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EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA “in vivo” DE AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO FITOPATOGENO Rhizoctonia solani JULIO CÉSAR TOVAR CASTAÑO PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA Bogotà D.C 2008 EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA “in vivo” DE AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO FITOPATOGENO Rhizoctonia solani JULIO CÉSAR TOVAR CASTAÑO TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al titulo de Microbiòlogo Agrìcola y Veterinario PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA Bogotà D.C Enero 2008 NOTA DE ADVERTENCIA Artìculo 23 de la Resoluciòn No 13 de Julio de 1946 “La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velarà por que no se publique nada contrario al dogma, y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se ve en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.” EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA “in vivo” DE AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO FITOPATOGENO Rhizoctonia solani JULIO CÉSAR TOVAR CASTAÑO _____________________________ JOSE SALVADOR MONTAÑA MSc. DIRECTOR. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA Bogotà D.C Enero 2008 EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTAGONISTA “in vivo” DE AISLAMIENTOS DE Trichoderma spp FRENTE AL HONGO FITOPATOGENO Rhizoctonia solani JULIO CÉSAR TOVAR CASTAÑO ______________________________ ________________________ Gerardo Moreno Durán MSc. Luis David Gomez MSc. JURADO JURADO PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRICOLA Y VETERINARIA Bogotà D.C Enero 2008 “A dios por darme la libertad de vivir, A mi madre Mery quien con su hermoso ejemplo de honestidad y fortaleza alienta siempre mi corazòn, por su amor de madre y comprensión infinita, a mi padre Julio Cèsar, por su incondicional apoyo, por sus invaluables consejos que fortalecieron mi alma y encaminaron mi vida, y a Angèlica Maria y Jairo Humberto por su aliento de hermanos y por el hermoso regalo de existir en mi vida “. AGRADECIMIENTOS A Jose salvador Montaña por su calidad humana y enseñanzas, por su apoyo y orientación constante e incondicional, por su comprensión y por la confianza brindada para culminar exitosamente este proyecto de mi vida. Al Doctor Gerardo Moreno por su orientación y consejos en la realización de los ensayos de la investigación en la Estaciòn experimental de la Pontificia Universidad Javeriana. Al Laboratorio de Microbiologìa ambiental y de suelos por el suministro del aislamiento T3 y por la colaboración durante la realización de esta investigación. Al CIIA por el suministro del hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani para el desarrollo de la investigación. Al LESYHT por el suministro del hongo nativo de Trichoderma T235 para el desarrollo de la investigación. A flor América por el suministro de los esquejes de clavel enraizados y el aislamiento Trichoderma Tsp5, Tv1, Tc1 y Ti1. A Claudia Patricia por su aliento y apoyo incondicional. RESUMEN Trichoderma es un hongo de gran importancia a nivel agrícola gracias a las diversas ventajas que ofrece como agente de control biológico, para la protección de plantas frente al ataque de fitopatògenos causantes de enfermedades de importancia económica, como es el caso de los cultivos hortícolas. En el presente estudio se evaluò la capacidad antagonista de 6 aislamientos de Trichoderma (T3, Tsp5, Tv1, Tc1, Ti1 y T235), frente a Rhizoctonia. solani, un fitopatògeno causante de muchas enfermedades en plantas. Se empleo para ello la técnica de cultivo dual, donde los aislamientos T235 Y T3 mostraron los mayores valores de crecimiento libre desde las 24h y los mas altos porcentajes de inhibición micelial PIM Curiosamente el aislamiento comercial Tc1 presento la menor tasas de crecimiento. Con el fin de confirmar la capacidad antagonista “in vivo” de los 6 aislamientos de Trichoderma, se realizaron ensayos en esquejes enraizados de clavel de la variedad everest susceptibles a R. solani bajo condiciones de invernadero, Confirmando los resultados obtenidos en los ensayos de antagonismo “in vitro”, se observo que el tratamiento silvestre T235 resultò tener la mejor capacidad antagonista, reflejado en mayores valores de crecimiento de la parte aérea, raiz y peso de los esquejes de clavel, además de una mejor apariencia de los mismos y ausencia de signos o síntomas de la enfermedad. Contrario a lo observado en el ensayo in vitro, donde el aislamiento Tc1 mostro tasas de crecimiento libre y porcentajes de inhibición micelial bajos, en los ensayos de invernadero este aislamiento presento una buena capacidad antagonista y promocion del crecimiento vegetal indicando que no necesariamente la capacidad antagonista de un aislamiento observada in Vitro sea un indicativo de cómo se va a comportar en condiciones de invernadero o campo INDICE GENERAL 1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………...…….. 1 2. MARCO TEÒRICO Y ESTADO DEL ARTE …………………………………… 3 2.1 BIOLOGIA DE Trichoderma ……………………………………………….. 5 2.2 Mecanismos de biocontrol de Trichoderma……………………………….. 6 2.2.1. Biocontrol por competencia………………………………………………. 7 2.2.2 Competencia por nutrientes……………………………………………… 8 2.2.3 Antibiosis……………………………………………………………………..8 2.2.4 Micoparasitismo…………………………………………………………….. 9 2.2.5 Sinergismo……………………..…………………………………….…......10 2.2.6 Biofertilización y mecanismos de defensa en plantas……………….. 10 2.2.7 Modificación de la rizosfera . …………………………………………… 10 2.3 Trichoderma en el biocontrol…………………………………………….….13 2.4 Trichoderma como biofertilizante………………………………….………. 15 2.5 Rhizoctonia solana……………………………………………………….…..16 2.5.1 BIOLOGÌA de Rhizoctonia solani……………………………………….. 17 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN……………...………20 4. OBJETIVOS………………………………………………………………………..22 4.1. Objetivo General……………………………………………………………. 22 4.2 Objetivos específicos……………………………………………………….. 22 5. MATERIALES Y METODOS……………………………………………………. 23 5.1 Diseño de la investigación………………………………………………….. 23 5.1.1 Ubicación…………………………………………………………………….23 5.1.2 Microorganismos……………………………………………………………23 5.1.3. Material vegetal …………………………………………………………... 24 5.1.4. Elaboración del banco de trabajo de aislamientos de Trichoderma... 24 5.1.5 Preparación del inoculo de aislamientos de Trichoderma …..……….. 25 5.1.6 Preparación del inóculo de Rhizoctonia solani………..……………….. 25 5.1.7 Prueba de antagonismo in-vitro …………………..…………………….. 26 5.1.8 Elaboración de la prueba de antagonismo…….……………………… .26 5.2 Evaluación de la capacidad antagonista “in vivo”……….……………….. 27 5.3 Diseño experimental ……….……………………………………………….. 28 5.4 Variables de estudio…………………………………………………. ..…… 29 6. RESULTADOS Y DISCUSIÒN………………………………………………….30 6.1 Evaluaciòn Macro y Microscòpica de aislamientos de Trichoderma ….. 31 6.2 Crecimiento libre de aislamientos de Trichoderma……………………... 33 6.3 Evaluaciòn de crecimiento del patógeno R. solani ……………………… 34 6.4 Actividad antagonista de las cepas de estudio ………………………….. 35 6.5 Evaluaciòn del antagonismo in vivo de aislamientos de Trichoderma …38 7. CONCLUSIONES ……………………………………………………………...…59 8. BIBLIOGRAFIA ……………………………………………………………….…. 61 INDICE DE FIGURAS Figura 1. Crecimiento en placa de los Aislamientos de Trichoderma T3, TSP5, Tv1, Tc1, Ti1, y T235 en agar PDA durante 48 horas a 30°C………....31 Figura 2. Porcentajes de crecimiento libre evaluado a las 24,36,48 y 60 horas para 6 aislamiento de Trichoderma……………………………………………….34 Figura 3. Curva de Crecimiento de Rhizoctonia solani……………………..… 34 Figura 4. Técnica de enfrentamiento: A la derecha de cada caja, aislamientos T3, Tsp5, Tc1, Ti1, Tv1, y T235 de Trichoderma a la izquierda Rhizoctonia solani. Fotografía tomada 72 horas después del inicio de la prueba…………36 Figura 5. Porcentaje de inhibición micelial de los 6 aislamientos de Trichoderma a las 24, 48 y 72 horas………………………………………….…..37 Figura 6. Aspecto del material vegetal previo a la inoculación con el Hongo Rhizoctonia solani…………………………………………………………….…… 39 Figura 7. Aspecto del material vegetal luego de la inoculación en campo con el patógeno ………………………………………………………………………... 40 Figura 8. Aspecto del material vegetal 7 días después de la inoculación con el patógeno …………………………………… ………………………………… 40 Figura 9. Aspecto del material vegetal 11 días después de la inoculación con el patógeno …………………………………………………………………... 41 Figura 10. Aspecto del material vegetal 15 días después de la inoculación con el patógeno ……………………………………………………………………..42 Figura 11 Evaluaciòn de la longitud de la parte aérea de esquejes de clavel En respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani………………………………………………………………………….…. 42 Figura 12. Síntomas iniciales visibles en Tsp5 y Control Rhizoctonia solani...43 Figura 13. Aspecto del material vegetal 19 días después de la inoculación con el patógeno …………………………………………………………………….. 44 Figura 14. Evaluación de la longitud foliar de esquejes de clavel en respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani………44 Figura 15 Evaluación del peso fresco de esquejes de clavel en respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani…….46 Figura 16. Aspecto del material vegetal 23 días después de la inoculación con el patógeno ……………………………………………………………………...48 Figura 17. Evaluación del peso seco aéreo de esquejes de clavel en respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani ………………………………………………………………………………… 49 Figura 18 Evaluación del peso seco raíz de esquejes de clavel en respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani……50 Figura 19. Sintomas visibles de la enfermedad en el material vegetal………. 51 Figura 20. Evaluación del peso seco total de esquejes de clavel en respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani…... 52 Figura 21. Incidencia de Muerte de esqujes de clavel en los tratamientos por acción patogénica de R. solani ……………………………………………….52 Figura 22. Evaluaciòn de las raíces en los diferentes tratamientos durante el desarrollo del ensayo …………………………………………………. 54 Figura 23. Evaluación de la longitud de raiz de esquejes de clavel en respuesta a la aplicación de Trichoderma spp posterior a la infección con R. solani ………………………………………………………………………………... 55 Figura 24. Aspecto del material vegetal 27 días después de la inoculación con el patógeno…………………………………………………………………….. 56 INDICE DE TABLAS Tabla 1. Tratamientos para la evaluación de antagonismos “in vivo” ……… 28 Tabla 2. Evaluación macroscópica de los 6 Aislamientos de Trichoderma … 31 Tabla 3. Resultados obtenidos al evaluar el crecimiento libre de Trichoderma a las 24, 36, 48 y 60 horas……………………………………….. 32 Tabla 4. Resultados obtenidos al evaluar el porcentaje de inhibición micelial de los 6 aislamientos de Trichoderma a las 24, 48 y 72 horas …….. 37 INTRODUCCIÓN El aumento de la población mundial, el deterioro del medio ambiente y calidad de vida del hombre, son sólo algunos de los tantos factores que han motivado al ser humano a buscar nuevos procesos de producción agrícola que permitan cubrir la demanda, cada vez más creciente, de alimento y materias primas a través de procesos donde se aprovechen los recursos naturales de manera sostenible e integrando así los conceptos de conservación y desarrollo para la plena satisfacción de las necesidades humanas. No obstante las actividades agrícolas extensivas y la ampliación de sus fronteras han traído consigo problemas fitosanitarios en los sistemas naturales, especialmente en el suelo, que es considerado el soporte principal de la agricultura. Uno de los aspectos importantes en la producción agrícola es el control de plagas y enfermedades; medidas fitosanitarias que minimicen las perdidas económicas ocasionadas por diferentes efectos como son los agentes químicos o biológicos. La utilización extensiva de compuestos químicos para el control de enfermedades, la emergencia de patógenos resistentes a fungicidas, y el deterioro en la salud de productores y consumidores, han promovido la búsqueda de alternativa viables que garanticen una mayor sostenibilidad en la producción agrícola, minimizando el impacto sobre el medio ambiente. Desde 1980 Rhizhobacterias y hongos biocontroladores han sido investigados como posible alternativa de producción limpia. El empleo de agentes de control biológico (BCAs) ha permitido una reducción en la aplicación de fungicidas químicos y por lo tanto un control más eficiente de patógenos causantes de enfermedades, al ser incorporados a los programas de manejo integrado. El hongo Trichoderma sp es un eficiente controlador biológico que está siendo ampliamente usado en agricultura como agente de biocontrol debido a su habilidad para colonizar sustratos rápidamente, inducir resistencia sistémica adquirida en plantas, promover el crecimiento vegetal y poseer actividad antagonista contra un amplio rango de hongos patógenos. El efecto inhibitorio de sus antibióticos y la degradación de componentes de la pared celular de patógenos de plantas, es citado como aspecto importante de su actividad antagonista. Las especies de Trichoderma tienen una gran actividad antagonista sobre patógenos como Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Pythium ultimum y Fusarium oxisporum, causantes de enfermedades importantes en cultivos de rábano, clavel, crisantemo, fríjol, cafeto, haba, tomate y cítricos entre otros. Durante los últimos años, varios investigadores y algunas empresas han mostrado gran interés en estudiar el potencial de Trichoderma como controlador biológico de patógenos de suelo. En este contexto, el presente trabajo evaluó bajo condiciones de invernadero, la capacidad antagonista de aislamientos nativos y comerciales de Trichoderma spp frente al hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani. Los resultados de esta investigación ayudaron en la obtención de información tanto en laboratorio como en campo sobre la acción potencial biocontroladora de este género. 2. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE El control biológico de enfermedades en plantas o insectos con agentes microbianos es una posibilidad atractiva, si se tiene en cuenta que los costos respecto al uso de otras prácticas de control tradicionales pueden resultar menores y de mayor eficiencia, pues, aunque los antagonistas pueden actuar en forma más lenta y en menor escala, su acción puede ser más estable y duradera que el control químico (Papavizas y Lewis, et al.1984). El conocimiento concerniente al comportamiento de algunos hongos como antagonistas es esencial para su efectivo uso, debido a que pueden actuar contra organismos blanco de varias formas constituyéndose en una alternativa biológica al empleo de compuestos químicos convencionales, considerados nocivos para el medio ambiente (Jeffries y Young, 1994). Mediante el uso de hongos y bacterias antagonistas se han podido conocer estrategias con mayor potencial para el control de enfermedades ocasionadas por patógenos del suelo (Cook y Baker, 1983). Muchas especies saprofitas como Trichoderma harzianum., Gliocladium spp., y Verticillium lecanii son antagonistas de varios organismos plaga, incluyendo patógenos de plantas, malezas e insectos (González et al., 1998). De otra parte sobreviven durante periodos relativamente largos como formas de resistencia, haciendo innecesaria la reinfección continua con el agente biocontrolador (Wainwright et al., 1995) Las especies de Trichoderma han sido investigadas como agentes de control biológico (BCAs) de enfermedades fúngicas por cerca de 70 años (Hjeljord y Tronsmo, 1998), pero es solo recientemente que las cepas han comenzado ha ser comercialmente aprovechables. El éxito de las cepas de Trichoderma como (BCAs) es debido a su alta capacidad reproductiva, habilidad para sobrevivir bajo condiciones ambientales desfavorables, eficiencia en la utilización de nutrientes, capacidad para modificar la rizósfera, fuerte agresividad contra hongos fitopatógenos y eficiencia en promoción de crecimiento en plantas e inducción de mecanismos de defensa (Benítez y Rincón 2004). Estas propiedades han hecho que Trichoderma se presente en cualquier hábitat en una alta proporción. Las diferentes especies de Trichoderma se caracterizan por tener un crecimiento micelial rápido y una abundante producción de esporas que ayuda a la colonización de diversos sustratos y del suelo. Así mismo pueden producir enzimas extracelulares, antibióticos antifùngicos, ser competidores contra hongos patógenos, promover el crecimiento en plantas, e inducir resistencia (Zimand et al., 1996) Además compiten muy bien por nutrientes, son micoparasitos muy activos y son competidoras muy eficientes de la rizosfera (Papavizas et al., 1985; Ahmad y Baker, 1987). Liu y Baker en 1980 y Chet y colaboradores en 1987, demostraron que especies de Trichoderma harzianum y T. hamatum fueron especialmente eficientes en el control de patógenos como Rhizoctonia solani. Varios aislamientos de Trichoderma harzianum se han utilizado exitosamente en el control de algunas enfermedades ocasionadas por Rhizoctonia solani como: damping off en tomate (Rodríguez, 2002), pudriciones radiculares en plantas de fríjol (Gutiérrez et al., 2006), podredumbre negra de la raíz en fresa (Baldarrago,1999), pudrición del tallo en clavel ( García et al.,1998), pudrimiento de las raíces en habichuela ( Cardoso, et al., 1987 ) y mal del talluelo o damping off en el cafeto (Castro et al., 2005 ). Además, se ha encontrado que algunas especies de Trichoderma, especialmente Trichoderma harzianum tienen el potencial de aumentar el crecimiento y desarrollo de las plantas; esto parece deberse a la inhibición de patógenos menores y a la producción de factores que estimulan el crecimiento de la planta y favorecen la toma de nutrientes (Widham et al., 1986; Chang et al., 1986; Chet, 1987; Baker, 1990). Los procedimientos por los cuáles se promueve la actividad de biocontrol contra fitopatógenos fúngicos se fundamenta sobre la activación de múltiples mecanismos entre los que se encuentran: la inactivación de las enzimas del patógeno, la competencia por el espacio y nutrientes, la secreción de metabolitos secundarios con efecto antibiótico y el ataque directo a otro hongo o micoparasitismo. Además indirectamente Trichoderma, es capaz de proteger a la planta del patógeno, mediante la inducción de sus sistemas de defensa ( Benitez, 2004 ). 2.1 BIOLOGIA DE Trichoderma spp Trichoderma sp, es un habitante natural del suelo, caracterizado por un comportamiento saprófito o parásito, propiedades que benefician su actividad antagónica. (Camargo, 2005). Es considerado un colonizador secundario dado su frecuente aislamiento a partir de materia orgánica en descomposición, también es aislado comúnmente a partir de la superficie de raíces de varias plantas de madera y parasitando estructuras de diferentes hongos patógenos, debido a la competencia por nutrientes y micoparasitismo (Camargo et al., 2005). Las colonias de Trichoderma presentan crecimiento rápido, que va formando una colonia delgada de sobre la superficie del agar, debido a la conidiación que presenta a través de su desarrollo. Las colonias al comienzo son lisas o casi transparentes y algunas veces blancas, posteriormente se presentan penachos blancos y algodonosos, de micelio blanco, conformando una red densa, responsable del pigmento característico. (Barnett, y Hunter, 1982). Las especies del género Trichoderma presentan conidióforos complejos y altamente ramificados en forma piramidal o cónica dando origen a esterigmas, con extremos ahusados. Al microscopio las fiàlides se observan más estrechas en la base que en la parte superior, permitiendo una buena correlación entre el sistema de ramificación del conidióforo y la disposición de estas. (Barnett, y Hunter, 1982). Microscópicamente muchas especies del género crecen rápidamente en cultivos artificiales y produce un largo número de pequeñas conidias verdes o blancas de células conidiogenas situadas al final de conidioforos extensamente ramificados. Esta característica permite una relativa fácil identificación de Trichoderma como género, pero el concepto de especies son difíciles de interpretar, y allí hay una considerable confusión sobre la aplicación de nombres específicos. Rifai dividió el género Trichoderma en nueve especies sobre la base de características morfológicas. Bisset, revisó el género y además incluyó algunas Hypocrea anamorfas en el género, resultando en el establecimiento de cinco nuevas secciones (Hermosa et al., 2000). La abundancia de Trichoderma spp en varios suelos, junto con su habilidad para degradar varios sustratos orgánicos, su versatilidad metabólica y su resistencia a inhibidores microbianos, sugiere que este hongo puede poseer la habilidad para sobrevivir en varios nichos ecológicos, dependiendo de las condiciones que prevalezcan y sobre las especies involucradas. (Riegel y Nielsen, 1996). Trichoderma spp se encuentra clasificado según Alexopulus et al., 1996 como: División: Eumycota Subdivisión: Deuteromycotina Clase: Hypomicetes Orden: Hyphales Familia: Monilaceae Género: Trichoderma Especie: Harzianum, hamatum, viride, longibranchiatum, entre otras. 2.2 Mecanismos de biocontrol de Trichoderma El entendimiento de la diversidad genética de cada cepa dentro de las especies de Trichoderma y sus mecanismos de biocontrol ha permitido mejorar la aplicación de las diferentes cepas. Estos mecanismos son diversos, complejos y pueden actuar sinergicamente para lograr el control de enfermedades (Howell et al., 2003). Las diferentes especies de Trichoderma ejercen el biocontrol de una manera indirecta bien sea por competencia por nutrientes o espacio, antibiosis (producción de metabolitos), modificando las condiciones ambientales o mediante la producción de sustancias promotoras del crecimiento vegetal y de una forma directa por micoparasitismo (Benítez, 2004). Algunas especies del género Trichoderma son muy comunes en diversos suelos, principalmente en suelos ácidos y ricos en materia orgánica. Estas especies son fáciles de aislar, de cultivar y de propagar en diversos sustratos y la mayoría presentan un buen micoparasitismo (Benítez, 2004). A pesar de la cantidad creciente de investigaciones dedicadas a estudiar la actividad antimicrobial de Trichoderma spp ” in vitro“, el conocimiento de los mecanismos exactos responsables de la reducción en la incidencia de las enfermedades, después de la aplicación de Trichoderma spp. es aún insuficiente. (Yedidia et al., 1999). 2.2.1. Biocontrol por competencia Fungistasis. Un buen antagonista es capaz de superar el efecto fungistático que resulta de la presencia de diferentes metabolitos producidos por otras especies, incluyendo plantas, y sobrevive bajo condiciones adversas o competitivas (Benítez, 2004). Las cepas de Trichoderma crecen rápidamente cuando se inoculan en suelo ya que son naturalmente resistentes a muchos compuestos tóxicos incluyendo herbicidas, fungicidas y pesticidas tales como DDT, y compuestos fenólicos (Chet,1997) además recuperan muy rápidamente después de la adición de dosis subletales de algunos de estos compuestos. La resistencia a compuestos tóxicos puede estar asociada con la presencia en cepas de Trichoderma de sistemas de transporte ABC (Harman et al., 2004). Por esta razón son muy eficientes en el control de muchos patógenos como R. solani, Pythium ultimum o Sclerotium rolfsii, cuando se aplica en combinación con fungicidas químicos como el bromuro de metilo, benomyl, captan u otros químicos (Vyas et al., 1995). 2.2.2 Competencia por nutrientes La inanición es la causa mas común de muerte para microorganismos, la competencia por nutrientes limitantes, resulta en un control biológico de hongos fitopatògenos, antagonistas y micoparasitos (Chet et al., 1997). Un ejemplo claro de este mecanismo de acción se encuentra representado en hongos filamentosos, donde la toma de hierro es esencial para la viabilidad de los mismos. Bajo condiciones de deficiencias de hierro, el hongo excreta agentes quelantes específicos de bajo peso molecular llamados sideroforos, que le permiten tomar el hierro en forma reducida (Eisendle et al., 2004), citado por (Chávez, 2004). 2.2.3 Antibiosis La antibiosis ocurre durante la interacción de los compuestos difusibles de bajo peso molecular o antibióticos producidos por cepas de Trichoderma que inhiben el crecimiento de otros microorganismos. Además las cepas de Trichoderma producen metabolitos tóxicos volátiles y no volátiles que impiden colonización por microorgansimos antagonizados; entre estos metabolitos, la producción de ácido harzianico, alameticinas, tricholinas, peptaiboiles, antibióticos, 6-penthyl pirona, massoilactona, viridina, gliovirina, glisoperonas, ácido heptéldico y otros están siendo descritos (Howell et al., 1998). 2.2.4 Micoparasitismo El ataque directo de un hongo a otro es un proceso muy complejo que involucra eventos secuenciales, incluye reconocimiento, ataque y penetración subsecuente y muerte al huésped. Trichoderma spp puede ejercer control directo por el rango de parasitismo de hongo, detectando otros hongos y creciendo sobre el. (Benítez et al., 2004). El proceso de micoparasitismo ejercido por Trichoderma se produce en varias etapas sucesivas. Comienza por el crecimiento quimiotrófico de Trichoderma hacia el hospedador, estimulado por moléculas procedentes del mismo, de naturaleza desconocida. Las únicas que se han detectado hasta ahora son aminoácidos y azúcares, por lo que no cabe esperar que la inducción sea específica del hospedador (Chet et al., 1981). Los hongos del género Trichoderma se adhieren con carbohidratos unidos a lectinas en la pared celular del patógeno. Una vez Trichoderma es adherido se enrosca alrededor del patógeno y forma el apresorio (Howell, 2003). El paso siguiente consiste de la producción de CWDE´s, peptaiboles y enzimas hidrolíticas CWDE´s (Howell, 2003), lo cual facilita la entrada de la hifa de Trichoderma dentro del lumen del hongo parasitado y la asimilación del contenido de la pared celular. (Benítez et al., 2004). Degradación de la pared celular: La lisis es el mecanismo en el cual intervienen las enzimas hidrolíticas producidas por los microorganismos antagonistas como factores biocontroladores. Se ha observado que Trichoderma spp, produce celulasas, glucanasas y quitinasas que degradan “in vitro “la celulosa de las paredes celulares de microorganismos oomycetes y la quitina y B-1,3 glucanos de las paredes celulares de microorganismos Deuteromycetes como Gliocladium spp (Elad et al., 1982). El sistema quitinolìtico de Trichoderma comprende muchas enzimas y la lista de estos componentes inicia con la actualización de nuevas enzimas y genes reportados. Las quitinasas son divididas dentro de 1,4- - acetylglucosaminidasas (glucanasas ), endoquitinasas y exoquitinasas. De igual forma las (glucanasas) -1,3-glucanasas, así como las quitinasas actúan sinérgicamente, e inhiben la germinación de la espora y el crecimiento de algunos patógenos (Benítez, 1998; El-Katatny, 2001). Se ha mostrado que 1,3 – glucanasas inhiben la germinación de esporas o el crecimiento de patógenos en cooperación sinérgica con quitinasas (Benítez, et al., 1998) y antibióticos (Harman et al., 2004). 2.2.5 Sinergismo El sinergismo entre la actividad de enzimas líticas y antibióticos, es la mejor estrategia para ser un buen controlador, además de abrir el campo para posibles cepas transformantes que puedan producir las diferentes enzimas logrando un sinergismo que sea relevante (Benítez, 2004). 2.2.6 Biofertilización y mecanismos de defensa en plantas 2.2.7 Modificación de la rizosfera La habilidad para desarrollarse sobre o amplios rangos de condiciones externas de pH es un importante componente del complejo conjunto de características que Trichoderma, mejor adaptado a suelos ácidos, encuentra durante esta interacción con otros organismos. (Benítez et al., 2004). Algunas cepas de Trichoderma harzianum controlan estrictamente su pH externo, asegurando valores óptimos para su propias enzimas secretadas (Benítez et al., 2004). Así mismo Diferentes proteínas extracelulares son sintetizadas a diferentes valores de pH. Las cepas de Trichoderma están siempre asociadas con raíces de plantas y ecosistemas de raíces. Algunos autores han definido las cepas de Trichoderma como plantas simbiontes oportunistas, organismos avirulentos, capaces de colonizar raíces de plantas por mecanismos similares a los de los hongos micorrizales y producir compuestos que estimulan el crecimiento como citoquininas, zeatinas y giberilinas (GA3) ó relacionadas con GA3; así como promover mecanismos de defensa en plantas. (Harman et al., 2004). La colonización implica la habilidad para adherirse y reconocer raíces, penetrar y resistir metabolitos tóxicos producidos en respuesta a la invasión de organismos extraños, sean o no patógenos. (Benítez, et al., 2004). Así mismo Trichoderma frecuentemente incrementa el crecimiento de raíces y su desarrollo, productividad del cultivo, resistencia a estrés abiótico y la toma y uso de nutrientes (Arora y Elander, 1992) citado por Benítez 2004). La productividad de cultivos en campo puede incrementarse cerca del 300% después de la adición de Trichoderma hamatum o Trichoderma koningii (Benítez, 2004). Se ha observado que muchas cepas de Trichoderma son capaces de inducir resistencia sistémica en las plantas, ya que aplicadas en la rizosfera, producen protección contra patógenos del suelo o foliares. Esta resistencia viene acompañada en muchos casos de un aumento de actividades peroxidasa y quitinasas en zonas distantes de la raíz (Yedidia et al., 1999). Las cepas de Trichoderma son generalmente más resistentes a compuestos como fitoalexinas, flavonoides y terpenoides, derivados fenólicos, agliconas que muchos hongos: sin embargo su habilidad a colonizar fuertemente raíces de plantas depende de la capacidad de cada cepa a tolerar estos. Esta resistencia es considerada un requerimiento esencial para la colonización de plantas, siendo asociada con la presencia de sistemas de transporte ABC en cepas de Trichoderma (Harman et al., 2004). Algunas especies de Trichoderma han sido reportadas como estimuladoras de crecimiento en especies tales como clavel, crisantemo, pepino, berenjena, arveja, rábano, tabaco, tomate, lechuga, zanahoria, papa, algodón, fríjol y pastos ornamentales (www.soil-fertility.com ). Algunos autores han demostrado el efecto inductor en el crecimiento y desarrollo de las plantas por parte de Trichoderma spp., es así como (Yossen et al.2003), citado por (Castro y Rivillas 2006), demostraron que al incorporar T. harzianum (TL 98) en germinadores de lechuga, además de reducir el daño causado por R. solani, el antagonista promovió el crecimiento de las plantas. Igualmente, (Inbar, et al 1994), citado por ( Castro y Rivillas 2006), observaron que aplicando T. harzianum en semilleros de pepino y de pimentón se incrementó significativamente el crecimiento de las plántulas, comparadas con aquellas que no recibieron la adición del hongo antagonista. Estos trabajos muestran el beneficio de aplicar hongos, como Trichoderma, desde la etapa de germinador para obtener plantas vigorosas y sanas. De la misma forma Se han realizado algunos estudios preliminares con Trichoderma para la estimulación del crecimiento sobre plantas de fríjol, donde los aislamientos seleccionados estimularon la germinación y presentaron un aumento en la altura de las plantas entre el 70 y 80%, y una ganancia en peso de un 60% aproximadamente, lo que supone un incremento en los rendimientos de este cultivo. Un ensayo similar realizado sobre pasto Estrella demostró que la ganancia en peso seco con algunos aislamientos es cercana al 23%, en longitud de las raíces y de estolones este incremento fue de un 30%. (www.soil-fertility.com ). Se han evaluado parámetros de crecimiento y desarrollo del control de la enfermedad de R. solani por parte de Trichoderma spp. Estudios desarrollados (Rincón et al., 1991) demostraron el efecto antagónico de Trichoderma sobre R. solani en semilleros de café, obteniendo una reducción de 55% en la incidencia de la enfermedad cuando inocularon el sustrato con el hongo antagonista (Trichoderma 1644). 2.3 Trichoderma en el biocontrol El biocontrol por parte de trichoderma en el manejo integrado de enfermedades en campo, causadas por hongos fitopatógenos, ha sido demostrada en su capacidad antagónica frente a agentes causales de pudriciones radiculares y marchitamientos como Rhizoctonia solani, Sarocladium sp y Sclerotinia sp en Arroz, Flores, Papa, Hortalizas, Frutales y Fríjol, Fusarium oxysporum en Clavel, Botrytis cinerea en Flores, Colletotrichum gloesporioides, causante de Antracnosis en Tomate de Árbol, Fresa, Fríjol y Flores; así como la reducción en la incidencia de la enfermedad llamada “pata prieta “, ocasionada por Phytopthora nicotianae var. nicotianae. En 1990, Lewis, reportó que bajo condiciones de invernadero y de campo T. viride ejercía un control biológico promisorio sobre Rhizoctonia solani en cultivos de tomate. Por su parte, Salmando en 1996, reportó que la técnica de pregerminación controlada de semillas de Tomate Variedad chonto, en presencia de T. koningii, es una alternativa promisoria para contrarestar el efecto de R. solani en condiciones de semillero, mostrando porcentajes de protección del 70 %, mientras que el tratamiento que consistía en semillas no pregerminadas y tratadas con T. koningii presentó sólo un 15 % de protección. Así mismo Ochoa en 1996 determinó en condiciones de invernadero que la utilización individual y combinada de T. hamatum, P.fluorescens y Sterptomyces coelicolor, ofrecía un alto nivel de protección a claveles variedad Nora. Barlo contra Fusarium oxysporum. Trichoderma probablemente sea el hongo beneficioso, más versátil y polifacético que abunda en los suelos. No se conoce que dicho microorganismo sea patógeno de ninguna planta. Puede desarrollarse en una amplia gama de sustratos, lo cual facilita su producción masiva para uso en la agricultura. Su gran tolerancia a condiciones ambientales extremas y hábitat, donde los hongos son causantes de diversas enfermedades, le permiten ser eficiente agente de control; de igual forma pueden sobrevivir en medios con contenidos significativos de pesticidas y otros químicos. Además su gran variabilidad se constituye en un reservorio de posibilidades de control biológico bajo diferentes sistemas de producción y cultivos ( www.infojardin.com/foro/showthread.php). Cuando se aplica Trichoderma en campo se deben tener en cuanta varios aspectos importantes que permitan su adecuada expresión, que se relacionan con la interacción planta hospedante – fitopatógeno susceptible – ambiente favorable (Temperatura del suelo, humedad, presencia de oxigeno, pH), Condiciones del suelo (estructura, contenido de materia orgánica y nutrientes) y tiempo ( Villegas, 2005). Asi mismo existen algunos principios básicos de vital importancia para el éxito del control biológico con ciertos hongos como Trichoderma. Esto incluye la importancia de un propágalo efectivo ( jóven, hifa de activo crecimiento ) en tenencia a una base de alimento, edad de la preparación, habilidad de los hongos de biocontrol a invadir y tener una base de alimento ocupada por el patógeno; la consideración de la cantidad de preparación y el tiempo de aplicación, y prevalencia de las condiciones ambientales, durante y después de la aplicación. ( Lewis and Papavizas ). Varios Autores han realizado estudios tendientes a evaluar la capacidad antagonista in vivo de Trichoderma frente a R. solani. Rodriguez, en 2002 evaluó la eficiente acción inhibitoria de la utilización de cepas de Trichoderma y Pseudomonas Como antagonistas contra R.solani, mediante pruebas in vitro y comparadas con su capacidad biocontroladora en un cultivo de tomate en invernadero. La adición de hongos tales como Trichoderma y gliocladium antes de realizar la siembra, en suelos infestados por R. solani, disminuye de manera considerable la incidencia y severidad de las enfermedades que ocasiona este patógeno en la mayoría de los cultivos como la zanahoria, el frijol, el tomate, el clavel y la papa, en los cuales se ha intentado controlar el hongo. Al parecer el método da buenos resultados en el aumento de las poblaciones de Trichoderma y otros microorganismos que son antagonistas de Rhizoctonia solani y, quizá la liberación de algunos compuestos químicos fungitóxicos ( Agrios G, et al.,1998). De la misma manera Cook y Baker distinguen varias especies de Trichoderma: T hamatum, T viride, T harzianum, T. koningue y T. polyspermun, en el control de hongos fitopatógenos ( Chet I, et al.,1980). 2.4 Trichoderma como biofertilizante En Colombia se han realizado algunos estudios enfocados a la optimización de parámetros para la producción de Trichoderma. Chávez, (2006) evaluó la producción de este hongo mediante fermentación sólida, líquida o bifásica empleando diferentes sustratos como arroz, avena, soya, trigo, cebada, entre otros y diferentes condiciones de temperatura y fotoperíodo. Los resultados indicaron que el proceso de fermentación sólida empleando como sustrato arroz–agua destilada a 25ºC y la exposición constante a la luz permitió mayor recuperación (45x1018 conidios/mL), con 88 y 96% de germinación a las 18 y 24 horas respectivamente y una pureza estimada de 92.1%. Este proceso representa una alternativa viable para producción tanto industrial como artesanal de un inoculante biológico de buena calidad a base del Trichoderma; con buenos resultados en campo. Estudios preliminares indican que al aplicar este hongo a las semillas, sustrato en vivero, plantas en vivero, recién transplantadas o plantas establecidas, produce efectos positivos en el crecimiento y desarrollo de las mismas. Algunas industrias agrícolas y biológicas en Colombia como: agrobiológicos del campo Ltda, biológicos y ecológicos de Colombia y Orius biotecnología entre otros, han desarrollado productos biológicos para el agro, como biofertilizantes y biocontroladores de organismos fitopatógenos. Cepas específicas a base de hongos como Trichoderma harzianum (exporaxx wp) desarrollada por Orius Biotecnología, así como (Fitoripen wp) a base del hongo Trichoderma spp como agente microbial, desarrollado por saber agrobiológicos y Trichode wp de Orius biotecnología, han permitido la activación de mecanismos antagonistas frente a hongos fitopatógenos que afectan los cultivos de importancia agrícola. Ahora bien, el conocimiento de estos nuevos biofertilizantes a base de concentración de esporas a partir del hongo Trichoderma spp ha permitido el desarrollo de estudios “in vivo” para la inducción de respuesta en plantas e incremento en la producción de cultivos. Brunner y Zeilinger, en 2005), en estudios “in vivo”, demostraron los progresos del hongo de biocontrol Trichoderma atroviridae para la inducción de respuestas de defensa en plantas de fríjol, frente al patógeno foliar B. cinerea, conteniendo 1x108 esporas/ml tipo salvaje. Reynoso y colaboradores (2006), demostraron en estudios de biocontrol bajo condiciones de cultivo, que la aplicación de diferentes concentraciones de inóculo de T. harzianum (102 y 106), produjo un notable incremento en la cosecha de maní. Se encontró un incremento en el porcentaje de 45 a 76% en zonas naturalmente infestadas y de 57 a 95% en suelos artificialmente infestados, cuando las semillas fueron tratadas con T. harzianum 106. 2.5 Rhizoctonia solani Es uno de los hongos más importantes reconocido como patógeno de plantas. Por lo general causa enfermedades en una amplia gama de hospederos, afectando tanto partes aéreas como subterráneas. Usualmente se le conoce como hongo estéril, debido a que durante muchos años se pensó que era incapaz de producir algún tipo de espora, ya fuera sexual o asexual. Actualmente se sabe que Rhizoctonia solani produce basidiosporas que hacen que esta especie sea un basidiomiceto al que se le denominó Thanatephorus cucumeris (Agrios, 2004). Un considerable número de aislamientos de Rhizoctonia son saprótrofos, aunque otros son micorrizales sobre orquídeas u otras plantas. 2.5.1 Biología de Rhizoctonia solani Rhizoctonia solani según Agrios (2004) ha sido clasificado como: Hongo superior Subdivisión: Deuteromycotina Clase: Agonomycetes Orden: Agonomycetales (Myceliales) Género: Rhizoctonia La especie R solani, fue definida por Candolle (1815), Sobre la base de la producción de esclerocios de textura uniforme con hilos hifales emanantes de estos, y la asociación del micelio con raíces de plantas vivas. (Sneh, et al, 1991). Es la especie más conocida dentro del género Rhizoctonia sp. Fue originalmente descrito en 1858 por Julis Kuhn (Barnett y Hunter 1982). Dentro de las características que permiten clasificar taxonomicamente aislamientos de R.solani son: tendencia de pigmentación hifal café, ramificación próxima al septo distal de células en hifas vegetativas jóvenes, estrechamiento de hifa y formación de septos a una distancia corta del punto de origen a la ramificación hifal, Septo dolípora y células multinucleadas en hifa vegetativa joven (Parmeter y Whitney, 1970). El anamorfo es denominado Rhizoctonia solani y su teleomorfo Thanatephorus cucumeris, es un basidiomiceto no productor de esporas asexuales (conidios) y productor ocasional de basidiosporas (esporas sexuales). En la naturaleza se reproduce asexualmente y se encuentra en forma de micelio vegetativo y/o esclerocios (Agrios, 2004). Macroscópicamente las colonias jóvenes de Rhizoctonia solani se caracterizan por ser incoloras, algodonosas y planas aunque dependiendo de la especie, pueden llegar a tornarse cremosas o amarillentas. Al producirse la maduración, la colonia toma una coloración marrón (Ceresini et al., 1999). Microscópicamente el micelio está constituido de hifas fraccionadas en células individuales polinucleadas y comunicadas entre si a través de un poro septal que permite el movimiento del citoplasma, las mitocondrias y los núcleos de una célula a otra (Ceresini et al., 1999). Características tales como células moniliales, esclerocio, hifas más grandes a 5 um en diámetro, rápida tasa de crecimiento y patogenicidad están usualmente presentes. Aunque puedan estar ausentes en algunos aislamientos. Este hongo, parasiticamente no especializado forma escleorcios en el suelo sobrevive por largos periodos de tiempo en ausencia de hospederos, mediante tales estructuras o por medio de hifas de pared gruesa sobre residuos de plantas; al conservar estas características de patógeno no especializado, es un buen competidor saprofítico, puede colonizar muchos sustratos y puede tolerar cambios amplios de ambiente; esta condición le favorece tanto para su supervivencia como para su acción patogénica sobre tejidos juveniles o en stress fisiológico inadecuado (González et al., 1989 ; Contreras et al., 1996). La especie fitopatógena Rhizoctonia solani ocasiona perdidas importantes, en la mayoría de plantas perennes y anuales, incluyendo casi todos los cultivos hortícolas que se desarrollan dentro o sobre el suelo. Entre las enfermedades más comunes causadas por este fitopatógeno está el llamado damping-off o caída de las plántulas, como consecuencia del estrangulamiento y necrosis del tallo a nivel de cuello en plántulas recién emergidas. Produce una reducción Significativa del vigor de las plantas y de la producción de tubérculos en cultivos de papa (Cedeño, 2001). En clavel el marchitamiento lento fungoso causado por una raza de R. solani produce una enfermedad que se caracteriza por la reducción en el crecimiento de la planta y la presencia de tallos y brotes delgados, los cuales se amarillan posteriormente y la planta se marchita y muere. Al hacer un corte del tallo, se observa a nivel vascular una coloración marrón. Para entender la relación que se establece entre patògenos y antagonistas, es necesario realizar estudios “in vivo e “in Vitro “, que permitan por una lado conocer a fondo los aspectos biológicos, bioquímicos y ecológicos de la interacción y por otro lado monitorear la actividad de los microorganismos biocontroladores en campo para enfocar de manera más precisa el control y manejo de la enfermedad. 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 3.1 Formulación del problema El incremento de enfermedades en plantas, causadas por un gran número de hongos fitopatógenos ha obligado a los agricultores a la aplicación de grandes cantidades de fungicidas e insecticidas químicos durante décadas. Este uso plantea una grave amenaza para la salud de los humanos y el medio ambiente, provocando la aparición de organismos resistentes a estos productos. La acción nociva de fungicidas químicos sobre los cultivos agrícolas ha originado entre otros problemas resistencias de plagas y patógenos, contaminación de los suelos y aguas de riego, de los animales y de los mismos seres humanos. 3.2 Justificación La utilización de fungicidas químicos durante décadas para el control de enfermedades en cultivos agrícolas ha hecho inminente la búsqueda de alternativas amigables, que contribuyan a minimizar el impacto negativo sobre el medio ambiente. Este deterioro ambiental en el tiempo ha llevado al hombre a buscar metodologías de control, que contribuyan en la prevención o reducción de los efectos a corto o a mediano plazo de estos compuestos frente al daño ambiental. El desarrollo basado en la conservación, debe proteger la estructura, función y la diversidad biológica de los sistemas naturales agrícolas, buscando mantener un equilibrio y un control de nuestro medio ambiente y los recursos naturales. Uno de estos recursos es el suelo que se constituye en el principal soporte de la agricultura. El manejo biológico y controlado de los cultivos, se presenta como una alternativa ecológica y eficaz frente a los numerosos y crecientes problemas causados por microorganismos patógenos presentes en nuestro agro ecosistema. Los hongos biocontroladores como Trichoderma spp ofrecen buenas posibilidades como antagonista de hongos patógenos de plantas, actuando como hiperparasitos competitivos, de la misma manera debido a su ubicuidad, facilidad de aislamiento y cultivo, crecimiento rápido en gran número de sustratos esta presente en todos los suelos agrícolas; sumado a la resistencia y persistencia de estos hongos en cultivos y cosechas, promueve una continua y progresiva investigación y análisis en estudios de control biológico de enfermedades en plantas. En este contexto el presente trabajo evaluó la capacidad biocontroladora de algunos aislamientos nativos y comerciales de Trichodema spp. Frente al hongo fitopatógeno R. solani bajo condiciones de invernadero. Los resultados del presente estudio permitirán apoyar los programas de manejo integrado de plagas empleando tecnologías limpias y amigables con el medio ambiente. 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo General Evaluar la capacidad antagonista “in vivo” de 6 aislamientos Trichoderma frente al hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani 4.2 Objetivos específicos Confirmar la patogenicidad de un aislamiento de R solani sobre plantas de clavel. Obtener inóculos de 6 aislamientos de Trichoderma y confirmar su viabilidad y pureza Verificar la capacidad antagonista de 6 aislamientos de Trichoderma sobre el fitopatógeno R solani bajo condiciones “in vitro” Evaluar en condiciones de invernadero la capacidad antagonista de 6 aislamientos de Trichoderma sobre el hongo patógeno Rhizoctonia solani. Comparar los resultados obtenidos en las pruebas de antagonismo “in vivo” con resultados obtenidos en condiciones “in vitro” 5. MATERIALES Y METODOS 5.1 Diseño de la investigación: 5.1.1 Ubicación Este proyecto se desarrolló en la estación experimental San Francisco Javier ubicada en la vereda el Mortiño, municipio de Cogua Cundinamarca 61 Km al norte de la ciudad de Bogotá y las instalaciones del laboratorio de Microbiología ambiental y de suelos del Departamento de Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana. 5.1.2 Microorganismos Se utilizó un aislamiento nativo de Trichoderma ( T3 )aislado en trabajo previo el cual fue suministrado por el cepario de micologìa del Departamento de Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana, 4 aislamientos provenientes de suelo de cultivos de flores de la sabana de Bogotá ( Tsp5 Tc1,Tv1,Ti1, y un aislamiento nativo procedente de bosque alto andino, suministrado por la Doctora Amanda Varela del Laboratorio de Ecología Suelos y Hongos Tropicales (LESYHT).del departamento de biología Para las pruebas de antagonismo se evaluaron aislamientos del patógeno Rhizoctonia solani suministrados por el laboratorio de fitopatología del Centro de Investigaciones Agroindustriales (CIAA) de la Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano. Se seleccionò un aislamiento por la capacidad de infectar esquejes de clavel de la variedad Everest. 5.1.3. Material vegetal Para el desarrollo de las pruebas de antagonismo “in vivo” se utilizaron esquejes enraizados de clavel Dianthus caryophyllus suministrados por la compañía América flor. 5.1.4. Elaboración del banco de trabajo de aislamientos de Trichoderma spp Con el fin de determinar la estabilidad de las cepas durante el estudio y el mantenimiento de las condiciones iniciales, se realizó un banco de trabajo a partir de 6 aislamientos de Trichoderma evaluados por Cháves 2004 y que se encuentran conservados a -70oC. A partir de los aislamientos, se realizaron repiques sobre agar papa dextrosa (PDA). De cada uno de los aislamientos se preparó una suspensión con una concentración igual a 108 esporas/ml, en un volumen final de 10ml en PBS. Esta suspensión se utilizó posteriormente como inóculo 10% para la fermentación discontinua de 24-48 horas, 100rpm, y una temperatura de 25OC en caldo papa dextrosa, en un volumen efectivo de trabajo de 50 ml. La evaluación del crecimiento, viabilidad y evaluación de cada una de las cepas, se realizó mediante cultivo en placa, tinción con azul de lactofenol, y microcultivo de acuerdo al método propuesto por Sergey et al., 2000. Guevara y Urcia en 2002 demostraron que se puede realizar la fermentación discontinua, en un Erlenmeyer de 250ml conteniendo caldo papa dextrosa con 10 ml de una suspensión conidial en una concentración de 108conidias/ml. El cultivo se incubó a una temperatura de 28°C por 48 horas con agitación a 100 rpm logrando así un volumen efectivo de trabajo de 50 ml. 5.1.5 Preparación del inoculo de aislamientos de Trichoderma. Para evaluar el crecimiento libre de cada uno de los 6 aislamientos del antagonista, a partir de los aislamientos crecidos en tubos de vidrio de (16X150), se realizó un repique en cajas de PDA hasta obtener un crecimiento radial de 90mm aproximadamente. Posteriormente se tomaron discos de 0.5cm de diámetro de zonas de crecimiento similares y serán sembradas sobre PDA (Cundom, 2003) Para cada cepa de Trichoderma en estudio se tomaron por triplicado datos sobre el crecimiento radial en mm a las 24, 48, 60 y 72h. 5.1.6 Preparación del inóculo de Rhizoctonia solani Para la preparación del inóculo de Rhizoctonia solani se tuvieron en cuenta su crecimiento en agar papa dextrosa durante 7 días. El micelio del hongo se resuspendió en agua destilada esterilizada, hasta obtener 103 UFC/ml en PDA. 5.1.7 Prueba de antagonismo in-vitro Previo al enfrentamiento del patógeno y el antagonista Trichoderma spp, se evaluó el crecimiento libre en el centro de la caja de petri con agar PDA del patógeno Rhizoctonia solani y los seis aislamientos del antagonista Trichoderma spp ( T3, Tsp5, Tv1, Tc1, Ti1, T235 ). Se inoculó por triplicado en cada caso en el centro de la caja de petri. 5.1.8 Elaboración de la prueba de antagonismo Para determinar la capacidad antagonista de los diferentes aislamientos de Trichoderma, sobre el patógeno Rhizoctonia solani, se aplicó un diseño completamente al azar, con tres repeticiones. La unidad experimental correspondió a una caja de Petri con agar PDA. Para las pruebas de enfrentamiento se tomarán discos de 0,5cm de diámetro obtenidos a partir de propágulos del patógeno (crecimiento libre), y se sembraron en la superficie de las cajas de Petri con PDA, a un centímetro del borde de la caja (Cundom, et al., 2003). Este procedimiento se realizó por triplicado. Después de 24 horas de incubación a una temperatura de 28°C el patógeno Rhizoctonia solani fue sembrado a 1cm del borde de la caja pero en posición opuesta un disco de 0,5cm de diámetro del antagonista (Cundom, et al., 2003; Holmes, et al., 2004). 5.2 Evaluación de la capacidad antagonista “in vivo” Esta prueba se llevó a cabo bajo condiciones de invernadero en un sustrato de Cascarilla/Turba 3.1. Se utilizaron los aislamientos Trichoderma T3. TrichodermaTsp5, TrichodermaTc1, TrichodermaTV1, Trichoderma Ti1 y TrichodermaT235. Para evaluar la capacidad antagónica de los 6 aislamientos de Trichoderma se utilizaron esquejes enraizados de clavel. Está prueba se llevó a cabo bajo condiciones de invernadero en materos con Cascarilla/Turba humedecida. Los esquejes fueron inicialmente inoculados por inmersión de las raíces lesionadas levemente en una suspensión de Rhizoctonia solani por 5 minutos. Posteriormente cada uno de los esquejes de clavel infectados con el patógeno, fueron colocados individualmente en materos con la mezcla de cascarilla: turba. Una vez inoculado el patógeno, después de 48 h, se realizó la aplicación al suelo con una suspensión de 108 conidias/ml de cada uno de los aislamientos de Trichoderma spp. (Tabla 1). La concentración de conidias se ajustó utilizando la cámara de Neubauer. Luego de ser inoculado el material vegetal con el patógeno y el sustrato con el antagonista, cada cuatro días se realizaron registros de: altura de la planta, incidencia de la enfermedad (% de plantas vivas), longitud de la raíz, peso seco de la parte aèrea y de raìz, número de hojas, color y apariencia de las plantas. El peso seco total, de la parte aérea y de raíz del material previamente medidio, se determinó mediante secado en un horno sin flujo de aire a 55Oc durante 48 horas. La humedad del suelo fue mantenida en el 60 % de la capacidad de campo, durante todo el ensayo. 5.3 Diseño experimental El ensayo de antagonismo “in Vitro” se realizó por triplicado para cada uno de los tratamientos. El ensayo de antagonismo in vivo se desarrolló empleando esquejes de clavel (Dianthus caryophyllus) La metodología del ensayo se desarrollará con un diseño completamente al azar con 3 repeticiones para cada tratamiento. Cada tratamiento constará de 24 plantas de clavel para cada uno de los 9 tratamientos. Tratamiento nomenclatura Controlador Patógeno 1 T3 Aislamiento nativo (PUJ) R. solani 2 Tsp5 Cultivo de Flores R. solani 3 Tv1 Cultivo de Flores R. solani 4 Tc1 Cultivo de Flores R. solani 5 Ti1 Cultivo de Flores R. solani 6 T-235 Aislamiento nativo ( LESYHT) R. solani Control 7 infecciòn -------------------- R. solani Control 8 Trichoderma Trichoderma Tsp ------------- 9 control Ccto -------------------- ------------ 5.4 VARIABLES DE ESTUDIO Con el fin de evaluar la capacidad antagonista de los 6 aislamientos de Trichoderma frente a R. Solani en plantas de clavel, se tomaron cada 4 dìas registros de: Altura de la planta Longitud parte aérea Longitud raíz Incidencia de la enfermedad (% plantas vivas) Síntomas: Amarillamiento, marchitamiento, necrosis de tejidos. Peso fresco total Peso seco parte aérea Peso seco de raíz Peso seco total Los tratamientos control corresponden a: Control de infección: Plantas con el patógeno Rhizoctonia solani Control de crecimiento: Plantas sin patógeno ni antagonista Control Trichoderma: Plantas con el aislamiento T235 Con los valores obtenidos durante el estudio para las variables medibles se llevó a cabo un análisis de varianza ANOVA y la comparación entre los tratamientos mediante la prueba de tukey, tanto para los análisis “ in Vitro como para los “ in vivo “. ! " % & '" #$ ( La expresión de necrosis (muerte del tejido) sugiere la presencia de metabolitos difusibles y altamente tóxicos de carácter enzimático (Celulasas, Quitinasas y Proteasas) acompañados por otros compuestos encargados de la inhibición del crecimiento como acido harzianico, alamenticinas, peptaiboles, antibióticos, 6-pentil- -pirona, massoilactona, viridina, gliovirina, glisoperinas, acido hepteldico y otros (Benitez, et al., 2004; Harman, et al., 2004; Limón, et al., 2004; Rey, et al., 2000; Cook y Baker, 1983 ; Cundom, 2003),afirman que la velocidad de crecimiento presentadas por las especies de Trichoderma son motivos para la utilización de este microorganismo como antagonista, para el control de fitopatógenos. ) "+ +,!'" ( * AISLAMIENTO 24 HORAS 48 HORAS 72 HORAS T3 TSP5 TV1 TC1 Ti1 T235 15,33 14,00 12,00 11,00 14,33 24,00 56,33 36,33 27,67 30,33 33,67 61,67 62,33 48,67 42,00 40,00 41,00 63,67 ) "+ +,!'" ( * & Estos resultados muestran el alto grado de patogenicidad que puede ejercer este hongo fitopatógeno cuando encuentra acción directa sobre ó sin la eficiente acción biocontroladora por parte de hongos antagonistas ( Figura 13). Barrera et al.,1997, afirman que la aparición de los primero síntomas, se ve influenciado por la agresividad del aislamiento del patógeno. Durante la tercera semana de evaluacion se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos: control de crecimiento. control de infeccion y control con Trichoderma. Las plantas de clavel en el control de crecimiento presentaron un crecimiento a nivel radicular y de la parte aérea progresivo en el tiempo y mayor al control de infeccion (Figura 13I), sin embargo el crecimiento de las plantas fue menor, en comparación con todos los tratamientos de Trichoderma excepto para el tratamiento con Tsp5 ( Figuras 13 y14). - .& $ ( !/ Por otra parte, la acción positiva ejercida por el hongo antagonista, se ve reflejada en el control Trichoderma, donde se observa una mejor apariencia y calidad en los esquejes, así como un mayor crecimiento total, al ser comparada con los controles ( Figuras 13H y 14). A su vez, el control de infeccion presentó los menores niveles de crecimiento, (Figura 13G), amarillamiento y marchitamiento progresivo en los esquejes. Los tratamientos con el aislamiento T3 y el Control Trichoderma, mostraron los mejores resultados en cuanto al crecimiento total y apariencia de las raíces de las plantas evaluadas al final de la tercera semana, si se compara con los demás tratamientos de Trichoderma y controles de crecimiento e infeccion (Figuras 13ª y 13H). Esto confirma además los resultados obtenidos al evaluar el crecimiento libre in vitro donde se observó que los aislamientos T3 y T235 tuvieron un mayor crecimiento y un alto PIM sobre el patógeno R.solani (Tabla 3, Figura 3). 0 & - $ En general todos los tratamientos con Trichoderma, a excepción de Tsp5, muestran una buena apariencia, calidad en los esquejes, un mayor crecimiento aéreo y radicular, así como ausencia de signos o síntomas de la enfermedad por R .solani. Estos resultados confirman los obtenidos en las pruebas de antagonismo in vitro ( Figura 4-5), que demuestran la excelente actividad antagonista ejercida por las especies de Trichoderma sobre el hongo R.solani. Estos son indicativos favorables de la actividad del hongo como promotor del crecimiento y agente antagonista en campo, sobre R.solani en esquejes de clavel variedad Everest. El aumento de vigor observado en las plantas inoculadas con Trichoderma, se ve reflejado en el crecimiento de la parte aérea y radicular en el control con Trichoderma, el cual muestrà un crecimiento de 16,1 cms y 6,1 cms respectivamente, si se compara con los obtenidos con el control con el patógeno el cual mostrò para estas mismas variables, resultados de 15,3 cm y 4,9 cms respectivamente ( Figura 13 -14) ( Anexo 1). Estos resultados coinciden con los descritos por López et al., 1999, el cual establece que Trichoderma produce sustancias estimuladoras del crecimiento y desarrollo de las plantas, que actúan como catalizadores o aceleradores de los tejidos meristemáticos primarios ( los que tienen potencial de formar nuevas raíces) en las partes jóvenes de éstas, acelerando su reproducción celular, logrando que las plantas alcancen un desarrollo más rápido que aquellas plantas que no han sido tratadas con dicho microorganismo. De la misma forma que lo observado al día 15, en el día 19, la patogenicidad del hongo se mantiene en las plantas con los tratamientos Control R. solani y Tsp5. Esto fue evidenciado por una apariencia débil de los esquejes y una menor tasa de crecimiento, además se presentó amarillamiento, marchitamiento progresivo, necrosis de tejidos y muerte en plantas ( Figura 19). Estas observaciones concuerdan con los resultados obtenidos para este tiempo, respecto a la longitud de la parte aérea, ( Figura 10), donde se manifiesta que la acción patógenica sobre el control R.solani y Tsp5 , queda reflejada en el menor valor de crecimiento de los esquejes (Figura 13B-13G ). Los síntomas observados en las plantas de clavel en el día 19, han sido reportados anteriormente por otros investigadores como Garibaldi et al.,1978, quien define que la enfermedad causada por Rhizoctonia solani incluye el marchitamiento lento fungoso que se caracteriza por la reducción en el crecimiento de la planta y la presencia de tallos y brotes delgados, los cuales se amarillan posteriormente, causando que la planta se marchite y muera. En la figura 15 se muestran los efectos de la aplicación de los diferentes aislamientos de Trichoderma sobre el peso fresco de los esquejes de clavel, así como de la acción antagonista ejercida por los diferentes tratamientos frente al hongo fitopatógeno R.solani. Las plantas con el tratamiento T3 y el control con Trichoderma T235 presentaron diferencias significativas 8 p<0.05) con relación al control de infección. - $ Las plantas con el tratamiento T3 y el control con Trichoderma presentaron los mayores valores de longitud de la parte aérea, longitud total y peso fresco total (Figuras 10 y 13 y 15) así como altos valores en cuanto a la longitud radicular (Anexos 1A, 1B y 1C) estos resultados se ven reflejados en esquejes con mejor apariencia y crecimiento, follaje abundante y una mayor biomasa radicular (Figuras 13 y 18). Por otra parte el tratamiento con el aislamiento Tc1, presentó valores significativamente altos para las variables de peso fresco ( Figura 15)(Anexo 1C ). Varios autores han demostrado que la adición de aislamientos específicos de Trichoderma en la rizósfera pueden resultar en promoción de crecimiento en plantas ; Bailey et al., 1998; Bjorkman et al., 1998; Yedidia et al., 1999; Harman, 2000; Naseby et al., 2000; Rojo, et al., 2006). Es interesante anotar que a partir de la tercera semana se observa un crecimiento significativo en la longitud y el peso de las plantas de clavel con el tratamiento TC1, logrando alcanzar niveles similares para los observados en el control Trichoderma y el aislamiento T3 (Figura 15). Al parecer la acción promotora del crecimiento de Tc1 sobre los esquejes de clavel es un poco más lenta en el tiempo, si se compara con las demás cepas de Trichoderma utilizadas, ya que solo a partir de la segunda a tercera semana se evidencia una real actividad de crecimiento de los esquejes de clavel, Estos resultados difieren notablemente de los obtenidos in vitro, donde se estableció que la menor tasa de crecimiento libre de las sps de Trichoderma cultivadas en el tiempo perteneció a la cepa TC1 (Figura 2, Tabla 3). Se confirma lo observado por otros autores (McLeod et al., 1995; Smith et al., 1990) respecto a que la selección previa de antagonistas mediante cultivos duales es útil, pero no garantiza el comportamiento de éstos en invernadero. En la cuarta semana se confirma la capacidad antagonista in vivo en los tratamientos con Trichoderma donde se observó un desarrollo normal de las plantas, con hojas, tallos y raíces saludables (Figura 16). Los esquejes de clavel en los tratamientos T235 y control Trichoderma siguen presentando el mayor índice de crecimiento (Figura 16E-16F), reflejado en mayores valores de peso seco de raíz y parte aérea (Figuras 17,18 ). Yedidia, et al., en 1999, en trabajo con Trichoderma harzianum afirman que esto es debido posiblemente a que Trichoderma penetra y se desarrolla en la epidermis exterior, estimulando el sistema de defensa de la planta por cambios metabólicos. por otra parte, Arora et al. en 1992, afirma que la colonización de raíz por cepas de Trichoderma frecuentemente incrementa el crecimiento de raíz en muchos cultivos de plantas bajo condiciones de invernadero. " & Vale la pena resaltar que entre los días 19 y 23, se encuentran los resultados de mayor relevancia respecto al aumento en el crecimiento. Se observa que para los tratamientos Control Trichoderma, T3 y T235, se encontraron aumentos cercanos al 43%, 40% y 39% respectivamente (Anexo 1C), mucho mayores al encontrado en el control del patógeno que mostró un rendimiento negativo a nivel de crecimiento para este tiempo. Estos resultados son concordantes a los encontrados para la variable de peso fresco, que mostraron aumentos de 35,7%, 32% y 34% para el control con Trichoderma, T3 Y T235 respectivamente. Por otra parte los resultados obtenidos para peso fresco en el Control de crecimiento y control R.solani 20% y 11.7% respectivamente, fueron mucho menores a los encontrados en los aislamientos con el hongo de Trichoderma. Estos resultados confirman aún más la acción promotora del crecimiento vegetal en esquejes de clavel por parte de las diferentes aislamientos de Trichoderma, así como el efecto antagonista ejercido por el hongo, sobre el fitopatógeno R .solani. Benitez et al., 2004; Sunil et al., 2005, determinan que la productividad de cultivos en campo puede incrementarse cerca del 300% después de la adición de Trichoderma hamatum o Trichoderma koningii. - $ El peso seco de la parte aérea y de las raíces de las plantas inoculadas con Tc1 y el control con Trichoderma, se diferenció claramente de las inoculadas sólo con el patógeno, observándose un desarrollo significativo de raíces y parte aérea en presencia de estos tratamientos( Figuras 17-18) ( Anexo 1,Tabla 1E1F). Harman et al., en 1998, determina que la promoción del crecimiento vegetal por parte de Trichoderma se manifiesta como una potenciación de la germinación de las semillas, una floración más abundante y temprana y aumentos de altura y peso de las plantas ( Vhang y Baker, et al.,1986). Por otra parte el Control con R.solani evidenció la presencia activa del patógeno sobre la base del tallo, asi como procesos de amarillamiento, marchitamiento y valores de mortalidad alta sobre los esquejes de clavel ( Figura 19-21). - & # $ En los tratamientos con el control con Trichoderma, asi como con los aislamientos T3 Y T235 se obtuvo una mayor respuesta en cuanto a niveles de crecimiento de la parte aérea y radicular de los esquejes de clavel, comparado con el control de crecimiento y con el control de infecciòn ( Figura 9 ) ( Figura 23). Se pudo evidenciar entonces, el alto grado de biocontrol ejercido por parte de las cepas de Trichoderma sobre el hongo R. solani, excepto el aislamiento Tsp5. Esto se confirmò por la apariencia saludable de las plantas, ausencia de síntomas de la enfermedad y valores superiores de las variables de longitud de la parte aérea y peso evaluadas, con relación a los tratamientos control de crecimiento y control de infección hacia el dìa 23 del ensayo. Algunos autores han demostrado el efecto inductor en el crecimiento y desarrollo de las plantas por parte de Trichoderma spp., es así como Yossen et al.,en 2003 demostraron que al incorporar T. harzianum (TL 98) en germinadores de lechuga, además de reducir el daño causado por R. solani, el antagonista promovió el crecimiento de las plantas. Igualmente Inbar et al., en 1994., observaron que aplicando T. harzianum en semilleros de pepino y de pimentón se incrementó significativamente el crecimiento de las plántulas, comparadas con aquellas que no recibieron la adición del hongo antagonista. Estos trabajos muestran el beneficio de aplicar hongos, como Trichoderma, para obtener plantas vigorosas y sanas ( Castro 2005). . ( La apariencia y calidad de los esquejes, síntomas visibles de amarillamiento, y marchitamiento, así como tejidos necrosados, la disminución en la calidad y cantidad de las raíces y muerte en los esquejes de clavel (Figura 19- 21), confirma la actividad del hongo fitopatógeno , durante los ensayos en invernadero, para los tratamientos con el control R.solani (Figura 19 A y B) y el Tratamiento con el aislamiento Tsp5 ( Figura 19 CyD). Benitez et al., 2004, establece que las cepas de Trichoderma pueden colonizar raíces de plantas en crecimiento y proteger contra infecciones. La colonización implica la habilidad para adherirse y reconocer raíces de plantas, penetrar la planta y resistir metabolitos tóxicos producidos por las plantas en respuesta a la invasión de organismos extraños, sean o no patógenos. - $ Se pudo determinar que las plantas con mayor peso seco fueron aquellas que crecieron en los diferentes aislamientos con Trichoderma, especialmente con el control de Trichoderma y T235 (Figura 20) ( Anexo 1G). Ahora bien, La evaluación del nivel de daño radical, mostró que este fue menor en presencia de los tratamientos con el hongo antagonista, que en el tratamiento con el control de infecciòn (Figura 20-22). Un ensayo realizado sobre pasto Estrella demostró que la ganancia en peso seco con algunos aislamientos de Trichoderma es cercana al 23%, en longitud de las raíces y de estolones este incremento fue de un 30% ( www.infojardin.com/foro/showthread.php). ! ' )% # " # $ % & % ' ##(% La buena actividad biocontroladora ejercida por parte del hongo Trichoderma sobre el fitopatògeno R. solani (Figura 21, 24), quedó demostrado con la ausencia de sìngos y síntomas de la enfermedad, asi como la baja incidencia de muerte de los esquejes bajo la acción de las diferentes especies de Trichoderma a través del tiempo, a excepción de Tsp5, que a lo largo del ensayo demostró una baja acción antagonsita sobre R .solani ( Figura 19C,19D- 21). Tal y como lo establece Meera et al ., en 1994, quien determina que la acción de biocontrol ejercida por el hongo antagonista, puede ser debido a que muchas cepas de Trichoderma son capaces de inducir resistencia sistémica de plantas, ya que aplicadas en la rizosfera producen protección contra patógenos del suelo o foliares. No obstante al excelente antagonismo ejercido por Trichoderma, se pudo determinar una clara actividad patogènica del hongo R. solani en los esquejes de clavel, cuando este se aplico como tratamiento control ( Figura 19A,19B21). Castro y Osorio en 2005, demostraron el efecto antagónico de Trichoderma sobre R. solani en semilleros de café, obteniendo una reducción de 55% en la incidencia de la enfermedad cuando inocularon el sustrato con el hongo antagonista (T1664). Es interesante notar que los resultados obtenidos durante la experiencia para el desarrollo radicular de los esquejes de clavel muestran que existió una actividad directa de Trichoderma como promotor del crecimiento vegetal en los esquejes de clavel y del aumento de la zona rizosfèrica ( Figura 22-23-24). La habilidad de cepas de Trichoderma para proteger plantas contra patógenos de raíces esta siendo atribuido a su efecto antagónico contra patógenos invasivos, Sin embargo esta asociación hongo-raíz además estimula mecanismos de defensa en plantas. ( Benitez., et al 2004) T3 Tv1 Control Trichoderma TSP5 Ti1 Control R. solani Tc1 T235 Control de crecimiento Figura 22 Apariencia de las raíces en los diferentes tratamientos. De igual manera se observò que los tratamientos con el aislamiento T235 y el control Trichoderma ( Figuras 22E, 22G y 23) mostraron los mayores valores de longitud de raìz, además de una excelente apariencia de sus raíces. Así mismo el tratamiento Tc1 mostro valores significativos a nivel radicular durante las ultimas dos semanas de evaluacion. El mayor tamaño de raíces influye de manera directa en el crecimiento aéreo de la planta, tal y como quedo en el crecimiento de los esquejes con el control de Trichoderma demostrado en diferencias mayores al 25% respecto al control de crecimiento y del 75% aproximadamente para el control con R. solani (Figuras 22C,D y E y Figura 23) - # $ Benitez et al., 2004 en estudios con Trichoderma demostraron que la colonización de raíces por este hongo frecuentemente incrementa el crecimiento y desarrollo de raíces, productividad de cultivos, resistencia a estrés abióticos y la toma y uso de nutrientes. De igual forma Bjorkman et al., en 1998 estableció una hipótesis en la que propone que Trichoderma es capaz de limitar el efecto del daño oxidativo en la raíz. Para el dia 27 despuès de la aplicación del antagonista se confirmó el efecto ejercido por Trichoderma como promotor del crecimiento vegetal en plantas y antagonista del hongo fitopatogeno R .solani ( Figura 24). Se observa una excelente apariencia y calidad de los esquejes, así como un gran desarrollo de la parte aérea y radicular. Por otra parte para la última semana se hace mas evidente la acción patogénica de R. solani, sobre las plantas, evidenciado por el aumento en el número de marchitamientos y necrosamiento de tejidos, así como la muerte de esquejes ( Figura 19 y 21). No obstante estos síntomas estuvieron ausentes durante el desarrollo del ensayo en las plantas bajo la acción del hongo Trichoderma, a excepción del aislamiento Tsp5 "' & . Benitez et al., 2004, Yedidia et al., 2000 establecen que el rápido desarrollo y colonización de Trichoderma de las zonas adecuadas para la infección, como áreas de necrosis, heridas o partes concretas de la planta, impiden físicamente el acceso y establecimiento del patógeno en su hospedador. Es claro que a pesar de la inoculación del hongo patógeno Rhizoctonia solani sobre los esquejes de clavel, el antagonista ejerció un biocontrol efectivo sobre el hongo fitopatógeno en condiciones de invernadero a lo largo del la investigación. Se encontrò que el tratamiento con el control con Trichoderma, mostró los mejores resultados respecto a crecimiento de la parte aérea y radicular (Figura 22)(Anexos1A-1B), evidenciado por un mayor crecimiento y un aumento en el crecimiento total de cerca del 46% respecto al control de crecimiento ( Figura 14) ( Anexo 1C); de igual manera reflejados en las mayores rendimientos en peso fresco y peso seco total frente a los controles del patógeno y de crecimiento ( Figura 15 y 20). Por otra se pudo confirmar que los mejores resultados en todas las variables evaluadas se obtuvieron en los aislamientos de Trichoderma ( T235 y T3). Estos resultados son consistentes con los obtenidos en los estudios in vitro ( Figura 2) ( Tabla 3), que demostraron que los aislamientos T235 y T3 presentaron las más altas tasas de crecimiento libre en el tiempo, del mismo modo el aislamiento T235 presentó el mayor PIM en las pruebas de antagonismo in vitro frente al hongo fitopatogeno R .solani. Vale la pena resaltar que el aislamiento con Tc1 mostró una buena actividad bajo condiciones de invernadero a partir de la segunda semana, convirtiéndose junto al control con Trichoderma, T235 y el T3 en los mejores aislamientos. No obstante a los buenos resultados obtenidos en campo para el aislamiento Tc1, estos difieren notablemente a los desarrollados in vitro ( Figura 2) ( Tabla 3), donde Tc1 mostrò los menores valores de crecimiento libre en el tiempo. Estos resultados confirman lo dicho por Macleod, quien establece que los resultados in vitro de especies de Trichoderma no garantiza plenamente su actividad y antagonismo sobre hongos fitopatógenos en condiciones de campo o invernadero. Por otra parte se puede inferir que el que el tratamiento Tsp5 no ejerció un biocontrol efectivo en esquejes de clavel para el control de enfermedades ocasionadas por el hongo fitopatógeno R. solani ( Figura 19,21); Siendo Tsp5 un hongo utilizado en cultivos de flores en la sabana de Bogotá, debería ejercer una acción efectiva sobre el fitopatógeno en cultivos de clavel, situación por la cual es evidente buscar alternativas tendientes a mejores rendimientos en pro del control de organismos fitopatógenos tales como R. solani, y que pudieran encontrar solución en el aislamiento nativo T235, el cual mostró los resultados más relevantes para el control del hongo patógeno en condiciones de invernadero y en la promoción del crecimiento vegetal en esquejes de clavel variedad Everest. Los resultados demuestran, la actividad antagonista diferencial de los aislamientos de Trichoderma estudiados frente a la acción patog`+enica ejercida por el hongo fitopatògeno R. solani, y su acciòn en la promoción en el crecimiento vegetal en esquejes de clavel variedad Everest . En este trabajo de investigación se demostró que 5 de los 6 aislamientos de Trichoderma aplicados en la rizòsfera de esquejes de clavel de la variedad Everest en condiciones de invernadero ejercen una buena acción antagonista frente al fitopatògeno R. solani. Los aislamientos (Control Trichoderma, T3 y T235) además de mostrar una excelente capacidad de biocontrol, confirmaron los mayores valores en cuanto a todas las variables evaluadas en el ensayo, asi como la mejor apariencia de las plantas comparada con los controles. Estos resultados corroboran los obtenidos por varios autores con relación a la habilidad de Trichoderma para promover el crecimiento vegetal. CONCLUSIONES Se logró evaluar la capacidad antagonista in vitro de seis aislamientos de Trichoderma frente al fitopatógeno Rhizoctonia solana. Donde el aislamiento nativo T235 mostró los mayores valores de crecimiento libre y porcentaje de inhibición micelial ( PIM). Bajo las condiciones evaluadas, los aislamientos control Trichoderma, asi como T235 y T3 pueden ser considerados los de mayor importancia en la promoción del crecimiento vegetal y en pro del control biològico del hongo fitopatógeno R .solani y la reducción de los síntomas de la enfermedad en esquejes de clavel variedad Everest en condiciones de invernadero. Los resultados obtenidos en condiciones de invernadero fueron consistentes a los obtenidos en condiciones in vitro para los aislamientos que demostraron tener una mayor tasas de crecimiento y un mayor PIM, tal y como quedo demostrado con los aislamientos T235 Y T3. Los resultados presentados a través de la presente investigación sugieren que la utilización de especies de Trichoderma para el control de R. solani en esquejes de clavel es una estrategia promisoria para el manejo de las enfermedades en condiciones de invernadero. Esta afirmación esta soportada por el factor de que todos los aislamientos de Trichoderma spp evaluados, a excepción de Tsp5, redujeron la severidad de la enfermedad en plantas. Tales reducciones fueron evidentes debido al bajo número de plantas afectadas por R. solani cuando se enfrentaron al hongo Trichoderma y a la baja aparición de signos y síntomas de la enfermedad sobre los esquejes de clavel evaluados. RECOMENDACIONES Para futuros estudios seria indicado la utilización de un mayor número de especies de Trichoderma en esquejes de clavel en condiciones de invernadero. Serìa importante el uso de camas de enraizamiento para el desarrollo de futuros estudios con especies de Trichoderma para el control biológico de hongos fitopatógenos, con el fin de asegurar la confiiablidad de la investigación. Uno de los objetivos a futuro será el de combinar bacterias y hongos antagonistas como una alternativa promisoria en el control biológico, de patógenos con alta versatilidad ecológica en condiciones de invernadero, tal y como es el caso de Rhizctonia solani.. Las grandes posibilidades de uso del microorganismo en el control de enfermedades en cultivos hortícolas, estimula las investigaciones al respecto. Sin embargo orienta a la selección de un mayor número de especies de Trichoderma o de lineas más eficientes de los organismos antagónicos; además de la alteración del medio ambiente de manera que el, o los antagonistas resulten favorecidos; el aprovechamiento de las sustancias antibióticas que producen y la aplicación precisa de ellos de acuerdo al ciclo de la enfermedad del fitopatógeno que se desea controlar son variables de importancia para la mayor efectividad y confiabilidad de las especies de Trichoderma investigadas. Realizar pruebas entre las especies del hongo Trichoderma con otros fitopatógenos de importancia interacciones y antagonismos. agrícola, para identificar las posibles ANEXOS ANEXO 1 !" " # " !" $" % !" " # " !" $" % !" " # " !" $" % !" " # " ' !" # ( !" $" % !" " # " & & & & & & & & & ' !" # ( ) ( " # " ' !" # ( ) ( " # " & & & & & & & & & ANEXO 2 ! " " " ! " " " ! " ! ! ANEXO 3. ANALISIS ESTADISTICO ANALISIS DE VARIANZA PARA LAS VARIABLES DE CRECIMIENTO !" # ,$ ) &! -! %!&'!!$( * &+ $( )" )" ,$ /0 * &+ $( )" )" ,$ &&. * &+ $( )" )" !" "!1 &! ! ! * &+ $( )" )" %!&'!!$( * &+ $( )" )" %!&'!!$( * &+ $( &. # #" # ! # "# # # "" # #! $%" # $%" #! $%" # !" $%" # ! # " # #! $%" # # ! !$%" # " # " #! $%" # $%" #! $%" # !" $%" # ! # " # $%" &. !" "!1 &&. # "! # " # &. !" 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Jonh Wiley y sons Inc USA. Altomare, C., Börkman, T., Norvell, W. y Harman, G. 2002. Solubilidad del dióxido de manganeso por el hongo Trichoderma harzianum. Relación de Trichoderma sp. con plantas superiores. [En línea]. Universidad de Cornell, Estados Unidos. Arora, D.K., Elander, R.P., Mukerji, K.G., 1992. Handbook of applied Mycology: Fungal Biotechnology. Marcel Dekker, New York, pp.4:697. Bailey, B.A., Lumsden, R.D., 1998. Directs effects of Trichoderma and Gliocladium on plant growth and resistence of pathogens. In Harman,G.E., Kubicek, C.P. (Eds), Trichoderma and Gliocladium: Enzymes, Biological control and comercial Applications. Taylor y Francis, London, pp. 185-204. Baker, R. 1988. Trichoderma spp. As plant growth stimulants. CRC Critical Reviews 7: 97-106. Bjorkman, T., Blanchard, L.M., Harman, G.E., 1998. Growth enhancement of shrunken-2 ( sh2) sweet corn by Trichoderma harzianum 1295-22: effect of environmental stress. J. Am.soc.Hort.Sci. 123,35-40. Baldarrago, L. 1999. Comportamientos y Rendimientos de tres cultivares de Fresa Fragaria x ananassa Duch en la región Arequipa. Tesis UNSA. ArequipaPerú. Barrera. A, S. Gòmez y G. Arbelàez. 1997. Determinaciòn de razas fisiológicas de Fusarium oxisporum f.sp.dianthi en ocho fincas del grupo chia cultivadoras de clavel, localizadas en la sabana de Bogotà. Fitopatologìa Colombiana; 21:53-59. Barnett, H. Hunter ,B. 1982 . Ilustrated genera of imperfect fungi. Third edition. Burgess publishing. Mineapolis, Minesota. USA 241 pp. Benítez T, Rincón A.M., Limón M.C., and Codón A. 2004. Biocontrol mechanism of Trichoderma strains. International Microbiology. 7: 249-260. Berlinger, M.J., Jarvis, W.R., Jewett, T.J. & Lebiush-Mordechi, S.1999. Managing the greenhouse, crop and crop environment for IPM, in Integrated Pest and Disease Management in Greenhouse Crops pp. 97-123. Benitez T, Delgado J, Rincón A, Rey M, and Limón MC.1998. Biofungicides: Trichoderma as a biocontrol agent against phytopathogenic fungi. In: Pandalai SG ( ed) Recent research developments in microbiology, vol. 2. Research Signpost, Trivandrum, pp 129-150. Benítez T, Rincón A.M., Limón M.C. and Codón A. 2004. Biocontrol mechanism of Trichoderma strains. International Microbiology. 7: 249-260. Camargo, H. 2005. Evaluación en campo de la incidencia de Rhizoctonia solani en arroz (Oriza satriva) , luego de la inoculación en semilla de un formulado comercial a base del antagonista Trichoderma harzianum. Cardoso, J.E., Echando, E. 1987. Biological control of Rhizoctonia root roto f snap bean with binucleate Rhizoctonia-like fungi. Plant disease 71 ( 2 ) :167170. Castro, M. Osorio, C. 2005. Bioregulaciòn de Rhizoctonia solani en germinadores de Cafè. Boletìn CENICAFE. Avance Tècnico No 336. Castro, A.M, Rivillas.C.A.. Bioregulación de Rhizoctonia solani en germinadores de Café. Boletín CENICAFÉ Avance Técnico N° 336 de 2.005. Cedeño, L., Carrero, C., Quintero, K., Araujo, Y., Pino, H y Garcia R. 2001. Identificación y virulencia de grupos de anastomosis de Rhizoctonia solani kühn asociados con papa en Mérida, Venezuela Inci v.26 n 7 Caracas. Ceresini , P. 1999. Rhizoctonia spp pathogen Profile. Soilborne plant pathogens offered on spring R. solani on page. http: // www.cals.ncsu.edu/course/pp720/Rhizoctonia/Rhizoctonia Chang, Y.C., R. Baker, O. Kleifeld and I. Chet. 1986. Incresead growth of plants in the presence of the biological control agent Trichoderma harzianum. Plant disease 70:145-148. Chávez, D 2004. Caracterización molecular de especies de Trichoderma. Trabajo de grado, Microbiología Agrícola y Veterinaria 57 pp. Chávez, M.P. 2006. Producción de Trichoderma sp y Evaluación de su efecto en cultivo de Crisantemo ( Dendranthema grandiflora ).Trabajo de grado, microbiología industrial. Chet, I. 1987. Trichoderma – aplication mode of action, and potencial as biocontrol agent of soilborne plant pathogenic fungi. Pp: 137-160. En I. chet, ed. Innovative approaches to plant disease control, New York. Chet, I and Baker R.1980. Induction of supressivenes to Rhizoctonia solani in soil. Phytopathology 70:994-998 Chet, I. and R. Baker. 1981 Isolation and biocontrol potential of Trichoderma hamatum from soil naturally suppressive to Rhizoctonia solani. Phytopathology 71: 286-290.. Chet I, Inbar J, Hadar I, et al 1997.Fungal antagonists and mycoparasites.In: Wicklow DT, Söderström B (Eds) The Mycota IV: Environmental and microbial relationships. Springer-Verlag, Berlin, pp 165-184. Cook, R.J. and R. Baker 1983. The nature and practice of biological control of plant pathogens. American Phytopathological Society. St. Paul, Minnesota. Cumdom M., Mazza S., Gutiérrez S., and Mazzanti M. 2003. Evaluación de Trichoderma sp. contra Rhizoctonia solani in vitro e invernáculo. http://www.unne.edu.ar/cyt/2001/5-Agrarias/A-051.pdf. Eisendle M, Oberegger H, Buttinger R, Illmer P and Haas H. 2004. Biosynthesis and uptake of siderophores is controlled by the PacCmediated ambient-pH regulatory system in Aspergillus nidulans. Euk Cell 3:561-563. Elad, Y., Chet, I. and Katan, J. 1980. Trichoderma harzianum: A Biocontrol Agent Effective Against Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani. Phytopathology 70 (2): 119-121. Elad, Y., Chet, I. and Henis. 1981.A selective medium improving quantitive isolation of Trichoderma spp from soils. Phytoparasitica 9:59-67. Elad, Y., Chet, I. 1982. Degradation of plant pathogenic fungy by Trichoderma harzianum, Canadian Journal of microbiology 28: 719-725. Elad, Y., Shtienberg, D. & Niv, A. 1994. Trichoderma harzianum T39 integrated with fungicides: Improved biocontrol of grey mould, pp. 1109-1113. Elad, Y. 2000. Biological control of foliar pathogens by means of Trichoderma harzianum and potential modes of action.Crop Protection 19 ; 709-714. García S.L; Camargo S. 1998. Hongos fitopatógenos del clavel, México. Garibaldi, A. 1978, Fungal and bacterial diseases of Carnation and gerebera. Proceedings of the eurcapia meeting on Carnation and gerbera. Alassio: 69-88. González, I. 1989. Introducción a la Fitopatología, Servicio editorial UCA, San José de Costa rica. Gonzalez C.H. 1998. Efecto de la aplicación de Trichodeerma harzianum sobre la composición cuantitativa de bacterias, hongos y actinomicetos de la rizósfera de solanáceas y sui influencia en el crecimiento vegetativo. Instituto de investigaciones agropecuarias. Cuba ( 23): 59-65. Guevara M., y Urcia F. 2002. Eficacia de medios de cultivo con infusiones de variedades de papa en la identificación de Tricophyton rubrum. Rev. Salud publica 19 (2). Gutiérrez B. González M y Salih L. 2006. Caracterización de aislamientos de Rhizoctonia solani kuhn que inducen pudriciones radicales en cultivares de Caraota ( Phaseolus vulgaris L ). Bioagro 18 (1): 64.72. Hadar;Y.I. Chet an Y. Henis. 1978. Biolgical control of Rhizoctonia solani damping of with wheat bran culture of Trichoderma harzianum. Phytopathology 69: 64-68. Harman, G.E., 2000. Myths and dogmas of biocontrol : changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T-22. Plant Dis. 84, 377-393 Harman GE, Howell CR, Viterbo A, Chet I, Lorito M. 2004.Trichoderma speciesopportunistic, avirulent plant symbionts. Nature Reviews 2:43-56. Hermosa, M., Grondona, I., Turriaga, E., Díaz-Minguez, J., Castro, C., Monte, E. and García-Acha, I. 2000. Molecular Characterization and Identification of Biocontrol Isolates of Trichoderma spp. App. Env. Microb. 65 (5): 1890-1898. Hjeljord, L., and A. Tronsmo. 1998. Trichoderma and Gliocladium in biocontrol: an overview, . In C. P. p. 135–151. Howell CR. 1998. The role of antibiosis in biocontrol. In: Harman GE, Kubicek CP. Trichoderma y Gliocladium, vol. 2. Taylor & Francis, Padstow, pp 173-184. Howell CR et al 2003. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts. Plant Dis 87:4-10. Inbar, J., Abramsky, M., Cohen, D., Chet, I. 1994. Plant growth enhancement and disease control by Trichoderma harzianum in vegetable seedlings grown under comercial conditions. European Journal of plant Pathology 100:337-346. Lewis, J. Barkadale, T. Papavizas, G. 1990. Greenhouse and field studies on the biological control of tomato fruit rot caused by Rhizoctonia solani. Crop Prot; 9:8-14. Lewis, J.A. and Papavizas, G.C. 1987. Reduction of inoculum of Rhizoctonia solani in soil by germlings of Trichoderma hamatum. Soil biochem. Vol 19, no 2 pp. 195-201. Limón MC., Chacón MR., Mejías R., Delgado-Jarana J., Rincón AM., Codón AC., Benítez T. 2004. Increased antifungal and chitinase specific activities of Trichoderma harzianum CECT 2413 by addition of a cellulose binding-domain. Appl Microbiol Biotechnol 64:675-685. Liu, S.B. and R. Baker. Mechanism of biological control in soil suppressive to Rhizoctonia solani. Phytopathology 70: 404-412. 1980. Lopez, H; Perez, M; Llobel, A; Vazquez, M;Bonillas, Z. 1999. Estudios in vivo de Trichoderma como agente de biocontrol contra Phytophtora cinamomi y Rosellinia necatrix en aguacate. Revista Chapingo serie Horticultura. 5: 261265. Mcleod,A; Labuschagne, N; y Kotzé, J.M. 1995. Evaluation of Trichoderma for biological control of avocado roo trot in bark médium artificially infested with Phytophtora cinamomi. South African Avocado Growers Association Yearbook 18:32-37. Marquez, M. 2001. Aislamiento de Trichoderma hamatum y Actinomycetes de la Rizósfera de Clavel (Dianthus cariophyllus) y Evaluación de su Capacidad Antagónica sobre Fusarium oxysporum f. sp dianthi. Tesis de pregrado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Bogotá, Colombia. Mora, B. 2005. Epidemiologìa y manejo de la mustia hilachosa del frìjol común cuasado por Rhizoctonia solani. Programa de Frìjol, Ministerio de agricultura y ganadería, San jose, Costa rica. Pag 1-6. Naseby, D.C., Pascual, J.A., Lynch, J.M., 2000. Effect of biocontrol strains of Trichoderma on planth growth, Phythium ultimum populations, soil microbial communities and soil enzyme activies. J. Appl.Microbiol. 88, 161-169. Ochoa, J.M. 1996. Control biológico del marchitamiento Vascular del clavel ocasionado por Fusarium oxisporum f.sp.dianthi mediante el uso de microorganismos potencialmente antagonistas Pseudomonas fluorescens, Streptomyces coelicolor y Trichoderma hamatum. Santafé de bogotá. Trabajo de grado ( Biólogo ) Universidad Javeriana facultad de Ciencias, departamento de Biología. Papavizas, G.C., Lumdsen, R.D., 1982. Improved medium for isolation of Trichoderma spp, from soils. Plant dis. 66,1019-1020. Papavizas, G. C., M. T. Dunn, J. A. Lewis, and J. Beagle-Ristaino. 1984. Liquid fermentation technology for experimental production of biocontrol fungi. Phytopathology 74:1171-1175. Papavizas, G.C. 1985. Trichoderma and gliocladium: biology, ecology, and potential for biocontrol. Annual review of phytopathology 23,23-54. Prieto, L. 2003. Caracterización molécular preliminar de aislamientos de Trichoderma sp .Tesis de pregrado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Bogotá, Colombia. XX páginas. Rey M., Delgado-Jarana J., Rincón A., Limón C. and Benítez T. 2000. Mejora de cepas de Trichoderma para su empleo como biofungicidas. Rev Iberoam Micol 17:31-36. Riegel, D. ; Nielsen. G. 1996 Trichoderma spp. As plant growth stimulants. CRC. Crititcal rewies in biotechnology 7 ( 2 ) : 97-106. Rincón, A.A., J. Leguizamón y G. Arbelaez. 1992. Control biológico de Rhizoctonia solani con Trichoderma spp. En semilleros de café. Cenicafe 43: 73-383. Rincón G., A. A. 1991.Control biológico del volcamiento Rhizoctonia solani Kunh en semilleros de café con varios aislamientos de Trichoderma spp. Bogotá, Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Agronomía. 101 p. (Tesis: Ingeniero Agrónomo). Rodríguez., V.J. 2002. Efecto antagónico y biocontrolador de algunos microorganismos saprofíticos contra Rhizctonia solani, un fitopatógeno causante del ( damping off ) en plántulas de Tomate. Tesis, Universidad Nacional mayor de San Marcos, Perú. Rojo, F. Reynoso, M. Ferez, M. Chulze, S. Torres, A. 2006. Biological control by Trichoderma species of Fusarium solani causing peanut Brown root rot under field conditions.26: 548-554 Schwartz, H. y Galvez, G. 1980. Problemas de producción del frìjol: enefermedades, insectos, limitaciones edàficas y climáticas de Phaseoulus vulgaris. CIAT. Cali, Colombia. 422 p. Sepulveda, H., Nuñez, L., Lopez, P 2000. Efecto de diferentes niveles de humedad en el suelo sobre el desarrollo del carbón de la papa (Angiosporum solani) en dos variedades de papa ( Solanum tuberosum) bajo condiciones de invernadero. Agricultura técnica Vol 60, No 4, pag 313-319. Silverio, M. 1987. Introducción a la Microbiología del suelo. Prentice Hall. México. Silvya, M., Fuhrmann, J., Hartel, P., and Zuberer, D. 1998. aplications of soil Microbiology. Prentice Hall. USA. Principles and Singh. A. S. Srivastava, H. Singh 2007. Efect of substrates on growth and shelf life of Trichoderma harzianum and its use in biocontrol of diseases. Bioresource Technology 98: 470–473 Sivan, A., Elad, Y. and Chet, I. 1984. Biological control effects of a new isolate of Trichoderma harzianum on Pythium aphanidermatum. Phytopathology 74:498-501 Sivan, A., Elad, Y. and Chet, I. 1987. Biological control of Fusarium crown rot of tomato by trichoderma harzianum under field conditions. Plant diseases 1987; 71:587-59. Sneh, B. Burpee, L. and Ogoshi, A.1991. Identification of Rhizoctonia species APS press. USA Sunil, D. Suresh, M. Singh, B. 2006.121-127.Evaluation of Trichoderma species against Fusarium oxisporum f.sp .ciceris for integratef managment of chickpea wilt. Velez, A., Posada F., Marin, M., Gozalez, G., Osorio, V. y Bustillo, P.1997. Técnicas para el control de calidad de formulaciones hongos entomopatógenos. Boletín técnico CENICAFE.N. 17:1-34. Colombia. Villegas M, 2005. Trichoderma pers. Caracteristicas generales y su potencial biológico en la agricultura sostenible, 4: 1-20, Vyas SC, Vyas S Lyr H. Integrated control of dry root of soybean. In: Modern fungicides and antifungal compounds. Intercept, Andover, pp 565-572. Windham, M.T..,Y.Elad and R. Baker 1986. A mechanism for incresead plant growth induced by Trichoderma spp Phytopathology 76:518-521.. Y. Elad. 2000.Trichoderma harzianum T39 Preparation for Biocontrol of Plant Diseases Control of Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum and Cladosporium fulvum Pag 7-9. . Yedidia, I.; Benhamou, N.; Chet, I. 1999. Induction of defense responses in cucumber plants ( Cucumis sativus L ) by the control agent Trichoderma harzianum. Applied and environmental microbiology. 65( 3 ) 1061-1070. Yeididia, I., Benhamou, N., Kapulnik, Y., Chet, I., 2000. Induction and accumulation of PR proteins activity during early stages of root colonization by the mycoparasite Trcihoderma harzianum strain T-203. Plant Physiol. Biochem. 38, 863-873. Yossen, V., Vargas, G.S., Diaz, M. del P., Olmos, C. 2003. Material compostado y Trichoderma harzianum como supresores de Rhizoctonia solani y pormotores del crecimientos de lechuga. Manjero integrado de plagas y Agroecologìa No 68:19-25.2003. Yossen, V.; Vargas, G. S.; Díaz, M. Del P.; Olmos, C. Material compostado y Trichoderma harzianum como supresores de Rhizoctonia solani y promotores del crecimiento de lechuga. Manejo Integrado de Plagas y Agroecología N° 68: 19-25. 2003 Wainwright M. 1995. Introducción a la biotecnología de los hongos. España. 225pp: 174-176. Zimand, G., Y. Elad., and I. Chet. 1996. Effect of Trichoderma harzianum on Botrytis cinerea pathogenicity. Phytopathology 86:1225–1260. Ayudas electrónicas. www.soil-fertility.com/trichoderma/espagnol/index.shtml (www.soil-fertility.com/trichoderma). (www.infojardin.com/foro/showthread.php www.infojardin.com/foro/showthread.php.