Download Procedimiento de Lab GenoVIH Gisely

PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO PARA
LA PRUEBA DE GENOTIPIFICACIÓN DEL
VIH
Blga. Gisely Hijar Guerra
Coordinación del Laboratorio de Biotecnología y Biología
Molecular.
Responsable de los Procesos de la Prueba de
Genotipificación de VIH – Centro Nacional de Salud Publca
¿COMO MONITOREAR RESISTENCIA?
GENOTIPO
CODIGO GENETICO ALTERADO
DE LA PROTEINA BLANCO DE LA
DROGA
FENOTIPO
SUSCEPTIBILIDAD ALTERADA
A LA DROGA
HIV DNA DEL PACIENTE
PATIENT HIV
DEFINICIONES
• Genotipo : Secuencia de nucleótidos del virus de la
cual se deduce la secuencia de aminoácido de una
proteína (En el caso del HIV, la RT y PV)
• Mutaciones : cambios en la secuencia de AA deducida
de la secuencia de nucleótidos con respecto a la
secuencia de una cepa de referencia (sensible o
salvaje) Ejemplo: Met184Val .
Mutaciones específicas se identifican como causantes
de resistencia genotípica
• Fenotipo : Deriva del genotipo. En el ejemplo, el
cambio Met184Val se traduce fenotípicamente como
resistencia a 3TC, ddC y Abacavir.
Regiones de PR y RT Evaluadas por test de
Resistencia
Gag Cleavage Sites
p7NC
p1
PR
p6
RNase
H
RT
IN
242
Genotipificación VIH-INS
360
320
305
483
9
DE LA MUESTRA A LOS RESULTADOS
Pre-Analitica
Analitica
Post-Analitica
Colecta de la
muestra
Envío y
Pre-Analítica
Almacenamiento
Edición de
Secuencia
Codificación de
muestra
Ensamblaje de
Secuencia
Post-Analítica
Alineamiento de
Secuencia
Determinación de
mutaciones
Reporte de
resultados
Extracción de Ac.
Nucleico
Amplificación de
Analítica
Ac.
Nucleico
Secuenciamiento
Automático
MUESTRA : Sangre Total
CONSIDERACIONES DE LA MUESTRA
•
PACIENTE
:
EN AYUNAS
•
TIPO DE MUESTRA:
•
TIPO DE TUBO : TUBO AL VACIO CON EDTA DE 5 – 7 CC.
•
TEMP. TRANSPORTE :AMBIENTE
•
TIEMPO DESDE QUE SE TOMA LA MUESTRA HASTA
QUE SE SEPARA
EL PLASMA
:
24 HORAS.
SANGRE
SEPARACIÓN DEL PLASMA Y EXTRACCIÓN DEL
MATERIAL GENETICO (ARN )
Controles de la Prueba
Controles Mutantes
Controles Silvestres
TRANSCRIPCIÓN REVERSA (RT) Y
REACCIÓN DE LA CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)
RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
RNA
è c DNA
ELECTROFORESIS
PURIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE
PRODUCTOS DE PCR
ÁREA SEGUNDA AMPLIFICACIÓN
SEGUNDO PCR
SECUENCIAMIENTO DE PRODUCTOS DE PCR
(Equipo : Analizador Genético)
ANÁLISIS DE SECUENCIAS
DE ADN DEL VIH
SOFTWARE Sequencing Analysis
SOFTWARE : SeqScape
La secuencia de ADN del
virus obtenido es ingresado
en la base de datos de la
Universidad
de
Stanford
empleando para ello el
Programa
HIVdb.
Este
programa
analiza
las
secuencias y determina si
están
presentes
las
mutaciones
del
virus
relacionadas a la resistencia
antiretroviral.
INFORMES DE RESISTENCIAS
COLECTA /TOMA DE MUESTRA
FLUJOGRAMA DE LA
PRUEBA DE
GENOTIPIFICACIÓN DE
VIH
SEPARACIÓN DEL PLASMA
TUBO N° 1
EXTRACCIÓN DE ARN
RT - PCR
ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS
No amplifica
Si amplifica
SEGUNDO PCR
(Primers alternativos)
No amplifica
1a vez
No amplifica
2da vez
INDETERMINADO
PURIFICACION Y CUANTIFICACIÓN DE
PRODUCTOS DE PCR
Si
amplifica
SECUENCIAMIENTO DE
PRODUCTOS DE PCR
No hay secuencia
1a vez
Hay secuencia
SECUENCIAMIENTO CON
PRIMERS ALTERNATIVOS
ANÁLISIS DE
SECUENCIAS
No hay secuencia
2da vez
REPORTE DE
RESULTADO
Hay secuencia
INFORME DE RESULTADO
Electroforesis
Extracción
de ARN
Muestra /
Separación de
Plasma
RT-PCR
http://hivdb.stanford.edu/pages/algs/HIVdb.html
Reporte
Análisis de
Datos
Análisis de
Datos
Por qué son útiles y necesarios los
ensayos de Resistencia
•
•
•
Asiste al médico en la toma de decisiones terapéuticas en distintos
escenarios:
– Clarifica los tratamientos disponibles
– Selecciona los regímenes mas activos
– Mejora el resultado clínico
– Clarifica la etiología de los aumentos de carga viral
– Reduce el uso de drogas inactivas.
Provee beneficios a nivel de salud pública
– Clarifica la epidemiología de la resistencia al HIV
– reduce transmisión de virus resistentes
– Permite mejorar las guías de tratamiento
Asiste en el desarrollo de nuevas drogas terapéuticas
AGRADECIMIENTOS
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Dr Robert Grant
Robert Hance
Maribel Acuña
Carlos Yabar
Equipo del laboratorio de VIH y del Laboratorio de Biología
Molecular