Athena el desarrollo del suspensor es aberrante,
aberrante debido a
que sufre proliferación celular lo cual origina, en algunos casos,
el desarrollo de una estructura tipo embrión o embrión
secundario.
5
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Perspectivas
Conclusiones
• En Athena el gen que codifica para la subunidad δ de la ATP
Sintetasa se desregula, aumentando su expresión
transcripcional, posiblemente esta desregulación sería la
responsable de la proliferación celular en el suspensor. Para
los otros cuatro genes analizados, no se detecta actividad
transcripcional.
transcripcional
• En Athena el análisis con marcadores moleculares del
desarrollo, muestra que las células que proliferan en el
suspensor, cambian su programa de desarrollo e identidad
celular, adquiriendo un destino embrionario.
Para confirmar que el gen de la ATP Sintetasa subunidad δ es
realmente responsable de producir el fenotipo mutante Athena,
se podrían realizar las siguientes actividades:
1.‐
Análisis de expresión por RT‐PCR para los cinco genes en estudio,
en plantas de mutantes Salk. El patrón de expresión para los
cinco genes, en estas mutantes debería ser similar al de la
mutante Athena.
2.‐ Sobreexpresión del gen de la ATP Sintetasa en un fondo genético
silvestre, a través de la generación de plantas transgénicas de
Arabidopsis, portando una construcción que consiste en el gen
de la ATP Sintetasa comandada por un promotor fuerte. Se
espera que la expresión de este gen dentro de la planta produzca
un desarrollo anormal del suspensor.
Control embrionario del suspensor en sus y twn
Genes SUS son necesarios para la morfogénesis normal
Schwartz et al. (1994)
Agradecimientos
Dr. Wilson Huanca‐Mamani, Laboratorio de Biotecnología Vegetal (U.T.A.) por el apoyo académico y técnico brindado en la realización de este seminario. Factores genéticos en el desarrollo temprano
YDA
MPK3
MPK6
SSP
WOX 2
WOX 8
WOX 8
PIN 1
PIN 7
PIN 7
TAA1
TAR 1 y 2
MP
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Mutantes en Arabidopsis
Factores genéticos en estados avanzados
WUS
KNOX
STM
WOX 5
sus Schwartz et al.
Development (1994)
twn 1
Vernon et al. A.J.B.(2001)
twn2
Zhang, J. (1997 )
7