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PROBLEMAS DE BIOQUIMICA I (Trimestre 10-0) CINETICA ENZIMATICA Y METODOS DE LINEARIZACIÓN (Prof. Javier Isidoro López Cruz) 1. ¿Cuál es la fracción de VMAX observada, cuando la concentración de sustrato es igual a KM, 2 KM y 4 KM? 2. ¿Qué cantidad de sustrato hay que aumentar para que la velocidad máxima aumente de 0.1 a 0.9? 3. Una enzima cataliza una reacción con una velocidad máxima de 5 µmoles por minuto, siendo su KM para el sustrato de 0.5 mM. Si la ponemos en presencia de una concentración 500 mM de sustrato. ¿Qué cantidad de sustrato se logrará transformar en 10 min? 4. La KM de una hexoquinasa para la glucosa es 10-4M. Si la concentración de glucosa en el medio de reacción es 1.8 µg/mL, ¿cuál será la relación CE/CES? (PM glucosa=180 g/mol). 5. La KM para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenada de levadura es de 1.3x10-2M. Si la concentración de alcohol en el medio de reacción es de 59.8 µg/mL, ¿Qué proporción de enzima estará libre y que proporción estará combinada con el sustrato? (PM etanol 46 g/mol) 6. Calcular que velocidad se obtendrá en una reacción enzimática si la velocidad máxima es igual a 100 y la concentración de sustrato es igual a) 10 KM y b) KM/3 7. Calcular que concentración de sustrato expresada en función de KM nos dará una velocidad de reacción enzimática al 60% de la velocidad máxima. (solución: Cs= 1.5K KM) 8. Una enzima cuya KM= 2.4x10-4M, se ensaya con las siguientes concentraciones de sustrato: a) 2x10-7M, b) 6.3x10-5 y c) 1x10-4M. La velocidad medida en la reacción con 5x10-2M de sustrato fue de 0.128µmoles/min. Calcular las velocidades iniciales en los otros casos. (solución b) 0.02674µmoles /min, c) 0.037 µmoles/min) 9. Una enzima cataliza una reacción a una velocidad de 35µmoles/min cuando la concentración de sustrato es 0.01M. La KM para el sustrato es 2x10-5M. ¿Cuál será la velocidad inicial a las concentraciones de sustrato: a) 3.5x103 M, b)4x10-4M, c) 2x10-4M, d) 2x10-6M y e)1.2x10-6 M?. 10.A partir de los siguientes datos obtenidos para una reacción catalizada enzimáticamente. ¿calcular KM y VMAX obtenida por Lineaweaver & Burk y por el método de Eadie & Hofstee de los siguientes problemas (a), (b) y (c). Además obtenga la grafica en papel milimétrico de cada uno de los métodos. a. Cs (mM) 0.5 1.0 γs (µmol/min) 1.00 1.67 1.5 2.0 2.5 3.0 2.40 2.50 2.78 3.0 b. 25 µL de una preparación de Ribonucleasa A se lleva a ensayo a un volumen de reacción estándar de 1 mL y a temperatura y pH óptimos, pero con distintas concentraciones iniciales de sustrato obteniéndose las velocidades iniciales que se indican Cs x10-3(mM) 303 149 128 100 80 γs (nmol/min) 120 98 92.6 83.3 74.6 Determínese la KM y VMAX y exprese también la cantidad de enzima en UI/mL y UI/mg. c. La descarboxilación enzimática de β-cetoácido procede con las velocidades iniciales para las concentraciones que se citan [cetoácido] (mM) 2.500 1.000 0.714 0.526 0.250 γs (µmol CO2/2 min) 0.588 0.500 0.417 0.370 0.252 Determínese la KM y VMAX d) Un sustrato fue hidrolizado por una enzima y la velocidad inicial de desaparición fue medida para distintas concentraciones del mismo. Calcular la KM y VMAX a partir de los datos que se resumen a continuación: Cs (mM) 2.3 3.0 4.5 12.0 38.0 γs (µmol/min) 0.95 1.13 1.42 2.14 2.64 11.¿Qué información puede obtenerse a partir de una representación gráfica del método de Lineaweaver & Burk cuando la recta obtenida, convenientemente extrapolada, corta el eje de las abscisas en -40 Litros/mol?. 12. Calcular la la KM y VMAX de una enzima sabiendo que la recta obtenida en una representación de Lineaweaver & Burk corta el eje de ordenadas en 5x103 (moles/min)-1 y que la pendiente de dicha recta es de 120 min/L. Además varíe la concentración de sustrato y represente la curva de Michaellis & Menten en papel milimétrico, a través de la ecuación del mismo nombre. PROBLEMAS DE INHIBICIÓN 13.Una reacción enzimática se lleva a cabo a diferentes concentracuines de sustrato en ausencia y presencia de dos inhibidores diferentes: (Ia)=(Ib)=1.5 mM. La siguiente tabla muestra los datos obtenidos: Cs (mM) 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2 γs (µmol/min) 1.67 2.86 4.44 6.15 7.62 γs a (µmol/min) 0.625 1.176 2.110 3.480 5.160 γs b (µmol/min) 0.83 1.43 2.22 3.08 3.81 a) determinar todos los parámetros cinéticos de la enzima b) ¿Qué tipo de inhibidor es Ia y Ib? Una reacción enzimática se lleva a cabo con distintas concentraciones de sustrato en ausencia y presencia de un inhibidor. Los datos obtenidos se representan en unos ejes de coordenadas según en métodos de Lineaweaver&Burk. Las rectas obtenidas cortan a los ejes en coordenadas en lo siguientes puntos, en ausencia y presencia del inhibidor, respectivamente, corte de abscisas (mM-1)= -3.7 y -0.2 corte en ordenadas (µmoles/min)-1=0.01 y 0.01. ¿De que tipo de inhibición se trata? ¿Calcular la KM y VMAX en ausencia y presencia del Inhibidor?. Determinar la concentración de inhibidor sabiendo que KI= 2.6x10-1mM. 14.- Al estudiar la cinética de la inhibición de cierta enzima., se han obtenido los resultados de la tabla siguiente: Cs [mM] 0.02 0.05 0.10 0.20 0.50 [I]=0 2.90 5.00 6.67 8.13 9.09 γs (µmol/min) [I]=0.1 mM [I]=1 mM 2.52 1.18 4.02 1.43 5.02 1.54 5.72 1.60 6.25 1.64 Determinar gráficamente a) El tipo de inhibidor b) El valor de KM y VMAX de la enzima c) El valor de KI OTROS PROBLEMAS DE CINETICA Y DE INHIBICIÓN 1. Calcular KM y VMAX de una enzima sabiendo que la recta obtenida en una representación de Lineaweaver y Burk corta el eje de ordenadas en 5x103 (moles/min)-1, y que la pendiente de dicha recta es 120 min/L 2. A partir de un representación de Lineaweaver y Burk para una reacción enzimática cuya recta corta al eje de ordenadas en 1/V=25 h/mol y extrapolando al eje de las abscisas en 1/S= -1.3 x 102 (moles/L)-1, calcular KM y VMAX. 3. La glutamina sintetasa (GS) cataliza la siguiente reacción: L-Glu + NH3 +ATP Æ L-Gln + ADP +Pi Cuando las concentraciones de NH3 y de ATP son saturantes, la enzima manifiesta una cinética Michaeliana respecto al ácido glutámico. Sin embargo, cuando a un preparado enzimático se le añade L-serina de modo que su concenración resulte ser 16 mM, se observa que tanto KM y VMAX disminuyen hasta alcanzar 1/3 del valor primitivo. Indicar a)¿Qué tipo de inhibición ejerce la serina? B)¿Cuál será su valor de KI? 4. Se ensaya una enzima con su sustrato específico en presencia de un inhibidor competitivo. Sila velocidad máxima de la reacción no inhibida es de 55 µmoles/min, Calcular la velocidad inicial de la reacción inhibida, sabiendo que Cs= KM=2 x10-4M y que [I]=Ki 2.5 x 10-3 M. 5. Una cierta enzima cataliza la transformación de 0.4 mmoles de sustrato en 5 minutos, cuando la concentración de este se encuentra en la saturación. Si se ensaya la enzima con una concentración de sustrato de 60 µM, la velocidad de reacción es de 40 µmoles/min y si además se añade inhibidor competitivo a concentración de 30µM, el grado de inhibición resulta ser del 75%. Calcular KM de la enzima y la KI del inhibidor (Tip Para la Inhibición competitiva el grado de inhibición se define como:) i% = 100[ I ] , además i % = (1 − a ) * 100 con a = [S ] Ki1 + + [I ] KM γ inhibida γ sin inhibida