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15/10/2012 El ciclo de vida de las plantas consta de dos fases. Proyecto Pregrado 2011 MEIOSIS DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD TRANSCRIPCIONAL DE GENES CANDIDATOS A SER RESPONSABLES DEL FENOTIPO Athena EN Arabidopsis thaliana. p MICROSPORA (N) ( ) Laboratorio de Biotecnología Vegetal Facultad de Ciencias Agronómicas Universidad de Tarapacá. MEGASPORA (N) ( ) MITOSIS Y DIFERENCIACIÓN ESPOROFITO (2N) ALUMNO: A. PATROCINANTE: VÍCTOR EDUARDO ROJAS PÉREZ DR. WILSON HUANCA‐MAMANI FECUNDACIÓN Arica‐Chile.2012 El desarrollo embrionario sigue un patrón ordenado de divisiones celulares. Con la fecundación se inicia el desarrollo de la semilla. Núcleos Espermáticos Endospermo Tubo Polínico LA DOBLE FECUNDACIÓN ES LA SEÑAL DE INICIO ES LA SEÑAL DE INICIO Embrión PARA LOS PROGRAMAS DE DESARROLLO Cubierta de la semilla Cigoto Identificación de Athena 1era División celular Estado globular Estado de corazón Estado de torpedo Estado de cotiledón Sitio de la mutación en el genoma de Athena Identificada por el Dr. Wilson Huanca en un escrutinio genético Athena Desarrolla un embrión secundario Cromosoma 5 Gen‐1 Tiene una mutación en una región Intergénica del cromosoma 5 895 pb Gen‐2 6105 pb 1 15/10/2012 Objetivo Resultados Semillas abortadas en plantas mutantes Athena Determinar el nivel de expresión de cinco genes candidatos de ser responsables del fenotipo Athena en Arabidopsis thaliana Athena Silvestre • Analizar fenotipos de líneas mutantes Athena e insercionales • Realizar análisis histológico de la embriogénesis en Athena • Determinar el nivel de expresión de los cinco genes candidatos en plantas silvestres y en Athena, en tejido reproductivo • Analizar cruzas con marcadores moleculares del desarrollo Desarrollo embrionario normal en semillas de Arabidopsis tipo silvestre Embriones de Athena muestran proliferación celular anormal en el suspensor y un patrón de desarrollo aberrante D C B A Proembrión 2 Células Estado globular Estado de corazón Estado de torpedo Semillas fueron clareadas con solución de clareo y analizadas con óptica de Nomarski Embriones de Athena muestran proliferación celular anormal en el suspensor y un patrón de desarrollo aberrante E Estado globular Estado de corazón En la mutante Athena existe proliferación celular anormal en el suspensor F B A ◄ ◄ * Estado de corazón Estado de torpedo 2 15/10/2012 Líneas mutantes que poseen una inserción en una región En Athena la mutación se inserta en una región intergénica intergénica cercana a Athena Salk_130478 Salk_073901 Athena Cromosoma 5 Cromosoma 5 Gen‐1 895 pb Gen‐1 Gen‐2 895 pb Gen‐2 Gen 2 598 pb 718 pb 6105 pb 6105 pb Athena ¿ La región intergénica es la responsable ? ¿Algún elemento regulatorio está siendo afectado ? Líneas insercionales muestran proliferación celular en el suspensor y desarrollo de embriones aberrantes ¿ Cuál es el gen responsable ? Salk_130478 Salk_073901 Cromosoma 5 Athena P.F.D. Salk_130478 ATP sintetasa Proteasa tipo Lon i L P.F.D. Proteína de unión a ribonucleasa S Salk_073901 Se realizó análisis de expresión por RT‐PCR Semillas fueron clareadas con solución de clareo y vistas con optica de Nomarski Reacción en cadena de la polimerasa en retrotranscripción (RT‐PCR) RT‐PCR 1 ug RNA total + DNAsa I Extracción de RNA total Método TRIzol ( Invitrogen ) RT AAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTT Cuantificación del RNA total RNAm Oligo dT Oligo dT Transcriptasa Inversa dNTP’s AAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTT Se colectaron muestras RNA total AAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTT AAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTT RNAm cDNA 3 15/10/2012 PCR TTTTTTTTTTTTT cDNA WT Taq Polimerasa dNTP’s Athena gen 1 gen 2 gen 1 gen 2 RT‐PCR Productos de PCR Visualización Visualización Gel de agarosa GEL Sobre expresión del gen para ATP Sintetasa en la mutante Athena 100pb ACTINA 11 P.F.D 1 ATP Sintetasa Proteasa tipo Lon Sobre expresión del gen para ATP Sintetasa en la mutante Athena Proteína unión a Ribonucleasa S P.F.D 2 100pb ACTINA 11 400 pb p 400 pb p 200 pb 200 pb P.F.D 1 ATP Sintetasa Proteasa tipo Lon Proteína unión a Ribonucleasa S P.F.D 2 Tamaños esperados : Tamaños esperados : Actina‐11 : 180pb P.F.D 1 : 391pb ATP Sintetasa: 357pb Proteasa Lon: 364pb Proteína unión a Ribonucleasa S: 342pb P.F.D 2: 389pb Actina‐11 : 180pb P.F.D 1 : 391pb ATP Sintetasa: 357pb Proteasa Lon: 364pb Proteína unión a Ribonucleasa S: 342pb P.F.D 2 : 389pb En Athena la región intergénica produce una sobrexpresión del gen para ATP Sintetasa( Sub‐unidadδ) ¿Que tipo de células son?. ¿ Son células del suspensor?. P.F.D. ¿ Se está desarrollando un nuevo embrión?. Salk_130478 Salk_073901 Cromosoma 5 ATP sintetasa Proteasa tipo Lon Athena Proteína de unión a ribonucleasa S P.F.D. ¿ Hay cambios en los patrones de desarrollo? Se analizaron cruzas de Athena con marcadores moleculares del desarrollo 4 15/10/2012 Athena cruzada con marcadores del desarrollo Línea marcador A Athena Marcador B Wild‐type PIN 1:: GFP F1 F 1 Resultados esperados E F I J WOX‐5:: GFP ó Expresión normal de marcadores moleculares del desarrollo embrionario WOX‐8 :: GFP Expresión de marcadores para desarrollo embrionario en la mutante Athena A C E Línea marcador Línea marcador A Athena B C D G E Wild‐type H Athena I J F Athena WOX‐5:: GFP PIN 1:: GFP Conclusiones Athena Línea marcador K WOX‐8 :: GFP L M N • La mutante Athena y las líneas insercionales Salk_130478 y Salk_073901 presentan fenotipos asociados a la semilla en desarrollo. • En Athena el desarrollo del suspensor es aberrante, aberrante debido a que sufre proliferación celular lo cual origina, en algunos casos, el desarrollo de una estructura tipo embrión o embrión secundario. 5 15/10/2012 Perspectivas Conclusiones • En Athena el gen que codifica para la subunidad δ de la ATP Sintetasa se desregula, aumentando su expresión transcripcional, posiblemente esta desregulación sería la responsable de la proliferación celular en el suspensor. Para los otros cuatro genes analizados, no se detecta actividad transcripcional. transcripcional • En Athena el análisis con marcadores moleculares del desarrollo, muestra que las células que proliferan en el suspensor, cambian su programa de desarrollo e identidad celular, adquiriendo un destino embrionario. Para confirmar que el gen de la ATP Sintetasa subunidad δ es realmente responsable de producir el fenotipo mutante Athena, se podrían realizar las siguientes actividades: 1.‐ Análisis de expresión por RT‐PCR para los cinco genes en estudio, en plantas de mutantes Salk. El patrón de expresión para los cinco genes, en estas mutantes debería ser similar al de la mutante Athena. 2.‐ Sobreexpresión del gen de la ATP Sintetasa en un fondo genético silvestre, a través de la generación de plantas transgénicas de Arabidopsis, portando una construcción que consiste en el gen de la ATP Sintetasa comandada por un promotor fuerte. Se espera que la expresión de este gen dentro de la planta produzca un desarrollo anormal del suspensor. Control embrionario del suspensor en sus y twn Genes SUS son necesarios para la morfogénesis normal Schwartz et al. (1994) Agradecimientos Dr. Wilson Huanca‐Mamani, Laboratorio de Biotecnología Vegetal (U.T.A.) por el apoyo académico y técnico brindado en la realización de este seminario. Factores genéticos en el desarrollo temprano YDA MPK3 MPK6 SSP WOX 2 WOX 8 WOX 8 PIN 1 PIN 7 PIN 7 TAA1 TAR 1 y 2 MP 6 15/10/2012 Mutantes en Arabidopsis Factores genéticos en estados avanzados WUS KNOX STM WOX 5 sus Schwartz et al. Development (1994) twn 1 Vernon et al. A.J.B.(2001) twn2 Zhang, J. (1997 ) 7