Download Transformación genética de banano (cv Gran enano)

In : Acorbat. Memorias XV reunión. Realizada en Cartagena de Indias,
Colombia. 27 de octubre al 02 noviembre 2002. Medellín (COL) : Asociación
de Bananeros de Colombia AUGURA, 2002
S E S I Ó N O R A L F I TO M E J O R A M I E N TO Y B I OT E C N O L O G Í A
Transformación genética de banano
(cv Gran enano) y platano (cv Curraré)
para introducir resistencia a Sigatoka Negra
(Mycosphaerella fijiensis).
Genetic transformation of banana (cv Gran enano)
and plantain (cv Curraré) to introduce resistance to
Black Sigatoka (Mycosphaerella Fijiensis).
J. L. Ortiz1; M. Gómez2; N. Vásquez1; M.E. Aguilar1.
RESUMEN
ABSTRACT
La transformación genética de cultivos celulares embriogénicos de los cultivares Curraré y Gran enano, se realizó mediante el bombardeo de partículas cubiertas de ADN. Se evaluó dos vectores de transformació n genética, el pBI121 que
expresa el gen reportero GUS y el gen marcador nptII. También se probó el plásmido pHAGG, constituido por el gen reportero GUS, el gen marcador hph y los genes de glucanasas
y quitinasas. Estos genes son de interés agronómico ya que
degradan las paredes del hongo constituido principalmente
por quitinas y glucanos. Ambos vectores están bajo el dominio del promotor constitutivo 35S (CaMV). La expresión transitoria se evaluó por medio del conteo de puntos azules,
mostrando mejores resultados para el cv Curraré, logrando
obtener en promedio 2207 puntos azules para el mejor tratamiento. El material se sometió a selección con el Medio de
regeneración M3, para el vector pBI121 se utilizó el antibiótico kanamicina a una concentración de 100mg/l y para el vector pHAGG el antibiótico higromicina a una concentración de
75 mg/l. Se observó la regeneración de agregados celulares
embriogénicos con formación de embriones en diferentes
estados de desarrollo. En esta etapa se llevó a cabo un análisis histoquímico que reveló la presencia del gen GUS en los
agregados celulares; el análisis histológico mostró la integración uniforme del agente revelador X-Gluc en el interior del
tejido.
Los embriones somáticos se subcultivaron al medio MS, logrando la germinación de los embriones. Secciones de tejidos de hoja y raíz se sometieron al agente revelador X-Gluc,
observándose una tinción uniforme del tejido expuesto.
Genetic transformation of embryogenic cellular cultures of the
cultivars Curraré and Gran enano through particle
bombardment covered with DNA was evaluated. In order to
establish bombardment conditions, two genetic
transformation vectors were evaluated: the pBI121 that
expresses the gene reporter GUS and the marker gene nptII.
Second plasmid proven was the pHAGG, that presents in its
construction the GUS reporter gene, the marker gene hph, it
displays the glucanase and chitinase genes of agronomic
interest which mainly degrade the fungus walls constituted
by chitinas and glucans. Both transformation vectors are
under the dominion of the constituent promoter 35S (CaMV).
The transient expression evaluated by counting blue dots
demonstrated better results for Curraré cultivar, obtaining in
average 2207 blue dots for the best treatment. The material
was subjected to using the selection M3 regeneration medium,
for cellular cultures bombarded with vector pBI121 the
kanamicina antibiotic was used at a concentration of 100/l and
for the pHAGG vector was used higromycin antibiotic at a
concentration of 75 mg/l. Regeneration of embriogenic cellular
aggregates with embryos formation at different development
stages was observed. In this stage, a histochemical analysis
was carried out that revealed the presence of the GUS gene
in cellular aggregates; the histological analysis showed a
uniform integration of the revealing X-Gluc agent into the
tissue. Regenerated somatic embryos were subcultivated into
the MS medium, obtaining germination of embryos. Leaf
tissue and root sections were put under the revealing X-Gluc
agent, showing a uniform stain of the exposed tissue.
1. CATIE, Unidad de Biotecnología, 7170 Turrialba, Costa Rica. E-mail [email protected]
2. CINVESTAV, Departamento de Ingeniería Genética, 629 Irapuato, Gto México.
49
I
INTRODUCCIÓN
Las musáceas de interés comercial, el banano y el plátano, son seriamente afectadas por la
Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis Morelet).
Esta enfermedad causa necrosis en las hojas y reduce la actividad fotosintética lo cual se traduce
en una disminución de la producción y el rendimiento y la pérdida de plantaciones y cosechas
(Stover, 1983).
El control de la enfermedad en fincas comerciales comprende el uso excesivo de productos químicos, provocando la aparición de poblaciones del
patógeno resistentes a los fungicidas (Carlier,
2000). Se estima que los costos anuales por aplicación de fungicidas están en el rango de $600 a
$1800 por hectárea. Este hecho, aunado al deterioro ambiental hace necesaria la búsqueda de
nuevas alternativas para resolver estos problemas
(Strobel et al, 1993).
Los avances en biotecnología permiten el mejoramiento genético de cultivos a través de la manipulación directa de genes de interés comercial
sin afectar otras características de los cultivos (Cruz,
1998). La transformación genética mediante el
bombardeo de partículas ó mediada por
Agrobacterium es una alternativa muy prometedora
para el desarrollo de plantas resistentes a estas
enfermedades (Crouch et al, 1998). El aislamiento
de genes de resistencia y el desarrollo de plantas
transgénicas ofrece expectativas para resolver estos problemas en musáceas (Cruz, 1998). El uso de
estas tecnologías en musáceas es bien justificado
dado que el mejoramiento genético convencional
es limitado por la alta esterilidad y niveles de
ploidía de los cultivares comerciales (Belalcázar et
al., 1995; Vuylesteke et al., 1999).
Este trabajo desarrollado en colaboración con
el CINVESTAV de México pretende hacer aportes
al desarrollo de una metodología para la transferencia de genes de resistencia a la Sigatoka negra
del banano y plátano, mediante la técnica de bombardeo de partículas.
METODOLOGÍA
El trabajo se realizó en los Laboratorios de Biotecnología del CATIE, Turrialba, Costa Rica, y en el
Laboratorio del Departamento de Ingeniería Genética del CINVESTAV, Irapuato, México.
50
La transferencia de genes se realizó con suspensiones celulares de banano del cv ‘Gran Enano’
(flores masculinas) y de plátano del cv ‘Curraré’
(flores femeninas) en fase de crecimiento exponencial, utilizando el método de aceleración de partículas (Biobalística PDS-1000/HE de BIO-RAD). El
Plásmido pHAGG (CINVESTAV) utilizado como
vector de transformación está constituido por el gen
reportero uid A de la b-glucuronidasa, el gen marcador hph con resistencia a higromicina y los genes de la b-1.3 glucanasa y quitinasa (clase I de
tabaco) como inductores de resistencia a Mycosphaerella fijiensis (Fig. 1). Estos genes están bajo
el control del promotor constitutivo 35S del virus
del mosaico de la coliflor (CaMV 35S).
El plásmido pBI121 integrado por el gen reportero uid A y el gen marcador con resistencia a
kanamicina nptII se utilizó como control. Estos
genes están clonados bajo el control del mismo
promotor (CaMV 35S). En cada bombardeo se usó
1mg de ADN y cada muestra de suspensión celular fue bombardeada una vez. Como testigo se utilizó suspensiones celulares no bombardeadas.
Después del bombardeo los cultivos se incubaron en el medio M2 osmótico (18g/l sorbitol, 18g/
l manitol) durante una noche, en la oscuridad a
27°C ± 1°C. Posteriormente, se realizó una transferencia al medio de regeneración M3 en presencia de los agentes selectivos (higromicina y
kanamicina), con subcultivos a medio fresco cada
45 días, hasta la proliferación de embriones somáticos en estado globular.
La expresión transitoria del gen GUS fue evaluada mediante el conteo de puntos azules , 48
horas después del bombardeo, según lo descrito
por Sági et al. (1995). La evaluación de la expresión estable del gen de resistencia a antibióticos se
llevó a cabo en el medio M3 con 100 mg/l de
kanamicina (Becker et al. 2000) y 75 mg/l de
higromicina (Sági et al. 1995), para lo cual se analizó las células muertas y las células sobrevivientes.
Asimismo, se realizó un análisis histológico
para conocer el estado celular de las suspensiones,
para lo cual se tomó muestras antes del bombardeo, posterior a la prueba de expresión transitoria
(GUS) y después de la prueba de selección (nptII,
hph). Cada muestra fue procesada según la técnica decrita por el CIRAD (1989).
Como variables se evaluó la distancia de dis-
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hph
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L
Figura 1. Representación esquemática del vector de transformación pHAGG.
paro (6 y 9 cm), la presión de gas Helio (1100 y
1350 psi), los plásmidos pHAGG y pBI121 y los
proyectiles de oro y tungsteno. Para cada una de
ellas se determinó la expresión transitoria del gen
GUS y la sobrevivencia de las células en medio con
selección. El análisis estadístico se realizó mediante
un diseño completamente al azar (DCA) y diseño
de tratamientos en arreglo factorial 25 con 3 repeticiones.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cabe destacar que por primera vez en el cultivar Curraré (AAB) se realizó la transformación genética de suspensiones celulares embriogénicas
utilizando la técnica de biobalística.
La evaluación de la expresión transitoria (GUS)
mostró que la mayor eficiencia en los eventos de
transformación se logró con el plásmido pHAGG,
con microproyectiles de tungsteno, una presión de
1100 psi y 6 cm de distancia, con lo cual se obtuvo valores promedio de 1596, 2207 y 1692 puntos azules (Fig. 2a), observaciones al microscopio
mostraron que la uniformidad de tinción provocada en las células, es debido a la presencia del gen
GUS en el interior de estos agregados celulares (Fig.
2b). Estos resultados también se reflejan en la capacidad regenerativa de las células durante la fase
de selección.
El estudio histológico de las células bombardeadas confirma que la mayoría de los agregados celulares y las células hijas que dieron positivo al gen
GUS, revelan la presencia del gen en el interior
celular (Fig. 2c). La evaluación de las células del
cultivar Curraré en presencia del agente selectivo
higromicina, mostró la presencia de células que
sobrevivieron (Fig. 2d) a la selección y de células
necrosadas que no soportaron la selección. El daño
celular observado consistió de células
plasmolizadas, completamente vacuoladas y con
núcleos mal definidos. No obstante, también se
observó grupos de células en división, con núcleos
bien definidos, las cuales soportaron el proceso de
selección. Estas células mostraron la formación de
los primeros agregados celulares en crecimiento
activo y posteriormente evidenciaron la diferenciación de numerosos embriones globulares (Fig. 2e).
Los embriones obtenidos se desarrollaron posteriormente en embriones bien diferenciados sobre el medio de germinación (MS + BAP 0.5mg/l y
AIA 2mg/l, pH 5.7 y phytagel 2.5 g/L) con 75 mg/
l de higromicina. Estos embriones se subcultivaron
en el medio de desarrollo (MS sin reguladores de
crecimiento) con el respectivo antibiótico. El desarrollo fue normal con la diferenciación de los
primordios foliares (Fig. 2f), la aparición de las
primeras hojas y raíces (Fig. 2g). El análisis histoquímico (X-Glu) reveló que tanto las hojas como
las raíces dieron positivo al gen GUS (Fig. 2h, 2i).
Estas observaciones hacen suponer que después
de nueve meses de realizados los eventos de transformación, tanto la expresión del gen GUS, como
la del gen de resistencia a higromicina (hph) son
estables. Como resultado, se espera que las plantas regeneradas sean portadoras del gen de resistencia (b- 1.3 glucanasa y quitinasa) a la Sigatoka
negra. El análisis molecular de las plantas obtenidas y los ensayos de resistencia a nivel de invernadero permitirán verificar esta hipótesis. Para el plásmido pBI121 la expresión transitoria no fue tan
exitosa, por lo tanto, era de esperar que estos materiales no sobrevivieran al agente selectivo
(kanamicina).
CONCLUSIONES
– Por primera vez se trabajó con la transformación
genética del cultivar Curraré obteniéndose resultados muy interesantes ya que se logró la
germinación de embriones somáticos y la conversión en planta en presencia del agente selectivo (Higromicina).
51
Figura 2. La fig.2a representa la expresión transitoria (gen GUS), 2b Presencia del gen GUS en el interior de las células individuales, 2c. Cortes histológicos de los agregados celulares que expresan la presencia del gen GUS, 2d. Células que sobrevivieron a la selección. 2e Regeneración de embriones somáticos en medio con selección. 2f. Germinación de embriones. 2g.
Desarrollo de embriones. 2h. Análisis histoquímico de hojas. 2i. Análisis histoquímico de raíces.
– Como condiciones óptimas de bombardeo se
determinó una distancia de 6 cm, con 1100 psi.
de presión, utilizando partículas de tungsteno.
– La expresión transitoria del gen GUS se constató a través del análisis histoquímico y se lo52
gró cuantificar en células embriogénicas mediante el conteo de puntos azules, 48 horas
después del bombardeo y en tejidos de hoja y
raíz, cinco meses después.
– El plásmido pHAGG portador de los genes de
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resistencia (quitinasa y glucanasa) a la Sigatoka negra expresó los mejores resultados en el
cultivar Curraré, comparativamente con el plásmido pBI121.
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