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¡Edición Especial 2009!
El Centro de Genomas Compartiendo Información - N°25
Pruebas de Resistencia del VIH a los medicamentos antiVIH (antirretrovirales)
Informaciones más detalladas del examen que se ha convertido en algo fundamental en el acompañamiento de pacientes
portadores del virus.
¿Cómo es la resistencia a los
antirretrovirales?
La resistencia a los antirretrovirales
es un mecanismo de selección
natural, Darwiniano, por lo tanto,
esto significa que con la presión
selectiva del medio ambiente en que
el virus vive, en la presencia de
antirretrovirales, cepas virales más
adaptadas a este medio ambiente
serán seleccionadas e prevalecer.
Esta selección sucede con mucha
facilidad en el caso del VIH en
función del ciclo de vida dinámico
del virus. Cuando se lleva en
consideración (i) el índice de errores
naturales de la enzima que
polimeriza el virus, que es la
transcriptasa inversa (4 x 104), (ii) el
alto índice de replicación del virus,
donde una persona crónicamente
infectada y sin tratamiento produce
y elimina 10 mil millones de virus
diariamente, (iii) y el tamaño del
genoma del virus, que es de 10 kB;
se nota que todas las mutaciones
posibles son generadas diariamente
a lo largo del genoma del VIH-1. Por
lo tanto, las mutaciones, que tienen
relación con resistencia a los
antirretrovirales
emergen
diariamente,
sin
embargo,
normalmente no se fijan. Fijarse
significaría que la cepa viral con la
mutación de resistencia debería
infectar un linfocito T CD4 +
susceptible. Esto probablemente, no
ocurrirá, puesto que esta cepa
estará compitiendo con otros 10 mil
millones de virus del tipo salvaje
que están siendo liberados en la
corriente
sanguínea
de
esta
persona
infectada.
Entretanto,
cuando
se
utiliza
cualquier
antirretroviral en monoterapia, se
eliminarán todos los virus sensibles
y se producirá la selección del virus
con mutaciones de resistencia. Así,
esta cepa viral es capaz de infectar
el "próximo" linfocito susceptible y
se expandirá el virus con la
mutación de resistencia, ya que, por
cada célula infectada salen de 5 a
10 mil virus con la mutación de
resistencia seleccionada. Esto es lo
que
fundamenta
la
terapia
antirretroviral combinada, donde al
seleccionar un virus con mutación
de resistencia, esta cepa aún
continúa susceptible a los otros
antirretrovirales presentes en el
esquema de tratamiento. De esta
forma, es fácil entender que la falla
en el uso adecuado de los
medicamentos puede producir la
selección
de
mutaciones
de
resistencia.
¿Cuál es la repercusión de la
resistencia
a
los
antirretrovirales?
Recientemente quedó claro que
cuando el virus vuelve a replicar en
la corriente sanguínea del paciente
como resultado de la resistencia a
los medicamentos, puede ocurrir la
progresión de la enfermedad con
reducción de los niveles de células
T
CD4+,
aparecimiento
de
enfermedades oportunistas y riesgo
de muerte.
¿Cuáles son las pruebas de
resistencia disponibles?
Son las (i) Pruebas de Resistencia
Genotípica (genotipificación), que
son pruebas de laboratorio que
determinan
la
presencia
de
mutaciones genéticas en el VIH-1
relacionadas a la disminución de
susceptibilidad a las drogas y las (ii)
Pruebas de Resistencia Fenotípica
(fenotipificación), que son pruebas
usadas para determinar en cultivo la
susceptibilidad del virus a los
antirretrovirales. Además, tenemos
el (iii) Fenotipificación virtual, que es
una Prueba de genotipificación,
cuyo resultado es sometido a una
base de datos que contiene pares
de muestras que poseen pruebas
de geno y fenotipificación. El
sistema de informática busca en la
base de datos, la secuencia más
similar a la secuencia genómica
ensayada. Como cada secuencia de
la base de datos posee un resultado
de fenotipificación equivalente, el
resultado de resistencia fenotípica
de la base de datos es atribuido al
paciente que hizo la prueba y por lo
tanto, se proporciona el resultado de
este paciente en el formato de un
resultado de fenotipificación.
¿Cuáles son los pasos en el
laboratorio para cada prueba?
Pasos en el laboratorio de la
prueba de Genotipificación.
1 – Purificación del ARN o ADN del
VIH-1 presente en la corriente
sanguínea del paciente.
2- Transcripción
inversa
(transformación de ARN viral en
cADN).
3- Amplificación de la región de la
transcriptasa inversa y proteasa por
la metodología de la PCR (reacción
en cadena de la polimerasa).
4- Secuenciación del genoma del
VIH del fragmento amplificado por la
PCR.
5- Producción de una lista de
mutaciones
de
los
codones
relacionados con resistencia a los
antirretrovirales.
6- Interpretación.
La
principal
fragilidad de la prueba está en la
falta de conocimiento sobre las
mutaciones que causan disminución
de
susceptibilidad
a
los
medicamentos.
*HIV
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Pasos realizados en laboratorio de la prueba de Fenotipificación.
1- Purificación del ARN o ADN del VIH-1 presente en la corriente sanguínea del paciente. *
2-Transcrição reversa (transformación de ARN viral en cADN). *
3-Amplificación de la región de la transcriptasa inversa y proteasa por la metodología de la PCR. *
4-Transfección de células utilizadas para cultivo utilizando clones infecciosos. Clon infeccioso es el fragmento de ADN del VIH1 con excepción del fragmento de la proteasa y transcriptasa inversa que vendrá a partir de (3) arriba. Se introduce el clon
infeccioso y el fragmento de la TR y PR del paciente en el interior de la célula por metodología conocida como electroporación*
5- Cultivo del virus en la presencia de cada uno de los antirretrovirales.
6- Cuantificación de la pérdida de susceptibilidad del virus probado comparado al virus del tipo salvaje.
7- Interpretación, la principal fragilidad de la prueba está en la ausencia de corte (cut off) definido para cada una de las drogas.
*Las fases 1-4 ocurren cuando son utilizados virus recombinantes obtenidos a partir de clon infeccioso.
Pasos realizados en laboratorio de la prueba de Fenotipificación Virtual.
123456-
Prueba de Genotipificación.
Compara la secuencia de nucleótidos del paciente con secuencias referencia del tipo salvaje.
Abrevia el genotipo del paciente basado en un perfil de mutaciones.
Busca en base de datos secuencias con perfil semejante de mutaciones.
Identifica resultado de fenotipificación a partir del perfil de mutaciones.
Produce informe de fenotipificación virtual.
¿Cuáles son las ventajas y desventajas de cada prueba?
PRUEBAS DE GENOTIPIFICACIÓN
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Son más simples de realizar
Más rápidos (1 a 2 semanas) y baratos
Ampliamente disponibles
Más sensibles, pueden detectar mutaciones
emergentes (mezclas) antes que ellas tengan
repercusión fenotípica, lo que puede promover
una señal de alerta para el desarrollo de
resistencia amplia
Poca
sensibilidad
a
variantes
minoritarias
(sensibilidad superior al 25%)
Interpretación requiere conocimiento previo de los
determinantes genéticos de la resistencia
Interacciones entre mutaciones aún no son bien
conocidas
Informaciones limitadas relacionadas a nuevas
drogas, nuevas combinaciones de drogas y subtipos
de virus que no sean B
Es una medida
fenotípica.
indirecta
de
susceptibilidad
PRUEBAS DE FENOTIPIFICACIÓN
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Medida directa de la resistencia, mensurando
la replicación del virus modificado presente
en el paciente frente a concentraciones
diferentes de antirretrovirales
Cuantifica la pérdida de susceptibilidad a las
drogas probadas
Cut offs aún no establecidos para buena parte de las
drogas, lo que es crítico para determinación de la
resistencia, especialmente con relación a los cut offs
clínicos.
Formato más familiar al clínico
Más caros y demorados
Menor dependencia de la acumulación de
conocimiento para interpretación, el cual,
tiene especial valor para drogas nuevas
Necesita de laboratorios mucho más especializados y
equipados.
Técnicamente más complejos
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Prácticamente no necesitando de
interpretación externa.
Evalúa mejor los efectos de la
hipersusceptibilidad proporcionada por la
compleja combinación de muchas
mutaciones seleccionadas por los
antirretrovirales
Tiende a subestimar resistencia en la vigencia de
mezclas entre virus resistentes y sensibles.
PRUEBAS DE FENOTIPIFICACIÓN VIRTUAL
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Son más simples de realizar, pues se trata de
una prueba de genotipificación
Cuantifica la pérdida de susceptibilidad a las
drogas probadas
Cantidad limitada de informaciones a drogas nuevas y
subtipos no B.
Formato más familiar al clínico
Más rápido y más barato que una
fenotipificación
Considera las "mezclas" entre virus salvajes y
resistentes como virus resistentes
También se trata de una medida indirecta de la
susceptibilidad fenotípica
Evalúa mejor los efectos de la
hipersusceptibilidad proporcionada por la
compleja combinación de muchas
mutaciones seleccionadas por los
antirretrovirales
¿QUÉ CONSIDERACIONES SON IMPORTANTES CON RELACIÓN A LAS PRUEBAS?
CONSIDERACIONES
OBSERVACIONES
Pruebas de resistencia deben ser realizadas
con carga viral detectable.
Alguno s laboratorios pueden acceder al ADN proviral
en vez del ARN plasmático, posibilitando la prueba,
mismo con carga viral indetectable.
La sangre debe ser colectada en la vigencia
de la medicación.
Las mutaciones deben persistir hasta dos semanas
después de la interrupción, pero algunas mutaciones
como la del codón 184 de la TR pueden desaparecer
rápidamente en la ausencia de medicación.
La falla virológica debe ser confirmada por
dos pruebas con intervalo superior a 3
semanas.
La transactivación heteróloga, secundaria a
infecciones transitorias y vacunación puede aumentar
la carga viral por períodos cortos de tiempo, sin que
haya repercusiones relacionadas a la falla virológica.
La falla virológica puede ser resultante de
factores no relacionados a la resistencia viral
Otros factores como la adhesión o interacciones
medicamentosas deben ser investigados antes de la
solicitación de la prueba. La resistencia celular
también puede ser la causa de la falla.
antes de la solicitación de la prueba. La resistencia
celular también puede ser la causa de la falla
La interpretación de las pruebas puede ser
compleja y necesitar de la interacción entre
los clínicos asistentes y virólogos clínicos.
Las pruebas presentan valor predictivo
positivo alto.
Una vez detectadas las mutaciones o una disminución de la susceptibilidad de una droga in vitro, es
muy probable que la droga no presente acción in vivo.
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CONSIDERACIONES
Las pruebas presentan valor predictivo
negativo bajo.
Las pruebas presentan valor predictivo
positivo alto.
Las pruebas presentan valor predictivo
negativo bajo.
La manipulación antirretroviral previa y el
resultado de pruebas anteriores, deben ser
considerados en la interpretación de
estándares de resistencia apuntados en las
pruebas actuales.
OBSERVACIONES
La falta de detección de la resistencia no significa
necesariamente que ésta no exista.
Una vez detectadas las mutaciones o una disminución de la susceptibilidad de una droga in vitro, es
muy probable que la droga no presente acción in vivo.
La falta de detección de la resistencia, no significa
necesariamente que ésta no exista.
Las mutaciones seleccionadas en el pasado pueden
desaparecer en la ausencia de la droga que la
seleccionó y aparecer de nuevo con rapidez, cuando
la droga es nuevamente introducida (falsa reversión
de mutaciones en la ausencia de las drogas).
Mutaciones como la M184V ocurren con frecuencia,
debido a la falla del 3TC, mismo que la prueba no
apunte esta mutación si en el momento el individuo
no esté usando 3TC.
Conceptos y definiciones importantes:
Mutación – Alteración en la composición genética del virus.
Codón - Grupos de 3 nucleótidos que codifican un aminoácido.
Mutación principal o primaria - Aquella que produce significativa pérdida de susceptibilidad al antirretroviral que la
seleccionó. Normalmente es la primera mutación que emerge resultante del uso del antirretroviral en cuestión.
Mutación accesoria o secundaria - Mutación que emerge normalmente para recuperar el fitness perdido por el aparecimiento
de la mutación principal. Propicia una pérdida modesta de susceptibilidad al antirretroviral que la seleccionó
Virus del tipo salvaje - Cepa viral con constitución genética considerada normal, siendo sensible a los antirretrovirales.
Virus mutante - Cepa viral con alteraciones genéticas.
Polimorfismos virales - Mutaciones genéticas que pueden estar presentes en los virus cuando hay ausencia de presión
selectiva de los antirretrovirales. Muchas veces son "firmas" de virus de diferentes subtipos del VIH-1.
Resistencia primaria - Resistencia a los antirretrovirales, detectadas en pacientes vírgenes de tratamiento antirretroviral
Resistencia secundaria - Resistencia a los antirretrovirales resultantes de la presión selectiva ejercida por las drogas.
Resistencia a múltiples drogas (MDR) - Mutaciones que normalmente ofrecen resistencia a todas las drogas de una misma
clase.
Inserciones -Adición de nucleótidos, generalmente múltiplos de 3, que elevan el número de aminoácidos en la secuencia viral.
Ej.: cccagttagttg - > cccagttagtacttg (el triplete colorido representa una inserción en la secuencia de nucleótidos, que no existía
en la secuencia original).
Deleciones - Pérdida de fragmento genético nucleotídico, generalmente múltiplo de 3, que produce la disminución en el
número de aminoácidos de la secuencia.
Cuál es la importancia de las pruebas de resistencia en la práctica clínica:
1
2
3
4
5
6
7
- Evita cambios innecesarios de antirretrovirales
- Levanta sospecha con relación a la falta de adhesión
- Propicia cambios direccionados, en vez, de cambios empíricos de antirretrovirales.
- Propicia el uso de drogas activas por períodos más prolongados.
- Economiza costos relacionados a cambios de drogas.
- Evita toxicidad innecesaria de drogas inactivas.
- Propicia una noción más realista del desempeño futuro del tratamiento.
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