Download polimorfismos genéticos en pacientes heterocigotos con

POLIMORFISMOS GENÉTICOS EN PACIENTES HETEROCIGOTOS CON
DEFECTO DE TUBO NEURAL.
Mares García, A.S. (1); Saavedra Alanís, V.M. (2)
(1)
Facultad de Química
Universidad Autónoma de Querétaro
(2)
Facultad de Medicina
Departamento de Bioquímica
Universidad Autónoma de San Luis Potosí
RESUMEN:
Se purificó DNA genómico a partir de muestras de sangre obtenidas por punción venosa de
pacientes con Defecto de Tubo Neural para analizar la presencia de una o dos mutaciones del
gen de la MTHFR; la C677T localizada en el exón 4, y la A1298T localizada en el exón 7.
También se buscaron las condiciones para amplificar una secuencia de los exones 4-7.
Además se utilizaron células en cultivo para purificar mRNA, y luego convertirlo a cDNA
mediante RT-PCR y amplificarlo por PCR para analizar en busca de las mutaciones ya
mencionadas.
INTRODUCCIÓN:
El gen MTHFR codifica para la enzima metilentetrahidrofolato reductasa, la cual es parte del
metabolismo de folatos.
Una mutación puntual en el nucleótido 677 de dicho gen, cambia una base: Citosina a Timina,
y provoca una sustitución de aminoácidos de Alanina a Valina; la alteración produce una
versión termolábil de la enzima, que presenta menor actividad. El polimorfismo C677T está
asociado con:
-
Hiper-homocisteinemia, esto es un factor de riesgo para la enfermedad coronaria y se
asocia con mayor frecuencia a casos de infartos de miocardio.
-
Defectos de tubo neural, estos pueden ser: Anencefalia, Encefalocele, o Espina bífida:
Mielomeningocele, Meningocele.
En complicaciones obstétricas como pre-eclampsia, aborto, retardo en el crecimiento, y
mortinatos.
Alta incidencia a eventos trombóticos.
-
Existe otra mutación puntual en el gen de la MTHFR, la A1298C, que origina la sustitución
de Ácido glutámico por Alanina. Esta mutación ha sido relacionada con:
- En defectos de tubo neural.
- Disminución del riesgo de leucemia linfoblástica aguda en adultos y niños.
- Y en combinación con la C677T en una disminución del el riesgo de sufrir leucemia
linfoblástica aguda en niños.
Los defectos de tubo neural son malformaciones secundarias a un cierre anormal del tubo
neural que ocurre entre la tercera y cuarta semanas de edad gestacional.
Se considera que el 90% de los DTN se presentan como malformaciones aisladas,
determinadas multifactorialmente. Las condiciones ambientales, que pueden actuar en una
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persona con predisposición genética específica pueden llevar a un umbral de transgresión,
donde bajo efectos específicos incrementan la aparición de la enfermedad.
En la literatura se reportan diversos factores que incrementan el riesgo a tener un hijo con
DTN, entre ellos están: la edad (mayor riesgo en madres muy jóvenes <19 o de edad avanzada
>40), paridad (riesgo incrementado en mujeres primigestas), escolaridad (riesgo incrementado
en mujeres con menos de educación primaria o sin secundaria); obesidad (IMC >29 dobla el
riesgo). La exposición al calor también se ha asociado al riesgo incrementado, como el uso de
baños calientes en el primer trimestre, enfermedad febril o uso de sauna.
ANTECEDENTES:
Mutchinik realizó un estudio en 250 mujeres mexicanas sanas de diferentes partes del país, se
encontró una alta frecuencia del alelo mutante y una alta prevalencia para el estado
homocigoto y de que un mexicano sea portador homocigoto de la mutación; se notaron
diferencias regionales: los sujetos originarios del norte del país tenían más baja prevalencia de
la mutación y del genotipo homocigoto que los sujetos originarios del centro, este y oeste.
González-Herrera y cols. no encontraron diferencias significativas entre los casos de DNT y
sus madres, sin embargo la frecuencia del alelo C677T encontrada en la población sana de
Yucatán fue estadísticamente significativa comparada con otras poblaciones.
En cuanto al ácido fólico, en 1990 se confirmó que el suplemento periconcepcional del ácido
fólico reducía la recurrencia, y la ocurrencia de DNT en más del 50% hasta 70% cuando se
tomaba antes de la concepción y hasta el primer trimestre del embarazo. Desde 1992 se
recomienda la ingesta diaria de ácido fólico, la siguiente tabla muestra las recomendaciones
publicadas en un reporte de una institución de medicina en 1997.
Estado del individuo
Hombres >14 años
Mujeres >14 años
Embarazo
Lactancia
DNT previo
μg diarios
400
400
600
500
4000
Proveniente de
Cualquier fuente
Sintético y alimentos
Sintético y alimentos
Cualquier fuente
Sintético
EXPERIMENTAL:
El DNA fue extraído de sangre obtenida por punción venosa de pacientes con Defecto de
Tubo Neural del Hospital Central Dr. Ignacio Molones Prieto de San Luis Potosí y fue
recolectada en tubos vacuntainer con EDTA. Se utilizó el kit de Wizard para la purificación
de DNA genómico. Las muestras de mRNA fueron obtenidas del cultivo celular proveniente
de un explante de aorta realizado en el mismo Hospital. Para extraer y purificar el mRNA se
utilizó cloroformo, isopropanol, etanol y agua DPEC, todo se realizó en tubos eppendorf
RNAsa free. Para la PCR se usaron los primers Forward y Reverse, Taq polimerasa Platinum,
Desoxis, MgCl 10mM, buffer y agua estéril. Los geles para la electroforesis fueron
preparados con agarosa normal y agarosa de bajo punto de fusión y buffer TAE 1X y TBE
1X. Se agregó bromuro de etidio como colorante. Para el análisis de los geles se utilizó un
transiluminador.
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ANÁLISIS DE RESULTADOS:
Se extrajo DNA genómico de las muestras sanguíneas de los pacientes; se comprueba con
electroforesis en gel de agarosa al 2%. En la figura 1, se muestran las bandas que confirman la
presencia del gDNA.
Figura 1. DNA genómico extraído de sangre. Primer carril
marcador ʎ , segundo y tercer carril gDNA.
Para analizar los polimorfismos C677T y A1298C, se tomó el gDNA y se amplificó por PCR.
Después se incubó con la enzima de restricción Hinf I para la C677T y Mob para la A1298C.
Se separaron los productos por electroforesis en un gel de agarosa 2%. En las figuras 2 y 3 se
observan los resultados para cada muestra. Existen 3 posibles: Homocigoto normal,
Homocigoto mutado y Heterocigoto.
Figura 2. Análisis del polimorfismo C677T de la MTHFR,
utilizando Hinf I. 1er carril: marcador de peso molecular. 2do:
muestra sin enzima de restricción. 3ro: una banda homocigoto
normal (AA). 4to: una banda homocigoto mutado (CC). 5to: dos
bandas heterocigoto (AC).
Figura 3. Análisis del polimorfismo A1298C de la
MTHFR, utilizando Mob. 1er carril: marcador de
peso molecular. 2do: muestra sin enzima de
restricción. 3ro: una banda homocigoto normal
(AA). 4to: una banda homocigoto mutado (CC).
5to: dos bandas heterocigoto (AC).
Se cambiaron varias veces las condiciones del termociclador para lograr amplificar los exones
4-7 en una sola secuencia. Las variables modificadas fueron la temperatura, la duración de los
ciclos, la enzima (polimerasa). En la figura 4 se observa la diferencia entre dos productos de
PCR para amplificar los exones 4-7. Los primers utilizados sólo amplificaban gDNA, ya que
uno de ellos se unía a una secuencia intrónica, esto se verificó al usar una muestra de gDNA
(que sí amplificó) y una muestra de cDNA (que no amplificó). La figura 5 muestra estas
diferencias.
Figura 4. PCR para exones 4-7. Primer carril: marcador ʎ . Segundo
carril: PCR fallida. Tercer carril: PCR lograda, se observa la banda de
aprox. 2100 pb, este tamaño es cercano a la secuencia buscada.
Figura 5. Diferencias entre DNA genómico y
complementario.
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Se purificó mRNA del cultivo celular para verificar la presencia de mRNA, se separó por
electroforesis en un gel de agarosa 1% preparado con agua DPEC. La figura 6 muestra el gel
visto con un transiluminador.
Figura 6. mRNA de explante de aorta humana. Primer carril: marcador ʎ . Segundo y tercer carril: muestras de RNA, se
observa la primera banda que pertenece a la subunidad 28S ribosomal y la segunda banda perteneciente a la subunidad 18S.
CONCLUSIONES:
Se lograron identificar los polimorfismos de ambos exones en las muestras analizadas (C677T
y A1298C), a partir de gDNA como de mRNA; esto servirá para formar una base de datos en
la que se capturen los resultados de la presencia de una o dos mutaciones en cada paciente y
así obtener datos que sean significativos para relacionar la interacción de ambas mutaciones
en el incremento del riesgo a presentar defectos de tubo neural.
Además se obtuvieron las condiciones para amplificar los exones 4-7, esto servirá para
clonarlo en una bacteria que exprese la enzima MTHFR y con esto analizar los efectos de la
interacción de ambas mutaciones.
BIBLIOGRAFÍA:
González-Herrera, G García-Escalante, I Castillo-Zapata, J Canto-Herrera, J Ceballos-Quinta,
D Pinto-Escalante, F Díaz-Rubio, RM Del Angel, L Orozco-Orozco. “Frequency of the
thermolabile variant C677T in the MTHFR gene and lack of associuation with the neural tube
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NS Green."Folic acid supplementation and prevention of birth defects.". J. Nutr. 132: 2356S2360S, 2002.
O Mutchinik, MA López, L Luna, J Waxman, VE Bainsky, RYVEMCE Collaborative group.
“High prevalence of the thermolabile metilentetrahydrofolate reductase variant in Mexico: a
country with a very high prevalence of neural tube defects.” Mol. Genet. Metab. 68: 461-467,
1999.
Romero-Alvarado, I.”Frecuencia de la mutación C677T del gen metilentetrahidrofolato
reductasa (MTHFR) en pacientes con Defecto de Tubo Neural y en individuos sanos del
Hospital Central Dr. Ignacio Morones Prieto, en SLP México”. Tesis para la titulación en la
Especialidad de Pediatría. UASLP-San Luis Potosí, México, 2009.
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