Download 8 – C Barrera – Estrategia Detección de Virus

ESTRATEGIAS PARA LA DETECCÍON Y DIAGNOSIS
DE VIRUS EN PLATANOS Y BANANOS EN LA
COMUNIDAD ANDINA DE NACIONES
CIRO BARRERA
Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA)
PERÚ
Piura, Junio 2011
INTRODUCCION
Campos comerciales
Plantones de Banano
Forma tradicional de la propagación e
instalación de plantaciones a partir de
campos comerciales.
Síntomas de CMV en follaje
Efecto del Virus BSV
Otras síntomas de CMV
Efecto del Virus BBTV
BBrMV (Banana Bract Mosaic Virus)
Virus del Mosaico de la Bràctea
400 nm
BBTV (Banana Bunchy Top Virus)
Virus del Cogollo racimosos del Banano
Virus del Arrosetamiento del Banano
100 nm
Descarte
Altos porcentajes de descarte por
no alcanzar calibres requerido
para exportación.
Objetivo General
• Establecer las bases para la unificación y
fortalecimiento del sistema de protección
fitosanitaria en la Comunidad Andina
(CAN) implementando un caso modelo de
trabajo en el aspecto de detección y
control de virus de importancia económica
en la cadena productiva de Musáceas
(Banano y Plátano) de países de la CAN
Objetivo Específico
• Implementar los laboratorios del ICA,
SENASA e INIA con tecnologías y
metodologías modernas para la
identificación, detección y diagnosis de
los virus más importantes que afectan al
banano y plátano Banana Streak Virus
(BSV), Cucumber Mosaic Virus (CMV),
Banana Bunchy Top Virus (BBTV),
Banana Brack Mosaic Virus (BBrMV),
Banana Mild Mosaic Virus (BanMMV) y
Abacá Mosaic Virus (AbaMV)
Virus de Musáceas
Estructura - Virus
Procedimientos basados en ensayos con ácidos nucleicos (ADN
y ARN) aplicados al diagnóstico y caracterización, entre otros.
ADN
Los ácidos nucleicos ADN y ARN contienen la información genética
Diversas técnicas moleculares
NASH:
Hibridación de Ácidos Nucleicos:
Dot-Blot, Southern Blot, Northern Blot
PCR:
Reacción en Cadena de la Polimerasa:
AFLP, RFLP, RAPDS, NESTED, RT-PCR, SSR
0
Secuenciamiento
Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Principio de la PCR:
4to ciclo
36 ciclos
Fragmento deseado
3er ciclo
ARN
Segundo ciclo
Transcripción
Reversa
Primer ciclo
ADN molde
ADN
21 =
RT-PCR
2 copias
22 =
4 copias 8 copias
16
copias
236 = 68
billones
de copias
Materiales y Métodos
Distribución de Virus por
Países
Virus
Nombre
Entidad
BSV
Banana Streak Virus
ICA
CMV
Cucumber Mosaic Virus
ICA
BBTV
Banana Bunchy Top Virus
SENASA
BBrMV
Banana Brac Mosaic Virus
SENASA
BanMMV
Banana Mild Mosaic Virus
INIA
AbaMV
Abacá Mosaic Virus
INIA
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Y
EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS
Selección y división
Electroforesis
Pulverización
Visualización y
documentación
Centrifugación
Resultados
100 bp
H2O
Positivo
M 69
M 68
M 22
M8
H2O
Positivo
M 69
M 68
M 22
M8
100 bp
Detección de BBrMV mediante PCR
convencional: RT-PCR de un solo paso
500
400
300 280
260
bp
200
100 bp
N2/NR
N1/NR
bp
+ Adgen
+ Agdia
+ Adgen
+ Agdia
100bp
55.3 °C
54.3 °C
53.0 °C
51.8 °C
51.1°C
55.3 °C
54.3 °C
53.0 °C
51.8 °C
51.1°C
100bp
56.4°C
55.3 °C
54.3 °C
53.0 °C
57.3 °C
56.4°C
55.3 °C
54.3 °C
53.0 °C
ESTANDARIZACION DE CONDICIONES DE PCR PARA LA
DETECCIÒN DEL BBTV MEDIANTE PCR CONVENCIONAL
1056 bp
349
bp
Detecciòn de BBrMV mediante PCR en
tiempo real
BBrMV
COX
COX
SANO
Positivo para BBrMV (Sonda MGB FAM)
Sano para BBrMV (Sonda MGB FAM)
Internal Control COX (Sonda MGB VIC)
Internal Control COX (Sonda MGB VIC)
Detección del BBTV mediante PCR en tiempo real
a partir del segmento DNA-1
BBTV
COX
COX
SANO
Positivo para BBTV (Sonda MGB FAM)
Sano para BBTV (Sonda MGB FAM)
Internal Control COX (Sonda MGB VIC)
Internal Control COX (Sonda MGB VIC)
Western blot
1. Preparación de la muestra
3. Transferencia a la
membrana de nitrocelulosa
4. Detección
2. Electroforesis en geles
de acrilamida
Detección
PS
PV
1/50 1/50 1/250 1/500 1/1000
PS (-) PS (+)
1/50 1/50
kD
97.4
66.2
45.0
31.0
21.5
14.4
Acrilamida al 15%, Fosforilasa B BSA Ovoalbumina Anhidrasa Carbónica Inhibidor de Tripsina Lisozima
Resultados
Virus
Genoma
Técnica Detección
BSV
DNA
IC PCR
CMV
RNA
RT PCR
DAS ELISA
BBTV
DNA
PCR convencional
PCR tiempo real
BBrMV
RNA
RT PCR Convencional
RT PCR tiempo real
BanMMV
RNA
Western Blot
Micro propagación plántulas
Resultados
•
El proyecto permitió un mejor
equipamiento de los laboratorios
de las tres instituciones.
•
Capacitar al personal en técnicas
modernas e innovación de
tecnologías.
Conclusiones
• Trabajo en equipo dentro y fuera del país.
• Las técnicas de detección y diagnosis permitirán
fortalecer el sistema de producción de plantones.
• Contribuir a la producción de plantones de mejor calidad
fitosanitaria permitirá una mejor vida útil de las
plantaciones de plátanos y bananos.
• Intercambio de material de propagación de plátanos y
bananos promisorios entre Perú y Colombia.
• Fortalecimiento y sostenibilidad de las actividades agro
exportadoras plátanos y bananos.
Compromiso
El Proyecto "Unificación y Fortalecimiento del Sistema
de Protección Fitosanitaria en la Comunidad Andina
de Naciones (CAN) Caso
Modelo: Virus
en
Musáceas (plátano y banano) de Importancia
Económica en CAN“ contribuirá significativamente a:
Brindar sostenibilidad (sanidad) a las actividades
de
exportación del banano orgánico y la
seguridad alimentaría para nuestras poblaciones
Importancia del banano y plátano
Gracias!
Ciro Barrera Rojas
[email protected]
INIA - Perú