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TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: PROBLEMAS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA
Los alumnos deben repasar todos los conceptos de cinética enzimática, tanto de las
clases teóricas como de los prácticos de enzimología 1, 2 e isoenzimas. Asimismo,
deben practicar la resolución de problemas. Los que se incluyen en esta guía son
algunos ejemplos resueltos que se discutirán en clase práctica, pero se sugiere la
resolución de los otros problemas propuestos en la guía y la interpretación de los
gráficos resultantes de los prácticos anteriores.
Traer calculadora, papel milimetrado y otros elementos necesarios la resolución de
problemas.
Problema 1:
1- Un sustrato S se transforma por una enzima, y la velocidad de desaparición se mide
cada 30 seg. durante 3 min. Se preparó en tubos de ensayo una serie de seis tubos con
1.5 µg de enzima (peso mol 30,000) añadiéndose un mismo volumen de disolución de
sustrato a distintas concentraciones. Los resultados están resumidos en la tabla.
¿Cuáles son las velocidades iniciales para cada tubo con distinta concentración de
sustrato?
Tiempo (min)
0
0.5
1
1.5
2.0
2.5
3
Conc. Inicial
(µmoles ml-1)
S
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.0
1
S
0.49
1.05
1.66
2.23
2.81
3.40
2.32
2
S
0.71
1.52
2.36
3.18
4.00
4.55
Sustrato transformado (µmol)
3
4
S
S
1.10
1.36
2.24
2.74
3.48
12.66
38.50
5
S
1.45
3.00
200.00
Solución: Paso 1. Corregir cada lectura sustrayendo el cambio aparente en la disolución
testigo (0S) en el tiempo correspondiente.
1
S
0.4
9
0.9
5
1.4
6
1.9
3
2.4
1
2.9
2
S
3
S
0.71 1.1
4
S
5
S
1.36 1.45
1.42 2.14 2.64 2.90
2.16 3.28 -
-
2.88 -
-
-
3.6
-
-
-
-
Paso 2. Representar moles de sustrato transformado para cada concentración frente al
tiempo (Figura). Trazar la mejor recta para cada serie de puntos.
1
4S
Su
str
at
o
tra
ns
for
m
ad
o
(µ
m
ol)
5S
3S
2S
1S
Tiempo (minutos)
De esta figura determinar la velocidad de sustrato transformado por minuto para cada
concentración de sustrato en el tramo lineal de cada curva. Estos valores serán las pendientes
de las porciones lineales y serán también las velocidades iniciales.
[1S]
2.32
2
[ S]
4.55
[3S] 12.66
[4S] 38.50
[5S] 200.00
x
x
x
x
x
10-3 M
10-3 M
10-3 M
10-3 M
10-3 M
V= 0.95 µmol min-1
2
V= 1.44 µmol min-1
3
V= 2.31 µmol min-1
4
V= 2.64 µmol min-1
5
V= 2.90 µmol min-1
1
Estos valores se representan unos frente a otros
Velo
cida
d
inici
al
(µm
ol
min1
)
Conc. Sustrato (M x 103)
2
Problema 2:
v0 = Vmáx [S]
Km + [S]
Utilizando la ecuación de Micaelis-Menten, calcular el cambio en la [S] necesaria para
aumentar la velocidad de una reacción del 10 al 90 % de la velocidad máxima.
SOLUCIÓN
Poniendo v0 = 0,1 Vmáx
Entonces
[S]
= 0,1
Km + [S]
[S] = (Km + [S]) . 0,1
[S] = 0,1 Km + 0,1 [S]
[S] - 0,1 [S] = 0,1 Km
0,9 [S] = 0,1 Km
9 [S] = Km
Es decir,
[S] = Km / 9
Poniendo
v0 = 0,9 Vmax encontramos que [S] = 9 Km,
entonces
[S]90% = 9 Km = 81
[S]10%
Km/9
Es decir, se debe aumentar la [S] 81 veces.
Problema 3:
Las velocidades iniciales a varias concentraciones de sustrato para una reacción catalizada
por una enzima hipotética son:
[S] (moles/l) V (µmoles/min)
5x10-2
0.25
-3
5x10
0.25
5x10-4
0.25
5x10-5
0.20
-6
5x10
0.071
5x10-7
0.0096
a) ¿Cuál es la velocidad máxima para esta reacción?
b) ¿Por qué la velocidad inicial permanece constante a una [S] mayor de 5x10-4 M
c) ¿Cuál es la concentración de enzima libre para una [S] de 5x10-4 M?
d) ¿Cuál es la Km de la enzima?
3
e) Calcular la velocidad inicial para [S]=1x10-6
y [S]=1x10-1
f) Calcular la concentración de producto formado en los cinco primeros minutos de reacción
utilizando 10 ml de una disolución de sustrato 2x10-3 M.
SOLUCIÓN
a) Vmax = 0.25 µmol/min, ya que por encima de [S] de 5x10-4 no aumenta.
b) Porque todos los enzimas está ocupados transformando un sustrato.
c) Cero, todos los enzimas ocupados, a esa [S] se da la Vmax.
d) Empleando la ecuación de Michaelis, utilizando la velocidad 0.20, 0.070 ó 0.0096 y sus
correspondientes [S], como sabemos la Vmax, obtenemos una Km 0 1,25 x 10-5 moles/l.
e) Sabiendo la Km y Vmax, aplicamos Michaelis utilizando esas [S], y
obtenemos: V = 0,018 µmol/min y V = 0,25 µmol/min.
f) A [2x10-3] la V = Vmax = 0,25 µmol/min. En 5 min 0,25 x 5 = 1,25 µmol. Tenemos 10 ml
de sustrato, luego 1,25 µmol / 10-2 l = 1,25 x 102 µmol/l
Problema 4:
Se estudió la actividad de la enzima ureasa, que cataliza la reacción:
CO(NH2)2+H2O  CO2+2NH2
en función de la concentración de urea, con los resultados siguientes:
Concentración de urea (mmoles dm-3)
V inicial (mmoles urea consumidos min-1 mg enzima-1)
30
3,37
60
5,53
100
7,42
150
8,94
250
10,70
400
12,04
¿Cuáles son los valores de Km y Vmáx para esta reacción?
SOLUCIÓN
Los datos se ordenan en la forma adecuada para una gráfica lineal (por ejemplo, 1/Vinicial
frente a 1/[S], aunque existen otras formas de linealizar que no son motivo de nuestro
estudio). La gráfica de la doble inversa se indica en la Figura. De la gráfica se puede calcular
que Km es 105 mmoles dm-3 y la Vmáx es 15,2 mmoles urea consumidos mg-1 min-1. Observar
la distribución de los puntos y tener presente cuando se eligen los valores adecuados para la
concentración de sustrato al planificar un experimento.
-1
)
0.30
1/V inicial (mg min mmoles
0.24
0.18
0.12
0.06
0.00
0.00
0.01
0.02
3
0.03
0.04
-1
1/[urea] (dm mmoles )
Ejemplo resuelto de acuerdo con el método de doble inversa o de Lineweaver-Burk.
Problema 5:
4
Se investigó el efecto de un inhibidor I sobre la velocidad de una reacción catalizada
enzimáticamente sobre un solo sustrato, obteniéndose los siguientes resultados
Concentración de sustrato
(mmol L -1)
Concentración del inhibidor
(mmol L -1)
0
0.5
1.0
Velocidad de reacción n (mol L -1 min-1)
0.05
0.10
0.20
0.40
0.50
0.33
0.50
0.67
0.80
0.83
0.20
0.33
0.50
0.67
0.71
0.14
0.25
0.40
0.57
0.63
A) ¿De que manera actúa el inhibidor? B) Obténgase los valores para Vmáx, y Km.
SOLUCIÓN
A) La manera más sencilla de deducir cómo actúa un inhibidor es graficar 1/n en función de
1/[S]0 para cada concentración del inhibidor.
8
1
1/n 0 (mol L -1 min-1 )
7
6
0.5
5
[I ] 0 (mmol L-1)
[I ] 0,5 (mmol L-1)
4
Vmáx
[I ] 1,0 (mmol L-1)
0
3
2
1
0
-15
-10
-1/Km
-5
0
5
10
15
20
25
1/[S] 0 [(mmol L-1) -1]
Gráfica de Lineweaver-Burk del efecto de un inhibidor
A partir de la gráfica se puede observar que la pendiente de las curvas se modifica con los
cambios en la concentración del inhibidor pero no la intersección en el eje 1/nVmax). Por
ello los datos anteriores indican que el inhibidor I está actuando como un inhibidor
competitivo.
B) De la intersección en el eje 1/n se puede estimar Vmax= 1(mol L -1 min-1) y de la
intersección con el eje 1/[S]0 los valores de Km=0,1 (mmol L -1) sin ihnhibidor, Km=0,2(mmol
L -1) con 0.5(mmol L -1) de inhibidor y Km=0,3 (mmol L -1) con 1(mmol L-1)
5
Problema 6:
A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar de que manera está
actuando el inhibidor. Determinar la Km y la velocidad máxima.
[S] mM µg producto/h
µg producto/h
(sin inhibidor)
(6 mM inhibidor)
2
139
88
3
179
121
4
213
149
10
313
257
15
370
313
SOLUCIÓN
Se calculan los inversos de [S] y de v, producto sin inhibidor y producto con inhibidor y se
representa. Sin inhibidor: Vmax = 0,5x103 µg/h y Km = 5 mM. Con inhibidor: Vmax es la
misma y Km=9 mM.
PROBLEMAS PARA RESOLVER
Problema 7:
Calcular qué velocidad se obtendrá en una reacción enzimática si la velocidad máxima es igual a 100 y
la concentración de sustrato es a) 10 Km b) Km/3.
Sol.: a) 91 %; b) 25%
Problema 8:
Una enzima cuya Km es 2,4 · 10-4 M se ensaya con una concentración de sustrato de 2·10-7 M. Si la
velocidad media para esta reacción con una concentración de sustrato de 5·10-2 M fue 0.128
mmoles/min, calcular la velocidad inicial en el caso anterior.
Sol.: 0.107 µmol/min
Problema 9:
Se detectó actividad de una determinada enzima en extractos de hígado y cerebro. Para dilucidar si la
actividad detectada era atribuible a la misma enzima presente en ambos órganos, o a especies distintas
de la enzima propias de cada órgano, se llevaron a cabo estudios cinéticos con distintos sustratos. Uno
de los sustratos, ensayado siempre bajo idénticas condiciones en 1 ml de volumen total incluyendo 0,1
ml de extractos de cada órgano, resultó ser transformado a las siguientes velocidades iniciales:
Concentración de sustrato
Velocidad (moles/min)
(moles/ml)
Hígado
Cerebro
1
0,14
0,085
2
0,23
0,14
5
0,39
0,23
10
0,50
0,30
Den las características de la enzima que puedan ser determinadas a partir de estos datos, y muéstrese
cuáles de ellas son de interés en relación con la cuestión de la identidad de las dos enzimas.
Sol.: los valores de Km son los mismos
Problema 10:
La fructosa difosfatasa (que cataliza la hidrólisis de la fructosa difosfato a fructosa-6-fosfato y fosfato)
es inhibida por AMP. Los siguientes datos se obtuvieron a partir de un estudio de la enzima del hígado
de rata:
FDP (moles ml-1)
4
6
10
20
40
6
AMP (moles ml-1)
Velocidad inicial (moles ml-1 min-1)
0
0,059
0,076
0,101
0,125
0,150
8
0,034
0,043
0,056
0,071
0,083
Comentar estos resultados en relación a las constantes cinéticas en cada caso.
Sol.: Km 8 moles ml-1; Vmáx sin inhibidor 0.185 moles ml-1 min-1; Vmáx con inhibidor 0.102
moles ml-1 min-1
0,010
0,008
Km (M)
Problema 11:
Una determinada enzima cataliza la reacción A ↔
B. Se ha observado previamente que la Vmáx de
esta reacción no varía dentro de un rango de pH
entre 5 y 9: Vmáx= 100 moles/min/g de enzima.
Por otra parte, la Km varía según se muestra en esta
figura:
El ensayo fue realizado en presencia de 0,01 M
sustrato, y 1 g de enzima, en cada uno de los
bufferes. ¿Qué velocidad inicial se esperaría para pH
5.5 y 8? Explique.
Sol.: Para pH 5.5: 50 moles/min/g de enzima
Para pH 8: 100 moles/min/g de enzima
0,006
0,004
0,002
0,000
5
6
7
8
9
pH
Problema 12:
Habiéndose conseguido aislar de Salmonella typhimurium una enzima (E) que cataliza la
reacción A→P, se decidió hacer un estudio estructural y cinético de dicha enzima:
[A] mM
1,00 0,55 0,25 0,20
V(mmol P/ min)
1,00 0,71 0,50 0,41
V (nmol P/min) con J
0,66 0,41 0,25 0,20
donde J es un inhibidor de E cuya influencia como tal se quiere estudiar. [J] = 0,25mM.
a) Calcular la Km de la enzima estudiada para A, y Vmax para la transformación A--P en
presencia de E.
b) Que tipo de inhibidor es J?
c) Cuál sería el efecto sobre la Vmax de la enzima, un aumento de la concentración de J?
Solución: Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4
a) Vmax = Vmax’ = 1.66 mmol P/min
b) KM = 0.5 mM
c) KM’ = 1.25 mM (con inhibidor) (Inhibición Competitiva)
Problema 13
La cinética de una enzima viene determinada como función de la concentración de sustrato en
presencia y ausencia del inhibidor I.
[S], Mx10-5
0.3
0.5
1.0
V(µmol/min) sin inhibidor
10.4
14.5
22.5
V(µmol/min) con inhibidor 10-4 M
2.1
2.9
4.5
a) Calcular la Km y la Vmax en presencia y ausencia de inhibidor
b) Que tipo de inhibidor es?
3.0
33.8
6.8
9.0
40.5
8.1
Solución: Se calcula siguiendo el mismo procedimiento que el problema 4
a) Vmax = 50 µmol/min
b) Vmax’ = 9.5 µmol/min
7
c) KM = 1.1x10-5 M
d) Inh. No Competitiva
Problema 14
¿Qué relación numérica existe entre Km y [S] cuando una reacción enzimática alcanza el 87
% de la Vmax?
Problema 15
100 ug de una enzima a 25 °C descomponen en 10 min el 1% de un sustrato 0,1 M. La misma
cantidad de enzima descompone en 1 min el 10% de un sustrato 10-3 M. Calular Vmax y
ctividad específica de la enzima.
Problema 16
Una enzima se ensayo con una [S] inicial de 2.10-5 M. en 6 min la mitad del sustrato había
reaccionado. Si la Km para el sustrato es 5x10-3 M, calcular la Vmax y la cantidad de
producto formado en 10 min de reacción.
Problema 17
Una enzima cataliza una reacción con una velocidad máxima de 5 µmoles por minuto, siendo
su Km para el sustrato de 0.5 mM. Si la ponemos en presencia de una concentración 500 mM
de sustrato. ¿Qué cantidad de sustrato se logrará transformar en 10 min?
Problema 18
La KM para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenada de levadura es de 1.3x10-2 M. Si la
concentración de alcohol en el medio de reacción es de 59.8 µg/ml, ¿Qué proporción de
enzima estará libre y que proporción estará combinada con el sustrato? (PM etanol 46 g/mol).
Problema 19
Calcular que velocidad se obtendrá en una reacción enzimática si la velocidad máxima es
igual a 100 y la concentración de sustrato es igual a) 10 Km y b) Km/3.
Problema 20
Una enzima cataliza una reacción a una velocidad de 35µmoles/min cuando la concentración
de sustrato es 0.01M. La KM para el sustrato es 2x10-5 M. ¿Cuál será la velocidad inicial a las
concentraciones de sustrato: a) 3.5x10-3 M, b)4x10-4 M, c) 2x10-4 M, d) 2x10-6 M y e) 1.2x10-6
M?
Problema 21
Calcular Km y Vmax de una enzima sabiendo que la recta obtenida en una representación de
Lineaweaver y Burk corta el eje de ordenadas en 5x103 (moles/min)-1, y que la pendiente de
dicha recta es 120 min/L.
Problema 22
Una reacción enzimática se lleva a cabo a diferentes concentraciones de sustrato en ausencia y
presencia de dos inhibidores diferentes: [Ia] = [Ib] = 1.5 mM. La siguiente tabla muestra los
datos obtenidos:
[S] (mM)
v (µmol/min)
v (Ia) (µmol/min)
v(Ib)
(µmol/min)
0.2
0.4
0.8
1.6
1.67
2.86
4.44
6.15
0.63
1.18
2.1
3.48
0.83
1.43
2.22
3.08
8
3.2
7.62
5.16
3.81
a) determinar todos los parámetros cinéticos de la enzima.
b) ¿Qué tipo de inhibidor es Ia e Ib?
Problema 23
25 µL de una preparación de Ribonucleasa A se lleva a ensayo a un volumen de reacción
estándar de 1 mL y a temperatura y pH óptimos, pero con distintas concentraciones iniciales
de sustrato obteniéndose las velocidades iniciales que se indican
[S] x10-3 (mM)
v (nmol/min)
303
120
149
98
128
92.6
100
83.3
80
74.6
Determine la Km y Vmax y exprese también la cantidad de enzima en UI/mL.
Problema 24
La descarboxilación enzimática de β-cetoácido procede con las velocidades iniciales para las
concentraciones que se citan:
[cetoácido] (mM)
2.500
v (µmol CO2/2 min)
0.588
Determine la Km y Vmax.
1.000
0.500
0.714
0.417
0.526
0.370
0.250
0.252
Problema 25
¿Qué información puede obtenerse a partir de una representación gráfica del método de
Lineaweaver & Burk cuando la recta obtenida, convenientemente extrapolada, corta el eje de
las abscisas en -40 Litros/mol?
Problema 26
La Km para el etanol de la enzima alcohol deshidrogenada de levadura es de 1.3x10-2 M. Si la
concentración de alcohol en el medio de reacción es de 59.8 µg/ml, ¿Qué proporción de
enzima estará libre y que proporción estará combinada con el sustrato? (PM etanol 46 g/mol)
9