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“ESTUDIO DE PROCESOS PARA LA SOLUBILIZACIÓN Y
PRECIPITACIÓN DE IONES METÁLICOS CONTAMINANTES
MEDIANTE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES Y SULFATOREDUCTORAS”
UNIVERSIDAD DE CÁDIZ
FACULTAD DE CIENCIAS
Departamento de Ingeniería Química, Tecnología de Alimentos y
Tecnologías del Medio Ambiente
Gema Cabrera Revuelta
Mayo, 2005
“ESTUDIO DE PROCESOS PARA LA SOLUBILIZACIÓN Y
PRECIPITACIÓN DE IONES METÁLICOS CONTAMINANTES
MEDIANTE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES Y SULFATOREDUCTORAS”
Memoria presentada por la Licenciada Gema Cabrera Revuelta para optar al grado
de Doctor por la Universidad de Cádiz
Fdo: Gema Cabrera Revuelta
Puerto Real, Mayo de 2005
La presente Tesis Doctoral ha sido co-dirigida por los Doctores D. Domingo Cantero
Moreno, Catedrático de Ingeniería Química y D. Jose Manuel Gómez Montes de Oca,
Profesor Titular de Ingeniería Química de la Universidad de Cádiz, y cumple los
requisitos exigidos por la legislación vigente.
Fdo: Dr. D. Domingo Cantero
Moreno
Fdo: Dr. D. José Manuel Gómez Montes
de Oca
Fdo.: Dr. D. José María Quiroga Alonso
Director del Dpto. de Ingeniería Química, Tecnología de Alimentos y Tecnologías del
Medio Ambiente
Universidad de Cádiz
Después de este largo camino siento la necesidad de dar las gracias a
todas las personas que de alguna manera han contribuido para que esto
sea posible:
-
Al Prof. Domingo Cantero Moreno, por brindarme la oportunidad de
pertenecer a su grupo de investigación y permitirme estrenar la línea
de Biorremediación. Su experiencia y su capacidad de crítica me
han ayudado a creer en mi trabajo.
-
Al Prof. José Manuel Gómez Montes de Oca, por su entrega, su
confianza, su disponibilidad y su eficacia, en realidad es difícil
destacar sólo algunas de sus cualidades. Gracias Tete, por tu calidad
humana y por saberme hacer poner los pies en la tierra. Tengo suerte
de trabajar contigo.
-
Al Prof. Edgardo Donati, le agradezco su acogida, su disponibilidad y
todo lo que he aprendido durante las estancias que realicé en su
país, vos sabés que es mucho. Gracias por haberme dado la
oportunidad de conocer y trabajar con tus chicas, a ellas gracias
también.
-
A mis compañeros del departamento, cada acontecimiento que
ocurre es, sin duda, fruto del trabajo de todos. Gracias por lo que me
aportáis día a día.
A mis padres,
a mis hermanos
y a Elsa
A Jose,
por todo lo que me quieres,
por todo lo que te quiero.
Querer es poder
INDICE
A.-INTRODUCCIÓN………….……………………………..……………….
1
B.-ANTECEDENTES………..………………...………………………………..
7
1
9
CONTAMINACIÓN POR METALES PESADOS………...…..…………………
1.1 METALES PESADOS: TOXICIDAD Y TÉCNICAS DE
REMEDIACIÓN…………………………………………………………
9
1.1.1 TÉCNICAS DE REMEDIACIÓN……………………….…………………..
12
1.1.1.1
Técnicas de contención………………..……………………..
13
1.1.1.2
Técnicas ex-situ……………………………………………….….
14
1.1.1.3
Técnicas in-situ…………………………….……………………..
15
1.2 MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS………………………
16
1.2.1 TÉCNICAS DE BIORREMEDIACIÓN……………………………………..
18
1.2.1.1
Técnicas de movilización………………………….…………..
18
1.2.1.2
Técnicas de inmovilización……………….…………………...
20
1.3 RESIDUOS DE LA INDUSTRIA DE GALVANIZADO……….…………
21
1.4 CARACTERÍSTICAS Y TOXICIDAD DE LOS METALES
2
ESTUDIADOS……………………………………………………………
26
1.4.1 CROMO…………………………………………………………………….
27
1.4.1.1
Características…………………………………………………..
27
1.4.1.2
Toxicidad…….……………………………………………………
29
1.1.2. NÍQUEL……………………………………………….…………………….
30
1.1.2.1.
Características………….………………………………………..
30
1.1.2.2.
Toxicidad……………………….…………………………………
32
1.4.2 ZINC…………………………………………………………………………
34
1.1.3.1.
Características……….…….……………………………………
34
1.4.2.1
Toxicidad……………….…………………………………………
35
1.5 LEGISLACIÓN SOBRE METALES PESADOS…………………….……
36
BIOLIXIVIACIÓN CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES…………..…
43
2.1. BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES…………………………………….
44
INDICE
2.2. BACTERIAS AZUFRE OXIDANTES…………………..…………………
45
2.1.1 CARACTERÍSTICAS DE Acidithiobacillus ferrooxidans Y
Acidithiobacillus thiooxidans……………………………………….…..
46
2.2 MECANISMOS INVOLUCRADOS EN LA BIOLIXIVIACIÓN DE
MINERALES SULFURO…………………………..……………………….
49
2.2.1 MECANISMO DIRECTO………………………………….………………..
49
2.2.2 MECANISMO INDIRECTO…………………………….…………………..
50
2.2.3 DISCUSIÓN DE LOS MECANISMOS…………………….……………….
52
2.3…FUNCIÓN DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN LA
LIXIVIACIÓN DE MINERALES SULFURO………………..……………
55
2.4 ADHESIÓN BACTERIA-MINERAL……………………….……………..
56
2.5…FACTORES QUE INFLUYEN EN LA BIOLIXIVIACIÓN………….……
59
2.6…TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS DE LAS BACTERIAS
AZUFRE-OXIDANTES……………………….…………………………..
61
2.7 APLICACIONES DE LA BIOLIXIVIACIÓN CON BACTERIAS
AZUFRE-OXIDANTES…………..……………………………………....
66
2.7.1 BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES………………………..……………….
66
2.7.2 BIOLIXIVIACIÓN DE LODOS………..…………………..…….………….
70
2.7.3 BIOLIXIVIACIÓN DE SUELOS……………………………………………..
75
2.7.4 BIOLIXIVIACIÓN DE OTROS RESIDUOS…………………………...……
77
2.7.5 APLICACIONES INDUSTRIALES…………………………………………..
78
2.8 REDUCCIÓN DEL Cr(VI) POR LA ACCIÓN DE LAS BACTERIAS
3
AZUFRE-OXIDANTES…………………………………….……………..
81
BIOPRECIPITACIÓN CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS……..
84
3.1 PRECIPITACION DE METALES DISUELTOS………..………………….
84
3.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS…………….…………………..
85
3.2.1 CARACTERÍSTICAS………...………………………………………………
88
3.2.2 GÉNERO Desulfovibrio………..………………………………………….
89
3.2.3 METABOLISMO DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS……….
90
INDICE
3.2.4 METABOLISMO DEL GÉNERO Desulfovibrio……..……………………
91
3.3 FUNCION DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN LA
BIOPRECIPITACIÓN DE METALES……….…………………………..
93
3.3.1 ADHESIÓN BACTERIA-MINERAL………………...……………………….
94
3.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA REDUCCION DE SULFATO….…
94
3.5 TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS….………………………...
98
3.6 APLICACIÓN DE LA BIOPRECIPITACIÓN DE METALES POR
BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS……….…………………………
102
3.7 INTEGRACIÓN DE PROCESOS DE BACTERIAS AZUFREOXIDANTES Y BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS…..……………
106
INMOVILIZACIÓN DE CELULAS…………………………….…………….
109
4.1 EMPLEO DE LA INMOVILIZACIÓN…………….…………..…………
109
4.2 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN…………….………………..……..
109
4.2.1 ADHESIÓN………………..…………………………..…………………….
110
4.2.2 ATRAPAMIENTO……………………….……………..……………………
111
4.3 INMOVILIZACION DE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES….……….
112
4.4 INMOVILIZACION SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO….………..
113
C.-MATERIAL Y MÉTODOS…………….…………………………………...
117
1
MATERIAL Y MÉTODOS……………………….……………………………
119
1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS…………………………………...
119
4
1.1.1 BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES……………………….………...
119
1.1.1.1
Características…………………………………………………..
119
1.1.1.2
Mantenimiento de las cepas…………………………………
119
1.1.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS……………………………………
122
1.1.2.1
Características…………………………………………………..
122
1.1.2.2
Mantenimiento de las cepas…………………………………
123
1.2 MÉTODOS DE ANÁLISIS……………………………………………….
127
1.2.1 pH Y POTENCIAL REDOX………………………………………………...
127
INDICE
1.2.2 CONCENTRACIÓN CELULAR…………………………………………...
127
1.2.2.1
Bacterias en suspensión……………………………………….
127
1.2.2.2
Bacterias inmovilizadas………………………………………..
128
1.2.3 CONCENTRACIÓN DE PROTONES…………………………………….
129
1.2.4 CONCENTRACION DE SULFATO……………………………………….
129
1.2.5 CONCENTRACION DE IONES METÁLICOS……………………………
130
1.2.6 CONCENTRACION DE CROMO HEXAVALENTE……………………..
131
1.2.7 PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA
2
ELECTRÓNICA……………………………………………………………..
131
1.2.8 DIGESTIÓN DE COMPUESTOS INSOLUBLES DE METAL………........…
132
PROTOCOLOS EXPERIMENTALES………………………………………..
133
2.1 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)
CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO………
134
2.2 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)
CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO…………...
136
2.2.1 REACTOR DE At. thiooxidans…………………………………………...
137
2.2.2 SOLUBILIZACIÓN DE METALES PRESENTES EN ARENA………………
137
2.3 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIÓN DE Cr(VI) CON
BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO………..……..
138
2.4 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIÓN DE Cr(VI) Y
SOLUBILIZACIÓN DEL Cr(III) CON BACTERIAS AZUFREOXIDANTES EN CONTINUO……………………………………………
139
2.4.1 REACTOR DE At. thiooxidans…………………………………………...
139
2.4.2 COLUMNA CON RESIDUO DE CROMO………………………………
140
2.5 PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II)
CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN DISCONTINUO…
141
2.6…PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)
CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN CONTINUO…
142
2.6.1 REACTOR DE Desulfovibrio sp………………………………………….
143
INDICE
2.6.2 REACTOR DE PRECIPITACIÓN…………………………………………..
144
2.7…PROTOCOLO PARA LA INMOVILIZACIÓN DE At. ferrooxidans
Y At. thiooxidans SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO…..……….
145
2.8 PROTOCOLO PARA LA INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS DE
SOLUBILIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) EN
CONTINUO……………………….…………………………………….
147
D.-RESULTADOS…………………………………………………..…............
149
1
151
SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)……………………..…
1.1 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS
AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO………………………..…..
151
1.2 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON At. thiooxidans
EN CONTINUO………………………………...……………………….
2
168
REDUCCION DEL Cr(VI)…………………………………………….. 174
2.1 EXPERIENCIAS DE REDUCCIÓN DEL Cr(VI) EN DISCONTINUO....
174
2.2 REDUCCIÓN DE Cr(VI) Y SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III) CON
3
BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO……….………...
181
PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II)…………………………
187
3.1 ESTUDIO DE TOLERANCIA Y PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y
Zn(II) CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN
DISCONTINUO………………………………………………………….
187
3.1.1 ESTUDIO CON Cr(III)………………….…………………………………..
187
3.1.2 ESTUDIO CON Cr(VI)…………………………………………….……….
191
3.1.3 ESTUDIO CON Cr(III) y Cr(VI)……………………………….…………..
193
3.1.4 ESTUDIO CON Ni(II)………………………………….……………………
195
3.1.5 ESTUDIO CON Zn (II)………………………………….…………………..
199
3.1.6 ESTUDIO CON Cr(III), Ni(II) y Zn(II)………………………….…………..
203
3.2 PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS
SULFATO-REDUCTORAS EN CONTINUO……………………………
210
INDICE
4
INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS……………………..…………
214
4.1 INMOVILIZACIÓN DE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES SOBRE
ESPUMA DE POLIURETANO……….………………………………….
214
4.2 INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS DE SOLUBILIZACIÓN Y
PRECIPITACIÓN EN CONTINUO…………….………………………
219
4.3 COMPARACIÓN CON OTRO PROCESO…………….…………….
226
E.-CONCLUSIONES…………………..………………………………….…..
231
F.-BIBLIOGRAFÍA…………………………..………………………….……..
235
A.-INTRODUCCIÓN
INTRODUCCION
En el último siglo, se ha generado un aumento considerable del
contenido de metales pesados en el medio ambiente provocado,
principalmente, por el gran número de procesos industriales que emplean
como materias primas los metales, así como por las explotaciones mineras y
sus industrias derivadas. Por este motivo, el estudio de técnicas que traten
de reducir la contaminación causada por éstos constituye un tema de gran
actualidad. Normalmente estos metales se encuentran presentes en aguas
y suelos y, en ocasiones, en forma de pequeñas partículas dispersas en el
aire. Hoy en día, el tratamiento de medios contaminados con iones
metálicos, como efluentes industriales, lodos, sedimentos y suelos, puede
llevarse a cabo mediante distintas técnicas tales como precipitación,
intercambio iónico, filtración por membrana o métodos electroquímicos. Sin
embargo, estos tratamientos están restringidos por problemas técnicos y
económicos; provocando la aparición de otras técnicas alternativas que
involucran bioprocesos.
En ocasiones, los iones metálicos se encuentran en los medios
contaminados
en
formas
insolubles.
La
acción
de
determinados
microorganismos permite la transformación de compuestos insolubles a otros
solubles, de modo que los iones pasan a solución acuosa. A esta operación
de solubilización de iones mediante microorganismos se le conoce con el
nombre de biolixiviación. Las bacterias azufre-oxidantes del género
Acidithiobacillus
(en
concreto
Acidithiobacillus
ferrooxidans
y
Acidithiobacillus thiooxidans) son conocidas por su capacidad para
solubilizar iones metálicos a partir de sulfuros y óxidos complejos dando lugar
a otras formas solubles como los sulfatos.
Por otra parte, cuando los metales se presentan en formas solubles en
los medios contaminados de forma natural, o como consecuencia de
procesos químicos o biológicos, podría ocurrir que debido a su movilidad las
3
INTRODUCCION
especies metálicas pasen de capas superficiales a capas más internas y, en
consecuencia a los posibles acuíferos. Una de las vías para evitar la
movilización de los metales presentes en un medio es la bioprecipitación de
dichos iones. Algunas especies microbianas tienen la capacidad de oxidar
o reducir ciertos iones, de manera que modifican la solubilidad de las
especies metálicas provocando su precipitación y, por tanto, su separación
y posterior eliminación del medio. Las bacterias sulfato-reductoras, entre las
que se encuentra el género Desulfovibrio, tienen la habilidad de precipitar
iones metálicos a partir de formas metálicas solubles.
Habitualmente el contacto directo entre la biomasa y la solución que
contiene los iones metálicos no es sencillo y presenta algunos problemas
técnicos. La inmovilización previa de la biomasa en estructuras sólidas
proporciona el tamaño, la rigidez y la porosidad necesarios para realizar
este tipo de procesos. Esta técnica, además, facilita la recuperación de los
iones metálicos y la reactivación de la biomasa para su reutilización.
El presente trabajo se realizó con el objeto de estudiar los procesos
que permiten la solubilización y precipitación de metales pesados presentes
en medios contaminados empleando la capacidad de las bacterias azufreoxidantes y sulfato-reductoras para tolerar la presencia de iones metálicos y
llevar a cabo estos procesos.
Para ello, en primer lugar, se seleccionaron los metales a estudiar:
cromo, níquel y zinc. Estos metales se encuentran presentes de forma
común en los residuos de las plantas de tratamiento de superficies y en los
efluentes o lodos de industrias relacionadas con la minería. Debido a su
toxicidad y a su presencia en variedad de medios contaminados parece de
interés tomarlos como referencia en el estudio de bioprocesos que permitan
la disminución o eliminación de estas especies metálicas en dichos medios.
4
INTRODUCCION
El estudio de la solubilización de estos metales por la acción de las
bacterias azufre-oxidantes se realizó en discontinuo para determinar de esta
forma la viabilidad del proceso y la tolerancia de At. ferrooxidans y At.
thiooxidans a los distintos metales. El estudio se llevó a cabo en distintas
condiciones y los resultados obtenidos permitieron desarrollar un proceso de
solubilización de dichos metales en forma continua, donde compuestos
insolubles de éstos metales se encontraban soportados en arena.
Las bacterias azufre-oxidantes tienen además la capacidad de
generar compuestos reductores a partir de la oxidación de azufre
elemental, esta propiedad les permite reducir el cromo hexavalente a
cromo trivalente, menos tóxico. Por tanto, debido a la evidente presencia
del Cr(VI) en distintos tipos de residuos, se consideró de interés el estudio de
la reducción de éste ion por parte de las bacterias azufre-oxidantes en
régimen discontinuo y continuo.
El estudio de la bioprecipitación de metales en solución con las
bacterias sulfato-reductoras (Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp.) se
realizó de forma discontinua empleando varias concentraciones de los
iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II). El estudio se realizó determinando la precipitación
de cada metal individualmente y, posteriormente, se estudió dicho proceso
con una combinación de todos los metales. El desarrollo del proceso de
precipitación en continuo persiguió una mayor disminución de la movilidad
de cada uno de los metales en solución en un medio acuoso.
Con el fin de integrar ambos procesos de una forma efectiva se
decidió inmovilizar previamente las bacterias azufre-oxidantes sobre espuma
de poliuretano. Para ello, se estudió previamente la dinámica de
inmovilización de cada una de las bacterias para determinar cual de ellas
podría resultar más ventajosa.
5
INTRODUCCION
Finalmente la integración de los procesos de solubilización y
precipitación en continuo estudiados permitió evaluar la transformación y la
disminución del contenido metálico de un residuo contaminado con cromo,
níquel y zinc.
En definitiva, el objetivo general del presente trabajo fue el
estudio de los procesos de solubilización con bacterias azufreoxidantes y de precipitación con bacterias sulfato-reductoras para el
tratamiento de residuos contaminados por metales pesados. Este
objetivo general se concretó en los siguientes objetivos específicos
desarrollados en el trabajo realizado:
- Estudio de la solubilización de compuestos insolubles de cromo,
níquel y zinc mediante la acción de las bacterias azufre-oxidantes,
At. ferrooxidans y At. thiooxidans, en régimen discontinuo y
continuo.
- Estudio de la reducción de Cr(VI) a Cr(III) por parte de las bacterias
azufre-oxidantes en régimen discontinuo y continuo.
- Estudio de la precipitación de iones metálicos (Cr(III), Ni(II) y Zn(II))
mediante
el
empleo
de
las
bacterias
sulfato-reductoras,
Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp., en régimen discontinuo y
continuo.
- Estudio de la integración de los procesos de solubilización y
precipitación de metales pesados en régimen continuo.
6
B.-ANTECEDENTES
ANTECEDENTES
1 CONTAMINACIÓN POR METALES PESADOS
1.1 METALES PESADOS: TOXICIDAD Y TÉCNICAS DE
REMEDIACIÓN
Los metales se encuentran de forma habitual formando parte de
depósitos minerales los cuales son procesados física y químicamente para la
obtención de metales puros. Esta actividad ha sido desarrollada a lo largo
de los siglos debido al elevado interés que representan estos elementos o
sus compuestos por su extensa aplicación en un gran número de industrias
(construcción, aeronáutica, automovilística…). En la tabla 1 se recogen las
aplicaciones más importantes de algunos de los metales más comunes.
Metal
Aplicaciones más comunes
Referencia
Ag
Fotografía, joyería
Gordon(2001)
Au
Joyería, electrónica, láminas
Gordon(2001)
Cd
Co
Cr
Cu
Ni
Galvanizado, baterías, pigmentos de plásticos y
pinturas
Imanes, superaleaciones
Acero inoxidable, materiales refractarios, curtido de
pieles
Sistemas eléctricos, tuberías, equipos de calefacción,
aleaciones
Aceros, aleaciones para monedas, utensilios de
cocina
Beveridge y Doyle(1989)
Gordon(2001)
Gordon(2001)
Beveridge y Doyle(1989)
Beveridge y Doyle(1989)
Pb
Baterías, cables, pigmentos y aleaciones.
Beveridge y Doyle(1989)
Pt
Joyería, catalizadores, electrónica
Gordon(2001)
Zn
Aleaciones, galvanizado, gomas, papel, productos
cosméticos y farmacéuticos, pinturas.
Mulligan y col.(2001)
Tabla 1: Principales aplicaciones de algunos metales pesados
Estos elementos han sido extraídos y utilizados ampliamente por el
hombre desde la antigüedad pero en las últimas décadas la rápida
9
ANTECEDENTES
expansión de la industria, el incremento de las actividades domésticas y el
carácter consumista de la sociedad actual han dado lugar a un aumento
desorbitado de la cantidad de metal emitida al medio ambiente. Los
metales se introducen en el medio ambiente como residuos procedentes de
la actividad minera o de otras fuentes como son la combustión del petróleo,
procesos industriales, restos de pesticidas y residuos domésticos, entre otros.
Los metales pesados se acumulan mayoritariamente en suelos y
sedimentos
cercanos
a
zonas
industriales
y
mineras.
Los
efluentes
procedentes de estas zonas son habitualmente sometidos a tratamientos de
depuración de aguas pero una vez que vuelven al medio natural persisten
en él, no pueden ser biodegradados y pueden además participar de un
gran número de reacciones que lo pueden hacer más o menos tóxico. En
general, pueden quedar adsorbidos en el suelo, incorporarse a ríos y lagos,
lixiviar hasta acceder a aguas subterráneas o expandirse en la atmósfera. La
movilidad de estos metales de un medio a otro ocurre mediante procesos
físicos, químicos o biológicos (Figura 1). La exposición a los metales pesados
a través del agua y los alimentos da lugar a la acumulación de éstos en
microorganismos, plantas, animales y
seres humanos lo que puede
desembocar en la alteración o extinción de estos seres vivos (Mulligan y col.,
2001).
10
ANTECEDENTES
n
ció
ala ión
Inh sorc n
Ab estió
Ing
te
sin
De
co
nd
en
n
ció
gra
Pr
e
cip
ita
c ió
n
Desintegración
S
Reacciones
químicas y
biológicas
n
ció
olu
Reacciones
químicas y
biológicas
sedimento
suelo
Me
teo
riza
ció
n
rocas
Sedimentación
Ev
ap
or
ac
ión
sac
ión
hidrosfera
biosfera
Desintegración
ev
ap
ora
ció
n
atmósfera
S
e
im
ed
n
c ió
nta
Figura 1: Procesos de movilización de los metales en el medio ambiente (Board, 1996).
Los metales pesados se pueden definir como aquellos metales con
una densidad por encima de 5 g/cm3, de forma que los elementos de
transición desde el vanadio hasta el semi-metal arsénico, del circonio al
bismuto y del lantano al polonio se consideran metales pesados junto con el
grupo de los lantánidos y los actínidos (Nies, 1999) que no son considerados
como tales por otros autores (Beveridge y Doyle, 1989). De cualquier modo,
la definición de metal pesado está asociada a aquellos metales que en
pequeña concentración resultan nocivos para los seres vivos.
De los 90 elementos que existen de forma natural en la Tierra, 21 son
no-metales, 16 son metales ligeros y los 53 restantes incluyendo el arsénico
son metales pesados. La mayoría de los metales pesados son elementos de
transición con orbitales d incompletos, que dan lugar a cationes con la
habilidad de formar compuestos complejos susceptibles de actuar en
reacciones redox y variar de este modo su movilidad en el medio en que se
11
ANTECEDENTES
encuentran o interaccionar con otros compuestos que se encuentren en él.
Habitualmente estos cationes juegan un importante papel como elementos
traza en complejas reacciones bioquímicas.
Sin embargo, a elevadas concentraciones los metales pesados
forman compuestos complejos no específicos en las células que pueden
producir efectos tóxicos. Algunos cationes de metales pesados como Hg(II),
Cd(II) y Ag(I) forman fuertes complejos que lo hacen demasiado tóxicos
para cualquier función fisiológica. Incluso algunos elementos traza básicos
en la alimentación, como el zinc, el níquel o el cobre, se convierten en
tóxicos a mayores concentraciones.
Entre los mecanismos moleculares que determinan la toxicidad de los
metales pesados se encuentran (Cañizares-Villanueva, 2000):
•
desplazamiento de iones metálicos esenciales de moléculas y
bloqueo de sus grupos funcionales.
•
modificación de la conformación activa de biomoléculas
(enzimas, polinucleótidos).
•
ruptura de la integridad de biomoléculas.
•
modificación de otros agentes biológicamente activos.
1.1.1 TÉCNICAS DE REMEDIACIÓN
En vista de la extensión de los metales pesados en el medio
ambiente, en los últimos tiempos se han venido desarrollando una serie de
técnicas que tratan de reducir su contenido o, mejor dicho, transformarlos
en formas más estables que no accedan con tanta facilidad a ciclos
biológicos.
Entre ellos se distinguen las técnicas de contención que tratan de
retener físicamente los contaminantes de modo que queden depositados
12
ANTECEDENTES
de forma controlada; las técnicas ex-situ que emplean transformaciones
físicas, químicas o biológicas para modificar la toxicidad o disponibilidad de
los contaminantes, pero tratándolos fuera de su ubicación original; y las
técnicas in-situ que se basan en la transformación de los contaminantes
presentes en el medio sin modificar su ubicación, habitualmente se
aprovechan propiedades de los microorganismos o las plantas para tratar
de reducir la contaminación propia del medio
1.1.1.1 Técnicas de contención
- Aislamiento y contención: Los medios contaminados se aíslan y se
confinan para prevenir posteriores movimientos, reducir la permeabilidad
del residuo e incrementar la capacidad de resistencia al residuo. Las
barreras físicas se realizan de acero, cemento, bentonita o ladrillo en capas
horizontales y/o verticales dispuestas de forma que eviten las infiltraciones.
- Solidificación/estabilización: Estas técnicas no implican barreras
físicas. La solidificación consiste en la encapsulación de los contaminantes
en una matriz sólida y la estabilización incluye la adición de un compuesto
(polímeros orgánicos y silicatos) que reacciona con el contaminante
reduciendo su movilidad. Estos tratamientos se hacen complejos in-situ
debido a la dificultad de mezcla de los componentes adicionados.
- Vitrificación: Es un proceso de solidificación/estabilización que
requiere el aporte de energía térmica. Esto implica la inserción de
electrodos en el medio contaminado transmitiéndose una corriente que
desplaza los iones metálicos y la posterior solidificación cuando el medio se
enfría.
1.1.1.2 Técnicas ex-situ
- Separación mecánica: El objetivo de estos procesos de selección
del tamaño de partícula es eliminar contaminantes que por su tamaño se
13
ANTECEDENTES
puedan distinguir de otras menos contaminantes. Para determinar si estos
procesos son adecuados resulta esencial caracterizar los tamaños de
partícula y el nivel de contaminación de cada fracción. Para la separación
física se emplean hidrociclones, tanques de sedimentación, columnas de
lecho fluidizado, flotación o separación magnética.
- Separación pirometalúrgica: Este tipo de procesos emplea hornos a
alta temperatura (200-700ºC) para volatilizar los metales presentes en suelos
contaminados y, posteriormente, los metales se recuperan o inmovilizan. Se
aplica actualmente al mercurio ya que éste es fácil de convertir a su forma
metálica a altas temperaturas. Otros metales como el arsénico, cromo,
cadmio y plomo requieren de un pretratamiento.
- Tratamientos químicos: Los tratamientos químicos por mecanismos
reductores u oxidantes se emplean para reducir la toxicidad o la movilidad
de los metales contaminantes. Se emplean habitualmente en el tratamiento
de aguas residuales. Las reacciones de oxidación, que pueden disminuir la
toxicidad, precipitando o solubilizando metales, implican la adición de
permanganato potásico, peróxido de hidrógeno, hipoclorito o cloro
gaseoso. Las reacciones de neutralización se emplean para ajustar el pH de
suelos ácidos o básicos. Las reacciones de reducción se inducen por la
adición de compuestos alcalinos como sodio, dióxido de azufre, sales de
sulfito
y
sulfato
ferroso.
Esta
técnica
se
emplea
a
veces
como
pretratamiento de otras como la solidificación/estabilización. Por otra parte,
al tratarse de reacciones no específicas se corre el riesgo de que otros
metales se transformen en formas más tóxicas o más móviles.
1.1.1.3 Técnicas in-situ
- Barreras permeables: Son barreras que contienen una sustancia
reactiva (física, química o biológica o una combinación de ellas) que está
dispuesta para reducir la movilidad de metales presentes en aguas
14
ANTECEDENTES
subterráneas cercanas a lugares contaminados. Hasta el momento se han
empleado como material zeolita, hidroxiapatita, hierro elemental y piedra
caliza
- Técnicas de electrocinética: Estos procesos implican el paso de una
corriente eléctrica de baja intensidad entre un cátodo y un ánodo
introducidos en el medio contaminado, los iones y pequeñas partículas
cargadas se transportan entre los electrodos. Un gradiente eléctrico inicia el
movimiento por electromigración (movimiento de las especies químicas
cargados),
electroósmosis
(movimiento
del
fluido),
electroforésis
(movimiento de partículas cargadas) o electrolisis (reacción química
producida por un campo eléctrico).
-
Técnicas
de
biorremediación:
Estos
procesos
bioquímicos
aprovechan la capacidad de los microorganismos de tolerar elevadas
concentraciones de metales pesados y de transformar las especies
metálicas en función del estado de oxidación en que se encuentran y de
las condiciones que existan en el medio. Los procesos más conocidos son la
biolixiviación, solubilización de un metal en estado insoluble en forma de
óxidos
o
sulfuros,
permitiendo
su
extracción;
la
bioprecipitación,
precipitación de un metal que se encuentra soluble y móvil en el medio
favoreciendo su deposición y separación, y la biosorción, retención de
metales por interacción fisicoquímica del metal con componentes de la
superficie celular.
- Fitoremediación: Estos procesos aprovechan la habilidad de
algunas plantas de acumular metales pesados en sus raíces, ramas y hojas
mediante mecanismos de adsorción o por la excreción de componentes
que pueden variar las condiciones del suelo dando lugar a la formación de
complejos metálicos. La elección del método más adecuado depende de
las condiciones climáticas y de la biodisponilidad del metal en el suelo. Estas
15
ANTECEDENTES
técnicas tienen el inconveniente de requerir un tiempo elevado para la
obtención de resultados, habitualmente se emplean plantas que se
caracterizan por un rápido crecimiento. (Mulligan y col., 2001)
1.2 MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS
Algunos metales son esenciales para los microorganismos mientras
que otros son tóxicos incluso en pequeña cantidad. La habilidad para
crecer a altas concentraciones de metal se ha encontrado en muchos
microorganismos (Nies, 1999) y puede ser el resultado de mecanismos
intrínsecos o inducidos (Ledin, 2000). Gadd (1992) definió tolerancia como la
habilidad para soportar la presencia de metales tóxicos por medio de
propiedades intrínsecas y resistencia como la habilidad para sobrevivir en
presencia de metales tóxicos por medio de mecanismos de disminución de
toxicidad producidos como respuesta directa a la presencia de metal. Así,
muchos microorganismos se han adaptado adecuadamente a la presencia
de metales mediante sistemas de resistencia cromosómicos. Las mejoras en
las técnicas de manipulación genética pueden aumentar la resistencia a los
metales de gran número de microorganismos haciéndolos susceptibles de
ser
aplicados
para
la
remediación
a
mayor
escala
de
medios
contaminados (Bruins y col., 2000).
Existe una gran diversidad de formas por las que los microorganismos
pueden interaccionar con los metales y variar su toxicidad (figura 2),
principalmente:
16
ANTECEDENTES
Membrana celular/espacio periplasmático
Adsorción/Intercambio iónico
Reacciones redox/Transformaciones
Precipitación
Difusión y transporte
Pared celular
Adsorción/Intercambio iónico
Unión covalente
Atrapamiento de partículas
Reacciones redox
Precipitación
Intracelular
Metalotioninas
Péptidos de metal gamma-glutamilcisteína
Enlazamiento no específico/Quelación
Compartimentalización en organelos
Reacciones redox/Transformaciones
Materiales asociados a células
(Polisacáridos, cápsulas)
Intercambio iónico
Atrapamiento de particulas
Enlazamientono específico
Precipitación
Reacciones extracelulares
Precipitación por productos excretados
Formación de complejos y quelación
Sideróforos
Figura 2: Procesos que contribuyen a la captación microbiana y disminución de la toxicidad
de metales. (Gadd y White, 1993).
•
Transformación mediante procesos redox, alquilación, etc.
modificando la movilidad y toxicidad de los metales.
•
Acumulación de metales, que puede ser por un metabolismo
independiente
(acumulación
pasiva), sorción
o
por un
metabolismo dependiente que implica transporte intracelular
(acumulación
activa),
consumo.
Pueden
ocurrir
ambos
mecanismos en el mismo organismo.
•
Producción o eliminación de sustancias, como compuestos
orgánicos que varían la movilidad de los metales, o sulfuros
que reducen la movilidad de éstos.
•
Participación en el ciclo del carbón, influyendo en la cantidad
y características de la materia orgánica, lo cual puede variar
en la movilidad de ciertos metales, ya que los compuestos
17
ANTECEDENTES
orgánicos
formación
podrían
de
formar
complejos
enlace
con
los
metales.
La
organo-metálicos
modifica
la
especiación de los metales.
•
Modificación de la movilidad de los metales de forma
indirecta por cambios en el pH, potencial redox, etc.
consecuencia de su propio metabolismo.
1.2.1 TÉCNICAS DE BIORREMEDIACIÓN
Los avances tecnológicos desarrollados actualmente para la
remediación de medios contaminados por metales pesados consisten en el
uso selectivo y la mejora de procesos naturales para el tratamiento de
residuos particulares. Las distintas interacciones entre microorganismo y
metal han dado lugar al desarrollo de distintos bioprocesos, algunos de los
cuales, se describen a continuación. La descripción de estos bioprocesos
(Figura 3) se puede realizar atendiendo a si movilizan o inmovilizan las
especies metálicas presentes en el medio contaminado (CañizaresVillanueva, 2000).
1.2.1.1 Técnicas de movilización
Biolixiviación
Los procesos de biolixiviación están basados en la habilidad de
ciertos microorganismos (bacterias, hongos) para transformar compuestos
sólidos dando lugar a elementos solubles y extraíbles, los cuales pueden ser
recuperados (Krebs y col., 1997). Esta capacidad implica principalmente:
•
reacciones redox.
•
formación de ácidos orgánicos e inorgánicos.
•
excreción de agentes complejantes.
18
ANTECEDENTES
MOVILIZACIÓN
INMOVILIZACIÓN
M-org
M
org
Eliminación/producción
de sustancias
movilizadoras de metal
Acumulación de metales
M activa
M pasiva
Fe(II)
U (ox)
Reducción de metal
Reducción de metal
U (red)
Fe(III)
Fe(II)
oxidación de metal
Oxidación de azufre
Fe(III)
descenso de pH
Biodegradación
de compuestos
organo-metálicos
Movilización de metal
M
sulfuro
Reducción de azufre
aumento de pH
Inmovilización de metal
M-org
Figura 3: Interacciones entre metales y microorganismos (Ledin, 2000)
Existe una gran diversidad de microorganismos de los que se conoce
su capacidad de lixiviar metales, entre ellos hay autótrofos, de cómo los
microorganismos del género Thiobacillus, y heterótrofos, como especies del
género Aspergillus y Penicillium, entre otros. La lixiviación de minerales con
sulfuro se basa en la actividad de bacterias quimiolitotrófas, principalmente
Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans, las cuales
convierten los sulfuros metálicos insolubles en sulfatos metálicos solubles
mediante una reacción de oxidación. La lixiviación de minerales sulfurados
por la acción de este tipo de bacterias con el objetivo de la extracción de
metales valiosos es una bioindustria ya establecida, sin embargo, hasta
hace unos años no se han comenzado a dar aplicaciones de la lixiviación
dirigidas a la reducción de la contaminación de suelos y otras matrices
contaminadas con metales pesados. La lixiviación de minerales no sulfurosos
(óxidos, carbonatos o silicatos) se lleva a cabo por bacterias y hongos
19
ANTECEDENTES
heterótrofos que excretan ácidos orgánicos o agentes quelantes o
complejantes que disuelven el metal presente en el medio. La biolixiviación
representa una tecnología limpia con bajo coste económico y bajo
requerimiento energético (Bosecker, 1997, Krebs y col., 1997)
1.2.1.2 Técnicas de inmovilización
Bioacumulación
Este tipo de técnicas se basan en la capacidad de algunos
microorganismos para interaccionar con especies metálicas por medio de
su superficie celular. Los microorganismos más adecuados para este tipo de
procesos son aquellos que tienen una relación área superficial/volumen
elevada para garantizar una superficie de contacto suficiente y poder así
interaccionar con el metal que se encuentra en sus alrededores.
La bioacumulación puede ser pasiva, llamada entonces biosorción, y
depende principalmente de las propiedades de superficie como la carga,
la orientación de los grupos funcionales sobre la superficie celular y de la
especiación del metal y su estado químico en la fase acuosa. La
bioacumulación consta básicamente de dos etapas, primero ocurre la
interacción electrostática entre los iones metálicos y los grupos reactivos
dispuestos sobre la superficie celular y, segundo, estos lugares se comportan
como núcleos de deposición de más metales. Actualmente se han
desarrollado procesos de biosorción con biomasa viva y muerta (CañizaresVillanueva, 2000).
Pero, además, los microorganismos tienen mecanismos de consumo o
acumulación de metales esenciales para su metabolismo y, en ocasiones,
pueden desarrollar esta capacidad para acumular metales no esenciales
en su interior. La bioacumulación activa o bioacumulación intracelular
requiere que se produzcan reacciones o componentes metabólicos por
20
ANTECEDENTES
parte de la célula, para ello necesitan de una fuente de energía. El
mecanismo intracelular se realiza mediante un sistema de transporte
específico que permite inmovilizar el metal en el interior de la célula. La
bioacumulación pasiva y activa puede darse de forma simultánea en un
mismo microorganismo (Ledin, 2000).
Bioprecipitación
Los microorganismos pueden inmovilizar de forma efectiva ciertos
metales pesados a través de su capacidad para reducir esos elementos a
estados de oxidación menores que los transforman en especies metálicas
menos activas, es decir, de menor movilidad. A veces este fenómeno está
muy ligado al de biosorción (Valls y Lorenzo, 2002). Uno de los mejores
ejemplos de este tipo de procesos lo representa la producción de sulfuro de
hidrógeno por parte de bacterias sulfato-reductoras, el cual reacciona con
metales pesados en forma soluble para transformarlos en compuestos
sulfuro, insolubles. Las bacterias del género Citrobacter tiene la capacidad
de precipitar metales pesados en forma de fosfatos (Beveridge y Doyle,
1989).
1.3 RESIDUOS DE LA INDUSTRIA DE GALVANIZADO
Una de las mayores fuentes de contaminación por metales pesados
la constituyen los residuos (emisiones, efluentes, lodos, etc.) procedentes de
las industrias. Como ejemplo de los residuos a tratar por los procesos
propuestos
en
esta
memoria
podemos
considerar
los
residuos
de
galvanizado. Las industrias dedicadas al galvanizado de piezas metálicas
destacan por su elevado contenido en este tipo de elementos. La
legislación actual establece los límites de vertido de los residuos
procedentes de este tipo de industrias por la toxicidad que suponen para el
medio ambiente. Como métodos prioritarios para la disminución del
21
ANTECEDENTES
contenido metálico en estos residuos se han comenzado a tomar medidas
en el proceso de fabricación tales como la separación de efluentes o la
sustitución de compuestos por otros menos nocivos.
Los métodos galvánicos o de recubrimiento electrolítico consisten en
depositar por vía electroquímica finas capas de metal sobre la superficie
sumergida en una solución hídrica con iones metálicos, electrolitos, al hacer
pasar una corriente (Figura 4). El objetivo es aportarle propiedades de
resistencia mecánica, conductoras o decorativas. El balance general de
este tipo de procesos se recoge en la figura 4. No obstante, es evidente que
en función del recubrimiento electrolítico que se utilice se van a generar
distintos de residuos. Así se pueden distinguir:
RECUBRIMIENTO ELECTROLÍTICO
e-
e-
Ánodo
Cátodo
Electrolito
M+n
M
Recubrimiento de M
Figura 4: Esquema de un baño de recubrimiento electrolítico.
22
ANTECEDENTES
Pieza metálica
Agua residual de
enjuague
Agua
Electrodos
contaminados o
usados
Sales metálicas
Aditivos
Ánodos
Recubrimiento electrolítico
Material auxiliar
(filtros, carbón activo).
Lodos anódicos o
de limpieza
Material auxiliar
usado
Electricidad
Emisiones
Pieza recubierta
Figura 5: Diagrama de balance de materiales para las operaciones de recubrimiento
electrolítico
Cobrizado: Los baños de cobre pueden ser ácidos (sulfato de cobre)
o alcalinos (cianuro de cobre). Los ácidos requieren un mayor control pero
se prefieren a los cianurados por su toxicidad para el medio ambiente y la
salud.
Niquelado: En el galvanizado con níquel se pueden utilizar baños de
sulfamatos o baños “Watts” con sulfatos de níquel. La mezcla con otros
componentes del proceso puede generar complejos de níquel muy estables
y difíciles de tratar.
Cromado: los baños de cromado emplean cromo trivalente y
hexavelente. Debido a la elevada toxicidad del cromo (VI) sobre los seres
vivos, se realiza un control más exhaustivo de los residuos emitidos en esta
etapa y, generalmente, se someten sus aguas residuales a procesos con
bisulfito de sodio para reducir el Cr(VI) a Cr(III), menos tóxico.
Zincado: Los baños de zinc pueden ser cianurados (alcalinos) y
existen otros (ácidos) basados en potasio y amonio. Los baños cianurados,
23
ANTECEDENTES
por la toxicidad que representan, están comenzando a ser sustituidos por
otros compuestos como sales de sodio.
Actualmente, los residuos de galvanizado se suelen derivar a:
•
confinamiento controlado
•
reciclaje/reutilización
•
almacenamiento temporal en la planta
•
relleno sanitario
•
tratamiento fisicoquímico
•
drenaje municipal
Durante los últimos años, se han tomado las siguientes medidas para
reducir la contaminación por metales pesados en este tipo de plantas:
Enjuagues de recuperación y prolongación del escurrido: la pieza
recubierta se enjuaga y se trata de recuperar, aumentando la eficacia del
escurrido, el metal implicado en esa etapa para volver a emplearlo en el
baño electrolítico.
Sustitución de los compuestos metálicos más dañinos: los baños
cianurados de zinc se sustituyen por baños neutros de cloruro de zinc o
baños ácidos de sulfato, cloruro o fluoroboratos de zinc. Los baños
cianurados de cobre se sustituyen por baños ácidos de sulfato o
fluoroborato de cobre. Además se comienza a sustituir el cromo
hexavalente por cromo trivalente en el proceso de cromado, aunque esto
supone mayor coste y mantenimiento.
Eliminación de compuestos quelantes: en algunos baños de
recubrimiento electrolítico se emplean este tipo de compuestos para
controlar la concentración de iones libres en la solución pero pueden inhibir
24
ANTECEDENTES
la precipitación de los metales, por ello la tendencia es no emplearlos para
favorecer el tratamiento posterior de los lodos con metales.
Recuperación de metales y sales metálicas de los baños mediante
procesos de:
•
Ósmosis inversa
•
Electrodiálisis
•
Precipitación y separación.
•
Separación electrolítica.
•
Evaporación
•
Intercambio iónico
Entre los factores que determinan si la recuperación del metal es
económicamente justificable se incluyen el volumen de residuo que
contiene el metal, su concentración, el potencial para reutilizar el metal una
vez recuperado y los costos de tratamiento y deposición. Algunas de las
características más relevantes de estos procesos se recogen en la tabla 2.
Habitualmente, los métodos convencionales para eliminar los metales
pesados de los efluentes industriales resultan muy costosos. La necesidad de
encontrar procesos más económicos hace atractivos a los procesos
biológicos que pueden reducir el contenido de estos contaminantes de
forma eficaz y sin implicar elevados costes (Atkinson y col, 1996). En este
sentido, se vienen desarrollando algunos trabajos que van desde la
utilización de corteza de árbol cuyos componentes actúan como agentes
quelantes sobre los metales pesados (Gaballah y Kilbertus, 1998), el uso de
subproductos de algunas industrias (barros, cenizas, etc.) u otros soportes
(arena, silica, etc.) para actuar como base para procesos de adsorción
(Santos y Oliveira, 2003, Ciccu y col., 2003), el empleo de bacterias, hongos
25
ANTECEDENTES
o algas como biosorbentes (Atkinson y col., 1996, Malik, 2004) o el desarrollo
de procesos con otros microorganismos para la solubilización de los metales
presentes en un residuo industrial (Bosecker, 2001).
Técnica
Intercambio
iónico
Ósmosis inversa o
electrodiálisis
Objetivo
Recuperación
del electrolito
Recuperación del
electrolito y el
agua desionizada
Requisitos
Costos
Relación
costo/
beneficio
Aplicación
Limitantes
equipo de
intercambio
iónico, agua
desionizada,
energía electrica
Alto
Separación
electrolítica
Recuperación
interna de
metales en
enjuagues o
soluciones
concentradas
Evaporación
Concentración
de los enjuagues
para retornarlos
al baño
Energía eléctrica,
membranas
Equipo de
electrolisis,
energía
eléctrica
Equipo de
evaporación
atmosférica,
energía
Alto
Bajo-medio
alto
Regular-/mala
Buena
Buena
Regular -mala
Recuperación
de metales
presentes como
electrolitos
Recuperación de
metales en el
primer enjuague
de cascada
Recuperación
de metales en
enjuagues de
recuperación o
de cascada
Recuperación d
metales en
baños calientes
Uso de agua
desionizada.
Resistencia de las
membranas a
cambios en el pH
y la temperatura.
No aplicable al
cromo
Solo para
soluciones
concentradas.
No aplicable al
cromo
Baños calientes
sin tensioactivos
Es recomendable
el agua
desionizada
Exige alto control
de proceso.
No se puede usar
para algunos
electrolitos
Tabla 2: Principales características de algunos de los tratamientos empleados para recuperar
metales en las plantas de galvanizado (GTZ, 1998)
1.4 CARACTERÍSTICAS Y TOXICIDAD DE LOS METALES
ESTUDIADOS
Existe un gran número de metales que se encuentran de forma
habitual
en
los
medios
contaminados
por
la
actividad
industrial,
principalmente. De todos ellos, se han seleccionado para el estudio de su
posible eliminación o reducción por medio de la actividad bacteriana, los
26
ANTECEDENTES
iones cromo (III), niquel (II) y zinc(II). Estos iones se encuentran a distintas
concentraciones en los efluentes industriales y existe una legislación que
detalla los niveles máximos permitidos en el medio ambiente.
1.4.1 CROMO
1.4.1.1 Características
El cromo es un metal de color blanco plateado, duro y quebradizo,
relativamente suave y dúctil cuando se encuentra en estado puro y no está
tensionado. No se encuentra en estado elemental en la naturaleza. Su
mineral más importante por abundancia es la cromita (FeCr2O4 o FeO·
Cr2O3). El cromo puro se obtiene por reducción del óxido de cromo(III) con
aluminio (procedimiento aluminotérmico), mediante electrolísis o a partir de
ioduro crómico. Sus características más relevantes y las de sus compuestos
más comunes se recogen en la tabla 3. (Página web 1)
Existen cuatro isótopos naturales del cromo:
50Cr, 52Cr, 53Cr
y
54Cr.
Se
han producido otros mediante reacciones radioquímicas de los cuales el
más importante es el 51Cr.
El cromo galvanizado y pulido es de color blanco azulado brillante y
su poder reflejante es el 77% del de la plata.
El cromo forma fundamentalmente compuestos con el oxígeno: óxido
de cromo (II) (CrO), óxido de cromo(III) (Cr2O3) y óxido de cromo (VI) (CrO3).
Se conocen también los peróxidos, ácido percrómico y percromatos y son
muy comunes los halogenuros.
27
ANTECEDENTES
Nombre
Cromo
Símbolo
Cr
Nº atómico
24
Masa atómica (g/mol)
51,996
Valencia
2, 3, 4, 5, 6
Aspecto
metal blanco-azul plateado
Nº CAS
7440-47-3
Punto de ebullición (ºC)
2665
Punto de fusión (ºC)
1857
Densidad (g/ml) a 20ºC
7,19
Solvólisis
en H2SO4 y HCl diluidos
Presión vapor (Pa, 844ºC)
10-6
Configuración electrónica
[Ar] 3d54s1
Electronegatividad
1,66
1er
6,80
Pot. de ionización (eV)
Radio atómico (Å)
1,27
Radio covalente (Å)
1,27
Radio iónico (Å) (e.o +3)
0,69
Tabla 3a: Datos generales y características fisico-químicas del cromo.
Nombre
Dicromato de sodio (dihid)
Óxido de cromo(VI)
Fórmula
Na2Cr2O7·2H2O
CrO3
Masa molecular (g/mol)
298 (anhidro 261,98)
99,99
Aspecto
agujas anaranjadas-rojas
Cristales rojo oscuro
Nº CAS
7789-12-0
1333-82-0
Punto de ebullición (ºC)
> 400 ºC descomposición
No destilable
Punto de fusión (ºC)
357ºC (>86º sal anhidra)
198ºC
Densidad (g/ml)
2,35-2,52
2,7
Solvólisis
73,18% en H2O a 20ºC
1660 g/l a 20ºC
Tabla 3b: Características de algunos compuestos comunes de cromo (VI)
Sus propiedades mecánicas, dureza y resistencia a la tensión, le
proporcionan una gran variedad de aplicaciones. El cromo tiene una
capacidad relativamente baja de forjado, enrrollamiento y propiedades de
28
ANTECEDENTES
manejo, pero cuando se encuentra libre de oxígeno, hidrógeno, carbono y
nitrógeno es muy dúctil y se puede forjar y manejar.
Las principales aplicaciones del cromo son: su uso como catalizador
en la síntesis del amoniaco, en la fabricación de aceros de cromo y aceros
inoxidables, en aleaciones con cromo y en el cromado galvánico. Los
compuestos orgánicos del cromo se emplean como pigmentos para
pinturas y las sales de cromo(VI) se emplean para la preservación de la
madera y el curtido de cueros (Pais y Benton, 2000).
1.4.1.2 Toxicidad
El cromo es un elemento natural que se encuentra en rocas,
animales, plantas, suelos y en polvos y gases volcánicos. Las formas más
comunes en el medio ambiente son Cr elemental, Cr(III) y Cr(VI). No se
asocia un olor o sabor característico a este tipo de compuestos.
El cromo (III) aparece de forma natural en el ambiente y es un
elemento nutritivo esencial ya que interviene en algunos procesos
metabólicos. El cromo elemental y el cromo (VI) se producen generalmente
por procesos industriales.
Resultado de las actividades industriales, el cromo en sus distintas
formas entra en contacto con el medio natural, es decir, con el aire, agua,
suelo y, consecuentemente, en la cadena alimenticia.
Agua: En los sistemas acuáticos, la toxicidad de los compuestos
solubles de cromo varía según la temperatura, pH, dureza del agua y
organismos que la pueblan. Los compuestos de cromo (VI) se disuelven con
facilidad, pero en condiciones naturales y en presencia de materia
orgánica oxidable, se reducen rápidamente a compuestos de cromo (III)
más estables y menos hidrosolubles.
29
ANTECEDENTES
Suelo: La movilidad del cromo se evalúa considerando la capacidad
de adsorción y reducción de los suelos y sedimentos. Los hidróxidos de
cromo (III), una vez sedimentados, difícilmente vuelven a movilizarse, ya que
la oxidación a cromo (VI) no ocurre de forma natural. El cromo (VI) resulta
tóxico aun en concentraciones muy bajas, siendo el pH del suelo un factor
muy influyente. El uso de fosfatos incrementa la entrada de cromo en el
suelo.
Cadena alimentaria: Los compuestos de cromo (III) asimilados junto
con los alimentos resultan relativamente inocuos, sin embargo, los de cromo
(VI) son altamente tóxicos. Los animales y seres humanos incorporan al
organismo cantidades relativamente bajas de cromo por inhalación. La
mayor entrada de cromo se produce por el agua o los alimentos que se
ingieren, la resorción en el intestino depende de la forma en que se
encuentre este metal. Se asimilan el 20-25% del cromo de complejos
orgánicos y un 0,5% del cromo inorgánico. La gran parte del cromo que se
encuentra en el medio ambiente se atribuye a emisiones industriales. Las
emisiones naturales hacia la atmósfera son de unas 58000 t/a y las de origen
industrial cerca de las 100000 t/a.
Riesgos sobre la salud humana: Respirar niveles altos de cromo (VI)
provoca irritación y hemorragias nasales y úlceras y perforaciones en el
tabique nasal. Los efectos agudos que puede provocar el contacto con
derivados del cromo hexavalente son fuerte irritación de la piel e incluso
quemaduras, así como alteraciones hepáticas y renales. Como efectos
crónicos se conocen la dermatitis alérgica de contacto y el cáncer de
pulmón (OIT, 2001).
30
ANTECEDENTES
1.1.2.NIQUEL
1.1.2.1.Características
El níquel es un metal blanco plateado. Es duro, maleable, dúctil, algo
ferromagnético y buen conductor del calor y de la electricidad. Este metal
es estable al aire y al agua y no se suele encontrar de forma libre en la
naturaleza pero es muy común encontrarlo de forma elemental en los
meteoritos (5-20%) y se cree que hay gran cantidad de este elemento en el
núcleo terrestre. Los minerales más comunes de este metal son la pirrotina
(pirita de cobre [CuFeS2], pentlandita [NiS]), garnierita [(Ni,Mg)3H4Si2O11],
millerita [NiS], niquelina [NiAs] y algunos más.
Existen cinco isótopos naturales del níquel:
58Ni, 60Ni, 61Ni, 62Ni
y
64Ni.
Además se han identificado siete isótopos radiactivos. En la tabla 4 se
resumen las principales características del níquel y algunos de sus
compuestos.
Los compuestos más comunes del níquel son: el tetracarbonilo de
níquel [Ni(CO4)], líquido incoloro sumamente venenoso, el óxido de níquel
[NiO] , el cloruro de níquel [NiCl2] y el sulfato de níquel [NiSO4].
Entre las aplicaciones principales del níquel destacan su uso
formando parte de aleaciones, forma aleaciones con casi todos los
metales, en técnicas de niquelado para recubrimiento de metales como
protección
a
la
corrosión,
fabricación
de
monedas
y
blindajes,
catalizadores, baterías de níquel-cadmio y pigmentos para pinturas entre
otras (Pais y Benton, 2000).
31
ANTECEDENTES
Nombre
Níquel
Símbolo
Ni
Nº atómico
28
Masa atómica (g/mol)
58,71
Valencia
2, 3
Aspecto
Blanco plateado
Nº CAS
7440-02-0
Punto de ebullición (ºC)
2730
Punto de fusión (ºC)
1455
Densidad (g/ml) a 20ºC
8,9
Solvólisis
en H2SO4 y HCl diluidos
Presión vapor (Pa, 20ºC)
0
Configuración electrónica
[Ar] 3d84s2
Electronegatividad
1,8
1er
7,68
Pot. de ionización (eV)
Radio atómico (Å)
1,24
Radio covalente (Å)
1,21
Radio iónico (Å) (e.o +2)
0,78
Tabla 4a: Datos generales y características fisico-químicas del níquel.
Nombre
Tetracarbonilo de níquel
cloruro de níquel
Fórmula
Ni(CO4)
NiCl2(·6H2O)
Masa molecular (g/mol)
170,75
129,6
Aspecto
Líquido incoloro
Cristales amarillo pálido
Nº CAS
13463-39-3
7718-54-9
Punto de ebullición (ºC)
42,2
Punto de fusión (ºC)
-19,3
987
Densidad (g/ml)
1,31
3,55
Solvólisis
Disolventes orgánicos
En agua: 1170 g/l
Tabla 4b: Características de algunos compuestos comunes de níquel.
1.1.2.2.Toxicidad
El níquel es liberado al aire por las plantas de producción de energía
y las incineradoras de basuras y es, posteriormente, depositado en el suelo.
También puede llegar al medio ambiente en las aguas residuales. La mayor
32
ANTECEDENTES
parte de los compuestos de níquel liberados al ambiente se absorben por
los sedimentos o partículas del suelo donde el níquel es finalmente
inmovilizado.
Agua: En los sistemas acuáticos el níquel, habitualmente, se
encuentra en estado de oxidación (II), la forma en que se encuentra en el
agua depende del pH. Los compuestos de níquel ingresan en el agua
generalmente de modo antropogénico y se pueden encontrar sales
solubles, óxidos insolubles o polvo de níquel metálico.
Aire: El níquel en el aire se encuentra en forma de aerosol. En el aire la
forma metálica es estable. Con respecto a las emisiones, las mayores
corresponden a sulfatos, óxidos simples y óxidos complejos de níquel y, en
menor medida, el polvo de níquel metálico.
Suelo: Se suele encontrar como mineral cristalino inorgánico, en
complejos quelados o como ión libre. El comportamiento de estos
compuestos en el suelo depende de su naturaleza y, principalmente, del
tipo de suelo. Generalmente la disminución del pH incrementa la desorción
y, por tanto, aumenta el contenido de níquel en solución en el suelo.
Cadena alimentaria: Numerosas plantas acumulan níquel que toman,
principalmente, del suelo a través de su sistema radicular, lo cual hace que
la ingestión de níquel por el ser humano se pueda deber al consumo de
vegetales. Para muchas plantas el níquel constituye un nutriente importante
para el crecimiento vegetal.
Riesgos sobre la salud humana: El metal y sus compuestos inorgánicos
se pueden considerar inocuos pero el contacto permanente con la piel
puede provocar la “sarna del níquel”. Los compuestos orgánicos, como el
tetracarbonilo de níquel son extremadamente tóxicos. Los riesgos principales
derivados de la exposición continuada a compuestos de níquel son:
33
ANTECEDENTES
alergias, rinitis, sinusitis, enfermedades respiratorias y cáncer (cavidades
nasales, pulmón) (OIT, 2001).
1.4.2 ZINC
1.1.3.1.Características
El zinc puro y recientemente pulido es de color blanco azulado y
brillante, es dúctil y maleable pudiéndose enrollar y tensar pero cantidades
pequeñas de otros metales pueden volverlo quebradizo. Es buen conductor
del calor y de la electricidad. El zinc puro no es ferromagnético. Los
minerales de zinc son muy comunes y se suelen encontrar acompañados de
otros metales (plomo, cadmio, hierro, cobre…), entre ellos destacan: la
blenda (esfarelita) [ZnS], la wurzita [ZnS], la smithsonita o calamina [ZnCO3],
la hemimorfita y willemita (silicatos de zinc) y la cincita [ZnO] (Tabla 5).
Se conocen un gran número de isótopos del zinc de los cuales los
cinco más estables son: 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn y 70Zn.
El zinc normalmente forma los compuestos en estado divalente, los
más importantes son: el óxido de zinc [ZnO] que se emplea como pigmento
blanco, relleno de materiales de caucho, farmacia, cosmética, tintas y
equipos eléctricos; el sulfuro de zinc [ZnS] que se emplea como fluorescente
en señales, televisiones, radioscopia y pinturas, y el sulfato de zinc [ZnSO4] útil
en la fabricación de pinturas, tratamiento de maderas y obtención de zinc
hidrolítico.
Las aplicaciones del zinc más importantes son su uso en aleaciones,
sobretodo con aluminio y cobre que aumentan su solidez, su empleo como
protección superficial de otros metales en chapas y alambres de hierro,
cubos y techados y el agregado de magnesio es muy empleado en la
industria del automóvil (Pais y Benton, 2000).
34
ANTECEDENTES
Nombre
Zinc, cinc
Símbolo
Zn
Nº atómico
30
Masa atómica (g/mol)
65,38
Valencia
+2
Aspecto
Blanco-azulado brillante
Nº CAS
7440-66-6
Punto de ebullición (ºC)
907
Punto de fusión (ºC)
419,5
Densidad (g/ml) a 20ºC
7,14
Solvólisis
En ácidos y bases
Presión vapor (Pa, 103,3ºC)
1,3 x 10-7
Configuración electrónica
[Ar] 3d104s2
Electronegatividad
1,6
1er Pot. de ionización (eV)
9,42
Radio atómico (Å)
1,38
Radio covalente (Å)
1,31
Radio iónico (Å) (e.o +2)
0,74
Tabla 5a: Datos generales y características fisico-químicas del zinc.
Nombre
Óxido de zinc
Sulfato de zinc
Fórmula
ZnO
ZnSO4
Masa molecular (g/mol)
81,37
161,43
Aspecto
Cristales o polvo blanco
Cristales incloros
Nº CAS
1314-13-2
7733-02-0
Punto de fusión (ºC)
1975
>600
Densidad (g/ml)
5,6
Solvólisis
En agua: 1,6 x
3,54
103
Tabla 5b: Características de algunos compuestos comunes de zinc
1.4.2.1 Toxicidad
El zinc se encuentra de forma natural en el aire, el agua y el suelo
pero
actualmente
las
concentraciones
están
aumentando
por
las
35
ANTECEDENTES
actividades industriales como la minería, la combustión del carbón y los
residuos y el procesado del acero.
Agua: La presencia de zinc en el agua se debe principalmente a los
vertidos de aguas residuales que no son depuradas de forma satisfactoria, lo
cual puede provocar el aumento de la acidez del suelo. Este metal
permanece estable en agua dulce y salada debido a la capa de óxido que
lo recubre. En polvo, debido a la gran superficie de contacto, es muy
reactivo, creando peligro de explosión.
Suelo: Se puede detectar acumulación de zinc en suelos hasta un
radio de varios kilómetros de distancia de las plantas metalúrgicas y en las
cercanías inmediatas no es posible la explotación agrícola. La presencia de
zinc afecta a las plantas y puede interrumpir la actividad biológica en los
suelos, dificultando la descomposición orgánica.
Cadena alimentaria: En suelos ricos en zinc sólo un número limitado
de plantas tiene la capacidad de sobrevivir ya que la presencia de este
metal produce necrosis, clorosis e inhibe el crecimiento. Algunos peces
pueden acumular zinc cuando viven en cursos contaminados de agua. La
acumulación de zinc en seres vivos y plantas afecta claramente a la
cadena alimentaria.
Riesgos sobre la salud humana: El zinc es nutriente esencial para los
humanos y los animales (cofactor enzimático) su deficiencia provoca
problemas en el crecimiento y la madurez y anemia. En contraposición un
exceso de zinc produce úlceras de estomago, irritación de la piel, vómitos,
daños en el páncreas, disturbios en el metabolismo de las proteínas y
arteriosclerosis. La exposición continuada en el ambiente de trabajo
produce la fiebre o los escalofríos del zinc (OIT, 2001).
36
ANTECEDENTES
1.5 LEGISLACIÓN SOBRE METALES PESADOS
Los metales pesados son considerados como residuos tóxicos y
peligrosos por la ley 20/1986, de 14 de Mayo, Básica de Residuos Tóxicos y
Peligrosos. Dicha ley fue modificada por el Real Decreto 952/1997, de 20 de
junio, y en ella se exponen la clasificación de residuos, los modos de gestión
y las obligaciones del productor de residuos.
La generación de residuos con presencia de metales pesados
proviene de muchas y diversas fuentes. La orden del Ministerio de Medio
Ambiente MAM/304/2002, de 8 de Febrero, publica las operaciones de
valorización y eliminación de residuos y la lista europea de residuos.
En la tabla 6 se recopilan los principales residuos que contienen
metales pesados obtenidos a partir de la clasificación europea de residuos
procedente de la decisión 2000/532/CE de 3 de Mayo de 2000. Por otra
parte esta orden presenta un listado de las operaciones de eliminación y
valorización de residuos, entre ellas se consideran algunas de las
actividades relacionadas con el tipo de residuos que se tratan en este
estudio (tabla 7).
Resulta complicado establecer unos valores límite de metales
pesados
en
suelos,
lodos,
aguas
y
sedimentos,
ya
que
estas
concentraciones dependen del tipo de residuo en que se encuentren y de
la legislación propia de cada estado o comunidad autónoma.
Ya que el residuo a tratar bajo el proceso estudiado en el presente
trabajo se constituye de una matriz sólida en la que se encuentran
inmovilizados los metales pesados, podemos hacer referencia a la
legislación existente respecto a la aplicación de lodos a suelos.
37
ANTECEDENTES
01 Residuos de la prospección, extracción de minas y canteras y tratamientos físicos y químicos de
minerales
010101
Residuos de la extracción de minerales metálicos
010304
Estériles que generan ácido procedentes de la transformación de sulfuros
010307
Otros residuos que contienen sustancias peligrosas
transformación física y química de minerales metálicos.
procedentes
de
la
04 Residuos de las industrias del cuero, de la piel y textil
040104
Residuos líquidos de curtición que contienen cromo
040106
Lodos, en particular los procedentes del tratamiento in situ de efluentes, que
contienen cromo.
040108
Residuos de piel curtida (serrajes, rebajaduras, recortes, polvo de esmerilado) que
contienen cromo.
06 Residuos de procesos químicos inorgánicos
060313
Sales sólidas y soluciones que contienen metales pesados
060315
Óxidos metálicos que contienen metales pesados
060405
Residuos que contienen otros metales pesados
060502
Lodos de tratamiento in situ de efluentes que contienen sustancias peligrosas
10 Residuos de procesos térmicos
1005
Residuos de la termometalurgia del zinc
1006
Residuos de la termometalurgia del cobre
1008
Residuos de la termometalurgia de otros metales no férreos
11 Residuos del tratamiento químico de superficie y del recubrimiento de metales y otros materiales;
residuos de la hidrometalurgia no férrea
110109
Lodos y tortas de filtración que contienen sustancias peligrosas
110111
Líquidos acuosos de enjuague que contiene sustancias peligrosas
110202
Lodos de la hidrometalurgia del zinc
110502
Cenizas de zinc
12 Residuos del moldeado y tratamiento físico y mecánico de superficies de metales y plásticos
120103
Limaduras y virutas de metales no férreos.
38
ANTECEDENTES
120118
Lodos metálicos que contienen aceites
16 Residuos no especificados en otros capitulos
160118
Metales no férreos
160601
Baterías de plomo
160602
Acumuladores de Ni-Cd
160802
Catalizadores usados que contienen metales de transición peligrosos o compuestos
de metales de transición peligrosos
17 Residuos de la construcción y demolición
19 Residuos de las instalaciones para el tratamiento de residuos de las plantas externas de tratamiento
de aguas residuales y de la preparación de agua para consumo humano y de agua para uso industrial
1903
Residuos estabilizados/solidificados
1904
Residuos vitrificados y residuos de la vitrificación
1905
Residuos del tratamiento aeróbico de residuos sólidos
190702
Lixiviados de vertedero que contienen sustancias peligrosas
190805
Lodos del tratamiento de aguas residuales urbanas
190808
Residuos procedentes de sistemas de membranas que contienen metales pesados
190811
Lodos procedentes del tratamiento biológico de aguas residuales industriales, que
contienen sustancias peligrosas
190813
Lodos procedentes de otros tratamientos de aguas residuales industriales, que
contienen sustancias peligrosas
1910
Residuos procedentes del fragmentado de residuos que contienen metales
191202
Metales férreos
191301
Residuos sólidos, de la recuperación de suelos, que contienen sustancias peligrosas
20 Residuos municipales incluidas las fracciones recogidas selectivamente
200133
Baterías y acumuladores especificados en los códigos 160601, 160602 ó 160603 y
baterías y acumuladores sin clasificar que contienen esas baterías
200140
Metales
Tabla 6: Clasificación de residuos que contienen metales pesados
39
ANTECEDENTES
código
D2
Tratamiento en medio terrestre (biodegradación
residuos líquidos o lodos en el suelo)
D8
Tratamiento biológico que da como resultado compuestos
o mezclas que puedan eliminarse por un procedimiento
autorizado
R4
Reciclado o recuperación de metales y de compuestos
metálicos
Operaciones de
eliminación
Operaciones de
valorización
Operacion
de
Tabla 7: Operaciones relacionadas con el trabajo desarrollado.
La directiva 86/278/CEE, de 12 de junio, se refiere a la protección del
medio ambiente y, en particular, de los suelos, en la utilización de los lodos
de depuradora en agricultura.
Esta ley tiene por objeto regular el uso de lodos para evitar efectos
nocivos sobre suelos, plantas, animales y seres humanos y fomentar su
correcto uso. En ella se considera:
•
que los lodos pueden tener propiedades agronómicas útiles, lo
que conlleva a su valorización en la agricultura.
•
que ciertos metales pesados pueden ser tóxicos para las
plantas y para el ser humano por su presencia en las cosechas.
•
que es necesario fijar valores límite para dichos elementos en
el suelo.
•
que es necesario prohibir la utilización de lodos con metales
pesados cuando la concentración de éstos supera los valores
límite.
Para ello, se establecen los niveles permitidos de ciertos metales para
tres condiciones diferentes:
•
valores límite de concentraciones de metales pesados en los
suelos que reciben lodos.
40
ANTECEDENTES
•
valores límite de concentraciones de metales pesados en los
lodos.
•
valores de las cantidades máximas anuales de metales
pesados que pueden ser introducidos en los suelos destinados
a la agricultura.
Dichos valores se recogen en la tabla 8. En esta directiva queda
pendiente el establecimiento de los valores límite para el cromo.
Valores límite de metales
pesados en suelos
tratados con lodos
(mg/kg mat. seca)
Valores límite de
metales pesados en
lodos
(mg/kg mat. seca)
Cantidades
máximas anuales
(g/ha/año)
Cd
1-3
20-40
150
Cu
50-140
1000-1750
12000
Hg
1-1,5
16-25
100
Ni
30-75
300-400
3000
Pb
50-300
750-1200
15000
Zn
150-300
2500-4000
30000
Tabla 8: Valores límite de concentraciones de metales pesados recogidos en la directiva
86/278/CEE
En el borrador para una nueva Directiva relativa a la aplicación de
lodos en el suelo (Bruselas 12/01/2000) se definen los tipos de lodos y se
presentan valores límite de concentración de metales pesados algo más
restrictivos y en función del pH del suelo.
En dicho trabajo además:
•
se exige comprobar mediante un test si es posible que el Cr(III)
se oxide a Cr(VI) y si es así, se prohíbe el uso de lodos que
produzcan mas de 1 M de Cr(VI).
41
ANTECEDENTES
•
se establecen los valores límite para concentraciones de
compuestos orgánicos y dioxinas
La legislación española, en el Real Decreto 1310/1990 regula la
utilización de lodos de depuración en el sector agrario y traspone al
derecho español la Directiva de la UE 86/278/CEE. En ella se presentan los
valores límite de concentración de metales pesados, incluyendo el cromo,
en suelos tratados con lodos, en lodos para ser utilizados con fines agrícolas
y las cantidades máximas anuales aplicables de lodos en suelos (tabla 9)
Valores límite de metales
pesados en suelos tratados
con lodos (mg/kg mat. seca)
Suelo pH<7
Suelo pH>7
Valores límite de metales
pesados en lodos
(mg/kg mat. seca)
Suelo pH<7
Cantidades
máximas
anuales
(g/ha/año)
Suelo pH>7
Cd
1
3
20
40
150
Cu
50
210
1000
1750
12000
Ni
30
112
300
400
100
Pb
50
300
750
1200
3000
Zn
150
450
2500
4000
15000
Hg
1
1,5
16
2,5
Cr
100
150
1000
1500
30000
Tabla 9: Valores límite de concentraciones de metales pesados recogidos en el Real Decreto
1310/1990
El tratamiento de residuos sólidos que contienen metales pesados
puede dar lugar a la movilidad de estos elementos y su paso a medios
líquidos. Por tanto, resulta de interés conocer los valores límite de vertido de
los metales pesados.
42
ANTECEDENTES
La ley 29/1985, de 2 de Agosto, ley de Aguas, modificada
principalmente por la Ley 46/1999, de 13 de Diciembre, recoge los valores
límite de diversos parámetros en los vertidos de agua residuales. Los
principales metales pesados se recogen en la tabla 10.
Elemento
Valores límite (mg/l)
Cadmio
0,1-0,5
Cobre
0,2-10
Cromo (III)
2-4
Cromo (IV)
0,2-0,5
Niquel
2-10
Mercurio
0,05-0,1
Plomo
0,2-0,5
Zinc
3-20
Tabla 10: Valores límite de concentración de metales pesados (mg/l) permitidos en vertidos
de aguas residuales para efluentes con pH 5,5-9,5.
43
ANTECEDENTES
2 BIOLIXIVIACIÓN
CON
BACTERIAS
AZUFRE-
OXIDANTES
2.1.BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES
Los metales valiosos han sido obtenidos a partir de minerales por
lixiviación desde hace cientos de años. Este proceso se creyó que era una
reacción química mediada por la presencia de oxígeno y agua hasta 1947,
cuando fue demostrada la catálisis bacteriana de la oxidación del hierro y
la formación de ácido sulfúrico en las aguas de mina (Colmer y Hinkle, 1947)
En la actualidad, el uso de microorganismos para extraer metales a
partir de minerales, denominado como biominería, es bien conocido. Los
microorganismos participan en la deposición y solubilización de metales
pesados
de
la
corteza
terrestre
desde
siempre
y
esta
actividad
mayoritariamente ha estado ligada al ciclo del hierro y del azufre. El uso de
microorganismos en el procesado de minerales tiene algunas ventajas sobre
los métodos fisicoquímicos tradicionales: son compatibles con el medio
ambiente, no requieren un elevado costo energético y son útiles en la
recuperación de minerales de baja ley (Rawlings, 2002).
La biominería incluye términos como biolixiviación y biooxidación. La
biolixiviación consiste en la conversión de un metal formando parte de un
compuesto insoluble mediante un proceso de oxidación que lo transforma
en una forma soluble, permitiendo así la extracción del metal en el medio
acuoso. La biooxidación se refiere a los procesos en los cuales la
recuperación de un metal es facilitada por la descomposición microbiana
del mineral, pero el metal extraído no es solubilizado. Un ejemplo es la
recuperación de oro a partir de la arsenopirita, la oxidación se produce
44
ANTECEDENTES
sobre otros compuestos del mineral que acompañan al oro, permitiendo la
liberación de éste que es posteriormente extraído por cianurización.
La aplicación de procesos basados en la biolixiviación permite la
obtención de metales a partir de minerales de forma natural pero también
a partir de residuos industriales que no pueden ser manejados por técnicas
convencionales. No obstante, los procesos de biolixiviación sólo han
tomado importancia recientemente en algunas industrias minerales,
mientras que la lixiviación hidrometalúrgica química en condiciones ácidas
ha sido muy desarrollada (Krebs y col., 1997).
Una variedad de microorganismos catalizan la lixiviación de minerales
a partir de depósitos minerales y pilas en las minas. Entre ellos, las especies
autótrofas Thiobacillus y las especies heterótrofas Aspergillus y Penicillium son
las más estudiadas. Krebs y col. (1997), recoge una selección de los
microorganismos conocidos por su capacidad potencial para la lixiviación.
2.2. BACTERIAS AZUFRE OXIDANTES
Los microorganismos más activos en la biolixiviación de minerales
sulfurados son las bacterias que pertenecen al género Thiobacillus, aunque
también se conocen especies de otros géneros (Acidianus, Sulfolobus,
Leptospirillum) que actúan sobre este tipo de minerales.
La lixiviación bacteriana es llevada a cabo en los ambientes ácidos,
a valores de pH entre 1,5-3, a los cuales la mayoría de los iones metálicos se
mantienen en solución. En estas condiciones las especies acidófilas
Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans son las de mayor
importancia. Otros miembros de este género son también capaces de
oxidar azufre y sulfuros pero sólo crecen a valores de pH mayores a los
cuales no todos los iones metálicos se mantienen disueltos.
45
ANTECEDENTES
Como resultado del análisis de la secuencia 16S rARN (ARN
ribosomial) se incluyen desde el año 2000 dentro del género Thiobacillus las
bacterias azufre-oxidantes pertenecientes a las divisiones
,
y
de las
Proteobacterias. Con lo cual, el género Thiobacillus fue subdividido en un
nuevo género, Acidithiobacillus (At.), para acomodar a los miembros
altamente
acidófilos
que
componían
el
género.
Éste
incluye
At.
ferrooxidans, At. thiooxidans y At. caldus (anteriormente conocidos como
Thiobacillus ferrooxidans, thiooxidans y caldus, respectivamente)(Nelly y
Wood, 2000).
2.1.1 CARACTERÍSTICAS DE Acidithiobacillus ferrooxidans Y
Acidithiobacillus thiooxidans.
Son bacterias gram-negativas, de forma cilíndrica no esporulada y
que habitualmente se encuentran de forma natural en las aguas ácidas de
minas (Johnson y Hallberg, 2003; Dopson y col., 2003). Sus características
más destacables son (Nemati y col., 1998; Bosecker, 1997; Norris, 1990):
•
Quimiolitotrófas: obtienen la energía necesaria para su
metabolismo a partir de compuestos reducidos o parcialmente
reducidos de azufre siendo el producto final de la oxidación el
sulfato.
•
Autótrofas: la fuente de carbono para la síntesis de nuevo
material celular la obtienen mediante la fijación de dióxido de
carbono atmosférico. Requieren de otros nutrientes como N y P
junto con algunos elementos traza.
•
Aerobias: el oxígeno es el principal aceptor de electrones.
•
Mesófilas: su óptimo de temperatura se encuentra en torno a
30ºC aunque el rango de temperaturas es muy amplio debido
a la gran diversidad de las distintas cepas de estas especies.
46
ANTECEDENTES
•
Acidófilas: viven en ambientes ácidos (pH<6).
A pesar de su similitud estas bacterias difieren en otras características
muy relevantes que se describen a continuación y algunas de las cuales se
recogen en la Tabla 11.
Característica
Acidithiobacillus ferrooxidans
Acidithiobacillus thiooxidans
0,5 x 1-1,5 m
0,3 x 1-1,2 m
15-37 ºC
10-37 ºC
Temperatura óptima
30 ºC
30 ºC
Rango de pH
1,4-6
0,5-6
2,0
2,0-3,5
Fuente de energía
Fe2+,S0, S2-, S2O32-, UO22+
S0, S2O32-, S4O62-
Fuente de carbono
CO2
CO2
Fuente de nitrógeno
NH4+
NH4+
O2, Fe3+
O2
Tamaño
Rango de temperatura
pH óptimo
Aceptores electrónicos
Tabla 11: Principales características de Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus
thiooxidans.
Acidithiobacillus ferrooxidans: es el protagonista en los procesos de
biolixiviación (Norris, 1990; Bosecker, 1997). Esta bacteria fue aislada por
primera vez en 1947 por Colmer y Hinkle de un drenaje ácido de minas.
Morfológicamente es muy similar a At. thiooxidans pero la principal
característica que las diferencia es su capacidad para derivar la energía
también de compuestos del ión ferroso, por lo que es una bacteria hierrooxidante y esta capacidad la hace partícipe en los distintos mecanismos
implicados en la lixiviación de minerales ya que regenera el férrico, que es
un importante agente lixiviante. At. ferrooxidans además no es aerobio
estricto, y es capaz de crecer anaerobiamente en sustratos de azufre bajo
ciertas condiciones empleando Fe(III) como aceptor de electrones (Das y
col., 1992; Pronk y col.; 1992, Leduc y Ferroni, 1994)
Acidithiobacillus thiooxidans: fue aislado por primera vez en 1922 por
Walksman y Joffe, tienen forma de varilla corta, su longitud no supera el
47
ANTECEDENTES
micrón y eventualmente poseen un flagelo polar que les confiere una
movilidad superior a la observada en At. ferrooxidans. Obtienen la energía
necesaria para su metabolismo únicamente a partir de azufre elemental o
de compuestos reducidos de azufre (sulfuros, tiosulfatos). La principal
diferencia con At. ferrooxidans es su menor contenido en GC (guaninacitosina) en su ADN y su imposibilidad para oxidar hierro, lo cual no le
permite la lixiviación por el mecanismo indirecto, ya que ésta involucra la
presencia de Fe(III) y, como consecuencia, no solubiliza algunos minerales
como la pirita y la calcopirita (Norris, 1990).
En la oxidación de los compuestos de azufre, donde el oxígeno
molecular es el último aceptor de electrones, se forman una serie de
especies
intermedias
(sulfito,
tiosulfato)
que
tienen
diversidad
de
aplicaciones por sus características reductoras (Donati y Curutchet, 1995).
En presencia de la bacteria, la oxidación se completa hasta la formación
de ácido sulfúrico, lo que provoca una disminución del pH en el medio que
puede alcanzar valores incluso menores de 1 (Imai, 1978).
La
elevada
producción
de
ácido
a
partir
de
una
fuente
relativamente barata, el azufre elemental, permite su uso como agente
lixiviante en variedad de situaciones (Imai, 1978; Schröter y Sand, 1992):
descomposición de rocas, solubilización de fósforo procedente de rocas
fosfáticas (Donati y Curutchet, 1995) y lixiviación de metales a partir de
sulfuros minerales (Suzuki, 2001; Gómez y col., 1999).
En cultivo mixto con otras bacterias acidófilas hierro-oxidantes (At.
ferrooxidans o Leptospirillum ferrooxidans) pueden contribuir en la disolución
de concentrados minerales a través de la oxidación del azufre depositado
sobre la superficie mineral que impide el ataque del Fe(III) regenerado por
las bacterias hierro-oxidantes (Sasaki y col., 1998, Giaveno y Donati, 2000,
Falco y col., 2003)
48
ANTECEDENTES
2.2 MECANISMOS
INVOLUCRADOS
EN
BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES SULFURO.
LA
En los últimos años se ha profundizado en el estudio de los
mecanismos involucrados en la biolixiviación de sulfuros minerales llevada a
cabo por las bacterias azufre-oxidantes
Actualmente existen aplicaciones de estos procesos implantados
comercialmente, como son la recuperación de cobre, uranio y oro
(Bosecker, 1997; Rohwerder y col., 2003; Suzuki, 2001). Por ello, es importante
conocer los mecanismos que rigen la relación bacteria-mineral.
La biolixiviación de minerales sulfuro con bacterias del género
Acidithiobacillus ocurre a través de dos mecanismos: directo e indirecto.
Existe gran diversidad de trabajos que discuten la existencia o no de éstos o
que tratan de describir las reacciones o compuestos involucrados en cada
uno de ellos (Suzuki, 2001; Sand y col., 2001; Crundwell, 2003)
2.2.1 MECANISMO DIRECTO
Para que ocurra lixiviación bacteriana por mecanismo directo debe
existir un contacto directo entre la bacteria y la superficie del sulfuro mineral.
La oxidación a sulfato tiene lugar mediante una serie de etapas catalizadas
enzimaticamente, que se puede resumir en la siguiente reacción.
bacteria
MeS + O2 
→ MeSO4
[1]
Donde MeS representa un sulfuro mineral.
En el caso de la pirita, el mecanismo es distinto y se necesita la
intervención de bacterias hierro-oxidantes, la pirita es oxidada a sulfato
férrico de acuerdo con las reacciones:
bacteria
4FeS 2 + 14O2 + 4H2 O 
→ 4FeSO4 + 4H2 SO4
[2]
49
ANTECEDENTES
bacteria
4FeSO4 + O2 + 2H2 SO4 
→ 2Fe2(SO4 )3 + 2H2O
[3]
que se pueden resumir en la reacción:
bacteria
4FeS2 + 15O2 + 2H2O 
→ 2Fe2(SO4 )3 + 2H2 SO4
[4]
Existen trabajos de Torma (1971 y 1977) que describen la oxidación de
algunos minerales sulfuro no ferrosos por parte de At. ferrooxidans: covelita
(CuS), calcocita (Cu2S), esfalerita (ZnS), galena (PbS), antimonita (Sb2S3),
cobaltita (CoS) y millerita (NiS). Las cuales seguirian una reacción similar a la
descrita en la reacción [1].
Existen evidencias de que la bacteria tiene que estar en íntimo
contacto con la superficie mineral. El mecanismo de adhesión y el inicio de
la solubilización del metal no están aún completamente comprendidos. Si
resulta obvio que la bacteria no se adhiere en cualquier lugar de la
superficie mineral sino que lo hace en lugares específicos de imperfecciones
del cristal y que la solubilización del metal es debida a interacciones
electroquímicas.
2.2.2 MECANISMO INDIRECTO
En este mecanismo la bacteria genera un agente lixiviante que oxida
químicamente al sulfuro mineral. En soluciones ácidas este lixiviante es el ión
férrico y la solubilización del metal se puede describir por la reacción:
MeS + Fe2(SO4 )3 → MeSO4 + 2FeSO4 + S o
[5]
Para mantener suficiente hierro en solución la oxidación química del
sulfuro metálico debe ocurrir en ambientes ácidos, pH inferior a 5. La
cantidad de ferroso formada por la reacción [5] puede ser regenerada por
la acción de las bacterias hierro-oxidantes (At. ferrooxidans o Leptospirillum
ferrooxidans) que oxidan el ferroso dando lugar a férrico, el cual puede
50
ANTECEDENTES
actuar de nuevo como lixiviante. En este mecanismo la bacteria no
necesita estar en contacto con la superficie mineral. Las bacterias sólo
tienen una función catalítica ya que aceleran la reoxidación de ferroso, que
sería mucho más lenta en ausencia de bacteria. Lacey y Lawson(1970)
muestran que en el rango de pH 2-3, la oxidación bacteriana de ferroso es
aproximadamente 105-106 veces más rápida que la oxidación química.
El azufre formado de forma simultánea en la reacción [5] puede ser
oxidado a ácido sulfúrico por acción de las bacterias azufre-oxidantes,
reacción [6], en este caso la reacción es mucho más rápida para At.
thiooxidans que para At. ferrooxidans.
bacteria
2 S0 + 3O2 + 2H2O 
→ 2H2 SO4
[6]
Un ejemplo bien conocido del proceso de biolixiviación indirecta es
la extracción de uranio de minerales; el uranio tetravalente, insoluble, es
oxidado a uranio hexavalente, soluble en agua.
UIV O2 + Fe2(SO4 )3 → UIV O2 SO4 + 2FeSO4
[7]
El lixiviante puede ser generado por At. ferrooxidans por oxidación de
la pirita [4] que está frecuentemente asociada a los minerales de uranio.
Además del mecanismo indirecto hay evidencias de que esta bacteria
puede oxidar UIV a UVI enzimáticamente y empleando parte de la energía
de esta reacción para la asimilación del CO2.
Aunque, de forma clásica, la biolixiviación está basada en la
interacción de procesos de oxidación químicos y biológicos, se le debe
atribuir una importancia particular al ciclo de ferroso a férrico. En la
naturaleza y en las aplicaciones técnicas ambos mecanismos, directo e
indirecto, ocurren simultáneamente.
51
ANTECEDENTES
2.2.3 DISCUSIÓN DE LOS MECANISMOS
Como ya se ha referido, existe un debate acerca de la interacción
de las bacterias hierro-oxidantes y azufre-oxidantes y los minerales sulfuro.
Los defensores del mecanismo directo argumentan que la bacteria posee
un mecanismo biológico específico para degradar el mineral y obtener así
energía directamente del mineral. Por otra parte, los autores que se
decantan por el mecanismo indirecto sostienen que son los iones férricos en
solución los que disuelven el mineral y que la bacteria gana la energía
necesaria para su metabolismo de la regeneración de los iones férricos
(Crundwell, 2003). El mecanismo directo indudablemente ocurre pero
algunos creen que no es la ruta predominante. Existen argumentos en la
bibliografía que tratan de demostrar la existencia de este mecanismo,
basados en la estequiometría, la adhesión bacteriana o mediciones sobre
la superficie mineral (Hansford y Drossou, 1988) que no pueden resolver el
debate. Crundwell (2003) deduce que la cinética de cada uno de las vías
propuestas parece ser el factor crítico y plantea su demostración a partir de
un estudio cinético
Sin
embargo,
recientes
publicaciones
realizadas
por
Sand
y
colaboradores (Sand y col., 1995: Schippers y col., 1996; Sand y col., 1996 y
2001; Rohwerder y col., 2003; Kinzler y col., 2003) dudan sobre la existencia
del mecanismo directo. Estos investigadores defienden que las bacterias
pueden realizar la disolución del sulfuro por mecanismos de contacto o nocontacto. El mecanismo de no-contacto asume que la bacteria sólo oxida
los iones Fe(II) a Fe(III) el cual, posteriormente, ataca al sulfuro mineral y es
reducido de nuevo a Fe(II). El mecanismo de contacto requiere la adhesión
de la bacteria a la superficie del sulfuro y el mecanismo primario para la
adhesión a la pirita es de tipo electrostático. En el caso de At. ferrooxidans,
exopolímeros de la pared celular contienen iones Fe(III) formando complejos
52
ANTECEDENTES
con dos tipos de residuos de ácido urónico, la carga positiva resultante se
adhiere a la carga negativa de la pirita. Así, la primera función del férrico es
la adhesión, seguida de su función como lixiviante del sulfuro al igual que en
el mecanismo de no-contacto.
La principal característica del modelo que describen es que los iones
Fe(III) y/o los protones son los únicos agentes (químicos) que disuelven un
mineral sulfuro. El mecanismo es estrictamente indirecto y la bacteria tiene
la función de regenerar los iones Fe(III) y/o H+ y concentrarlos en la interfase
mineral/agua o mineral/bacteria para aumentar el ataque del lixiviante y
así la degradación. El factor determinante es la capa de exopolímeros ya
que en ella tienen lugar los procesos químicos que disuelven el mineral.
Basándose en esto, diferencian dos mecanismos de lixiviación: vía
tiosulfato y vía polisulfuros. En general, la disolución es alcanzada por
combinación de procesos de ataque de protones y oxidación. La vía de
lixiviación depende de la especie mineral, el criterio relevante es la
reactividad del sulfuro con los protones, es decir, su solubilidad en ácido.
Esta propiedad está directamente relacionada con la configuración
electrónica. Los sulfuros metálicos cuya banda de valencia es derivada sólo
de orbitales del átomo metálico del sulfuro no pueden ser atacados por
protones (sulfuros no solubles en ácido). Estos sulfuros se disuelven vía
tiosulfato, pertenecen a este grupo la pirita (FeS2), molibdenita (MoS2) y
tungstenita
(WS2).
Aquellos
sulfuros
cuya
banda
de
valencia
está
conformada por orbitales del átomo metálico y del sulfuro pueden ser
atacados por protones (son más o menos solubles en ácido) y lixivian via
polisulfuro. En este grupo están la esfalerita (ZnS), galena (PbS), arsenopirita
(FeAsS), calcopirita (CuFeS2) y hauerita (MnS2).
La descripción de estos mecanismos se esquematiza en la figura 6 y
se puede describir como:
53
ANTECEDENTES
A. Vía tiosulfato
B. Vía polisulfuro
Fe3+
Af, Lf
Fe3+
O2
Af, Lf
MS
Fe2+
H+
O2
MS
Fe2+
M2+ + S2O32(Af, At )
M2+ + H2S+ (H2S2)
Fe3+, O2
(Af, At )
SnO62- , S6
H2Sn2- ,
Fe3+, O2
(Af, At)
Fe3+, O2
S6
Af, At
SO42- + H+
Fe3+, O2
SO42- + H+
Figura 6: Esquema comparativo de los mecanismos de ataque indirecto propuestos por Sand.
(A) Via tiosulfato y (B) Vía polisulfuro. (Rohwerder y col., 2003)
Los reactivos recuadrados indican que son los productos mayoritarios del proceso. El nombre de las
bacterias aparece entre paréntesis cuando la reacción no es sólo llevada a cabo por las bacterias sino
también de forma abiótica.
Via tiosulfato: El ión férrico ataca al mineral sulfuro mediante la
extracción de un electrón reduciéndose a ferroso y obteniéndose del
mineral el catión metálico y compuestos de azufre intermedios solubles en
agua. Las bacterias hierro-oxidantes (At. ferrooxidans (Af) y Leptospirillum
ferrooxidans (Lf)) catalizan el reciclado del ión férrico en condiciones
ácidas. El primer compuesto de azufre liberado es el tiosulfato que es
oxidado por las bacterias azufre-oxidantes vía tetrationato y otros
politionatos
para
dar
finalmente
sulfato.
También
puede
darse
la
acumulación de azufre sino existen bacterias azufre-oxidantes. Para la
extracción del electrón se concluye que solo las bacterias oxidantes de
ferroso pueden lixiviar sulfuros no solubles en ácido en condiciones ácidas.
54
ANTECEDENTES
Vía polisulfuros: En el caso de los sulfuros solubles en ácido la
disolución se realiza por la acción combinada de la extracción de
electrones por iones férricos y el ataque del protón, es decir, el enlace del
protón a la parte sulfuro del mineral mediante los electrones de la banda de
valencia. La unión metal-sulfuro en el mineral puede ser rota por el ataque
del protón, después de que dos protones se hayan unido se libera sulfuro de
hidrógeno. A su vez, el férrico puede oxidar el azufre del mineral liberando
catión sulfuro que dimeriza espontáneamente a disulfuro(H2S2) y se oxida,
posteriormente, vía polisulfuro y radicales polisulfuro a azufre elemental. La
acción oxidante del ión férrico no es prerrequisito para la vía polisulfuro, ya
que, en este caso, la unión metal-sulfuro puede ser rota por el ataque de
protones, así que los sulfuros metálicos solubles en ácido pueden ser
disueltos por la actividad de las bacterias azufre-oxidantes. En ausencia de
Fe(III), estas bacterias oxidan el sulfuro de hidrógeno liberado del ataque del
protón al mineral a azufre elemental y luego a ácido sulfúrico, regenerando
así los protones previamente consumidos por la disolución del mineral.
2.3 FUNCIÓN DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES
EN LA LIXIVIACIÓN DE MINERALES SULFURO.
En las dos rutas descritas, las bacterias hierro-oxidantes tienen un
papel primordial en la regeneración de Fe(III), que es el principal agente
lixiviante en este tipo de ambientes ácidos. Los microorganismos oxidantes
de ferroso controlan el potencial redox de éstos ambientes, el cual se
determina principalmente por la relación Fe(III)/Fe(II) en solución.
Por su parte, las bacterias oxidantes de azufre contribuyen a la
transformación de los compuestos intermedios de azufre a ácido sulfúrico,
fuente de protones (Schippers y Sand, 1999; Schippers y col., 1999). En el
caso del azufre elemental esta transformación es llevada a cabo
55
ANTECEDENTES
exclusivamente por las bacterias ya que esta especie es inerte a la
oxidación abiótica en medios ácidos. Esto hace que en ausencia o estado
de inhibición de estas bacterias el azufre elemental se acumule en el curso
del proceso de disolución del mineral sulfuro. El azufre elemental puede
estar suspendido, en forma de agregados o cristales libres, o formando una
capa sobre la superficie del mineral (Fowler y col., 1999; Mustin y col., 1993).
En este último caso, las propiedades electroquímicas de la superficie mineral
podrían cambiar y/o formarse una barrera que reduciría la velocidad de
difusión de los iones lixiviantes y el oxígeno para interaccionar con el
mineral, lo cual influye negativamente en la velocidad de lixiviación.
Las bacterias azufre-oxidantes tienen entonces una doble función en
la lixiviación de minerales sulfuro:
•
la producción de ácido sulfúrico a partir de compuestos de
azufre reducido para la regeneración de los protones
consumidos en la etapa inicial de la lixiviación (vía polisulfuros).
•
la eliminación del azufre acumulado sobre la superficie
mineral.
2.4 ADHESIÓN BACTERIA-MINERAL
La mayoría de las bacterias lixiviantes crecen adheridas a la
superficie de los minerales sulfuro. Se conoce que el proceso de adhesión es
predominantemente mediado por la presencia de sustancias poliméricas
extracelulares, conocidas como EPS (del inglés “extracellular polymeric
substances”) (Sand y col., 2001, Gehrke y col., 1995). Hay suficientes
evidencias que demuestran la función de una capa orgánica en la
interacción bacteria-sustrato. Estas películas han sido observadas en células
de At. ferrooxidans crecidas en pirita y para comprender su función en los
procesos de biolixiviación se ha estudiado su composición en este sistema
56
ANTECEDENTES
(Gehrke y col., 1995). Para llevar a cabo la lixiviación de la pirita, las células
de At. ferrooxidans atacan la superficie mineral por medio de sustancias
exopoliméricas excretadas (lipopolisacáridos) y oxidan el mineral a ácido
sulfúrico e iones férrico. El ataque primario a la pirita (pH 2) es mediado por
un complejo exopolímero-Fe(III). Se cree que la especie de hierro se une a
subunidades de ácido glucurónico, este complejo tiene una carga neta
positiva que interacciona electrostáticamente con la carga negativa de la
superficie del sustrato, pirita. La figura 7 representa un modelo de
mecanismo de lixiviación de la pirita por adhesión de células de At.
ferrooxidans.
membrana externa
Medio de lixiviación
espacio periplasmático
(O2, Fe3+, Fe2+, SO42-)
membrana citoplasmática
glóbulos de azufre
bacteria
EPS
S2O32Fe2+
Fe3+
pirita
Figura 7: Representación de lixiviación por mecanismo de contacto catalizada por una
célula de At. ferrooxidans. La célula queda embebida en la capa de EPS adhiriéndose a la
pirita por interacción electrostática. Durante la oxidación de tiosulfato y tetrationatos puede
formar agregados de azufre elemental y politionatos en el espacio periplasmático (glóbulos
de azufre) (Rohwerder y col., 2003)
57
ANTECEDENTES
La capa de exopolímeros formando complejos con Fe(III) constituye
un lugar de reacción en el cual el proceso de disolución tiene lugar (Fowler
y col., 1999; Tributsch, 1999). Este puede ser interpretado como un
compartimento donde algunas condiciones especiales, aunque todavía no
bien conocidas, prevalecen (pH, potencial redox, concentración de iones,
etc.) (Sand y col., 1999). Existen estudios dirigidos a determinar la correlación
entre la cantidad de iones férrico que se encuentran dentro de la capa
formada por los EPS y la actividad oxidativa de At. ferrooxidans (Kinzler y
col., 2003). Otros estudios tratan de demostrar la importancia de este tipo de
compuestos realizando estudios con bacterias At. ferrooxidans a las cuales
se les ha desprendido la capa de sustancias exopoliméricas. Se observa una
disminución de la capacidad oxidativa pero en pocas horas la capa de EPS
es producida de nuevo. La adición de compuestos exocelulares a las
células previamente desprendidas de ellos también regenera la capacidad
oxidativa en poco tiempo, alcanzando niveles de lixiviación similares a los
obtenidos con las células sin tratar (sin modificar sus EPS) (Sand y col., 2001).
Las células que crecen sobre azufre, sin hierro, exhiben una
composición diferente de sus exopolímeros, constituyen una superficie
fuertemente hidrofóbica y no atacan la pirita. En el estudio de sus EPS no se
ha detectado la presencia de acido glucurónico ni férrico pero si un
aumento del fosfato. Por tanto, es evidente que el sustrato influye en la
estructura química de los exopolímeros, aunque no todos los mecanismos
de regulación están aún clarificados.
Considerando las propiedades de superficie de la bacteria, la
adhesión al azufre se piensa que está regida por fuerzas de atracción de
carácter hidrófobo (Van de Waals), mientras que la adhesión a la pirita es
debida a fuerzas electrostáticas.
58
ANTECEDENTES
En ausencia de iones Fe(III) At. ferrooxidans actúa del mismo modo
que At. thiooxidans, por oxidación del azufre. El conocido como mecanismo
directo de lixiviación de sulfuros metálicos puede no ser más que la
oxidación biológica del azufre elemental formado químicamente para dar
sulfato.
2.5 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA BIOLIXIVIACIÓN
La efectividad de la biolixiviación depende en gran medida de la
eficiencia de los microorganismos y de la composición química y
mineralógica del mineral a ser lixiviado. La extracción máxima de metal
puede
ser
alcanzada
sólo
cuando
las
condiciones
de
lixiviación
corresponden a las condiciones óptimas de crecimiento de la bacteria.
Entre los factores que intervienen en este proceso destacan:
Nutrientes: Los microorganismos que se emplean para la extracción
de metales de minerales sulfuro son bacterias quimiolitotrófas, con lo cual,
sólo requieren compuestos inorgánicos para su crecimiento. En general, los
nutrientes minerales son obtenidos del medio ambiente y a partir del mineral
lixiviado. Para un crecimiento óptimo es necesaria la presencia de la
cantidad adecuada de hierro, azufre y sales de amonio, fosfato y
magnesio.
O2 y CO2: Para el adecuado crecimiento y actividad oxidativa se
requiere suplemento de oxígeno. En el laboratorio puede ser obtenido por
aireación o agitación. A mayor escala, como en las acumulaciones al aire
libre de mineral (dump o heap leaching) el suministro del oxígeno requerido
puede tener ciertas dificultades. El dióxido de carbono es la única fuente de
carbono requerida pero normalmente no es necesaria una adición externa
de CO2.
59
ANTECEDENTES
pH: es importante el correcto ajuste del pH al valor óptimo para el
crecimiento de la bacteria y su capacidad de solubilización. El pH óptimo,
así como el rango de pH, en el que la bacteria trabaja con efectividad
varía de una cepa a otra, por tanto, es importante conocerlos por medio de
la literatura o mediante trabajos experimentales.
Temperatura: El óptimo de temperatura para el crecimiento y la
lixiviación de las bacterias azufre-oxidantes se encuentra en torno a 30ºC,
aunque al igual que para el pH existe una gran variabilidad en función de la
cepa empleada y del pH al que se encuentre el medio.
Sustrato mineral: La composición mineralógica del sustrato a lixiviar es
de gran importancia. Un alto contenido en carbonato del mineral puede
aumentar el pH del líquido lixiviado inhibiendo o suprimiendo la actividad
bacteriana. Los bajos valores de pH necesarios para la lixiviación pueden ser
alcanzados por un aporte externo pero esto puede provocar la formación o
precipitación de algunos compuestos (yeso) y afectar al coste del proceso.
La velocidad de lixiviación depende también de la superficie total del
sustrato. Una disminución del tamaño de partícula se traduce en un
aumento del área superficial dando lugar a una mayor cantidad de metal
producido para una masa igual de mineral.
Metales pesados: La lixiviación de sulfuros metálicos da lugar al
incremento de la concentración de metales disueltos en el lixiviado. En
general, las bacterias lixiviantes, y entre ellas las azufre-oxidantes, tienen la
capacidad de tolerar concentraciones relativamente elevadas de metales
pesados (De y col., 1997). Diferentes cepas de una misma especie
presentan sensibilidades muy diferentes a un mismo metal. Por ello, es
importante conocer la tolerancia de las bacterias que se van a emplear en
un proceso de lixiviación a los metales concretos que se encuentran en el
mineral.
Con
bastante
frecuencia,
estos
microorganismos
también
60
ANTECEDENTES
presentan la capacidad de adaptarse a niveles mayores de un metal por
continuos subcultivos a concentraciones incrementadas gradualmente del
metal a estudiar (Novo y col., 2000; Boyer y col., 1998; Baillet y col., 1997 y
1998).
Agentes surfactantes y “extractantes” orgánicos: estos compuestos
empleados como disolventes en la extracción generalmente tiene efectos
inhibitorios sobre la lixiviación bacteriana, principalmente porque disminuye
la tensión superficial y la transferencia de oxígeno.
2.6 TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS DE LAS
BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES
La extensa aplicación de las bacterias azufre-oxidantes a la
biolixiviación se debe a su capacidad de oxidación mediante los
mecanismos ya descritos y a su elevada tolerancia a los metales pesados en
solución. Esto hecho provoca que una vez lixiviado el mineral, si el metal que
pasa a la solución está a una concentración no tóxica para la bacteria, no
afectaría de forma significativa al metabolismo celular, de lo contrario
produciría su inhibición o muerte. Para la aplicación de estas bacterias a
procesos concretos de lixiviación es necesario conocer los límites de
tolerancia de la bacteria frente a los metales presentes en el mineral y a las
condiciones en que se va a trabajar posteriormente, esto permite diseñar un
proceso que trabaje con concentraciones de metal adecuadas para el
crecimiento y capacidad oxidativa de la bacteria.
Existen muchos estudios dedicados a conocer la tolerancia de estas
bacterias a distintos metales pesados. En su mayoría se refieren a
Acidithiobacillus ferrooxidans debido a su tradicional uso en la biolixiviación
y los numerosos trabajos desarrollados para estudiar el efecto de diversos
61
ANTECEDENTES
parámetros sobre la capacidad de oxidación del ión ferroso de esta
bacteria.
En las tablas 12 y 13 se recogen datos de tolerancia de distintas
cepas de At. ferrooxidans y At. thiooxidans a varios metales pesados. Se
pueden observar que no existen niveles absolutos de tolerancia para los
iones metálicos, ya que dependen de la cepa utilizada y su estado
fisiológico, su historial previo de exposición al tóxico en cuestión y las
condiciones ambientales durante la exposición, así como el método
utilizado para la determinación de la toxicidad o la tolerancia. Además, los
niveles
de
tolerancia
pueden
incrementarse
por
reinoculación
del
microorganismo a concentraciones más altas del ión tóxico de manera
progresiva. Así, la resistencia ligada a la adaptación de una especie a un
metal en concreto puede incrementar o disminuir la tolerancia del
organismo a otros metales (Tuovinen y col., 1971). Los mecanismos de
toxicidad de los metales y la resistencia bacteriana son complejos y no
están completamente comprendidos, no obstante, se han propuesto
algunos mecanismos para ciertos metales (Hutchins y col., 1986).
En los estudios acerca de la resistencia de Acidithiobacillus
ferrooxidans a determinados metales pesados se encuentra una gran
disparidad de datos debidos, principalmente, a que las cepas que se
estudian en cada caso son distintas y a que las condiciones experimentales
de los estudios no son siempre las mismas. Los primeros trabajos acerca de la
tolerancia de At. ferrooxidans a los metales pesados fueron realizados por
Tuovinen y col.(1971) e Imai y col.(1979).
En los últimos años, un gran número de trabajos se han enfocado al
estudio de la tolerancia natural de esta especie y al aumento de su
capacidad para tolerar un metal por continuos subcultivos en cantidades
iguales o crecientes del metal.
62
ANTECEDENTES
Ion metálico
Cobre
Cadmio
Zinc
Níquel
Cromo
Limite tolerancia
(g/l)
Referencia
4,5
Tuovinen y col. (1971)
0,63
Imai y col. (1975)
5
Brahmaprakash y col. (1988)
10
Hubber y nStetter (1990)
63,5
Rossi (1990)
10
Leduc (1997)
25
Das y col. (1997)
19
Boyer y col. (1998)
12,7
Novo y col. (2000)
10
Cabrera y col. (2005)
1,12
Imai y col. (1975)
0,112
Rossi (1990)
56,2
Baillet y col. (1997)
10
De y col. (1997)
0,5
Cerruti y col. (1998)
67,2
Novo y col. (2000)
10
Cabrera y col. (2005)
10
Trevors y col. (1985)
70
Kondratyeva y col. (1995)
6,5
Rossi (1990)
40
Das y col. (1997)
30
Cabrera y col. (2005)
0,006
Tuovinen y col. (1971)
0,06
Imai y col.(1975)
10
Hubber y Stetter (1990)
9,4
Leduc (1997)
19
Chisholm y col. (1998)
58,7
Dew y col. (1999)
35,2
Novo y col. (2000)
30
Cabrera y col. (2005)
0,02
Sisti y col. (1998)
3,9
Baillet y col. (1998)
0,4
Cabrera y col. (2005)
Tabla 12: Límites de tolerancia de At. ferrooxidans a distintos iones metálicos
63
ANTECEDENTES
Ion metálico
Limite tolerancia
(g/l)
Referencia
Zinc
39
Sakamoto y col. (1989)
Cadmio
45
Sakamoto y col. (1989)
As(III)
5
Collinet y Morin (1990)
As(IV)
40
Collinet y Morin (1990)
Fe(II)/Fe(III)
30/10
Sluszny (1995)
Al(III)
10
Sluszny (1995)
Cu(II)
6,5
Matlakosvka y Sklodowska (2001)
Tabla 13: Límites de tolerancia de At. thiooxidans a distintos iones metálicos
Baillet y col. (1997) estudiaron la tolerancia de una cepa de At.
ferrooxidans exponiéndolo a un amplio rango de concentraciones de ion
cadmio(II). Una vez encontrado el límite de tolerancia (56,25 g Cd(II)/l)
expusieron al cultivo a dicha concentración hasta observar que el tiempo
de oxidación de ferroso y la producción bacteriana toman valores similares
a los encontrados para el cultivo sin presencia de metal. A esto lo llaman
cultivo adaptado y, posteriormente, lo suplementan con cantidades
superiores de metal. Se observa que en presencia del ión cadmio se
produce una adaptación genética, tras varios subcultivos sin añadir metal,
la adición de cadmio al cultivo provoca una respuesta mejor a la obtenida
cuando se añade metal por primera vez, lo que indica que la exposición
previa al tóxico ha generando un cambio permanente en la bacteria. De lo
contrario, si el cultivo, tras varios subcultivos sin presencia del tóxico, hubiera
respondido de forma similar a cuando se añade por primera vez metal, la
exposición al tóxico produce un cambio no permanente o reversible, la
bacteria vuelve a su estado normal cuando el estímulo (metal) cesa,
adaptación fisiológica.
En otro trabajo, Baillet y col. (1998) estudiaron la tolerancia al cromo,
en este caso el límite de tolerancia fue encontrado para 3,9 g Cr(III)/l,
encontrándose que para posteriores subcultivos no mejora de forma
64
ANTECEDENTES
significativa el tiempo necesario para la oxidación del sustrato ni aumenta la
producción bacteriana.
Sisti y col. (1998) estudiaron la tolerancia de At. ferrooxidans y At.
thiooxidans al ion cromo (III), observando efecto inhibitorio a partir de los 20
mg Cr(III)/l pero tras varios subcultivos, se alcanza una tolerancia de 0,5 g
Cr(III)/l. Das y col. (1997) presentaron valores de tolerancia para distintas
cepas de esta bacteria al cobre y al zinc. Por distintos subcultivos
consiguieron obtener cultivos adaptados a estas concentraciones con un
tiempo de oxidación de ferroso similar al de un cultivo control (sin metal).
Existen otros estudios de adaptación al cobre, Boyer y col. (1998) que
encontraron el límite de tolerancia a este metal para At. ferrooxidans en 19
g Cu(II)/l, la adaptación del cultivo les permitió doblar este valor,
alcanzando los 38 g Cu(II)/l. Por otra parte, Novo y col. (2000) presentaron la
inhibición de una cepa At. ferrooxidans LR para 12,7 g Cu(II)/l. El cultivo una
vez crecido en presencia de este metal se puso en presencia de cobre,
cadmio, níquel o zinc a concentraciones conocidas como toleradas. Sólo se
observó una mejora en el crecimiento bacteriano en el cultivo con cobre, lo
cual sugiere la implicación de un mecanismo de especiación de la bacteria
en la resistencia a metales. Posiblemente, debido al estrés al que se somete
la célula por la exposición al metal, se produce un cambio en la ruta de
síntesis de proteínas que impide o disminuye la capacidad para resistir otras
especies metálicas.
En algunos de estos trabajos el estudio del límite de tolerancia se
realiza como paso previo a la utilización de esta bacteria como biosorbente
(Boyer y col., 1998, Baillet y col., 1997 y 1998).
65
ANTECEDENTES
2.7 APLICACIONES DE LA BIOLIXIVIACIÓN
BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES.
CON
La aplicación de las bacterias azufre-oxidantes en la obtención de
metales a partir de minerales ha permitido conocer las condiciones
favorables y los mecanismos involucrados en la disolución de metales. El
desarrollo de investigaciones con minerales simples ha provocado, en
primer lugar, la aplicación y el estudio de esta capacidad bacteriana a
residuos contaminados habitualmente por
metales (lodos, sedimentos,
suelos…) y, en segundo lugar, la aplicación a escala industrial de los
procesos con resultados más ventajosos. En este capítulo se realiza un
recorrido
general
por
las
tendencias
observadas
en
los
trabajos
desarrollados por distintos autores dirigidos al estudio de los procesos de
biolixiviación con bacterias azufre-oxidantes en distintos sustratos.
2.7.1 BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES
La capacidad de las bacterias azufre-oxidantes para la extracción
de metales a partir de minerales de baja ley ha sido muy estudiada. (Tipre,
2004; Gómez y col., 1999; Donati y col., 1996).
Existen trabajos dedicados al estudio de la lixiviación de la pirita con
Acidithiobacillus ferrooxidans. Estos procesos se basan en la oxidación del
Fe(II) a Fe(III) por parte de esta bacteria y el ataque del ion férrico al mineral
(Fowler y col., 1999).
La tendencia en los últimos años es la selección de una cepa o
consorcio de ellas más adecuadas para la solubilización del mineral,
determinar la cantidad de sustrato necesaria para llevar a cabo este
proceso, así como estudiar el mecanismo responsable del proceso de
lixiviación.
66
ANTECEDENTES
La biolixiviación de covelita (CuS) ha sido estudiada en numerosos
trabajos. Así, Donati y col. (1996) estudiaron la influencia del sustrato sobre la
biolixiviación de la covelita empleando cultivos puros y mixtos de At.
ferrooxidans y At. thiooxidans.
En presencia de Fe(II) At. ferrooxidans lo oxida generando Fe(III) que
ataca el mineral hasta que el proceso se ralentiza por la presencia de
jarositas, lo cual no permite una lixiviación elevada. La lixiviación en estas
condiciones con At. thiooxidans comienza por la oxidación química del
ferroso y el ataque del férrico a la covelita, que da lugar a cobre soluble y
azufre, que es oxidado por la bacteria. El ácido obtenido ataca al mineral y
proporciona un ambiente de bajo pH donde se evita la formación jarositas.
En presencia de azufre elemental la biolixiviación se debe al ataque ácido,
siendo mayor para At. thiooxidans por su tendencia a crecer hasta un pH
más bajo, esta bacteria produjo el mayor porcentaje de biolixiviación.
En un trabajo posterior (Pogliani y Donati, 2000) se intentó comprobar
que la biolixiviación de covelita por la acción de At. ferrooxidans y At.
thiooxidans se podía extrapolar a un sistema más complejo que un sulfuro
puro (mineral de covelita, magnetita y pirita). El estudio se realizó con
adición de ferroso o de férrico o ninguno de ellos. Cuando no se adiciona
hierro la mayor lixiviación es obtenida por At. ferrooxidans, esencialmente
debido a un mecanismo directo, y At. thiooxidans una vez que el hierro
presente en el propio mineral es oxidado por el aire, la bacteria oxida el
azufre formado. Los cultivos inoculados con férrico y el cultivo At.
ferrooxidans con ferroso (oxidación casi instantánea a férrico) muestran una
disolución del cobre similar en el tiempo. La extracción de cobre no fue
máxima, dado que la presencia de férrico produce la precipitación de
jarositas, impidiendo en cierto grado la solubilización. La mayor solubilización
se obtuvo para At. thiooxidans suplementado con ferroso, lo cual corrobora
67
ANTECEDENTES
el mecanismo propuesto en el estudio de la biolixiviación de la covelita
pura.
En un trabajo más reciente (Falco y col., 2003) se consideró la
posibilidad de obtener una mayor lixiviación de la covelita mediante un
cultivo mixto de At. thiooxidans y la bacteria hierro-oxidante Leptospirillum
ferrooxidans. El estudio también se realizó con y sin adición de ferroso. En
esta ocasión también se comprobó la mayor lixiviación para At. thiooxidans
en presencia de ferroso.
Está comprobado que la biolixiviación de metales procedentes de
minerales está regida en gran parte por la adhesión previa de la bacteria al
mineral (Pogliani y Donati, 1999; Sand y col., 2001; Porro y col., 1997). Por ello
algunos trabajos han sido desarrollados para intentar relacionar ambas
propiedades. Porro y col. (1997) desarrollaron un trabajo para tratar de
establecer
la
relación
existente
entre
las
propiedades
superficiales
(hidrofobicidad) de At. ferrooxidans y At. thiooxidans crecidos en diferentes
fuentes de energía, no sólo con la capacidad de adhesión sino también
con la eficacia de biolixiviación de diferentes sustratos (azufre (Sº),
molibdenita (MoS2) y covelita (CuS)). Las bacterias crecidas en azufre,
sustrato hidrófobo, se adhieren en gran medida a sustratos de carácter
hidrófobo como la molibdenita y el azufre. At. ferrooxidans crecido en
medios con ferroso presentó una elevada adhesión a la covelita, un sustrato
más hidrofílico, que cuando es crecido sobre azufre. Se demostró una clara
relación entre la adhesión sobre diferentes sustratos y la fuente de energía
empleada. Sin embargo, no se observó una relación tan directa entre las
células adheridas y la eficacia de biolixiviación, el ataque de At. thiooxidans
a la covelita fue elevado a pesar de que no se dio una elevada adhesión
celular.
68
ANTECEDENTES
El estudio de biolixiviación de minerales no sólo se ha realizado sobre
los sulfuros minerales más comunes. Existen, entre otros, trabajos acerca de
la biolixiviación de molibdeno a partir de un mineral de cobre (Nasernejad y
col., 1999) o de la lixiviación de níquel de un sulfuro de níquel poco común,
Ni3S2 (Giaveno y Donati, 2001).
Los resultados positivos obtenidos en los estudios básicos de
biolixiviación de ciertos minerales hace pensar en la aplicabilidad real de
éstos y se han desarrollado estudios con el objetivo de conocer las
condiciones óptimas para la biolixiviación de minerales complejos.
En su trabajo, Gómez y col. (1999) estudiaron las condiciones óptimas
para la biolixiviación de un mineral complejo mediante un cultivo mixto de
At. ferrooxidans, At. thiooxidans y Leptospirillum ferrooxidans. Se estudio la
influencia del medio nutriente, la agitación, la densidad de pulpa del
mineral, la adición o no de dióxido de carbono y la temperatura. Los
mejores resultados se obtienen con medio 9K sin hierro, densidad de pulpa
del 5% y agitación mecánica. La mayor lixiviación para cobre ocurrió a 30ªC
y fue por ataque directo, para el zinc aumenta con la temperatura y la
disolución fue mayoritariamente química.
Tipre y col. (2004) estudiaron la biolixiviación de otro concentrado
mineral de cobre, plomo y zinc con un consorcio bacteriano formado por
At. ferrooxidans, At. thiooxidans, Leptospirillum ferrooxidans y organismos
heterótrofos. El experimento en discontinuo mostró para 20% p/v de mineral
la mayor solubilización (73% de Cu y 84% de Zn). La extracción mediante un
sistema en semi-continuo y densidad de pulpa del 25% p/v solubilizó 79% de
Cu y 82% de Zn y la operación en continuo en un reactor de tanque
agitado obtuvo extracciones del 85,3% y 80% de Cu y Zn, respectivamente.
La biolixiviación en continuo con la adición controlada del mineral se prevé
69
ANTECEDENTES
como una tecnología viable económicamente para la extracción de
metales de un concentrado mineral.
La capacidad oxidativa de las bacterias azufre-oxidantes también se
aplica en procesos de biooxidación, como en los minerales refractarios de
oro, donde la tarea de estas bacterias es lixiviar los metales constituyentes
del concentrado de minerales que acompaña al metal valioso para
favorecer su extracción, este proceso está aplicado tecnológicamente en
algunos lugares (Nestor y col., 2001).
2.7.2 BIOLIXIVIACIÓN DE LODOS
En las plantas de tratamiento biológico de aguas se procesan
elevados volúmenes de aguas residuales urbanas y de aguas residuales
industriales, lo cual genera una cantidad desmesurada de lodos, que la
mayoría de las veces son depositados en el medio ambiente sin tratamiento
previo (incineración, landfilling, descargas en el mar, aplicación a suelos
agrícolas… (Xiang y col., 2000)). Se ha demostrado que la aplicación
agrícola de los lodos es un medio factible y efectivo por la aportación de
constituyentes beneficiosos para el crecimiento de las plantas y, a su vez, la
mejora de las propiedades físicas del suelo (Chang y col., 1984). Aunque los
lodos de aguas residuales poseen buenas características fertilizantes, la
presencia de metales pesados restringe su uso. La reducción de metales
pesados por medio del control de la fuente que los genera es un proceso
caro y complicado ya que, con frecuencia, es difícil identificar las fuentes
de origen de los metales presentes en el lodo por la diversidad de
contribuciones que puede tener una planta de aguas residuales. La
eliminación de metales antes de la aplicación a la tierra de los lodos puede
ser una mejor opción.
Existen varios métodos químicos, como la extracción con AEDT o el
tratamiento con ácidos, que han sido aplicados con este objetivo. La
70
ANTECEDENTES
extracción con AEDT muestra una elevada eficacia de eliminación para el
Cu, Pb y Cd pero, sin embargo, baja para Fe, Ni y Cr (Jenkins y col., 1981).
En los tratamientos ácidos se emplean ácidos orgánicos y minerales para
solubilizar metales a bajos pH, se obtienen elevadas eficacias pero las
dificultades de operación y el elevado consumo de agentes químicos hace
poco atractivos estos métodos (Hayes y col., 1980).
Se ha desarrollado y demostrado que los procesos de biolixiviación
aplicados a este tipo de residuos constituyen una tecnología prometedora.
En las últimas décadas, muchos trabajos han sido dirigidos a investigar la
eficacia de la eliminación de metales pesados procedentes de lodos
residuales por medio de métodos de biolixiviación, empleando bacterias
acidófilas hierro-oxidantes y/o azufre-oxidantes como At. ferrooxidans y At.
thiooxidans (Tyagi y col., 1988 y 1991; Jenkins, 1988; Chartier y Couillard,
1997). Estos procesos pueden disminuir en un 80% los costes si lo
comparamos con un método químico tradicional. Los distintos estudios
realizados hasta el momento han sido, en su mayoría, enfocados a
determinar la influencia de los diversos parámetros que intervienen en la
biolixiviación.
Algunos estudios previos (Tyagi y col., 1988; Blais y col., 1993) indican
la necesidad de la preacidificación del lodo a pH menores de 4,5, lo cual
limita su aplicación industrial por el consumo de ácido que esto implica.
Además, esto puede provocar otros efectos como la acidificación del suelo
enmendado con lodo. Por otra parte, la biolixiviación genera un ambiente
fuertemente oxidante y una disminución del pH que, además de solubilizar
los metales, digiere gran parte la materia orgánica presente en el lodo, lo
cual puede provocar la pérdida de algunos nutrientes que le restan valor
nutritivo al lodo resultante.
71
ANTECEDENTES
Entre los estudios acerca de la biolixiviación de lodos existen muchos
enfocados a determinar la influencia de algunos parámetros sobre este tipo
de procesos.
Así, Wong y col. (2001) estudiaron el efecto del pH inicial en la
biolixiviación de lodos anaerobios mediante un cultivo indígena de At.
ferrooxidans. Se observó una disminución del pH de 3-7 a 2,1-2,4 en tan sólo
6 días. En cuanto a la biolixiviación, después de 16 días de incubación se
obtuvieron porcentajes de eliminación bastante elevados: 50,2-78,4 % de Cr,
63,7-74,1% de Cu, 74,9-88,2% de Zn y 15,5-38,6% de Ni.
Xiang y col. (2000) estudiaron la influencia del sulfato ferroso presente
en el medio sobre la biolixiviación de lodos anaerobios realizada por un
cultivo indígena de bacterias azufre-oxidantes. La biolixiviación de los
distintos metales fue dispar. La solubilización de cromo se mostró
dependiente del crecimiento del cultivo, sin embargo, la solubilización del
zinc ocurrió en función del pH del medio. Cobre, níquel y plomo tras llegar a
un máximo de lixiviación presentaron fluctuaciones por efectos de
readsorción o formación de complejos. Se consiguió solubilizar: 70,6 % de
Cr(III), 87% de Zn(II), 91,5% de Cu(II), 54% de Ni(II) y 16% de Pb. Los niveles de
los metales que quedaron en el lodo estaban dentro de los límites permitidos
por la legislación.
La solubilización en el rango de temperaturas de 20-40ºC mostró
valores entre 37-41% de Cr, 53-56% de Cu, 63-68% de Ni, 50-59% de Pb y 7785% de Zn. Tras una mayor fase de latencia, los cultivos a 20ºC alcanzan
valores de solubilización similares en torno a los 10 días.
Otros trabajos tratan de estudiar como influye la presencia de sólidos
y de una fuente de energía en la biolixiviación de metales presentes en
lodos por parte de las bacterias azufre-oxidantes.
72
ANTECEDENTES
Lombardi y col. (2001) estudiaron la biolixiviación del zinc presente en
un lodo con cultivos At. ferrooxidans con y sin presencia de Fe(II), At.
thiooxidans con y sin presencia de Sº y un control. El porcentaje de
solubilización del Zn fue aproximadamente del 85-90% para At. thiooxidans
con azufre y el 80% para At. ferrooxidans con hierro, At. thiooxidans produce
una mayor solubilización pero At. ferrooxidans lo realiza en un menor tiempo,
ya que At. thiooxidans requiere una primera etapa de oxidación de azufre
para producir ácido sulfúrico para la lixiviación del metal, mientras At.
ferrooxidans puede solubilizar el metal por ataque del férrico generado por
la oxidación del ferroso presente en el medio.
Por otra parte, es importante verificar, tras el proceso de biolixiviación,
como afecta la especiación química a los metales que quedan en el lodo.
Con este objetivo en varios trabajos (Villar y col., 2001; Lombardi y Garcia Jr,
2001) se realizan procedimientos de extracción secuencial para determinar
el reparto de los metales en cada una de las fracciones del lodo y
determinar la biodisponibilidad del metal residual que permanece tras la
biolixiviación ya que, en ocasiones, los metales pueden mostrar una mayor
movilidad y afectar en mayor medida al suelo y las plantas, una vez que el
lodo sea aplicado con fines agrícolas, con lo cual, el proceso de
biolixiviación podría producir un efecto global negativo.
El estudio realizado por Matlakowska y Sklodowska (2001) se dirigió a
evaluar la efectividad de biolixiviación de cobre y cadmio por un cultivo
puro de At. ferrooxidans o mixto con At. thiooxidans, con distintos sustratos
(azufre, covelita y calcocita) en distintos tipos de lodos (lodos primarios,
lodos
anaerobios,
lodos
deshidratados
y
lodos
deshidratados
preacidificados). Los lodos anaerobios y deshidratados parecen ser los más
indicados para ser lixiviados, tras 21 días se alcanzó una extracción del 40-
73
ANTECEDENTES
50% de Cd y Cu. La biolixiviación en todos los casos fue más efectiva en el
caso del cultivo mixto suplementado con azufre.
Habitualmente los lodos son sometidos a procesos de incineración,
esto hace que la idea de biolixiviación de metales también sea trasportada
a este tipo de residuos. Existen diversos trabajos enfocados al estudio de
procesos de biolixiviación con bacterias azufre-oxidantes sobre las cenizas
resultantes de la incineración de residuos. Ting y col. (2001) realizaron un
estudio comparativo entre la lixiviación química y la biolixiviación por At.
ferrooxidans de algunos metales para diferentes densidades de pulpa de
estas cenizas. La lixiviación química para 1% p/v de cenizas con ácido
sulfúrico 1M (77,5% Al, 42,3% Zn, 15,9% Pb, 7,0% Cu y 26,9% Mn) fue más
eficiente en el tiempo y la solubilización del plomo pero la biolixiviación con
At. ferrooxidans (75,3% Al, 44,7% Zn, 4,4% Pb, 11,6% Cu y 84,5% Mn) mostró
mayor solubilización de cobre y manganeso, los resultados para aluminio y
zinc fueron similares.
Krebs y col. (2001) estudiaron también la biolixiviación de metales
presentes en cenizas con cultivos Acidithiobacillus en función de la cantidad
de ceniza presente y de la adición o no de lodos anaerobios (fuente de
nutrientes, energía y flora indígena). La incorporación de lodos produce un
aumento de la población bacteriana y un mayor descenso del pH, dando
lugar a un menor tiempo necesario para la solubilización. Para densidades
entre 0,5-4%, pH 1-1,5, se obtuvo la solubilización del 80% de Cd, Cu y Zn, el
60% de Al, 30% de Ni, 10% de Cr y 5% de Pb, lo que supone el 50% del total
de metales presente en la ceniza.
Otros trabajos se han dirigido a la aplicación de la biolixiviación a
residuos concretos, como pueden ser los lodos procedentes de la actividad
industrial. Solisio y col. (2002) aplicaron At. ferrooxidans a la remediación de
lodos procedentes de dos tipos de industrias, lodos de la producción de
74
ANTECEDENTES
aleaciones
de
hierro-manganeso
(alto
contenido
en
Zn)
y
lodos
procedentes de una planta de oxidación anódica de aluminio (alto
contenido en aluminio). En el lodo rico en zinc se presentó una solubilización
del 73% de zinc para un 10% de contenido en lodo, sin embargo, el lodo rico
en aluminio sólo presentó una solubilización importante (78-77%) para un
contenido en lodo menor del 3%.
Al igual que los lodos, los sedimentos también presentan elevado
contenido en metales pesados. En su trabajo Chartier y Couillard (1997)
presentaron el estudio de los parámetros que influyen en la biolixiviación de
sedimentos por At. ferrooxidans (pH inicial, % de inóculo, incorporación de
nutrientes). Se observó que la biolixiviación del cobre dependía de la
presencia de bacteria y la lixiviación el zinc y el plomo se debió a la
presencia de ácido en el medio. En general, se obtuvo una lixiviación
aceptable del contenido en cobre (60-80%) y zinc (80-90%) pero no para el
plomo (< 30%), el pH afecta la solubilidad de este metal, el nivel de plomo
queda en valores superiores a los permitidos por la legislación. Otro trabajo
realizado por estos autores (Mercier y col., 1996) se dirige a la mejora de las
condiciones para la solubilización del plomo en sedimentos acuáticos. Para
evitar una elevada concentración de sulfato se sustituyó el sulfato ferroso
por cloruro ferroso, como fuente de energía para At. ferrooxidans,
obteniendo la solubilización de 5 mg Pb/l. Cuando la acidificación previa
del lodo se realizó con ácido clorhídrico en lugar de ácido sulfúrico se
biolixiviaron 11 mg Pb/l. En contraposición el bajo contenido en sulfato no
permite el desarrollo adecuado de la bacteria y, por consiguiente, la
eficacia en la solubilización de otros metales es menor.
2.7.3 BIOLIXIVIACIÓN DE SUELOS
La actividad industrial ha provocado una elevada deposición de
metales pesados y compuestos orgánicos en sus alrededores, siendo uno de
75
ANTECEDENTES
los mayores acumuladores de esta contaminación el suelo. La complejidad
de la aplicación de la biolixiviación con bacterias azufre-oxidantes reside en
que éstas son sensibles a bajas concentraciones de una gran variedad de
compuestos orgánicos frecuentemente presentes en el suelo (Tuttle y
Dugan, 1976). Algunos investigadores han tratado de demostrar que
algunas cepas Acidithiobacillus son tolerantes a ciertas sustancias orgánicas
(Zagury y col., 1994) y este hecho ha dado la posibilidad de aumentar la
aplicación de este proceso a los suelos y sedimentos contaminados.
Gómez y Bosecker (1999) estudiaron la biolixiviación de metales
pesados de varios suelos con cultivos aislados del propio suelo. El medio
empleado para el crecimiento de los cultivos, el tipo y la cantidad de suelo
fueron los parámetros de estudio. La biolixiviación fue mayor del 50% de los
metales presentes. At. ferrooxidans logró la solubilización total de Cd, Co, Cu
y Ni y At. thiooxidans solubilizó mas del 80% de Cd, Co, Cu y Zn. No se
detectó plomo ni bario en el lixiviado, dada la insolubilidad de sus sulfatos
correspondientes.
Gourdon y Funtowicz (1995) aplicaron la capacidad de producir
ácido sulfúrico de las bacterias azufre-oxidantes para eliminar los metales
pesados presentes en suelos contaminados de un área industrial. El 80-90%
de los metales (Zn, Pb, Cu y As) esta fuertemente unido a la matriz del suelo,
en la fracción residual. El proceso de biolixiviación, que se llevó a cabo con
cepas de At. ferrooxidans y At. thiooxidans con y sin suplemento de azufre.
Se eliminó 45-50% de zinc y 35-40% de cobre en 90 días, mientras que el
plomo y el arsénico no fueron apenas solubilizados. Los mejores resultados se
obtuvieron para At. thiooxidans con azufre en el medio.
White y col. (1998) también realizaron un proceso similar. El estudio de
biolixiviación se llevó a cabo con un suelo contaminado de forma artificial y
un suelo contaminado por la actividad industrial. En el suelo artificial (Cd,
76
ANTECEDENTES
Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Zn) se consiguió la solubilización de mayor cantidad
de metal que la añadida, es decir, se solubilizó parte del metal mineralizado
en el suelo anteriormente. El porcentaje de biolixiviación de estos metales
fue del 90-99%, excepto para el plomo (66%) cuya solubilización se
mantenía incompleta tras 180 días. En el suelo industrial, con alto contenido
en Cu y Ni, se obtuvo una solubilización algo menor y la lixiviación fue más
lenta debido a que todo el metal está formando parte de la matriz del
suelo, de forma más arraigada, y a un mayor tamaño de partícula de este
soporte.
2.7.4 BIOLIXIVIACIÓN DE OTROS RESIDUOS
El estudio las bacterias azufre-oxidantes y su aplicación en residuos
comunes (minerales, suelos, sedimentos, lodos, etc), ha dado lugar a que
algunos investigadores traten de aplicar esta capacidad a residuos más
concretos o de otro tipo. A continuación se citan algunos ejemplos.
Idachaba y col. (2004) evalúan la lixiviación del cromo presente en
un residuo procedente de un proceso de estabilización/solidificación
mediante la acción de At. thiooxidans formando una película. El tiempo de
formación de ésta influye de forma positiva en la extracción. A modo
general, se observó que el 50% del cromo se lixivia en las primeras 24 horas.
Uno de los residuos más tóxicos y numerosos que contienen metales
pesados son las pilas. Cerruti y col. (1998) tratan de aplicar la producción de
ácido sulfúrico de las bacterias azufre-oxidantes para disminuir el contenido
en metales de las baterías de níquel/cadmio. El trabajo se realizó en
biorreactores con At. ferrooxidans. Tras 93 días, se solubilizó el 100% del
cadmio, 96,5 % de níquel y 95% de hierro.
77
ANTECEDENTES
2.7.5 APLICACIONES INDUSTRIALES
Durante los últimos 25 años la biolixiviación ha abierto nuevas
oportunidades para la extracción metalúrgica y la biohidrometalurgia ha
sido implantada en la industria del cobre y el uranio, especialmente en el
tratamiento de minerales de baja ley (Bosecker, 1997).
Actualmente existen 11 plantas a gran escala que operan procesos
de biolixiviación en tanque agitado que emplean tres tecnologías diferentes
para procesar concentrados minerales refractarios de metales preciosos y
concentrados de pirita, cobalto y calcopirita (Brierley y Briggs, 2002).
La biolixiviación en pilas para recuperar cobre se ha convertido en
una práctica común en la industria. Desde 1980 hasta ahora 13 plantas han
trabajado realizando operaciones de biolixiviación (tabla 14), pero no todas
están en la actualidad en producción, debido al agotamiento de reservas
minerales o, en otros casos, por problemas operativos. Estas plantas
recuperan cobre a partir de la calcocita (Cu2S). El cobre es lixiviado de dos
formas: mediante ácido sulfúrico pasando a covelita (CuS) o por la acción
del férrico, formado a partir de la oxidación bacteriana de ferroso. El cobre
en la forma de calcopirita (CuFeS2) lixivia pobremente. Actualmente, se
están desarrollando nuevas tecnologías empleando microorganismos
termófilos para la biolixiviación de calcopirita, utilizando pilas o sistemas de
reactor de tanque agitado. La lixiviación en pilas de la calcocita es llevado
a cabo en aglomerados minerales de tamaño de partícula entre 1-4 cm,
que se acumulan en pilas de 6-10 metros de altura y cientos de metros de
ancho y de largo. La lixiviación es aplicada mediante regado por goteo. La
solución lixiviada que drena de las pilas es rica en sulfato de cobre y se
envía a un circuito de extracción para la recuperación del cobre. La
producción de cobre está en el rango de 10000-100000 t Cu/año según el
tamaño de las plantas de operación.
78
ANTECEDENTES
Planta y localización
Tamaño (t mineral/día)
Años en operación
Lo Aguirre, Chile
16000
1980-1996
Gunpowder’s Mammoth Mine, Australia
In situ
1991-presente
Mt. Leyson, Australia
1370
1992-1997
Cerro Colorado, Chile
16000
1993-presente
Girilambone, Australia
2000
1993-clausurada
Ivan-Zar, Chile
1500
1994-presente
Quebrada Blanca, Chile
17300
1994-presente
Andacollo, Chile
10000
1996-presente
Dos Amigos, Chile
3000
1996-presente
Cerro Verde, Perú
32000
1996-presente
Zaldívar, Chile
20000
1998-presente
S&K Copper, Myanmar
18000
1998-presente
Ecuatorial Tonopah, USA
24500
2000-2001
Tabla 14. Plantas industriales de lixiviación de cobre. Olson y col. (2003)
En el campo de la biooxidación, como pretratamiento para la
obtención
de
metales
preciosos,
la
primera
planta
comercial
de
biolixiviación en tanque agitado fue abierta en 1986 para el tratamiento de
un concentrado de oro sulfídico. En la Tabla 15 se muestra un listado de las
plantas
de
pretratamiento
de
concentrados
de
oro
refractario.
Normalmente, las plantas de este tipo operan con un 15-20% de densidad
de concentrado. Las plantas emplean mezclas de microorganismos
mesófilos y termófilos, de este modo, la oxidación de la pirita aumenta en
áreas internas de las pilas donde la temperatura puede ser de hasta 81ºC.
Brierley y Briggs (2002) han publicado una descripción de los equipos y
procesos empleados en la biooxidación comercial.
La aplicación comercial de la biolixiviación para la obtención del
uranio a partir de minerales de baja ley se practica desde los años 60. Las
más conocidas son las lixiviaciones in situ en las minas subterráneas de
Canadá. En ese tiempo la producción anual era entre 50-60 t de U3O8 (Olson
y col., 2003).
79
ANTECEDENTES
Tamaño
Planta y localización
(t concentrado/día)
Tecnología
Años de operación
Inicialmente 10
Fairview, South Africa
Expandido a 35
BIOX
1986-presente
Expandido a 40
Sao Bento, Brazil
Harbour Lights, Australia
Wiluna, Australia
Sansu, Ghana
Inicialmente 150
BIOX
Expandido
Eldorado
40
BIOX
1992-1994
BIOX
1993-presente
BIOX
1994-presente
Inicialmente 115
Expandido a 158
Inicialmente 720
Expandida a 960
1990-presente
Youanmi, Australia
120
Bac Tech
1994-1998
Tamboraque, Perú
60
BIOX
1990-presente
Beaconsfield, Australia
70
Bac Tech
2000-presente
Laizhou, China
100
Bac Tech
2001-presente
Tabla 15. Plantas comerciales de biolixiviación en tanque agitado para el pretratamiento de
concentrados de oro. Olson y col. (2003)
La biolixiviación está siendo utilizada comercialmente sólo para la
recuperación de cobre, uranio y oro, sin embargo, en el futuro estos
procesos se podrían convertir en importantes para la recuperación de zinc,
níquel, cobalto y molibdeno. La infraestructura y los costes de operación son
mucho más bajos que los métodos convencionales pirometalúrgicos e
hidrometalúrgicos. Las plantas de proceso pueden ser construidas en las
proximidades de los depósitos minerales, salvando así los costes de
transporte. Los procesos no son complejos y son fáciles de controlar.
80
ANTECEDENTES
2.8 REDUCCIÓN DEL Cr(VI) POR LA ACCIÓN DE LAS
BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES
Los compuestos de cromo tienen varias aplicaciones industriales
como la obtención de cromita, el galvanizado o el curtido de pieles entre
otras (Lawson, 1997). El cromo es acumulado en el medio ambiente por su
almacenamiento inapropiado o por la disposición de residuos de forma
inadecuada. El cromo hexavalente es clasificado como un contaminante
primario dada su movilidad en suelos y aguas subterráneas y sus efectos
dañinos sobre los seres vivos.
La reducción de Cr(VI) conduce a la formación de Cr(III), más estable
y menos tóxico, por tanto, este proceso se considera adecuado para ser
implementado como una tecnología limpia. La reducción o inmovilización
del Cr(VI) puede ser llevada a cabo de forma abiótica por distintas
sustancias (Palmer y Wittbrodt, 1991; Namasivayam y Raganathan, 1993,
James, 1996), pero estudios recientes han demostrado la idoneidad del uso
de la reducción biológica para el tratamiento de residuos que contienen
cromo (Quintana y col., 2001).
Generalmente, la biorreducción se realiza en presencia de fuentes de
carbono complejas y, de forma general, los microorganismos realizan la
reducción en condiciones anaerobias, empleando el Cr(VI) como aceptor
de electrones (Turick y col., 1996). La reducción del cromo hexavalente con
bacterias aerobias y que no requieren una fuente de carbono supone una
alternativa más atractiva.
Las bacterias azufre-oxidantes, At. ferrooxidans y At. thiooxidans
obtienen la energía de la oxidación de una variedad de compuestos de
azufre. La oxidación de dichos compuestos inorgánicos, en concreto del
azufre elemental, genera una serie de compuestos intermedios de azufre
81
ANTECEDENTES
(sulfitos, tiosulfatos y politionatos) con un alto poder reductor (Steudel y col.,
1987).
La capacidad de los cultivos Acidithiobacillus para reducir el Cr(VI)
en condiciones aerobias ha sido estudiada en algunos trabajos (Baillet y
col., 1998; Sisti y col., 1998; Quintana y col., 2001; Viera y col., 2003).
Aunque
los
completamente
mecanismos
elucidados,
se
de
oxidación
sabe
que
At.
de
azufre
thiooxidans
no
están
requiere
glutationato reducido (GSH) como intermedio para la oxidación de azufre
elemental (Schlegel y Bowien, 1989) y, por tanto, se piensa que At.
ferrooxidans puede actuar de igual modo (Rossi, 1990):
Sn + GSH → GSSnH
[8]
El polisulfuro formado es oxidado sucesivamente a diferentes
compuestos como sulfito (ecuación [9]), tiosulfato, otros politionatos y,
finalmente, sulfato (ecuación [10]).
2−
GSSnH + O2 + H2O → GSSn−1H + SO3 + 2H+
[9]
1
2−
2−
SO3 + O2 → SO4
2
[10]
Si este mecanismo es correcto, la reacción [9] genera compuestos
reductores y es responsable de la aparición de protones en solución, hecho
que está de acuerdo con algunos trabajos realizados (Quintana y col., 2001;
Viera y col., 2003) donde la reducción del Cr(VI) viene acompañada de un
aumento de la concentración de protones en el medio.
Se ha demostrado recientemente que la capacidad de reducción
del Cr(VI) por las bacterias azufre-oxidantes se puede relacionar con los
compuestos reductores asociados a las partículas de azufre y las células
(Quintana y col., 2001). De esta forma, el estudio realizado por Steudel
82
ANTECEDENTES
(1989) indicó que el azufre coloidal de los cultivos de Acidithiobacillus se
presenta como una larga cadena de politionatos formando micelas o
glóbulos de unas pocas micras.
Con el objeto de estudiar la capacidad de estas bacterias para
reducir el Cr(VI) en distintas condiciones se han llevado a cabo diversos
trabajos. Así, Sisti y col.(1998) estudiaron la reducción del Cr(VI) con At.
ferrooxidans y At. thiooxidans en cultivo discontinuo y formando biopelículas
con las cepas previamente adaptadas al Cr(III). En cultivo discontinuo se
registró inhibición completa de At. ferrooxidans para concentraciones
mayores de 2 mM, y de At. thiooxidans para concentraciones superiores a 1
mM. La inmovilización de las células sobre azufre produjo una mayor
reducción del Cr(VI), llegando At. ferrooxidans hasta 7mM.
En un estudio posterior, Quintana y col. (2001) evaluaron la
capacidad de reducción del Cr(VI) por At. ferrooxidans a diferentes valores
de pH y en condiciones aerobias y anaerobias. El estudio se realizó
separando el azufre coloidal obtenido del cultivo bacteriano por filtración,
con el objeto de poner en contacto éste con la solución de cromo. Se
observó que la habilidad de reducción del azufre coloidal tiene lugar a un
amplio rango de pH, aunque la reducción aumenta al disminuir el pH.
Además se observó que la reducción fue mayor cuando la fase de
crecimiento del cultivo fue más avanzada y se demostró la habilidad de At.
ferrooxidans para emplear el Cr(VI) como aceptor de electrones.
Viera y col (2003) presentaron la reducción de Cr(VI) mediante At.
thiooxidans para diferentes valores de pH y la integración de este proceso
con la inmovilización de Cr(III) por la acción de dos cultivos del género
Desulfovibrio. Ambos procesos operaron secuencialmente en condiciones
de flujo continuo permitiendo la transformación de una solución de 5 mg/l
de Cr(VI).
83
ANTECEDENTES
3 BIOPRECIPITACIÓN
CON
BACTERIAS
SULFATO-
REDUCTORAS
3.1 PRECIPITACION DE METALES DISUELTOS
Las aguas residuales generadas como producto de actividades
mineras, el procesado de metales y las industrias petroquímicas se
caracterizan por tener un elevado nivel de metales, sulfato, otras sales y un
bajo pH. Si no son tratadas de forma apropiada estas aguas pueden causar
un serio impacto en el medio ambiente. Además de los metales y la acidez,
el sulfuro de hidrógeno producido a partir del sulfato en condiciones
anaerobias puede también causar efectos nocivos. Por ello, se hace
necesario el desarrollo de métodos de tratamiento con el objeto de eliminar
los metales, el sulfato y la acidez de estas aguas. Convencionalmente se
han empleado métodos químicos, como la neutralización con cal, para el
tratamiento de aguas de estas características. Sin embargo, estos métodos
se consideran costosos y producen una elevada cantidad de lodos
químicos que requieren de un posterior tratamiento. Los métodos biológicos
de tipo pasivo o llevados a cabo en reactores han venido siendo estudiados
y desarrollados para el tratamiento de estos medios, aunque las
aplicaciones a gran escala son aun limitadas (Tuppurainen y col., 2002).
Entre estos tratamientos se encuentra la bioprecipitación, una
técnica que aprovecha la capacidad de los microorganismos para reducir
los metales pesados presentes en un medio pasándolos a un estado de
oxidación menor dando lugar a compuestos más estables por su menor
solubilidad y, por tanto, también menor movilidad o biodisponibidad. Los
metales pueden ser eliminados biológicamente por diferentes mecanismos
de precipitación, ya sea como sulfuros, carbonatos e hidróxidos o por
84
ANTECEDENTES
sorción sobre la biomasa ocurriendo a veces ambos fenómenos de forma
simultánea.
El proceso biológico anaerobio de reducción de sulfato es
potencialmente superior a otros procesos de precipitación ya que puede
eliminar tanto los metales como el sulfato presentes, siendo uno de los
procesos más baratos para la eliminación de metales de aguas residuales
(Bowell, 2000). En el proceso de reducción de sulfato los metales son
precipitados con el sulfuro producido por microorganismos sulfatoreductores formándose sulfuros metálicos insolubles (Drury, 1999; Groudev y
col., 1999).
Aunque muchos microorganismos generan metabolicamente sulfuro
de hidrógeno, siendo el sulfato un sustrato primario, este proceso sucede a
pequeña escala e implica la incorporación de azufre dentro de la célula y
su consiguiente degradación catabólica. Esta vía de producción de sulfuro
de hidrógeno se conoce como reducción de sulfato asimilatoria. En
contraste, la reducción no asimilatoria de sulfato es un proceso directo que
produce 10-100 veces más sulfuro de hidrógeno y es de gran interés
fisiológico debido a su similitud con la respiración de oxígeno y nitrógeno
(Postgate, 1984). La habilidad de las bacterias sulfato-reductoras para
realizar la reducción no asimilatoria de sulfato ha dado lugar al desarrollo de
gran número de investigaciones dirigidas a su estudio general y a su
aplicación a distintos niveles.
3.2 BACTERIAS SULFATO REDUCTORAS
Las bacterias sulfato-reductoras (BSR) constituyen un único grupo
fisiológico de procariotas ya que tienen la capacidad de utilizar sulfato
como aceptor final de electrones en la respiración. En un principio se
tomaron como una curiosidad pero luego el interés creció por su relación
85
ANTECEDENTES
con otras formas de vida. En las últimas décadas el estudio de los procesos
metabólicos de las bacterias sulfato-reductoras ha recibido una atención
considerable y, a partir de los estudios, realizados se puede decir que éstas
son muy similares a otras bacterias y que la característica que más las
distingue es la forma en que metabolizan el sulfato (Barton, 1995). Las
bacterias sulfato-reductoras están ampliamente distribuidas en la Tierra, se
sabe que estos microorganismos juegan un papel significativo en la
naturaleza por medio de numerosas interacciones (Figura 8)
Asociación con
animales
Producción de
combustibles
Transformaciones
geoquímicas
Tratamiento de
aguas residuales y
pantanos
Biocorrosión
Bacterias
sulfatoreductoras
Bioremediación
Descomposición
de alimentos
Ciclos de nutrientes
medioambientales
Figura 8: Interacciones de las bacterias sulfato-reductoras. (Barton, 1995)
Durante un tiempo se pensó que sólo existían unas pocas especies
sulfato-reductoras y que exclusivamente empleaban lactato o piruvato
para su crecimiento. Sin embargo, en la actualidad se conoce que estas
bacterias tienen capacidad y diversidad para utilizar varios compuestos
como donador de electrones (Hansen, 1993). En un principio también se
pensó que la única reacción inorgánica asociada a estas bacterias era la
86
ANTECEDENTES
reducción de sulfato, pero actualmente se conoce que interaccionan con
gran variedad de compuestos en su medio ambiente. La figura 9 muestra
algunas de las reacciones de oxidación-reducción asociadas a varios
miembros de la familia de las sulfato-reductoras.
H2
S2-
N2
NO2-
CO
e- + H+
SO42-
S0
Compuestos
orgánicos-S
NO3-
NH3
Compuestos
orgánicos-S
O2
CO2
HO·
Compuestos
orgánicos-C
H2O2
H2O
Bacterias sulfato-reductoras
Se0
SeO32-
U6+
Fe3+
Seleniometionina
U4+
Fe2+
Hg0
Hg(metil)2
Cr6+
Cr3+
Figura 9: Transformaciones químicas atribuidas a las bacterias sulfato-reductoras. (Barton,
1995)
Existen tres grupos celulares básicos de bacterias sulfato-reductoras:
eubacterias gram-negativas, eubacterias gram-positivas y arqueobacterias.
Las bacterias sulfato-reductoras mesófilas y gram-negativas son las más
ampliamente distribuidas en la naturaleza. Este grupo incluye cinco géneros
que oxidan compuestos orgánicos de forma incompleta a acetato (Tabla
16)
(Desulfovibrio,
Desulfobotulus,
Desulfobulbus,
Desulfohalobium,
Desulfomicrobium) y siete géneros que oxidan compuestos orgánicos de
forma completa a dióxido de carbono (Desulfoarculus, Desulfobacer,
87
ANTECEDENTES
Desulfobacerium,
Desulfococcus,
Desulfomonile,
Desulfonema,
Desulfoarcina) (Barton, 1995).
Especie
Cepa
Habitat
Sustrato
Fijación N2
D. africanus
NCIB 8401
Agua
Lactato
+
D. desulfuricans
DSM 642
Suelo
Lactato
+
D. frutosovorans
DSM 3604
Sedimentos de estuarios
Fructosa
NR
D. furfuralis
DSM 2590
Residuos de papel
Furfural
NR
D. giganteus
DSM 4123
Sedimentos
Glicerol
+
D. gigas
NICB 9332
Agua de laguna
Lactato
+
D. longus
DSM 6739
Productos del petróleo
Lactato
NR
D. pager
ATCC 29098
Heces humanas
Lactato
NR
D. sulfodismutans
DSM 3696
Barro de agua dulce
Tiosulfato
NR
D. vulgaris
NCIB 8303
Suelo
Lactato
+
Dbu. marinus
DSM 2058
Barros marinos
Propionato
+
Dbu. propionicus
DSM 2032
Barro de agua dulce
Propionato
+
Dsm. apsheronum
AUCCM 1105
Depósitos de petróleo
Lactato
NR
Dsm. Baculatum
AUCCM 1378
Mineral de manganeso
Lactato
+
Dbo. Sapovorans
DSM 2055
Barro de agua dulce
Butarato
NR
Dh. Retbaense
DSM 5692
Sedimentos de lago hipersalino
Lactato
NR
Tabla 16: Algunas características de bacterias sulfato-reductoras mesófilas gram-negativas.
NR: no recogida en bibliografía. (Barton, 1995)
3.2.1 CARACTERÍSTICAS
Las bacterias sulfato-reductoras son bacterias heterótrofas que
requieren condiciones anaerobias estrictas con un poder de oxidoreducción menor de -200mV. El principal sustrato orgánico empleado como
fuente de carbono y energía para los organismos que tienen mayor
velocidad de crecimiento, como Desulfovibrio sp., es un ácido orgánico de
bajo peso molecular como el ácido acético y láctico o alcoholes como el
etanol (Postgate, 1984; White y col., 1997). El metabolismo del carbono es
esencialmente similar en todos los casos, el sustrato orgánico es oxidado
completamente a CO2 o de forma incompleta a algún compuesto
88
ANTECEDENTES
intermedio. Se genera un ATP vía una cadena de transporte electrónico con
el sulfato como aceptor terminal de electrones que se reduce a sulfuro.
Las bacterias sulfato-reductoras mesófilas tienen su máximo de
crecimiento a pH 6-8, aunque, algunos aislados pueden crecer en
condiciones moderadamente ácidas, pH 3-4. En esas condiciones las
bacterias son encontradas en sedimentos y su aparente tolerancia al ácido
se deriva de la existencia de un microambiente más neutral dentro del
hábitat, el cual es mantenido mediante la actividad de las propias
bacterias. Tanto la reducción de sulfato como la reducción de metales
utilizan protones contribuyendo a la alcalinidad en el ambiente de la
bacteria (Postgate, 1984).
3.2.2 GÉNERO Desulfovibrio
Beyerinck (1895) presentó un aislado de Spirillum desulfuricans y
apuntó la importancia de la producción microbiana de sulfuro de
hidrógeno para su estudio y su aplicación. La descripción morfológica de
esta bacteria deja pocas dudas acerca de que se aisló y caracterizó la
primera especie Desulfovibrio. Muchos investigadores han ampliado el
conocimiento sobre las eubacterias sulfato-reductoras gram-negativas, la
clase a la cual pertenece el género Desulfovibrio (Voordouw, 1995).
Postgate (1984) realizó un amplio estudio en el que se incluye el
descubrimiento del citocromo c3. Otros investigadores (LeGall y Fauque,
1988; Peck Jr, 1994) han documentado una amplia variedad de enzimas y
proteínas que han sido encontradas en especies Desulfovibrio
y han
sugerido su participación en el metabolismo de estas bacterias.
Widdel (1991 y 1992) amplió el conocimiento actual de las bacterias
sulfato-reductoras gram-negativas mediante el descubrimiento de otros
géneros en los que se incluyen entre otras: Desulfobulbus, Desulfobacter,
Desulfobacterium,
Desulfococcus,
Desulfomonile,
Desulfonema,
89
ANTECEDENTES
Desulfobotulus y Desulfoarculus. Los avances en biología molecular han
permitido descubrir la composición, metabolismo y diversidad de las
bacterias Desulfovibrio en el medio ambiente.
3.2.3 METABOLISMO DE LAS BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS
El metabolismo del carbono por las bacterias sulfato-reductoras
ocurre vía mecanismo respiratorio (Hansen, 1993; Postgate, 1984). Los
sustratos empleados incluyen alcoholes, ácidos orgánicos, e hidrocarburos,
aunque los alcanos no son metabolizados y los azucares no se utilizan. Sin
embargo, cada cepa sólo es capaz de metabolizar un rango limitado de
estos sustratos. La preferencia por los sustratos ha sido empleada para
clasificar las bacterias sulfato-reductoras en tres grupos que pueden diferir
también en la velocidad de crecimiento (White y Gadd, 1998).
El grupo hidrogeno-lactato lo constituyen principalmente especies
Desulfovibrio y Desulfomaculum. Utilizan los ácidos orgánicos, lactato,
piruvato, succinato, fumarato y malato y pueden emplear también etanol
siendo el producto final acetato y/o CO2. Ciertos miembros de este grupo
pueden utilizar hidrogeno como donador de electrones en presencia de
CO2, acetato y otras fuentes de carbono. Es el grupo con crecimiento más
rápido (t1/2= 3-4 h en lactato).
Un segundo grupo incluye la especie Desulfobacter, bacterias que
son capaces de oxidar completamente acetato a CO2, aunque algunas
pueden emplear lactato o etanol. El rango de sustratos es muy limitado y no
son capaces de emplear hidrogeno como donador de electrones. El
crecimiento es más lento (t1/2= 20 h).
El último grupo se caracteriza por emplear ácidos grasos de mayor
peso molecular que el acetato. Son algunas especies Desulfobulbus y
90
ANTECEDENTES
Desulfovibrio, algunas oxidan sólo un número limitado de estos sustratos a
acetato y otras oxidan un gran rango de estos ácidos grasos hasta CO2. Este
grupo
incluye
algunos
organismos
extremadamente
versátiles
que
degradan compuestos fenólicos como ácidos aromáticos (Postgate, 1984).
3.2.4 METABOLISMO DEL GÉNERO Desulfovibrio
El sulfato es el aceptor de electrones preferente de las especies
Desulfovibrio (Voordouw, 1995). Éste es reducido a sulfuro mediante una
serie de reacciones en las que intervienen varias enzimas:
SO4
2−
+ ATP + 8H+ int → HS + AMP + 2Pi
[11]
Hidrógeno, formato, lactato o piruvato y muchos otros compuestos
orgánicos, incluidos hierro metálico y algunos compuestos del petróleo,
pueden servir como donadores de electrones para la reducción del sulfato.
El crecimiento quimiolitotrófo de Desulfovibrio con el hidrógeno como
donador de electrones requiere de acetato o CO2 como fuente de
carbono e implica un gradiente de protones del interior al exterior celular. El
primero en describir este proceso fue Badziong y col. (1979). La habilidad
para utilizar hidrógeno como donador de electrones para la producción de
energía es general en el género Desulfovibrio (White y Gadd, 1998).
Cuando lactato o piruvato son empleados como donadores de
electrones, se oxidan de forma incompleta a acetato y CO2, como se
muestra en la reacciones [12] y [13]
Lactato → piruvato + 2Hint + 2e−
+
[12]
Y el piruvato es oxidado a acetato y dióxido de carbono
Piruvato + ADP + Pi → acetato + CO2 + ATP + 2Hint + 2e−
+
[13]
91
ANTECEDENTES
De este modo, considerando la reacción de conversión energética
[14]
AMP + ATP → 2 ADP
[14]
y las ecuaciones [11], [12] y [13] se llega a una reacción que
relaciona dos moles de lactato por mol de sulfato
2 lactato + SO4
2−
→ 2 acetato + 2CO2 + HS
[15]
y combinando [11], [13] y [14] se obtiene para el piruvato:
4 piruvato + 2 ADP + 2Pi + SO4
2−
→ 4 acetato + 4CO2 + 2 ATP + HS − [16]
Una gran variedad de alcoholes y aldehídos de cadena corta
pueden servir como donadores de electrones, se ha purificado y
caracterizado la enzima alcohol-deshidrogenasa de la especie Desulfovibrio
gigas (Hensgens y col., 1993) y el gen de la aldehido-oxidasa ha sido
clonado y secuenciado. También se conoce la habilidad de algunas cepas
sulfato-reductoras en zonas industriales para utilizar el hierro elemental como
donador de electrones (Little y col., 1991), este hierro es producido
industrialmente mediante el calentamiento de óxidos de hierro en un
ambiente reductor y revierte a su forma oxidada mediante procesos de
corrosión.
Además de la diversidad de donadores de electrones, las especies
Desulfovibrio pueden utilizar otros aceptores de electrones distintos del
sulfato. Algunas cepas Desulfovibrio desulfuricans pueden reducir nitrato a
nitrito o amonio (Dalsgaard y Bak, 1994). A pesar de considerarse a las
bacterias sulfato-reductoras estrictamente anaerobias, existen especies
Desulfovibrio que pueden emplear oxígeno como aceptor de electrones
(Dilling y Cypionka, 1990). Otros organismos son capaces de reducir
arsenato a arsenito (Ahman y col., 1994) y el Fe(III) ha sido sugerido como un
92
ANTECEDENTES
importante aceptor de electrones para Desulfovibrio sp. en sedimentos
anaerobicos (Coleman y col., 1993).
Las bacterias sulfato-reductoras contribuyen a la reducción e
inmovilización de metales pesados. Las condiciones reductoras creadas por
las sulfato-reductoras generan la reducción de algunos iones metálicos. En
particular, pueden contribuir a la eliminación de Cr(VI), convirtiendo
oxianiones como CrO42- a especies catiónicas menos tóxicas como el Cr(III)
que son precipitadas o bioadsorbidas (Fude y col., 1994; Lovley y Philips,
1994), y a la transformación de U(VI) soluble reduciéndolo a U(IV) insoluble
(Lovley y col., 1993; Lovley, 1995), se piensa que el citocromo c3
periplasmático sirve como metal reductasa en todos los casos.
3.3 FUNCION
DE
LAS
REDUCTORAS EN LA
METALES
BACTERIAS
SULFATOBIOPRECIPITACIÓN DE
La generación de sulfuros por parte de las bacterias sulfatoreductoras tiene una serie de consecuencias de especial relevancia en la
eliminación de metales: creación de un ambiente reductor, eliminación de
la acidez y precipitación de metales en forma de sulfuros. Los sulfatos
metálicos se encuentran con frecuencia en aguas contaminadas, como las
aguas ácidas de mina, normalmente por la acción de bacterias azufreoxidantes en los ambientes relacionados con la actividad minera. La
presencia de metales en forma de sulfatos también es resultado de
procesos metalúrgicos como la fundición de minerales sulfuro (Barnes y col.,
1991; White y col., 1997).
Los productos de solubilidad de la mayoría de los sulfuros metálicos
son muy bajos, de modo que la producción de una cantidad moderada de
sulfuro puede eliminar los metales de forma efectiva, reduciéndolos a
93
ANTECEDENTES
concentraciones por debajo de los niveles permitidos en el medio ambiente
(Cathorne
y
Dobbs,
1990).
Además,
estos
microorganismos
son
necesariamente anaerobios y en estas condiciones los sulfuros son más
estables (White y Gadd, 1998). Adicionalmente, el aumento de pH puede
resultar en la precipitación de metales como el hierro y el aluminio su forma
hidróxidos (Weast, 1978).
3.3.1 ADHESIÓN BACTERIA-MINERAL
Las bacterias sulfato-reductoras generan sustancias poliméricas
extracelulares (EPS) que les permiten desarrollarse fácilmente en forma de
película.
Las
EPS
comprenden
una
mezcla
de
polisacáridos,
mucopolisacáridos y proteínas que varían en función de la especie y el
cultivo y pueden unirse a metales solubles o partículas finas. Algunos
estudios indican la adhesión de los sulfuros precipitados sobre la biopelícula
formado por las bacterias sulfato-reductoras (White y Gadd, 2000a y b)
Pero las EPS pueden afectar a las características de superficies
metálicas cuando forman complejos con iones metálicos. La interacción
bacteria-metal, en este caso, tiene un efecto negativo, por el cual las
bacterias sulfato-reductoras son objeto de estudio en numerosos trabajos
(Beech y Sunner, 2004; Fang y col, 2002). La formación de estas biopelículas
con frecuencia se da sobre superficies como canalizaciones industriales,
tuberías de aguas residuales o intercambiadores de calor, originando lo que
se conoce como biocorrosión. El sulfuro producido por estas bacterias
causa lo que se conoce como la despolarización catódica de hidrógeno y
daña el pasivado de aceros y otros tratamientos de superficies metálicas
acelerando la interacción anódica.
94
ANTECEDENTES
3.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA REDUCCION DE
SULFATO
Para llevar a cabo de forma efectiva la reducción de sulfato por
parte de las bacterias sulfato-reductoras, es necesario controlar una serie de
factores principales, aunque el valor de estos parámetros depende
ampliamente de las características del medio que se pretende remediar.
Estos factores son:
•
Nutrientes: Las bacterias sulfato reductoras por tratarse de
organismos heterótrofos, requieren de una fuente de carbono.
Suelen ser ácidos orgánicos de cadena corta, alcoholes y
otros
compuestos
menos
comunes.
Algunas
cepas
metabolizan diferentes fuentes, con lo cual es importante
conocer cual aporta un mayor crecimiento bacteriano o una
mayor
actividad
bacteriana
(White
y
Gadd,
1996).
Habitualmente estas bacterias se encuentran en hábitats
donde cuentan con una fuente de carbono cercana (lodos,
sedimentos). Además requieren de la presencia de otros
nutrientes esenciales como nitrógeno, fósforo, sales de amonio
y magnesio. Cuando el hidrógeno es empleado como aceptor
de electrones se requiere de dióxido de carbono y otros
sustratos como fuente de carbono para la bacteria.
•
Fuente de energía: habitualmente, la fuente de carbono
también actúa como donador de electrones.
•
Aceptor de electrones: para llevar a cabo su actividad es
necesario que exista una proporción de sulfato suficiente en el
medio. Existen estudios que tratan de relacionar la cantidad
óptima de sulfato o la velocidad de reducción de sulfato
95
ANTECEDENTES
necesarias para un mayor crecimiento bacteriano (Moosa y
col., 2002). Mantener la cantidad de sulfato adecuada es
importante también para evitar la proliferación de bacterias
metanógenicas
que
habitualmente
coexisten
con
las
bacterias sulfato-reductoras compitiendo por el acetato o el
hidrógeno.
•
Condiciones anaerobias: Las bacterias sulfato-reductoras son
anaerobias estrictas, es indispensable crear un ambiente
anóxico que se obtiene por el desplazamiento del oxígeno
presente en el medio mediante una corriente de gas libre de
éste, normalmente nitrógeno, o por el aporte de compuestos
reductores
(acido
tioglicólico,
ácido
ascórbico)
que
consumen el oxígeno que pueda quedar en un sistema
cerrado.
•
pH:
las
bacterias
sulfato-reductoras
crecen
mejor
bajo
condiciones ligeramente alcalinas en un rango de 7,0-7,8 y
toleran valores entre 5,5 y 9,0. El valor óptimo de pH difiere
mucho según la cepa y del habitat en el que se encuentre
previamente la bacteria ya que habitualmente se pueden
encontrar en efluentes industriales o aguas ácidas de mina
(Barton, 1995).
•
Potencial redox: es un factor clave para el inicio de la
reducción de sulfato y depende del sustrato orgánico
seleccionado, debe estar por debajo de -200 mV.
•
Temperatura: Las bacterias sulfato-reductoras mesófilas crecen
mejor entre 28-38 ºC y su temperatura límite está entorno a 45
ºC, aunque también existen algunas cepas termófilas. La
temperatura es un factor muy influyente, hay autores que
96
ANTECEDENTES
hablan de cambios estacionales en la reducción de sulfato en
estudios llevados a cabo en sedimentos (Jorgensen, 1977). El
rango de temperatura óptimo para las bacterias sulfatoreductoras se encuentra en torno a los 30 ºC.
•
Composición del medio: El medio a tratar puede contener
compuestos como carbonatos o fosfatos que pueden influir en
el pH del medio o favorecer el crecimiento de bacterias que
coexistan con este grupo de bacterias.
•
Ion sulfuro: producto de la reducción de sulfato, es tóxico para
las bacterias sulfato-reductoras y otras bacterias anaerobias.
La distribución del sulfuro en ambientes acuosos en sus diversas
formas (S2-, HS-, H2S) es dependiente del pH. La forma disociada
o libre de hidrógeno (S2-) es la responsable de la toxicidad e
inhibición de la bacteria. Las bacterias metanogénicas son
afectadas a una concentración de sulfuro de 150 mg/l
aproximadamente (Kalyuzhnyi y col., 1998), mientras que las
sulfato-reductoras tienen relativamente una alta tolerancia al
sulfuro, en torno a 1000 mg/l de sulfuro (libre de hidrógeno)
inhiben a éstas bacterias pero solo un 50% (Isa y col., 1986). No
obstante, el sulfuro producido a partir de la reducción de
sulfato puede aislar a las SRB de los efectos tóxicos de metales
pesados mediante la precipitación de éstos, un efecto
llamado “protección sulfuro” (Utgikar y col., 2002).
•
Metales pesados: Los metales pesados presentes en forma
soluble pueden afectar de forma negativa a la bacteria, con
lo cual es importante conocer los máximos niveles permitidos
por la bacteria antes de aplicarlas para la remediación de un
medio contaminado. Por otra parte, a medida que transcurre
97
ANTECEDENTES
el proceso la cantidad de metal disminuye en el medio por la
propia actividad bacteriana, retirándose a la vez, sulfuro.
3.5 TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS
Muchos metales son tóxicos a los microorganismos, incluidas las
bacterias
sulfato-reductoras,
ya
que
pueden
desactivar
enzimas
reaccionando con sus grupos funcionales, desnaturalizar proteínas y
competir con cationes esenciales (Mazidji y col., 1992). Las concentraciones
de metales pesados tóxicas para las bacterias sulfato-reductoras están en
un rango que va desde unas ppm hasta más de 100 ppm según la cepa y el
ion metálico. La Tabla 17 recoge las concentraciones tóxicas de diversos
metales por distintos autores. Por otra parte, en la literatura también se
recoge el efecto estimulatorio que producen los metales pesados en
cantidades traza sobre la producción de sulfuro de hidrógeno.
En los últimos años Utgikar y col. (2002 y 2003) han llevado a cabo
varios estudios acerca de la inhibición y toxicidad que producen los metales
pesados sobre las bacterias sulfato-reductoras. Su estudio se dirigió a
conocer la toxicidad de los metales pesados para la posible aplicación de
estas bacterias para la reducción de la contaminación de las aguas ácidas
de mina, disminuyendo la elevada concentración de sulfato y metales
pesados así como la acidez características de este tipo de ambientes,
mediante la precipitación de las especies metálicas en forma de sulfuros.
El objetivo de la investigación fue determinar el efecto tóxico y/o
inhibitorio de los metales disueltos sobre un cultivo mixto de bacterias
sulfato-reductoras. La exposición a un agente externo puede resultar en la
muerte celular (efecto tóxico) o en la disminución de la actividad
metabólica (efecto inhibitorio).
98
ANTECEDENTES
Metal
Cu
Zn
Cepa SRB
Cd
Ni
Referencia
tóxica (mg/l)
Cepas Desulfovibrio
20-50
Booth y Mercer (1963)
Cepas Desulfovibrio
3
Temple y Le Roux (1964)
Cepas Desulfovibrio
2-20
Saleh y col. (1964)
Cultivo mixto
4-20
Hao y col.(1994)
Cultivo mixto
12
Utgikar y col. (2003)
Cultivo mixto
25-40
Hao y col.(1994)
Cultivo mixto
20
Utgikar y col. (2003)
13
Poulson y col.(1997)
Cultivo mixto
75-80
Hao y col.(1994)
Cepa L60
125
Loka Bharath y col.(1990)
Cultivo mixto
>4-20
Hao y col.(1994)
Cepa L60
54
Loka Bharath y col.(1990)
Cultivo mixto
10-20
Hao y col.(1994)
10
Poulson y col.(1997)
Desulfovibrio
desulfuricans
Pb
Concentración
Desulfovibrio
desulfuricans
Cr
Cultivo mixto
60
Hao y col.(1994)
Hg
Cepa L60
74
Loka Bharath y col.(1990)
Cultivo mixto
20
Hao y col.(1994)
Mezcla (Cr, Ni,Cu,
Cd, Zn, Pb)
Tabla 17: Toxicidad de varios metales pesados sobre bacterias sulfato-reductoras
El estudio se realizó en botes sellados suplementados con cobre (618,5 mg Cu(II)/l) y zinc (6,5-20 mg Zn(II)/l) y en un reactor en discontinuo (1l)
suplementado con 25 mg Cu(II)/l. El estudio en menor escala mostró un
descenso de todas las concentraciones probadas para los dos metales pero
solo llega hasta cero para los niveles menores de metal, encontraron que
los cultivos suplementados con cantidades mayores no precipitaron
totalmente. Para la mayor concentración estudiada de cobre se insolubilizó
aproximadamente un 16% y para la mayor de zinc un 37%.
99
ANTECEDENTES
Es destacable que la precipitación ocurre mayoritariamente en las
primeras 50 horas y luego se produce una disminución de la velocidad de
producción de sulfuro metálico. Los autores sugieren que esta ralentización
se debe a la no disponibilidad de ion bisulfuro, ya que los metales están
presentes en solución y, por tanto, se deduce que la velocidad de la
reacción de reducción de sulfato también disminuye. La inhibición no
puede deberse a los metales disueltos ya que la concentración es menor a
la inicial, por ello la hipótesis es que el sulfuro metálico formado inhibe a la
bacteria a través de un obstáculo físico. El metal precipitado actúa como
barrera y dificulta el acceso del par donador-aceptor de electrones al lugar
activo de la bacteria o la enzima. Esta adhesión fue comprobada por
microscopía electrónica. Una ilustración de este proceso de inhibición se
representa en la figura 10. Debido a este efecto los bioreactores para el
tratamiento de efluentes, tipo agua ácida de mina, debe contar en su
diseño con un dispositivo que permita la sedimentación y separación del
sulfuro metálico precipitado.
En un trabajo posterior se desarrolló matemáticamente una expresión
de velocidad que incorpora los efectos adversos que influyen en la
biocinética de la reducción de sulfato. La reducción de sulfato por las
bacterias sulfato-reductoras puede ser representada por una expresión tipo
Monod:
−
dS
kSX
=
dt K s + S
100
ANTECEDENTES
sustrato orgánico
sulfuro de metal
ion metálico precipitado
sustrato orgánico
ion sulfato
ion bisulfuro
ion sulfato
bacteria
(a) Célula activa
ion bisulfuro
bacteria
capa de sulfuro de
metal precipitado
(b) Precipitación en torno a la célula
bacteria
(c) Inhibición celular
Figura 10: Mecanismo de inhibición de sulfuros metálicos. (Utgikar y col., 2002)
La reducción del número viable de células (efecto tóxico) se traduce
en una disminución de X, y una disminución en la velocidad metabólica se
traduce en una disminución de la constante de velocidad k, estos términos,
dependientes de la cantidad de metal presente en el medio, se expresan:
Efecto tóxico: X(M)=Xo exp(-KTM)
Efecto inhibitorio: k(M)=ko exp(-KIM)
Incorporando ambos términos a la expresión se obtiene una
disminución de la velocidad cuando la concentración de metal aumenta.
Esta expresión fue aplicada al estudio de la toxicidad del cobre y el
zinc sobre un cultivo mixto de bacterias sulfato-reductoras. Los resultados
mostraron una mayor toxicidad del cobre que del zinc (KT=10,6 y 2,9 mM-1
respectivamente). Las constantes de inhibición fueron aproximadamente 18
101
ANTECEDENTES
y 25 mM-1 para cobre y zinc, lo que indica que el zinc resulta algo más
inhibitorio.
3.6 APLICACIÓN DE LA BIOPRECIPITACIÓN DE
METALES POR BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS
La posibilidad de eliminación de metales disueltos en medios ácidos
con alto contenido en sulfato mediante el empleo de bacterias sulfatoreductoras ha dado lugar al desarrollo de numerosos trabajos dirigidos a
evaluar los distintos factores que influyen en el proceso, así como estimular
la actividad de estas bacterias. La mayoría de los trabajos han sido
desarrollados a escala de laboratorio y planta piloto, algunos enfocados al
desarrollo de este proceso in situ, aunque también existen tratamiento ex
situ y algunas aplicaciones industriales (White y col., 1997).
En Hammack y Edenborg (1992) se presenta un estudio llevado a
cabo en un reactor de lecho empaquetado de 900 ml con compost como
soporte de un cultivo de bacterias sulfato-reductoras. Se eliminó el 75% del
níquel presente cuando no se contó con una fuente de carbono adicional y
un 95% cuando se añadió lactato al medio.
Con este mismo soporte, Dvorak y col. (1992) llevaron a cabo un
estudio a escala piloto de dos tipos de sistemas para el tratamiento de
aguas contaminadas por metales. El sistema Pittsburg (tres reactores de 200 l
en serie), en el que se eliminó la totalidad del hierro y el aluminio, y el
sistema Palmerton (reactor de 4500 l), que eliminó la mayoría del Zn, Mn, Ni y
Cd del medio.
La aplicación más extensa de un proceso empleando las bacterias
sulfato-reductoras es el tratamiento de aguas subterráneas procedentes de
una planta de fundición de zinc en Holanda. La planta piloto comprende un
reactor de acero inoxidable de 9 m3 con un lecho de lodo. Esta planta
102
ANTECEDENTES
eliminó los metales tóxicos (principalmente zinc) y el sulfato procedentes de
las aguas contaminadas. El reactor empleó un consorcio indefinido, pero
seleccionado, de bacterias sulfato-reductoras con etanol como sustrato
orgánico. El proceso fue expandido en 1992 a escala comercial (reactor de
cemento de 1800 m3) con capacidad para tratar 7000 m3/día de agua
contaminada (Barnes y col., 1991).
En su trabajo, Christensen y col. (1996) estudian la posibilidad de un
tratamiento in-situ de las aguas ácidas de minas empleando como base
para el proceso material de mina. El objetivo del estudio se centra en
estimular la actividad de las bacterias sulfato-reductoras presentes
añadiendo una solución sustrato (lactato, proteínas, cenizas, ácidos grasos)
y la incorporación adicional de estiércol o un inóculo crecido de bacterias
sulfato-reductoras. La experiencia suplementada con sustrato e inóculo
adicional resultó la más positiva, ya que acorta la fase de latencia y mejora
la actividad bacteriana dando lugar a la eliminación de metales en menor
tiempo.
Elliot y col. (1998) trataron la remediación de drenajes ácidos de mina
con bacterias sulfato-reductoras. Para ello operaron con una columna de
flujo ascendente y su objetivo fue estudiar la influencia de la disminución del
pH del medio para así alcanzar valores similares a los que se encuentran en
este tipo de medio. Las bacterias toleraron un pH de aproximadamente 3.
El trabajo de Kim y col. (1999) se dirigió también a la aplicación in-situ
de las bacterias sulfato-reductoras. El estudio evalúa la habilidad de las
bacterias sulfato-reductoras para prevenir la generación de aguas ácidas
de mina procedentes de las pilas de residuos piríticos. En la experiencia,
llevada a cabo en columnas con residuos de mina, se evaluó el efecto del
pH del medio. En 30 días se redujo el 80-100% del carbono orgánico total y la
concentración de metales (Cu, Cd, Ni, Zn). En concreto, para un lixiviado de
103
ANTECEDENTES
pH 2-3 se consiguió la alcalinización hasta pH 7 en 4 días y se obtuvo un 99%
de eliminación para cadmio, cobre y zinc y un 87% para el níquel. La
formación de los sulfuros sucedió en el orden esperado CuS, CdS, NiS y ZnS
de menor a mayor producto de solubilidad.
Por su parte, Foucher y col. (2001) propusieron el tratamiento de
drenajes ácidos de minas mediante un proceso en dos etapas. El estudio
lleva a cabo el tratamiento a escala piloto de un agua ácida artificial y,
posteriormente, un efluente real de una zona minera. En la primera etapa se
empleó un biorreactor de lecho fijo donde se produjo el crecimiento de las
bacterias sulfato-reductoras en condiciones anaerobias. El sulfuro de
hidrógeno generado se dirige a una columna y de allí la mezcla gaseosa se
introduce en un reactor de mezcla completa donde se encuentra el medio
contaminado y en el cual se produce la etapa de precipitación de metales
en forma de sulfuros. En el efluente real la precipitación de metales se
produjo de forma selectiva: Cu y Zn a pH 2,8 y 3,5, respectivamente, y otros
metales (Ni, Fe) a pH 6.
Un estudio similar para el tratamiento de aguas ácidas de mina con
cadmio y cobre fue llevado a cabo por Luptakova y Kusnierova (2002). El
método incluye tres etapas: la producción biológica de H2S en discontinuo
en un reactor anaerobio inoculado con Desulfovibrio desulfuricans, la
precipitación de metales con el H2S generado de forma selectiva (Cu pH 2,8
y Cd pH 3,5) y la separación de los sulfuros metálicos formados mediante
filtración por membrana.
La aplicación de las bacterias sulfato-reductoras también se realiza
en procesos combinados cuando el medio contaminado posee otros tipos
de compuestos o tóxicos además de sulfato y metales pesados. Groudeva y
col. (2001) presentan el tratamiento de aguas contaminadas con petróleo y
metales pesados. El estudio se realiza en pantanos donde se almacenan
104
ANTECEDENTES
este tipo de residuos. Los pantanos contienen una flora autóctona que
incluye distintos hongos y bacterias capaces de degradar los compuestos
de petróleo y a su vez bacterias sulfato-reductoras. Éstas se encuentran en
la base de los pantanos donde se dan condiciones anóxicas y llevan a
cabo la reducción del contenido en sulfato de las aguas y la eliminación de
metales pesados (Cd, Cu, Pb, Mn y Fe).
El uso de este tipo de técnicas in situ, como el tratamiento en
pantanos, va tomando mayor importancia frente a las técnicas ex situ en
biorreactores. En Gibert y col. (2002) se describe la aplicación de las
bacterias sulfato-reductoras en barreras permeables reactivas. Las barreras
permeables se instalan en acuíferos con un material reactivo adecuado
que induce la realización de procesos biológicos y físico-químicos para la
biorremediación de las aguas subterráneas que fluyen a través de él. En el
trabajo se desarrollan los distintos aspectos necesarios para el diseño de
esta técnica.
Tuppurainen y col. (2002) investigaron la eliminación de zinc y sulfato
de un agua residual sintética de forma paralela en cuatro reactores de flujo
ascendente a escala de laboratorio. Estudiaron la influencia del soporte, la
adaptación o no previa al residuo y el contenido en zinc (50 o 200 mg/l).
Durante el proceso el 30-40% del sulfato y sobre el 98% del zinc fue eliminado
y más de 150-200 mg de H2S fueron producidos en cada reactor. Las
columnas que operaban durante 48 días en presencia del residuo antes de
introducir el metal eliminaron una mayor cantidad en los primeros días pero
al final de la experiencia (150 días) la eliminación fue similar para adaptadas
y no adaptadas.
Jong y Perry (2003) estudiaron la recuperación de unas aguas
contaminadas por sulfato, arsénico y varios metales pesados (Cu, Zn, Ni, Fe,
Al, As, Mg) en un reactor anaerobio de lecho empaquetado de flujo
105
ANTECEDENTES
ascendente. El cultivo empleado fue un aislado mixto de bacterias sulfatoreductoras procedente de una zona minera. Realizaron una primera etapa
de adaptación de 14 días, etapa discontinua, en la que el cultivo se puso
en contacto con el medio contaminado y se estudió el nivel de
precipitación de los metales para distintas concentraciones (5, 10, 20 y 50
mg/l de cada metal). Esta investigación demostró la reducción de sulfato y
eliminación consecutiva de Cu, Zn, Ni, Fe y As. La eficacia de eliminación
fue de un 97,5% para Cu, Zn y Ni, >82% para Fe y >77,5% para As, sin
embargo no fue nada efectivo para Mg y Al.
Hulshof y col. (2003) realizaron un estudio con el objeto de evaluar la
efectividad de la adición directa de virutas de madera o residuos de pulpa
de papel a residuos de mina y la inhibición potencial de los constituyentes
de los residuos sobre el crecimiento bacteriano. En la columna con residuos
de pulpa de papel se obtuvo una mayor reducción de sulfato y se requirió
menor tiempo de residencia, posiblemente sea debido al mayor contenido
en nutrientes (N, P, C) de este material. En ambas columnas se obtuvo la
remoción total del zinc (80 mg/l), el presente en mayor cantidad, y de otros
metales.
3.7 INTEGRACIÓN DE PROCESOS DE BACTERIAS
AZUFRE-OXIDANTES Y BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS
Existen trabajos que tratan de integrar la biolixiviación de los metales
existentes en un medio y la bioprecipitación de estos mismos metales
presentes en el lixiviado obtenido.
Con esta integración se logra extraer los metales presentes en un
medio aumentando su movilidad por la acción de las bacterias acidófilas y,
posteriormente, inmovilizar las especies metálicas para su deposición de
106
ANTECEDENTES
forma controlada o para su reutilización, de esta acción se encargan las
bacterias sulfato-reductoras.
Con este fin, White y col. (1998) presentaron un proceso biológico
integrado de este tipo, compuesto por una etapa de lixiviación realizada
por bacterias azufre-oxidantes seguida de la reducción de sulfato y la
precipitación de metales presentes en el lixiviado. En el estudio a escala de
laboratorio, emplearon un suelo contaminado artificialmente con metal. A
medida que decrecía el pH los metales fueron lixiviados en el orden: Mn, Cr,
Ni, Co, Cd, Zn, Cu, Pb, aunque se dieron periodos donde hubo lixiviación
simultánea de varios. En la etapa de bioprecipitación se empleo un reactor
de sedimentación interna con recirculación, capaz de retener una elevada
concentración de biomasa, con un cultivo indefinido de bacterias sulfatoreductoras resistentes a los metales por su exposición previa a éstos en los
ambientes en que habitan. Los metales precipitaron principalmente como
sulfuros aunque también se formaron carbonatos e hidróxidos. La
eliminación de los metales alcanzó una eficacia global de más del 98%.
Groudev y col. (2001) realizaron el tratamiento de tierras agrícolas
contaminadas por elementos radiactivos (uranio, radio, torio) y metales
pesados (cobre, zinc, cadmio) mediante dos métodos biotecnológicos
diferentes, el estudio fue llevado a cabo en dos porciones de suelo de unos
200 m2. En ambos métodos se realizó una solubilización inicial de los
contaminantes mediante la acción de la microflora indígena del suelo,
principalmente bacterias autótrofas mesófilas acidófilas y algunas basófilas y
ciertos organismos heterótrofos. En condiciones naturales la oxidación de los
sulfuros minerales se produce a velocidades relativamente bajas, debido a
algunos factores como son el elevado pH, la limitación de oxígeno en el
suelo, la insuficiente humedad durante relativamente largos periodos de
tiempo y la ausencia de nutrientes como nitrógeno y fósforo. Para tratar de
107
ANTECEDENTES
mejorar las condiciones de aireación y humedad se realizó el arado y la
irrigación del suelo y el aporte de nutrientes necesarios. Tras la solubilización,
una de las porciones de tierra se trató mediante un sistema de “enjuague” y
el efluente procedente del suelo cargado de metales disueltos fue tratado
por un sistema pasivo, como los pantanos, y las soluciones agotadas se
reciclaron al suelo. En la otra porción, no se lavó el suelo y una gran
cantidad de metales quedó retenida en las capas más profundas de suelo,
donde los contaminantes son inmovilizados como resultado de la actividad
de las bacterias sulfato-reductoras que habitan esta zona del suelo. La
actividad de estas bacterias fue estimulada por la inyección al suelo de una
solución de compuestos orgánicos.
Viera y col. (2003) presentaron un proceso combinado dirigido a la
reducción de Cr(VI) y precipitación del Cr(III) obtenido. Para ello,
aprovechan la capacidad Acidithiobacillus thiooxidans para reducir de
forma indirecta el Cr(VI). Esta primera etapa fue llevada a cabo en un
reactor de tanque agitado y en ella se obtuvo la reducción casi total del
Cr(VI) a Cr(III). La solución de Cr(III) generada pasó al reactor de
bioprecipitación (reactor de tanque agitado), donde las bacterias sulfatoreductoras han sido previamente crecidas en condiciones anaerobias
durante seis días, a partir de los cuales la solución metálica suplementada
con lactato (4,5 g/l) ingresa en el reactor (75 ml/día). En esta etapa, del
Cr(III) introducido durante 8 días (6 mg) sólo 0,3 mg Cr(III) no precipitaron.
El elevado contenido en metales de lodos, sedimentos y aguas
procedentes de la actividad minera e industrial hace pensar en la
necesidad de técnicas que traten de solventar este problema. El uso de
este tipo de procesos combinados permite, no solo extraer de forma natural
el metal, sino volver a obtenerlo en forma de sulfuro pero fuera del medio
contaminado. La diversidad de medios posibles hace necesario el estudio
108
ANTECEDENTES
en profundidad de cada caso pero, no obstante, una vez sentadas las
bases en las cuales se generan las condiciones adecuadas para la
obtención del metal, estos procesos muestran una alta aplicabilidad y
versatilidad.
4 INMOVILIZACIÓN DE CELULAS
4.1 EMPLEO DE LA INMOVILIZACIÓN
Algunos microorganismos y otros materiales celulares tienen una
tendencia natural a adherirse a superficies y, de esta forma, ser
inmovilizados.
Muchos
biocatalizadores
que
biorreactores
intervienen
avanzados
en
el
requieren
proceso
que
los
(microorganismos,
enzimas,…) estén inmovilizados en un soporte sólido con el fin de reducir el
lavado celular e incrementar la concentración de biocatalizador en el
proceso.
Desde
que
se
propuso
la
primera
aplicación
de
los
microorganismos inmovilizados, se han desarrollado un gran número de
procesos de este tipo en diferentes campos: biomédica (producción de
fármacos y reactivos), biosensores (medida de concentración de solutos
mediante reacciones catalizadas por enzimas), química (producción de
etanol,
combustibles
gaseosos,…),
macromoléculas,
producción
de
alimentos y bebidas, tratamientos de aguas residuales (Scott, 1987).
4.2 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN
La inmovilización de microorganismos se puede definir como una
técnica que limita la libertad de movimiento de las células. Esta movilidad
puede ser restringida por una agregación celular, por adhesión a un soporte
o por atrapamiento. Las técnicas de inmovilización se suelen clasificar en
dos tipos:
109
ANTECEDENTES
Adhesión: los microorganismos se adhieren a la superficie de otros
microorganismos o de un soporte por autoadhesión o por un enlace
químico.
Atrapamiento:
los
microorganismos
quedan
retenidos
en
los
intersticios de un material poroso o son físicamente envueltos por una matriz
porosa como un gel o una membrana.
4.2.1 Adhesión
Los métodos de adhesión aprovechan la capacidad de los
microorganismos
de
adherirse
a
otros
microorganismos,
formando
agregados, o a superficies sólidas. Esta habilidad puede ser natural o
inducida, y constituye la base de una técnica de inmovilización celular de
bajo coste pero efectiva.
La formación de agregados o flóculos ocurre principalmente cuando
se tiene un cultivo con alta concentración celular en suspensión. Este hecho
ocurre tanto con levaduras (Saccharomyces cerevisiae) como bacterias
(Zymomonas mobilis). La agregación microbiana puede ser inducida o
mejorada variando las condiciones ambientales, como puede ser la adición
de polielectrólitos o la aireación.
En la adhesión a superficies sólidas, dependiendo de la naturaleza
del soporte, el enlace entre microorganismo y superficie puede ser el
resultado de interacciones iónicas, físicas, hidrofóbicas o de Van der Waals.
El mecanismo de adhesión, aunque no está totalmente elucidado para
todos los microorganismos, en general se debe a la secreción por parte de
la célula de ciertas macromoléculas, como mucopolisacáridos, que actúan
como adhesivos para iniciar la interacción microorganismo-superficie.
110
ANTECEDENTES
La principal ventaja de estas técnicas es su simplicidad y su mayor
inconveniente la posible desorción de los microorganismos después de su
utilización.
4.2.2 ATRAPAMIENTO
Los métodos de atrapamiento consisten en el confinamiento de
microorganismos dentro de la red de un polímero, o bien en membranas
semipermeables que presentan poros de un tamaño tal que evitan la salida
del microorganismo pero permiten la difusión del sustrato y productos. Estas
técnicas no dependen de una forma significativa de la naturaleza de las
células.
Normalmente
la
encapsulación
o
atrapamiento
implica
la
ubicación de las células en los huecos intersticiales de la red de un polímero,
éstas se obtienen a partir de sus precursores (monómeros, olígomeros o
poliméricos), mediante cambios en las variables de solubilidad (disolvente,
temperatura, fuerza iónica y pH).
Desde el punto de vista físico, la interacción de microorganismos con
superficies se da en tres etapas sucesivas:
•
Adhesión reversible debida a energías débiles.
•
Adhesión
firme,
denominada
adhesión
irreversible,
que
contempla la formación de uniones por puentes de hidrógeno
y enlaces iónicos.
•
Secreción de material extracelular, adhesión más lenta.
Desde el punto de vista de los microorganismos y una vez producida
la interacción, el desarrollo y formación de la película bacteriana se da en
tres pasos.
•
Adsorción o inmovilización de los microorganismos sobre la
superficie soporte.
111
ANTECEDENTES
•
Adherencia
o
consolidación
de
la
interfase
entre
microorganismos y soporte.
•
Colonización por crecimiento y división de los microorganismos
sobre la superficie.
4.3 INMOVILIZACION
OXIDANTES
La
tendencia
natural
DE
de
BACTERIAS
las
bacterias
azufre
AZUFREoxidantes,
Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans para crecer
sobre superficies los convierte en organismos ideales para la inmovilización
celular. Un gran número de investigadores han tratado de desarrollar esta
capacidad para la mejora de los procesos en los que se ven involucrados
este tipo de microorganismos (Armentia y Webb, 1992).
Con el propósito de mejorar la capacidad
de Acidithiobacillus
ferrooxidans para oxidar ferroso se han desarrollado gran número de
trabajos dirigidos a la inmovilización de este microorganismo sobre
diferentes soportes y condiciones de operación. De este modo, se han
usado muchos tipos de reactores, operando tanto en régimen discontinuo
como en continuo, con el fin de obtener los mejores resultados.
Para la inmovilización de At. ferrooxidans se han empleado varias
matrices, existiendo trabajos de adhesión sobre esferas de vidrio (Grishin y
Tuovinen, 1988), resinas de intercambio iónico (Karamanev y Nikolov, 1988) o
carbón activo (Grishin y Tuovinen, 1988, Carranza y García, 1990, Halfmeier y
col., 1993) y de atrapamiento en alginato, carragenato y perlita (Wakao y
col., 1994, Lancy y Tuovinen, 1984). Otros soportes, como la espuma de
poliuretano (Armentia y Webb, 1992) o la fibra de aleación de níquel
(Gómez y col., 2000) combinan las ventajas de la adhesión y el
atrapamiento. Este tipo de trabajos se dirigen a la mejora de las condiciones
112
ANTECEDENTES
experimentales para la obtención de una mayor oxidación del ferroso, sin
embargo, existen pocos estudios acerca de la inmovilización de At.
ferrooxidans con azufre como sustrato, en ausencia de ferroso.
El estudio de Acidithiobacillus thiooxidans no está tan avanzado
como el de At. ferrooxidans, de modo que el número de trabajos
desarrollados en cuanto a la inmovilización de esta bacteria es mucho
menor. No obstante, la estructura celular y la capacidad para adherirse a
las superficies hacen pensar en la posibilidad de inmovilización de esta
bacteria en los mismos soportes que se han estudiado para la otra bacteria.
De este modo, se conocen algunos trabajos sobre At. thiooxidans
inmovilizado sobre azufre para distintos tamaños de partícula (Pogliani,
1999).
4.4 INMOVILIZACION
POLIURETANO
SOBRE
ESPUMA
DE
La espuma de poliuretano ha tomado últimamente una gran
relevancia como soporte para las técnicas de inmovilización, debido al
elevado número de aplicaciones de éste que se recoge en la literatura:
eliminación de compuestos orgánicos (Manohar y col., 2001, Moe e Irvine,
2001a y b, Hori y col., 2001, Yang y col., 2003), control de olores de residuos
(Burguess y col., 2001), fermentación de ácido acético (de Ory y col., 2004),
eliminación de hidrocarburos (Holubar y col., 1994), oxidación de sulfato
ferroso (Armentia y Webb, 1992), etc. En dichos trabajos, se inmovilizaron (o
coinmovilizaron) varios microorganismos dentro de los soportes empleando
diferentes tipos de reactores: tanque agitado, columnas empaquetadas o
biofiltros (de Ory y col., 2005).
La espuma de poliuretano es un material inerte con unas buenas
propiedades mecánicas (alta resistencia y elasticidad) y un bajo coste
113
ANTECEDENTES
comercial. Presenta una alta porosidad (cercana al 97%) y, por tanto, una
alta
superficie
de
adsorción.
Además,
este
material
no
sufre
los
inconvenientes de escalamiento que se experimentan con otras matrices
de encapsulación ya que pueden ser preparados fácilmente grandes
volúmenes de este soporte. Otra ventaja importante de este soporte es que
los problemas de difusión de oxígeno se pueden reducir debido al elevado
tamaño de poro, hecho que es muy importante para el metabolismo de los
microorganismos aerobios. En la Figura 11 se muestran algunas unidades
cúbicas de espuma de poliuretano comercial y una fotografía de
microscopía electrónica de su estructura interna.
Un aspecto a tener en cuenta para la correcta comprensión del
fenómeno involucrado en el proceso de inmovilización sobre espuma de
poliuretano es el equilibrio de adsorción-desorción en la biopelícula.
Figura 11: fotografía de algunas unidades de espuma de poliuretano y estructura interna
(x50) de la espuma de poliuretano.
Cuando la biopelícula de microorganismos inmovilizados está en
formación (adsorción) ocurre simultáneamente una pérdida continua de
células (desorción), especialmente si el reactor es agitado enérgicamente.
De modo que, debe ser establecida una velocidad de agitación adecuada
para encontrar un balance satisfactorio entre los dos efectos. Por un lado,
una agitación vigorosa mejora las condiciones generales de transferencia
114
ANTECEDENTES
de masa a la biomasa sumergida y, como consecuencia, aumenta la
población microbiana total así como el número de células adsorbidas
dentro del soporte. Por otro lado, los efectos de erosión y las colisiones
pueden aumentar por una agitación turbulenta frenando seriamente los
procesos de adsorción de la superficie celular. Al mismo tiempo, la
concentración de biomasa intersticial (células sumergidas en el líquido
retenido dentro de la estructura interna del soporte) constituye una fuente
potencial importante de biomasa para ser inmovilizada por el continuo
equilibrio de adsorción-desorción y tiene, además, una gran importancia en
las sucesivas fermentaciones posteriores.
115
C.-MATERIAL Y MÉTODOS
MATERIAL Y MÉTODOS
1 MATERIAL Y MÉTODOS
1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS
1.1.1 BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES
1.1.1.1 Características
Las bacterias azufre oxidantes empleadas en este estudio son cepas
de la colección alemana de microorganismos DSMZ, en concreto,
Acidithiobacillus ferrooxidans DSM 11477 y Acidithiobacillus thiooxidans DSM
11478.
1.1.1.2 Mantenimiento de las cepas
El medio de sales empleado para el mantenimiento de ambas
bacterias es de idénticas características y contiene nutrientes esenciales
tales como magnesio, fósforo, potasio y nitrógeno. La composición del
medio se describe en la Tabla 18 y es similar al propuesto para el
crecimiento de Acidithiobacillus ferrooxidans en presencia de ión ferroso por
Silverman y Lundgren (1959). Este medio sin la adición de Fe(II) se denomina
medio 0K. El medio ha de ser suplementado con la fuente de energía propia
de cada bacteria, así
•
Acidithiobacillus ferrooxidans: es una bacteria hierro y azufre
oxidante, es decir, toma energía de la oxidación de hierro (II) o
de compuestos de azufre reducido. Por tanto, el medio puede
ser suplementado con Fe (II), en forma de sulfato ferroso, o con
azufre elemental.
•
Acidithiobacillus thiooxidans: al ser exclusivamente azufre
oxidante el mantenimiento consiste en el aporte de las sales
nutrientes y el azufre elemental necesarios.
119
MATERIAL Y MÉTODOS
Compuesto
g/l
(NH4)2SO4
3,0
MgSO4
0,5
K2HPO4
0,5
KCl
0,1
Ca(NO3)2
0,01
Tabla 18: Composición del medio de nutrientes para las bacterias azufre-oxidantes.
Mantenimiento con ión ferroso
Para el crecimiento de las bacterias azufre-oxidantes con ión ferroso
se utiliza el medio denominado como 9K, ya que contiene 9 g/l de Fe (II).
Para la preparación de un litro de este medio se disuelven las sales del
medio 0K en 1000 ml de agua destilada, se ajusta el pH a 1,8 con H2SO4 5M y
se esteriliza en autoclave (121ºC, 20 min). Posteriormente, se disuelve el ión
ferroso (44,8 g FeSO4·7H2O) en 300 ml del medio preparado, se ajusta a pH
1,8 y se esteriliza mediante un sistema de filtración a vacío. Por último, se
incorpora la disolución estéril de ferroso al medio 0K reservado y se conserva
a 4ºC.
El mantenimiento de la cepa en volumen final de 100 ml consiste en
la adición de 90 ml de medio 9K en un matraz estéril de 250 ml. Este volumen
se inocula con 10 ml de cultivo en fase exponencial de crecimiento y se
incuba en un agitador a 30ºC y 150 rpm.
Mantenimiento con azufre elemental
La preparación del medio de crecimiento requiere preparar el
volumen necesario de medio 0K, ajustado a pH 1,8 para At. ferrooxidans ó
pH 2,5 para At. thiooxidans. A continuación, se procede a la esterilización en
120
MATERIAL Y MÉTODOS
autoclave (121ºC, 20 min). Por último se esteriliza el azufre elemental en
microondas (3 pulsos de 30 s).
Para el mantenimiento de la cepa en un volumen final de 100 ml se
depositan 90 ml de medio 0K en un matraz estéril de 250 ml y se le añade 1
g de azufre elemental. Posteriormente, se inocula con 10 ml de cultivo en
fase exponencial de crecimiento y se incuba en un agitador a 30ºC y 150
rpm.
Debido a que los experimentos se han realizado tomando como
fuente de energía el azufre, el mantenimiento se realizó siempre en
presencia de éste. Los cultivos de At. ferrooxidans crecidos en hierro que se
emplean en una experiencia con azufre como única fuente de energía,
necesitaron de subcultivos continuados en azufre para eliminar por
completo la presencia de hierro.
Seguimiento de las cepas
El azufre elemental, por su carácter hidrofobo, se mantiene en la
superficie del cultivo cuando lo incorporamos al medio. A medida que se va
consumiendo por la acción de las bacterias pasa a formar una suspensión
coloidal (Figura 12).
Los cultivos de bacterias azufre-oxidantes han de ser refrescados, es
decir, se ha de renovar su medio de crecimiento cuando se han alcanzado
valores constantes de pH y población celular. Dicha renovación no se ha de
realizar cuando hay agotamiento de sustrato, ya que esto suele ocurrir a un
pH muy bajo y provoca situaciones de estrés a las células dando lugar a
cultivos posteriores con una larga fase de latencia y de baja población
bacteriana.
121
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 12: Medio 0K suplementado con azufre y At. ferrooxidans y At. thiooxidans crecidos en
dicho medio (5 días)
Los cultivos se encuentran en la fase exponencial de crecimiento
cuando alcanzan un valor de pH igual a 1,0, aproximadamente, y la
población bacteriana se encuentra en torno a 1· 108 células/ml. En este
momento se encuentran en condiciones idóneas para ser utilizadas como
inóculo de las distintas experiencias que se deseen realizar.
Para cultivos crecidos con ión ferroso como fuente de energía, se
renueva el medio cuando la concentración de Fe(II) en el medio es de
aproximadamente 20 mg/l. La determinación de la concentración de este
ión se realiza por el método de la 1,10-fenantrolina propuesto por Vogel
(1989).
1.1.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS
1.1.2.1 Características
Las bacterias sulfato-reductoras empleadas fueron Desulfovibrio
vulgaris ATCC 29579 y Desulfovibrio sp. ATCC 49975, siendo esta última un
cultivo mixto de varias cepas de éste género.
122
MATERIAL Y MÉTODOS
1.1.2.2 Mantenimiento de las cepas
Los medios para la conservación y el crecimiento de estas bacterias
fueron propuestos por Postgate en 1979. Debido al carácter anaerobio de
estas bacterias, su mantenimiento es más complejo y se pueden distinguir
dos medios diferentes en función de la finalidad que se le vaya a dar al
cultivo: el medio Postgate B para el mantenimiento y el medio Postgate C
para el crecimiento y la realización de experimentos que requieran una
elevada reducción de sulfato.
Medio de mantenimiento
El medio Postgate B se caracteriza porque no facilita la producción
de biomasa en elevadas cantidades pero contiene compuestos reductores
que producen la anaerobiosis de este. La composición del medio Postgate
B se presenta en la Tabla 19
Compuesto
g/l
KH2PO4
0,50
NH4Cl
1
CaSO4
1
Mg SO4
2
Lactato de sodio
3,5
Extracto de levadura
1
FeSO4·7H2O
0,5
Ácido ascórbico
0,1
Ácido tioglicólico
0,1
Tabla 19: Composición del medio Postgate B
Para
su
preparación
se
realiza
el
siguiente
procedimiento
experimental, se incorporan los compuestos en el orden descrito en la Tabla
123
MATERIAL Y MÉTODOS
19 excepción de los ácidos, se preajusta el pH a 7 con NaOH o KOH 2N y se
añaden los compuestos reductores (ácido tioglicólico y ácido ascórbico). A
continuación, se vuelve a ajustar el pH a 7,0-7,5 y se preparan botes de
vidrio de 10 ml, con tapón de goma y virola metálica (tipo penicilina) para
asegurar el sellado hermético. Posteriormente, se fracciona el medio
depositando 9 ml en cada bote y cerrándolo inmediatamente. Durante este
tiempo es necesario mantener el medio en agitación para evitar que se
forme un precipitado coloidal y para favorecer la acción de los compuestos
reductores. Se debe proceder al sellado de los botes con la mayor urgencia
posible. Finalmente, se esterilizan a 121ºC durante 20 minutos y se mantiene
a 4ºC hasta su uso.
Para realizar los subcultivos, se utilizan frascos ya esterilizados con
medio Postgate B y se desinfectan con alcohol en la zona donde se va a
introducir el inóculo, así como aquellos que se utilizan como inóculo. Se
toma 1 ml de cultivo crecido en Postgate B y se inyecta en un frasco con
medio fresco teniendo especial cuidado de no introducir aire. Esta
operación se realiza por triplicado y se incuban de forma estática a 30ºC.
Seguimiento de las cepas
La presencia de sulfato ferroso en el medio provoca que las bacterias
reduzcan éste, dando lugar a sulfuro ferroso, que se caracteriza por ser un
precipitado negro (Figura 13). La presencia de este precipitado suele ocurrir
a las 24-48 horas y nos indica el óptimo crecimiento de estas bacterias. En
este momento se puede realizar un recuento de la biomasa para
comprobar el crecimiento y se mantienen los cultivos a 4ºC.
La actividad de la cepa se mantiene durante 20 días, tras los cuales
es necesario realizar un nuevo cultivo.
124
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 13: Medio Postgate B y Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp. crecidos en medio
Postgate B (48 horas).
Medio de crecimiento
El medio Postgate C se caracteriza por no contener compuestos
reductores y se emplea cuando se persigue un crecimiento bacteriano
elevado. Este medio permite una mayor reducción de sulfato y es una
modificación del propuesto por Postgate (1984) ya que omite la adición de
sulfato ferroso y ácido cítrico, con el objetivo de facilitar la precipitación de
los iones metálicos de interés. Su composición se detalla en la Tabla 20
Compuestos
g/l
KH2PO4
0,50
NH4Cl
1
Na2SO4
4,5
CaCl· 6 H2O
0,06
MgSO4· 7 H2O
0.06
Lactato de sodio
6
Extracto de levadura
1
Tabla 20: Composición del medio Postgate C modificado.
125
MATERIAL Y MÉTODOS
Para la preparación del medio Postgate C, se añaden los
compuestos en el orden descrito en la tabla 20, se ajusta el pH a 7,5 con
NaOH ó KOH 2N y se esteriliza en autoclave (121ºC y 20 minutos). Una vez
enfriado se conserva a 4ºC durante un tiempo limitado ya que es un medio
rico y pueden aparecer contaminaciones.
La inoculación de bacterias sulfato-reductoras en medio Postgate C
se realiza utilizando un bote estéril de 100 ml con un volumen de 90 ml de
medio. A continuación, se hace pasar una corriente de gas inerte
(normalmente nitrógeno), que pasa previamente por un filtro, durante 5-10
minutos.
Al mismo tiempo, se utiliza un cultivo crecido en Postgate B y se filtra
con papel Whatman nº4 para eliminar los precipitados de sulfuro ferroso y se
realiza una nueva filtración a vacío con membrana de 0,22 m. Las células
retenidas se resuspenden en 10 ml de medio Postgate C y se añade al
medio contenido en el bote, sin dejar de pasar la corriente gaseosa.
Después de 5 minutos, se retira el aporte gaseoso, se procede a cerrar y
sellar el bote, para cultivar en estufa a 30ºC.
Seguimiento del cultivo
El crecimiento del cultivo se puede comprobar de forma visual,
observando el espesamiento del medio y la concentración celular en forma
de mucosidad (Figura 14). El seguimiento cuantitativo del crecimiento se
realiza con el control de varios parámetros como son la concentración
celular, el pH y la concentración del sulfato residual en el medio. Se suele
observar crecimiento favorable hasta unos 14 días.
126
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 14: Medio Posgate C y Desulfovibrio sp. crecido en este medio (14 días)
1.2 MÉTODOS DE ANÁLISIS
1.2.1 pH Y POTENCIAL REDOX
La medida de estos parámetros se realizó mediante un electrodo de
plata (CRISON 52-02) empleando un pHmetro CRISON micropH 2002.
1.2.2 CONCENTRACIÓN CELULAR
1.2.2.1 Bacterias en suspensión
Para la determinación de la población bacteriana se utilizó el
método directo de recuento en microscopio óptico mediante una cámara
Neubauer (Gómez, 1997).
La cámara Neubauer es un dispositivo similar a un portamuestras, con
la diferencia de que cuenta con una cuadrícula en su zona central. La
cuadrícula aloja un volumen de 1
l de la muestra. Utilizando los objetivos
adecuados es posible contar las unidades celulares situadas sobre la zona
cuadriculada.
En este caso se empleó un microscopio óptico Olympus BH-2 que
dispone de oculares con 15 aumentos y objetivos de 4, 10, 20, 40 y 100
127
MATERIAL Y MÉTODOS
aumentos.
Previo
a
la
medida
se
requiere
realizar
la
dilución
correspondiente para tener una concentración a la que puedan distinguirse
y contarse las células. Las diluciones se realizaron con el medio de cultivo
característico de cada cepa para no someter a unas condiciones
desfavorables a las células que puedan provocar la muerte celular y, por
tanto, un recuento erróneo. El recuento se llevó a cabo considerando ocho
casillas, no siempre contiguas, tomadas de la diagonal de la cuadrícula. La
concentración celular se obtiene aplicando la siguiente expresión:
[Celular ] = nº de células contadas· factor de dilución· 4 ⋅10
6
nº de casillas consideradas
=
Mcel
ml
Los recuentos celulares se realizaron por duplicado para disminuir los
posibles errores en la determinación experimental.
1.2.2.2 Bacterias inmovilizadas
Los procesos de inmovilización de bacterias acumulan una elevada
concentración de éstas en los intersticios del soporte y adheridas en él. Para
realizar una estimación de la concentración de células que existe se ha de
realizar el recuento de la biomasa ocluida y la biomasa adherida.
Biomasa ocluida
Se toman varias unidades de soporte y se elimina el líquido intersticial
de cada una de ellas realizando presión con pinzas Millipore. En las
suspensiones obtenidas se realiza el recuento celular por cámara Neubauer
y se toma un valor medio.
Biomasa adherida
Cada una de las unidades de soporte se depositó en un recipiente
de 25 ml y se le añade un volumen exacto del medio de cultivo utilizado
para el crecimiento de la bacteria a un pH similar al que se encuentra en la
muestra (10 ml). Se introducen en un baño de ultrasonido (vetrasons-H
128
MATERIAL Y MÉTODOS
selecta) durante 15 minutos. Las bacterias adheridas se desprenden de la
superficie del soporte y pasan al medio líquido. Se realiza el recuento celular
de cada una de las muestras. Los soportes se secan en estufa (80 ºC, 24
horas) y se pesan en balanza analítica. La biomasa adherida se expresa
como Mcélulas/miligramos de soporte.
Mcelulas
10 ml
Mcelulas
⋅
=
ml
mg de soporte mg de soporte
1.2.3 CONCENTRACIÓN DE PROTONES
La medida de la concentración de protones en el medio se realizó
mediante una valoración con hidróxido sódico 0,02 N factorizada con
biftalato potásico.
1.2.4 CONCENTRACION DE SULFATO
La concentración de sulfato en el medio se realizó mediante el
método
turbidimétrico
clásico
(Clesceri
y
col.,
1989)
con
algunas
adaptaciones. Este método consiste en la reacción del ion sulfato con
cloruro de bario para dar sulfato de bario, que se caracteriza por formar
una suspensión blanca que enturbia el medio acuoso. La medida de esta
turbidez se relaciona con la concentración de sulfato.
El protocolo a seguir para la realización de esta medida requiere
preparar patrones entre 20 y 100 ppm de sulfato. Para ello se utiliza una
disolución de 1000 ppm de sulfato de sodio.
Las muestras se centrifugan durante 2 minutos o se filtran por
membrana de 0,22 micras para evitar la interferencia de otros componentes
en la medida.
Tanto los patrones como las muestras se llevan a un volumen final de
25 ml en matraces aforados, el contenido de éstos se deposita en tubos de
129
MATERIAL Y MÉTODOS
vidrio de 40-50 ml, para facilitar la agitación. A continuación se añade 1 ml
de una solución tampón (45 ml de H2O destilada, 4,5 ml de HCl
concentrado, 15 ml de etanol absoluto, 7,5 ml de glicerina y 11,25 g de
NaCl), se agita y se añade una punta de espátula de BaCl2. La mezcla se
agita un minuto en vortex (Heildolph REAX2000) y se deja reposar otro
minuto. La medida se realizó en un espectrofotómetro Hewlett-Packard 8453
a una longitud de onda de 450 nm.
1.2.5 CONCENTRACION DE IONES METÁLICOS
La
concentración
de
iones
metálicos
se
determina
por
espectroscopia de emisión atómica por plasma de acoplamiento inducido.
El espectrómetro empleado fue un Iris Intrepid de Thermo Elemental. Antes
de realizar la medida se requiere realizar un procedimiento para la
adecuación de la muestra. Para ello, se toma la muestra con jeringa de 10
ml y se filtra por un filtro de jeringa de nylon de 0,22 micras (ALBET-JNY-02025-100) para separar el metal no soluble y las bacterias que pueden influir en
el deterioro de la muestra antes de su medida.
A continuación se diluye la muestra filtrada en agua destilada o en el
medio en que se encuentra hasta un volumen total de 3 ml, de modo que la
medida quede dentro de la recta de calibrado preparada y supere el límite
mínimo de detección.
Posteriormente, se acidifica con ácido nítrico (60%) para conservar la
muestra a un pH menor a 2, en el caso de que sea necesario.
Esta mezcla se conserva a 4ºC hasta el momento de la medida.
El procedimiento de medida realiza la media de tres lecturas de
cada muestra.
130
MATERIAL Y MÉTODOS
1.2.6 CONCENTRACION DE CROMO HEXAVALENTE
La determinación del Cr(VI) se realiza por el método de la
difenilcarbazida (Clesceri y col, 1989).
Para ello, en matraces aforados de 5 ml se preparan patrones entre
0,5 y 1 ppm de Cr(VI) a partir de una disolución de 1000 ppm de dicromato
potásico. Se prepara un blanco con agua destilada de igual volumen.
Las muestras se llevan a un volumen de 5 ml en matraces aforados de
modo que su medida entre en el rango de determinación y a continuación
se vierten estas muestras en tubos de 10 ml y se acidifica con una gota de
ácido sulfúrico concentrado.
Se añaden 0,25 ml de difenilcarbazida (0,1 g en 20 ml de acetona) y
se agita en vortex para favorecer la reacción. Tras diez minutos en reposo, la
medida se realiza en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 540
nm.
1.2.7 PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA
La visualización de las bacterias empleadas así como de las
experiencias realizadas sobre distintos soportes (espuma, precipitados
metálicos) se realizó en un microscopio electrónico Quanta 200 previo
pretratamiento de las muestras.
La toma de la muestra se realiza de distinta forma en función de su
estado:
•
Muestras sólidas: se centrifugan y se deposita el pellet en un
tubo de 5 ml (si es muy grande se separa en varias porciones)
•
Muestras líquidas: las bacterias en suspensión, se concentran y
se depositan sobre un cubreobjetos tratado con polilisina
131
MATERIAL Y MÉTODOS
durante 10 min. La polilisina se deposita previamente y se retira
el exceso antes de poner la muestra con papel absorbente.
Los cubreobjetos (20 mm) se colocan en un recipiente
diseñado para ello donde quedan almacenados en vertical.
A continuación se procede a la fijación con glutaraldehido al 2,5 %
en tampón de cacodilato de sodio 3-hidrato (0,1M, pH 7,2) y se deja actuar
durante 1 hora.
Para retirar el glutaraldehido, se añade cacodilato (0,1M, pH 7,2) por
las paredes sin tocar la muestra. Se realizan 2 lavados de 10 minutos cada
uno.
Seguidamente, se realiza una nueva fijación con OsO4 al 1%
(disolución tampón cacodilato 0,2M-OsO4 al 2%) durante 1 hora. Este paso
no siempre es necesario, se realiza siempre y cuando no se haya
conseguido una fijación con los pasos anteriores.
Por último, se realiza el secado por punto crítico y el metalizado (100150 s). Las muestras se conservan en campana de secado hasta que se
observan al microscopio.
1.2.8 DIGESTIÓN DE COMPUESTOS INSOLUBLES DE METAL
Esta técnica se empleó para determinar la cantidad de metal que
permanece insoluble en una solución o matriz sólida, antes o después de
aplicar un proceso de solubilización.
Para un medio de, aproximadamente 100 ml, se añadieron 10 ml de
HNO3 y 10 ml de HCl , ambos concentrados. Se calentó y agitó durante 1
hora. Tras dejar enfriar se filtró y se llevó a un volumen conocido para
determinar su contenido en metales por espectroscopía de emisión
atómica.
132
MATERIAL Y MÉTODOS
2 PROTOCOLOS EXPERIMENTALES
El estudio de los procesos de solubilización y precipitación de los iones
Cr(III), Ni(II) y Zn(II), así como, la reducción del Cr(VI), por la acción de
bacterias azufre-oxidantes y sulfato-reductoras se llevó a cabo mediante la
sucesión de las etapas experimentales descritas a continuación:
•
Solubilización de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias azufreoxidantes en discontinuo.
•
Solubilización de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias azufreoxidantes en continuo.
•
Reducción de Cr(VI) con bacterias azufre-oxidantes en
discontinuo.
•
Reducción de Cr(VI) y solubilización de Cr(III) con bacterias
azufre-oxidantes en continuo.
•
Precipitación de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias sulfatoreductoras en discontinuo.
•
Precipitación de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias sulfatoreductoras en continuo.
•
Inmovilización de At. ferrooxidans y At. thiooxidans sobre
espuma de poliuretano.
•
Integración de los procesos de solubilización y precipitación de
Cr(III), Ni(II) y Zn(II) en continuo.
133
MATERIAL Y MÉTODOS
2.1 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III),
Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES
EN DISCONTINUO
El estudio de la solubilización de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) por la
acción de las bacterias azufre-oxidantes se llevó a cabo primeramente en
régimen discontinuo.
Se tomaron como referencia las concentraciones máximas de estos
metales en lodos para ser aplicadas al suelo: 1500 mg Cr/kg materia seca,
400 mg Ni/kg materia seca y 4000 mg Zn/kg materia seca. Estas mismas
cantidades en disolución dan lugar a concentraciones mayores a los que se
pueden encontrar habitualmente en efluentes contaminados. Por otra
parte, los estudios previos indicaron que algunas de estas concentraciones
no son toleradas por este tipo de bacterias.
Por tanto, se decidió trabajar con el 20% y el 50% de estas cantidades
en el medio de cultivo. La cantidad necesaria de cada metal se
suplementó empleando, óxido de cromo (III) (Cr2O3), sulfuro de níquel (NiS) y
sulfuro de zinc (ZnS), respectivamente.
Se prepararon ensayos con cada metal sólo y combinando todos
ellos. En la Tabla 21 se recogen las concentraciones de metal empleadas en
cada uno de ellos.
En matraces erlenmeyers de 250 ml se añadieron 90 ml de medio 0K
(ajustado a pH 4), 1 g de azufre elemental y la cantidad necesaria de
metal. A continuación se inoculó al 10% con un cultivo de At. ferrooxidans o
At. thiooxidans en fase exponencial de crecimiento. Se realizó un control
estéril (C50) al que se suplementaron todos los metales a la máxima
concentración de cada uno de ellos.
134
MATERIAL Y MÉTODOS
Ensayo
[Cr(III)]
ppm
Cr20
300
Cr50
750
[Ni(II)]
ppm
Ni20
80
Ni50
200
[Zn(II)]
ppm
Zn20
800
Zn50
2000
M20
300
80
8000
M50
750
200
2000
C50
750
200
2000
Tabla 21 Concentraciones de los metales empleados en cada uno de los ensayos
El seguimiento de la experiencia se realizó tomando muestras cada 34 días, reponiendo previamente el volumen de agua evaporado. A cada
muestra se le determinó el pH, la población celular y la concentración de
metales en solución. Al final de la experiencia se determinó la cantidad de
metal residual de cada ensayo mediante digestión ácida.
Dado que los metales habitualmente se encuentran integrados en
matrices sólidas como lodos, sedimentos o suelos, se estudió también la
solubilización de estos metales en las mismas condiciones en presencia de
una matriz sólida como la arena. Para ello, se prepararon arenas
contaminadas artificialmente con cromo, níquel y zinc individualmente y los
tres al mismo tiempo. La cantidad de arena agregada en cada ensayo dio
lugar a las mismas concentraciones iniciales que en el estudio de
solubilización anterior y el seguimiento de la experiencia se realizó siguiendo
el mismo procedimiento descrito anteriormente.
135
MATERIAL Y MÉTODOS
2.2 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III),
Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES
EN CONTINUO
La solubilización en continuo de los iones metálicos Cr(III), Ni(II) y Zn(II)
se llevó a cabo preparando un cultivo de At. thiooxidans en un reactor de
tanque agitado de modo que el medio ácido que sale de forma continúa
se hizo pasar por una columna de lecho fijo en la que se encontraba una
arena contaminada artificialmente con los metales citados.
La descripción del equipo se detalla a continuación y se encuentra
representado en la figura 15.
sensor pH
Sensor de
temperatura
At. t.
Arena con Cr(III),
Ni(II) y Zn(II)
Aireación
30ºC 300 rpm
Medio 0K pH4
Lixiviado
Figura 15: Equipo para la solubilización continua de cromo, níquel y zinc mediante un cultivo
de At. thiooxidans.
136
MATERIAL Y MÉTODOS
2.2.1 REACTOR DE At. thiooxidans
Para el crecimiento de esta bacteria azufre-oxidante se empleó un
reactor de tanque agitado con un volumen de trabajo de 800 ml sobre un
volumen total de 1 litro.
El reactor estaba provisto de un sensor de temperatura y un sensor de
pH para el control del proceso. La agitación (300 rpm) se obtuvo por
agitación magnética y el oxígeno necesario se proporcionó mediante un
compresor que suministraba un caudal de aire de 1,04 vvm.
El cultivo se realizó añadiendo al reactor 720 ml de medio 0K (a pH 4),
8 g de azufre elemental y 72 ml de un cultivo de At. thiooxidans en fase
exponencial de crecimiento (1020 Mcel/ml y pH 0,96) y se mantuvo a 30ºC y
300 rpm. Tras una primera fase en régimen discontinuo, cuando el pH se
encontró en un valor de 1, se conectó la alimentación en continuo
mediante una bomba peristáltica.
Diariamente se realizó la medida de pH, concentración de protones,
concentración de sulfato, población bacteriana y volumen alimentado.
2.2.2 SOLUBILIZACIÓN DE METALES PRESENTES EN ARENA
Para llevar a cabo el estudio de la solubilización de los metales
presentes en una arena contaminada artificialmente, se colocaron 50 g de
ésta en una columna de vidrio de 60 ml de volumen total.
La arena se preparó con aquellas concentraciones de cada uno de
los metales estudiados que según la legislación vigente marcan el mínimo
para que sea considerado como un lodo contaminado. De este forma, los
50 g de arena contenían: 75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II)
aportados en forma de Cr2O3, NiS y ZnS, respectivamente.
137
MATERIAL Y MÉTODOS
A través de la columna se hizo pasar un caudal de medio ácido
procedente del reactor de crecimiento exactamente igual al de entrada
de alimentación del reactor de At. thiooxidans.
Diariamente se le determinó al lixiviado obtenido el pH, la
concentración de protones, la concentración de sulfato, la concentración
de cada uno de los metales y el volumen obtenido.
2.3 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIÓN DE Cr(VI)
CON
BACTERIAS
AZUFRE-OXIDANTES
EN
DISCONTINUO
Para la determinación de la capacidad de reducción del cromo
hexavalente por At. ferrooxidans y At. thiooxidans en discontinuo se siguió el
protocolo descrito a continuación.
Se preparó una disolución de dicromato potásico (K2Cr2O7) de 1000
ppm y se esterilizó por filtración a vacío por membrana de 0,22 m.
Una serie de erlenmeyers de 250 ml fueron suplementados con 90 ml
de medio 0K (pH 4,0) y 1 g de azufre elemental. A este medio se le añadió el
volumen necesario para obtener una concentración final de 1, 2,5, 5 y 10
mg/l; y finalmente, se inoculó al 10% con cultivos en la fase exponencial de
crecimiento.
Se realizó un control sin inóculo a la mayor concentración de Cr(VI)
considerada (10 ppm) y dos controles inoculados (uno de cada bacteria)
sin metal.
El seguimiento de esta experiencia se realizó mediante la medida del
pH, la población celular, la concentración de Cr(VI), empleando el método
de
la
difenilcarbazida,
y
la
concentración
de
cromo
total,
por
espectroscopia de emisión atómica.
138
MATERIAL Y MÉTODOS
2.4 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIÓN DE Cr(VI) Y
SOLUBILIZACIÓN DEL Cr(III) CON BACTERIAS
AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO
Para el estudio de la reducción del Cr(VI) y la solubilización del Cr(III)
presentes en un residuo por la acción de las bacterias azufre-oxidantes, se
empleó un reactor para el crecimiento de un cultivo At. thiooxidans y una
columna de lecho empaquetado, que soportaba el residuo, donde se
produjo la reducción/solubilización del cromo por la acción del medio
procedente del reactor de At. thiooxidans. La descripción del proceso se
detalla a continuación y se encuentra representado en la figura 16.
Aireación
At. thiooxidans
+ azufre
Residuo de
cromo
pH1
Medio 0K
pH5
Lixiviado
Figura 16: Esquema del sistema empleado para la reducción del Cr(VI) y la solubilización del
Cr(III) presentes en un residuo mediante la acción de At. thiooxidans
2.4.1 Reactor de At. thiooxidans
El reactor empleado fue una columna de lecho empaquetado
constituida por 170 g de azufre elemental (tamaño de partícula 2-4 mm). El
139
MATERIAL Y MÉTODOS
azufre tiene una doble finalidad: actuar como soporte para la inmovilización
de las bacterias y como sustrato. La columna disponía de 150 ml de
volumen útil sobre un total de 300 ml.
Inicialmente se añadió a la columna medio 0K a pH 2,5 y se inoculó al
10% con un cultivo At. thiooxidans en fase exponencial de crecimiento.
La alimentación del reactor constaba de medio 0K ajustado a pH 5.
El oxígeno necesario para el metabolismo celular se proporcionó mediante
un sistema de aireación conectado a un difusor (1,10 vvm). Para la entrada
de alimentación y salida de medio se empleó una bomba peristáltica de
doble cabezal.
El seguimiento del reactor se realizó diariamente mediante la medida
del pH, la concentración de protones y la población celular.
El sistema operó inicialmente en discontinuo hasta alcanzar un pH
igual a 1, es entonces cuando se dispuso en régimen continuo para obtener
la renovación de todo el medio presente en la columna y se mantuvo de
nuevo en discontinuo. Este proceso se repitió hasta asegurar la formación
de la biopelícula, momento en que se mantiene en régimen continuo.
2.4.2 Columna con residuo de cromo
En una columna de características similares a la empleada para la
inmovilización de At. thiooxidans, se añadieron 157 g del residuo de cromo a
tratar.
El residuo empleado procedía de un filtro prensa de una planta de
galvanizado. Dicho filtro, constituido principalmente de compuestos
arcillosos, retiene el cromo procedente de los baños de cromado y cuando
se colmata se desecha y es renovado por otro; este hecho supone una
acumulación elevada de cromo en el medio donde se almacenan.
140
MATERIAL Y MÉTODOS
El contenido del residuo es 30% de Cr(III) y 0,1% de Cr(VI).
La columna estaba conectada a una bomba peristáltica que
permitía la salida de lixiviado a un caudal similar al de entrada de medio a
pH 1. El seguimiento de la columna se realizó midiendo el volumen
recolectado de lixiviado y determinando a éste el pH, la concentración de
protones, la concentración de sulfato y la concentración de cromo
hexavalente y total.
2.5 PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIÓN DE Cr(III),
Ni(II) y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS EN DISCONTINUO
Las experiencias realizadas tenían el objetivo de estudiar la tolerancia
de las bacterias sulfato-reductoras a los iones metálicos, así como
cuantificar la capacidad de precipitación de dichos iones por estas
bacterias.
Durante la experimentación fueron necesarios cultivos crecidos en
medio Postgate C, y para ello, con la antelación suficiente, se sembraron en
medio Postgate C las cepas de bacterias sulfato-reductoras necesarias
mantenidas en medio Postgate B, de acuerdo al protocolo descrito
anteriormente en el apartado 1.1.2.2 de esta misma sección.
Una vez crecido el cultivo y, antes de utilizarlo en la experiencia, es
necesario retirar el sulfuro que existe en el medio, con el fin de que no se
produzca una precipitación inicial de los metales solubles que se vayan a
suplementar al medio. Para ello se centrifuga (5000 G, 30 min, 20 ºC) o se
filtra a vacío por membrana de 0,22 micras y se resuspende en el volumen
necesario de medio Postgate C fresco
141
MATERIAL Y MÉTODOS
Las disoluciones de los metales objeto del estudio se prepararon a
partir de una disolución stock de 1000 ppm para cada ión metálico con
Cr2(SO4)3, NiSO4 ·6H2O y ZnSO4 ·7H2O, respectivamente, filtrados a vacío por
membranas de 0,22 micras para asegurar su esterilización.
Se prepararon recipientes de vidrio con medio Postgate C estéril a los
que se añadió el volumen de disolución metálica necesario para disponer
de la concentración metálica deseada en cada ensayo. Cada prueba se
realiza por duplicado.
A continuación se burbujeó una corriente de N2 gaseoso durante
unos minutos, y se añadió 5 ml de inóculo a cada prueba manteniendo la
corriente de nitrógeno unos minutos más. Se cerraron herméticamente con
tapón de goma y virola metálica. Los cultivos se incubaron a 30ºC en estufa.
El muestreo se realizó cada 3-4 días extrayendo con aguja y jeringa
1,5-2 ml de cada experimento cuidando de no introducir aire en el bote,
hecho que se evita haciendo pasar la corriente de nitrógeno durante unos
minutos después del muestreo.
De cada muestra se tomó una fracción para la determinación de la
concentración celular, que se diluye si es necesario, y el resto se filtró por
filtro de membrana de 0,22 micras. Al sobrenadante obtenido se le
determinó la concentración de sulfato y se acondicionó para la medida del
ión o iones metálicos que existan en la muestra.
2.6 PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIÓN DE Cr(III),
Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS EN CONTINUO
Para el estudio de la precipitación de iones metálicos en solución
mediante bacterias sulfato-reductoras se procedió a realizar un cultivo
142
MATERIAL Y MÉTODOS
continuo de estas bacterias en un reactor de tanque agitado. El sulfuro de
hidrógeno obtenido se puso en contacto con una disolución metálica de
cromo, níquel y zinc.
El proceso se detalla a continuación y se encuentra representado en
la figura 17.
sensor pH
Sensor de
temperatura
Nitrógeno
D. sp
30ºC 500 rpm
Medio Postgate C
Precipitado
Figura 17 Sistema empleado para la precipitación de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) en solución
con un cultivo Desulfovibrio sp. en continuo.
2.6.1 REACTOR DE Desulfovibrio sp.
Para el crecimiento de este cultivo mixto de Desulfovibrio sp. se utilizó
un reactor de tanque agitado de 800 ml cerrado herméticamente. El
reactor disponía de una entrada para el paso de una corriente de N2
gaseoso que permitió asegurar las condiciones anaerobias necesarias tanto
143
MATERIAL Y MÉTODOS
al inicio como a lo largo de la experiencia cuando se producía algún
cambio que implicase entrada de aire al sistema.
El reactor cuenta además con un sensor de temperatura y un sensor
de pH. La toma de muestra se realizó mediante una jeringa en la
conducción de salida del reactor para evitar la manipulación en el interior
del reactor y la entrada no deseada de aire al sistema.
El cultivo se preparó con 720 ml de medio Postgate C y 72 ml de un
cultivo de Desulfovibrio sp. en fase exponencial de crecimiento. El cultivo se
mantuvo en régimen discontinuo durante dos días y, transcurrido este
tiempo, necesario para el crecimiento de la biomasa hasta la fase
exponencial, se comenzó a operar en régimen continuo con la entrada de
medio Postgate C.
El seguimiento del cultivo continuo se realizó con la medida diaria del
pH, la población bacteriana y la concentración de sulfato.
2.6.2 REACTOR DE PRECIPITACIÓN
Para determinar la capacidad para precipitar iones metálicos del
medio generado por las bacterias sulfato-reductoras se preparó una
disolución con los sulfatos comunes de cromo, níquel y zinc hasta obtener
una concentración de 1500 ppm de Cr(III), 400 ppm de Ni(II) y 4000 ppm de
Zn(II).
Se realizó un seguimiento diario del volumen que se fue descargando
en el reactor de precipitación. En dicho reactor se dispone de un medio
líquido procedente del reactor de crecimiento de las bacterias sulfatoreductoras, la disolución metálica bajo estudio y una cantidad de
precipitado generado. A una muestra de dicha mezcla se le determinó el
pH, la concentración de sulfato y la concentración de metales en solución.
En aquellos casos en los que se detectó una escasa precipitación, el
144
MATERIAL Y MÉTODOS
volumen recogido en el reactor de precipitación se volvió a reutilizar para
continuar con la precipitación de los metales en solución, a fin de
completar la precipitación total.
2.7 PROTOCOLO PARA LA INMOVILIZACIÓN DE At.
ferrooxidans Y At. thiooxidans SOBRE ESPUMA DE
POLIURETANO
Para el seguimiento de la dinámica de inmovilización de las bacterias
azufre-oxidantes sobre espuma de poliuretano se realizó un cultivo en
discontinuo, la metodología empleada se representa en la figura 18.
Se emplearon matraces erlenmeyers de 500 ml a los que se le añadió
180 ml de medio 0K ajustado a pH 1,8 para el cultivo At. ferrooxidans o a pH
2,5 para At. thiooxidans. El medio se suplementó con
2 g de azufre
elemental, 1 g de espuma de poliuretano (cubos de 0,5 cm de lado) y 20 ml
de inóculo del cultivo correspondiente en fase exponencial. Los cultivos se
incubaron a 30ºC y 150 rpm. Y cuando alcanzaron un pH de 1, se retiró el
medio filtrando el cultivo por un embudo Buchner y un filtro de papel
Whatman nº4. La espuma retenida se llevó a un nuevo matraz erlenmeyer
estéril y se añadieron 200 ml de medio 0K al mismo pH que en la etapa
inicial y se incubó en las mismas condiciones. Cuando el pH fue 1, se volvió
a repetir el procedimiento pero empleando medio 0K ajustado a pH 4, ya
que este medio será el que se emplee en los procesos de solubilización de
metales con las bacterias inmovilizadas sobre espuma.
145
MATERIAL Y MÉTODOS
2 g Sº
2 g Sº
180 ml medio
0K pH óptimo
200 ml medio 0K
pH óptimo
20 ml
inóculo
pH 1
pH 1
30ºC 150 rpm
2 g Sº
30ºC 150 rpm
200 ml medio 0K
pH 4
pH 1
NUEVO CICLO
30ºC 150 rpm
Figura 18: Procedimiento de inmovilización de bacterias azufre-oxidantes sobre espuma de
poliuretano
Los ciclos se continuaron realizando en estas últimas condiciones
hasta observar que la cantidad de biomasa inmovilizada se mantiene
constante al final de cada etapa y que los ciclos tienen una duración
similar. El seguimiento de la experiencia se realizó midiendo diariamente el
pH, la concentración de protones y la concentración de sulfato. Al final de
cada ciclo se determinó la biomasa ocluida y la biomasa retenida en el
soporte.
146
MATERIAL Y MÉTODOS
2.8 PROTOCOLO PARA LA INTEGRACIÓN DE LOS
PROCESOS DE SOLUBILIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN
DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) EN CONTINUO.
La integración de los procesos de solubilización y precipitación se
llevó a cabo en el sistema experimental descrito en la figura 19. La etapa de
solubilización se desarrolló con un cultivo de At. thiooxidans inmovilizado
sobre espuma de poliuretano. Para ello, se inocularon al 10% dos
erlenmeyers de un litro los cuales contenían 650 ml de medio 0K, 4 g de
cubos de espuma de poliuretano y 6,5 g de azufre elemental. Se realizaron
cuatro ciclos de inmovilización en discontinuo y, a continuación, se
depositaron en una columna de vidrio donde se llevó a cabo el crecimiento
de este cultivo en continuo. Inicialmente la columna se preparó con 7,5 g
de espuma de poliuretano con una densidad celular de 12 Mcel/mg de
espuma sumergidas en 650 ml de medio 0K a pH 4 y con 6,5 g de azufre
elemental.
sensor pH
At. thiooxidans
inmovilizado
sobre espuma
de poliuretano
Sensor de
temperatura
pH1
Arena
contaminada
Nitrógeno
30ºC 500 rpm
Aireación
Medio Postgate C
Lixiviado
Medio 0K
Precipitado
Figura 19. Esquema del sistema empleado para la integración de los procesos de
solubilización y precipitación de cromo, níquel y zinc en continuo.
Una vez que se alcanzó un valor de pH 1 el sistema comenzó a
operar en régimen continuo mediante el uso de una bomba peristáltica de
147
MATERIAL Y MÉTODOS
doble cabezal. La alimentación continua consistió en medio 0K a pH 4 y el
aporte de azufre elemental se realizó de forma puntual cuando se detectó
un descenso en la producción de ácido sulfúrico. El efluente procedente de
la columna se hizo pasar a través de una columna de lecho empaquetado
con la arena contaminada. En concreto, la columna se preparó con 50
gramos de una arena que contenía 75 mg de Cr(III), 50 mg de Cr(VI), 20 mg
de Ni(II) y 200 mg de Zn(II). El lixiviado procedente de la columna se recogió
en un erlenmeyer de un litro y, tras tomar muestra, se filtró para eliminar los
posibles sólidos arrastrados del lecho antes de someter esta solución al
proceso de bioprecipitación. Diariamente se siguió el estado del proceso
midiendo el pH, la concentración de protones y la concentración de sulfato
tanto a la salida del reactor como al lixiviado, y a éste también se le
determinó el volumen obtenido y la concentración de los iones metálicos.
La etapa de precipitación se realizó en condiciones similares a las
empleadas en el proceso de precipitación en continuo descrito con
anterioridad en el que se empleaba un lixiviado artificial. Se empleó un
reactor de tanque agitado para el crecimiento del cultivo mixto de
bacterias sulfato-reductoras, Desulfovibrio sp., en medio Postgate C. Una vez
obtenido el estado estacionario, el medio procedente del reactor se goteó
sobre un embudo de decantación donde se encontraba la fracción de
lixiviado diaria obtenida de la etapa de solubilización.
Se siguió la concentración celular, el pH y la concentración de sulfato
en el reactor de crecimiento de Desulfovibrio sp. y al volumen de
precipitado obtenido se le determinó el pH, la concentración de sulfato y la
concentración de metales en solución.
148
D.-RESULTADOS
RESULTADOS
1 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)
1.1 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON
BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO
Se estudió la solubilización de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II), aislados o
combinados entre sí a dos concentraciones distintas de cada uno de ellos
en presencia de At. ferrooxidans y At. thiooxidans. Se tomaron como
referencia concentraciones de 1500 ppm de Cr(III), 400 ppm de Ni(II) y 4000
ppm de Zn(II), siendo estos valores los máximos permitidos por la legislación
vigente para lodos que pueden ser aplicables a suelos. Sin embargo, estas
concentraciones pueden resultar tóxicas para los microorganismos, por lo
que se decidió trabajar con el 20% y el 50% de éstas en solución, esto da
lugar a concentraciones que se pueden encontrar de forma habitual en
lodos (Matlakoska y Sklodowska, 2001; Villlar y col. 2001), sedimentos (Chen
y Lin, 2000; Seidel y col. 1998) y suelos (Gómez y Bosecker, 1999)
contaminados. De esta forma, se denominó a estas experiencias como 20 o
50 según el porcentaje de estas cantidades que se encuentran en solución.
Durante la experimentación se siguió la evolución del pH, la
concentración del metal en solución y la concentración de biomasa, la
evolución de las concentraciones de cada uno de ellos se representa en un
mismo gráfico para cada bacteria en presencia de las dos concentraciones
de metal estudiada en cada caso.
Para ambas bacterias se observó que, en presencia de la
concentración menor de cromo y de níquel se produjo un descenso
acusado del pH parejo al cultivo control.
151
RESULTADOS
Figura 20: Fotografía de microscopía electrónica (x 20000) de las bacterias azufre-oxidantes
empleadas en el estudio, At. ferrooxidans (izqda.) y At. thiooxidans (dcha.)
En el experimento de At. ferrooxidans en presencia de cromo (III)
(figura 21) se observa una solubilización inicial significativa y luego se
mantiene prácticamente constante durante todo el estudio para las dos
concentraciones estudiadas.
En el caso del experimento AfCr20 se observa un aumento de la
biomasa pasado el tercer día, a partir de este momento se estabiliza la
cantidad de metal solubilizado independientemente de la disminución
progresiva del pH (1,8-0,7) y del crecimiento de la población bacteriana.
Este comportamiento es distinto cuando se trabaja con la concentración
más alta de metal (AfCr50), de tal forma que la biomasa se mantiene en los
valores iniciales, lo que hace pensar que la cantidad de metal solubilizado
al principio, puede inhibir la actividad metabólica de At. ferrooxidans. A
pesar de ello, la cantidad de cromo solubilizado es muy pequeña en ambos
casos (< 2%) y sólo es posible su justificación en base a la baja solubilidad
del óxido de este metal.
152
RESULTADOS
At. ferrooxidans + Cr(III)
14
900
800
12
700
Mcel/ml
500
8
400
6
300
[Cr(III)] (ppm)
10
600
4
200
2
100
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tiempo (días)
Mcel/ml AfCr20
Mcel/ml AfCr50
[Cr] AfCr20
[Cr] AfCr50
Figura 21: Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At.
ferrooxidans en presencia de 300 y 750 de ppm de Cr(III)
En la figura 22 se representa la evolución de la concentración
bacteriana y la concentración de Cr(III) en solución para los cultivos de At.
thiooxidans. Al igual que para el experimento con At. ferrooxidans, tan sólo
el cultivo de menor concentración registra un crecimiento apreciable de la
biomasa, llegando a niveles similares de población que éste otro
microorganismo. Este aumento de la biomasa tiene relación directa con el
descenso registrado en el valor del pH (2,0-0,5). En este experimento,
también se observa una solubilización inicial del metal que se mantiene
prácticamente constante a lo largo del tiempo.
153
RESULTADOS
At. thiooxidans + Cr(III)
900
16
800
14
700
Mcel/ml
600
10
500
8
400
6
300
[Cr(III)] (ppm)
12
4
200
2
100
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tiempo (días)
Mcel/ml AtCr20
[Cr] AtCr20
Mcel/ml AtCr50
[Cr] AtCr50
Figura 22: Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At.
thioooxidans en presencia de 300 y 750 de ppm de Cr(III)
Por tanto, se puede decir que, a las concentraciones ensayadas, At.
thiooxidans no es capaz de solubilizar el óxido de cromo presente en el
medio.
Las figuras 23 y 24 representan la evolución del proceso de
solubilización
de
Ni(II)
por
At.
ferrooxidans
y
At.
thiooxidans,
respectivamente. Así, en el caso de At. ferrooxidans se puede observar que
la presencia de la menor concentración de níquel no afecta al crecimiento
de esta especie bacteriana ya que, tras una fase de latencia de 3 días, se
observa un crecimiento exponencial del cultivo. Este aumento se
corresponde con un descenso en el pH (1,8-0,6) y un aumento gradual en la
solubilización del sulfuro metálico.
154
RESULTADOS
At. ferrooxidans + Ni(II)
1400
40
1200
35
Mcel/ml
25
800
20
600
15
400
[Ni(II)] (ppm)
30
1000
10
200
5
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tiempo (días)
Mcel/ml AfNi20
[Ni] AfNi20
Mcel/ml AfNi50
[Ni] AfNi50
Figura 23: Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At.
ferrooxidans en presencia de 80 y 200 ppm de Ni(II)
La cantidad final solubilizada fue mayor de 17,5 ppm, lo que supone
un 22,1% del metal agregado. Por el contrario, la concentración mayor de
níquel estudiada afecta claramente al crecimiento celular, de tal forma que
ni el pH ni la biomasa varían con respecto a los valores iniciales y la
cantidad de metal solubilizada inicialmente se mantiene constante.
155
RESULTADOS
1200
60
1000
50
800
40
600
30
400
20
200
10
0
[Ni(II)] (ppm)
Mcel/ml
At. thiooxidans + Ni(II)
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tiempo (días)
Mcel/ml AtNi20
[Ni] AtNi20
Mcel/ml AtNi50
[Ni] AtNi50
Figura 24 Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At.
thiooxidans en presencia de 80 y 200 ppm de Ni(II)
En los experimentos realizados con At. thiooxidans se puede observar
un comportamiento similar, de modo que con la menor concentración de
sulfuro, se registra un crecimiento microbiano importante, mientras que la
concentración de biomasa permanece prácticamente invariable cuando
se encuentra presente una mayor concentración del sulfuro (AtNi50). De
esta forma, se puede llegar a registrar una solubilización del 21,7% de Ni(II)
para el caso de AtNi20, mientras que en el experimento de mayor
concentración, la solubilización que se consigue es la inicial del sulfuro
(16,7%) permaneciendo invariable con el tiempo.
En las figuras 25 y 26, se muestra la evolución de los distintos
parámetros seguidos para las experiencias en presencia de sulfuro de zinc.
156
RESULTADOS
En general, se puede decir que la presencia del zinc inhibe la actividad
bacteriana, ya que se registran fases de latencia un poco más acusadas
que
para
el
resto
de
los
compuestos
metálicos
ensayados.
Este
comportamiento puede tener su explicación en una mayor solubilidad
inicial del sulfuro de zinc, de tal forma, que en las primeras horas de cultivo
se pueden alcanzar valores de 600 - 900 ppm de Zn(II) en solución para los
experimentos con At. ferrooxidans y 600 – 700 ppm de Zn(II) para los cultivos
de At. thiooxidans, de tal forma que nos encontramos ante elevadas
concentraciones del metal en solución que provocan la inhibición parcial o
total de la actividad bacteriana. Este hecho no ocurre en los ensayos con
compuestos de cromo o níquel ya que la solubilización propia de éstos no
llega a superar tales niveles de solubilización inicial, principalmente porque
la cantidad aportada de estos metales es mucho menor.
At. ferrooxidans + Zn(II)
450
1200
400
Mcel/ml
300
800
250
600
200
150
400
100
[Zn(II)] (ppm)
1000
350
200
50
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tiempo (días)
Mcel/ml AfZn20
[Zn] AfZn20
Mcel/ml AfZn50
[Zn] AfZn50
Figura 25 Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At.
ferrooxidans en presencia de 800 y 2000 ppm de Zn(II)
157
RESULTADOS
De las dos cepas ensayadas, At. ferrooxidans es más sensible a la
presencia de Zn en solución, ya que no se registra crecimiento para el caso
del 50%, mientras que si es posible encontrar un aumento de la población
bacteriana para At. thiooxidans. Esta evidencia tiene una relación directa
con el grado de solubilización, de tal forma, que se registran valores de
78,4% y 43% para las dos concentraciones estudiadas en los cultivos de At.
thiooxidans.
Una vez que se estudiaron los comportamientos de las dos cepas
frente a cada uno de los compuestos metálicos de forma individual, el
siguiente paso en la experimentación fue determinar la influencia que tiene
la presencia de los compuestos de cromo (III), níquel (II) y zinc (II) de forma
conjunta para acercarnos a lo que puede ocurrir de forma natural en un
residuo contaminado
At. thiooxidans + Zn(II)
600
1000
900
500
800
Mcel/ml
600
300
500
400
200
[Zn(II)] (ppm)
700
400
300
200
100
100
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tiempo (días)
Mcel/ml AtZn20
[Zn] AtZn20
Mcel/ml AtZn50
[Zn] AtZn50
Figura 26: Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At.
thiooxidans en presencia de 800 y 2000 ppm de Zn(II)
158
RESULTADOS
En cuanto al comportamiento de At. ferrooxidans en presencia de la
mezcla de metales, la tendencia está claramente condicionada por la
presencia de zinc. De tal forma que, para el caso de las experiencias con el
20% de cada cantidad referencia de metal (figura 27), se obtuvo un
crecimiento celular importante a partir del décimo día de incubación y,
para el caso de las experiencias con 50% no se detectó crecimiento
microbiano relevante (figura 28).
At. ferrooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (20%)
25
Mcel/ml - [Zn(II)] (ppm)
600
20
500
15
400
300
10
200
5
100
0
[Cr(III)], [Ni(II)] (ppm) - pH
700
0
0
5
10
15
Tiempo (días)
Mcel/ml
[Zn]
[Cr]
[Ni]
pH
Figura 27: Evolución del pH, crecimiento bacteriano y concentraciones de metales para At.
ferrooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (20% de concentraciones máximas, 300ppm
de Cr(III), 80 ppm de Ni(II) y 800 ppm de Zn(II)).
159
RESULTADOS
At. ferrooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (50%)
1200
50
Mcel(ml) - [Zn(II)] (ppm)
40
35
800
30
600
25
20
400
15
10
200
[Cr(III)], [Ni(II)] (ppm) - pH
45
1000
5
0
0
0
5
10
15
Tiempo(días)
Mcel/ml
[Zn]
pH
[Cr]
[Ni]
Figura 28: Evolución del pH, crecimiento bacteriano y concentraciones de metales para At.
ferrooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (50% de concentraciones máximas, 750ppm
de Cr(III), 200 ppm de Ni(II) y 2000 ppm de Zn(II))
Si
se
comparan
los
porcentajes
de
solubilización
de
estas
experiencias, se puede comprobar que se encuentran en el mismo nivel a
los obtenidos de forma individual. Es decir, que la presencia de varios tipos
de compuestos metálicos en el medio no afecta de forma significativa al
comportamiento de estas cepas.
At. thiooxidans se comporta de manera similar, la combinación de
metales parece que no afecta al porcentaje de solubilización final y la
evolución del crecimiento celular (figuras 29 y 30) fue pareja a la vista para
At. thiooxidans en presencia de zinc.
160
RESULTADOS
At. thiooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (20%)
700
Mcel/ml - [Zn(II)] (ppm)
600
20
500
15
400
300
10
200
5
100
0
[Cr(III)], [Ni(II)] (ppm) - pH
25
0
0
5
10
15
Tiempo (días)
Mcel/ml
[Zn]
[Cr]
[Ni]
pH
Figura 29: Evolución del pH, crecimiento bacteriano y concentraciones de metales para At.
thiooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (20% de concentraciones máximas, 300ppm
de Cr(III), 80 ppm de Ni(II) y 800 ppm de Zn(II))
Con el objetivo de comparar los resultados obtenidos mediante
solubilización biológica con aquellos que pueden obtenerse por métodos
químicos, se llevo a cabo la digestión ácida de cantidades iguales de los
compuestos metálicos empleados en 100 ml de medio 0K a pH 4. Tras la
adición de ácido nítrico y ácido clorhídrico, se llevó la mezcla a ebullición,
tal como se describe en el apartado de Material y Métodos de la presente
memoria Los resultados también se compararan con la solubilización
obtenida por un control estéril realizado con medio 0K ajustado a pH 1,8
para una composición de metales igual a la estudiada con las bacterias. En
la tabla 22 se puede muestran los porcentajes de solubilización obtenidos
con el cultivo At. ferrooxidans, el cultivo At. thiooxidans, la debida al ataque
161
RESULTADOS
con ácidos fuertes y la obtenida con el control estéril para una mezcla
metálica de cromo, níquel y zinc.
60
1000
50
800
40
600
30
400
20
200
10
Mcel(ml) - [Zn(II)] (ppm)
1200
0
[Cr(III)], [Ni(II)] (ppm) - pH
At. thiooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (50%)
0
0
5
10
15
Tiempo(días)
Mcel/ml
[Zn]
pH
[Cr]
[Ni]
Figura 30: Evolución del pH, crecimiento bacteriano y concentraciones de metales para At.
thiooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (50% de concentraciones máximas, 750ppm
de Cr(III), 200 ppm de Ni(II) y 2000 ppm de Zn(II))
Modo de
Solubilización
Cr2O3
NiS
ZnS
At. ferrooxidans
1,13 (1,5%)
4,52 (22,6%)
106,5 (53,25%)
At. thiooxidans
1,01 (1,35%)
4,85 (24,25%)
110 (55%)
Digestión ácida
1,12 (1,49%)
18,51 (92,5%)
168,9 (84,45%)
Control pH 1,8
1,14 (1,51%)
2,21 (11,05%)
42,22 (21,11%)
Tabla 22:. Cantidad en mg y porcentaje (%) de cada metal solubilizado de una
combinación de compuestos metálicos (75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II) en
100 ml de medio 0K) por At. ferrooxidans, At. thiooxidans, digestión ácida y control ésteril a pH
1,8 l.
162
RESULTADOS
Como
se
puede
observar
la
solubilización
del
cromo(III)
es
prácticamente igual independientemente del método empleado. Este
hecho se debe, fundamentalmente, a la insolubilidad característica del
óxido de cromo empleado, ya que éste presenta una elevada resistencia a
su disolución en presencia de una gran variedad de agentes químicos.
Por el contrario, el ataque químico con ácidos fuertes permite una
elevada solubilización del sulfuro de níquel (92,5%) y del sulfuro de zinc
(84,45%) frente a la obtenida por un método biológico. No obstante, el
porcentaje de solubilización biológica obtenidos para las dos bacterias
empleadas permite reducir en gran medida el contenido metálico de
ciertos residuos hasta alcanzar niveles aceptables para ser depositados o
reutilizados según la legislación. Al mismo tiempo, la solubilización de níquel
y zinc con medio a pH 1,8 es mucho menor a la obtenida en los demás
casos, pero permite asegurar que una proporción del metal solubilizado se
debe a la acción de los compuestos del medio ácido generado por las
bacterias azufre-oxidantes.
Por tanto, cuando se desea llevar a cabo la solubilización de los
metales presentes en un medio contaminado, existe la necesidad de
realizar una evaluación de las ventajas e inconvenientes que presenta cada
una de ellas en función de la cantidad de metal que se desea solubilizar y
del uso posterior que se le quiera dar al residuo. De esta forma, si mediante
una técnica de tipo químico nos podemos asegurar un elevado grado de
solubilización, su aplicación resulta mucho más costosa y genera un ataque
más agresivo al medio ambiente que mediante la aplicación de una
técnica de tipo biológico. En ese sentido, para concentraciones bajas de
los metales ensayados, la solubilización biológica se presenta como una
alternativa viable y de menor coste económico y ambiental que la digestión
163
RESULTADOS
ácida, ya que no requiere del uso de compuestos químicos ni de un aporte
energético.
Los resultados de solubilización en este estudio son menores a los
obtenidos por Villar y col. (2001). Estos autores estudiaron la lixiviación de los
metales presentes en lodos anaerobios mediante un cultivo indígena de
bacterias azufre-oxidantes en cultivo discontinuo. El lodo empleado
contenía concentraciones de cromo, níquel y zinc dentro del rango de las
concentraciones consideradas en el presente trabajo (685 mg Cr(III)/kg, 38
mg Ni(II)/kg y 888 mg Zn(II)/kg). En dicho trabajo se calcula la eficacia de
solubilización (r) como la razón entre la cantidad de metal disuelto y la
cantidad de metal total en el lodo.
r=
mg metal disuelto
mg metal total
El cálculo de este término permite hallar la constante de velocidad
de solubilización del metal (k (d-1)) asumiendo una cinética de solubilización
de primer orden.
d(1 − r )
= − kt → ln(1 − r ) = − kt
dt
La pendiente de la representación de ln(1-r) en función del tiempo
proporciona
el valor de la constante k. En la tabla 23 se presentan los
valores de la constante de velocidad y el porcentaje de solubilización para
cada metal para la experiencia a 30ºC llevada a cabo por Villar y
colaboradores, a las concentraciones que más se asemejan a las
empleadas en el presente trabajo.
164
RESULTADOS
metal
k (d-1)
% solubilización
Cromo
0,125
40
Níquel
0,377
64
Zinc
1,000
80
Tabla 23: Constante y porcentaje de solubilización de los metales presentes en un lodo
presentados por Villar y col. (2001)
De igual manera se realizó el cálculo de estas constantes para cada
una de las experiencias realizadas en este trabajo, tanto para At.
ferrooxidans como para At. thiooxidans, dichos valores se presentan en la
tabla 24 junto a los porcentajes de solubilización. Dado que la mayor
solubilización ocurre en los primeros 3 días se calculó la velocidad en este
periodo y, por ello, se presenta el porcentaje de solubilización a los 3 días y
al final del proceso (día 14).
Si se realiza la comparación entre los resultados obtenidos se observa
que las constantes de velocidad obtenidas en este estudio son siempre
menores a las obtenidas en el experimento con lodos. Este hecho se debe
principalmente a que en ocasiones la cantidad de metal dispuesta para
solubilizar es mayor, el compuesto de cromo empleado para el estudio de
solubilización en el presente trabajo destaca por su baja solubilidad incluso
en condiciones ácidas extremas y, por otra parte, el cultivo empleado por
Villar y colaboradores se constituye de un consorcio de bacterias azufreoxidantes aislado del propio lodo y, por tanto, habituadas a la presencia de
los metales existentes en el lodo. En cuanto al porcentaje de solubilización,
sólo en el caso del zinc, se obtienen valores similares a los encontrados por
Villar y col. (2001), la insolubilidad del óxido de cromo y una mayor cantidad
de níquel suplementada en el presente trabajo dan lugar a unos
porcentajes mucho más bajos. El grado de solubilización obtenido coincide
con los resultados presentados por otros autores (Chen y Lin, 2000; Xiang y
165
RESULTADOS
col. 2000; Krebs y col. 2001), de tal forma que la solubilización es mayor para
el ion zinc, en menor extensión para níquel y luego para cromo, el cual
muestra mucha resistencia a la biolixiviación.
At.
ferrooxidans
Experiencia
Cr20
Metal
día 14
k(d-1 )
día 3
día 14
0,002
1,2
1,25
0,0015
1,06
1,38
0,0023
1,68
1,73
0,0016
1,62
1,86
0,051
16,5
22,07
0,051
15,96
21,74
0,055
16,65
18,42
0,077
21,98
24,48
0,472
76,56
80,81
0,391
70,25
78,38
0,182
43,16
48,63
0,127
32,95
43,05
Cr
0,027
0,93
0,98
0,0018
1,29
1,31
Ni
0,0504
16,36
25,71
0,046
16,55
25,54
Zn
0,432
74
76,94
0,426
73,43
78,81
Cr
0,003
1,53
1,51
0,0027
1,31
1,36
Ni
0,583
18,98
22,62
0,069
21,62
24,28
Zn
0,187
44,38
53,25
0,138
35,1
55
Cr
Ni
Zn
Zn50
M20
M50
% solubilización
día 3
Ni50
Zn20
At.
thiooxidans
k(d-1 )
Cr50
Ni20
% solubilización
Tabla 24: Constante y porcentaje de solubilización de cada uno de los metales para las
distintas experiencias de solubilización con At. ferrooxidans y At. thiooxidans.
Hasta el momento se ha estudiado el comportamiento de las
bacterias con los metales presentes en forma de compuestos insolubles en
el medio de crecimiento, sin embargo, para acercarnos un paso más a la
configuración de un suelo o lodo contaminado real, es necesario que estos
sulfuros se encuentren confinados en una matriz sólida. En este sentido, se
realizó un estudio en el que se preparó una arena contaminada con los
mismos compuestos metálicos en la misma proporción que los experimentos
anteriores y, ésta se agregó al medio de cultivo de ambas cepas para el
seguimiento de la solubilización.
La primera consecuencia de la adición de arena es el aumento del
pH inicial en torno a 2,5 - 3, sensiblemente superior a las experiencias
166
RESULTADOS
realizadas sin la presencia de arena. Además, transcurridos 3 días de
incubación, se produce la solubilización de algunos componentes de la
arena ya que se registra una alcalinización del medio y el pH se sitúa en un
rango de entre 7 y 8,5. En estas condiciones, nos encontramos añadiendo
una variable adicional y las bacterias no pueden crecer ni realizar su
actividad oxidativa debido a su carácter acidófilo. Por tanto, no se observó
ningún tipo de solubilización de los iones metálicos presentes. Los resultados
indicaron la imposibilidad de poder solubilizar los compuestos metálicos
tomados empleando arena como soporte. Se puede pensar que un mayor
tiempo de contacto entre bacteria y metal podría llevar a la acidificación
del medio para bajas concentraciones de metal.
Por tanto, se puede concluir que la solubilización de metales en
forma de compuestos insolubles, tanto libres como alojados en una matriz
de un soporte (como la arena) que puedan interferir en la actividad
metabólica de estas bacterias, sería más conveniente realizarlo de forma
indirecta, es decir, creciendo el cultivo de las bacterias en su medio de
crecimiento óptimo con azufre como fuente de energía. A continuación, se
utiliza el medio ácido generado en el metabolismo microbiano para ponerlo
en contacto con el residuo sólido donde se encuentre el metal objeto de
lixiviación.
167
RESULTADOS
1.2 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON At.
thiooxidans EN CONTINUO
Para el estudio de solubilización de cromo, níquel y zinc por la acción
de At. thiooxidans en continuo se empleó un cultivo de este microorganismo
crecido en un reactor de tanque agitado y cuyo medio, una vez alcanzado
un pH igual a 1, se hacía pasar a través de una columna de lecho fijo con
una arena contaminada por estos metales. El sistema empleado se muestra
en la figura 31.
Figura 31: Sistema empleado para la solubilización continua de una arena contaminada de
Cr(III), Ni(II) y Zn(II) mediante el medio ácido generado por At. thiooxidans crecido en cultivo
sumergido.
Inicialmente, el crecimiento de At. thiooxidans (figuras 32 y 33) en
cultivo sumergido se mantuvo 3 días en régimen discontinuo hasta alcanzar
un pH de 0,99 (800 Mcel/ml, 0,23 g H+/l, 15,5 g SO4=/l) y, a partir de ese
168
RESULTADOS
momento, se comenzó a trabajar con alimentación continua. Inicialmente
se estableció un caudal de 12 ml/h, que resultó muy bajo, y provocó gran
inestabilidad en el cultivo, de forma que se llegaron a alcanzar valores de
pH por debajo de 1 y grandes fluctuaciones en la población celular. Sin
embargo, a partir de los 12 días, el pH del cultivo se estabilizó en un valor
próximo a 1 y una población de 300 Mcel/ml, para un caudal de 15 ml/h
(THR 2,2 días). Esta situación se mantuvo, hasta que la población subió en el
día 30 de operación hasta un valor de 700 Mcel/ml, sin que hubiese ningún
otro cambio aparente, posiblemente por una adaptación del cultivo a las
condiciones de operación. De cualquier forma, esta nueva situación
termina en un nuevo estado estacionario que resulta adecuado para el
objetivo que se persigue en esta experiencia. En ambos casos, se puede
observar que se trabaja en régimen de estado estacionario, ya que el resto
de parámetros (concentración de sulfato y protones) también permanecen
en valores casi constantes durante los períodos anteriormente reseñados.
1600
2.5
1400
Mcel/ml
1000
1.5
800
1
600
400
pH
2
1200
0.5
200
0
0
0
10
20
30
40
Tiempo (días)
Mcel/ml
pH
Figura 32: Seguimiento de la población bacteriana y el pH en el reactor de At. thiooxidans.
169
[SO4=] g/l
20
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
15
10
5
0
0
10
20
30
[H+] g/l
RESULTADOS
40
Tiempo (días)
[SO4]
[H+] g/l
Figura 33: Seguimiento de la concentración de sulfato y de protones en el reactor de At.
thiooxidans.
El medio ácido generado en este reactor se empezó a circular a
través de la columna una vez alcanzado el estado estacionario en el
reactor de At. thiooxidans. Inicialmente, el lixiviado obtenido presentó un pH
básico debido a la alcalinidad de la arena, y a medida que fue pasando el
medio ácido por el lecho se produjo la neutralización de los compuestos del
residuo hasta alcanzar un pH menor a 1, cuando se había obtenido un
volumen de lixiviado de 600 ml.
De esta forma, mientras el lixiviado obtenido fue básico, no se
observó solubilización alguna de zinc, sin embargo fue más significativa para
el níquel, alcanzando su concentración máxima, y también se observó
solubilización del cromo (figura 34). Una vez que el pH fue menor a 2, se
incrementó considerablemente la lixiviación del zinc, alcanzándose una
concentración máxima de 186,8 ppm. Pasados 5 litros de medio ácido, la
cantidad lixiviada de este metal fue insignificante.
170
9
140
8
120
7
100
6
80
5
60
4
40
3
2
20
1
0
0
[Zn(II)]
[Cr(III)], [Ni(II)] y pH
RESULTADOS
-20
0
2
4
6
8
10
12
Volum en de liviviado (l)
[Cr(III)]
[Ni(II)]
pH
[Zn(II)]
Figura 34: Concentración de los iones metálicos en el volumen de total de lixiviado.
En este período de solubilización de zinc, se solubilizó una pequeña
fracción de cromo y níquel que permanecieron prácticamente constantes
en un rango entre 1-3 ppm. Cuando el volumen de lixiviado obtenido
alcanzó los 4,5 litros se registró un incremento notable de la lixiviación de los
tres metales estudiados. Este hecho no se observó en otros experimentos
posteriores de solubilización continua llevados a cabo en este trabajo, con
el mismo tipo de residuo aunque en distintas condiciones de producción de
ácido y cantidad de metal. Por tanto, esta anomalía pudo deberse a que la
compactación de la arena hizo que se formaran caminos preferenciales del
medio ácido a través del lecho, de modo que, a partir de un momento, al
producirse
la
solubilización
de
algunos
compuestos
se
redujo
la
compactación del lecho facilitándose así el contacto del medio ácido con
otra porción aún muy rica en metal y, por tanto, la lixiviación de una gran
proporción del metal presente. Este comportamiento viene a resaltar la
necesidad de una adecuada homogeneización previa del residuo a tratar
para evitar cambios indeseables en el proceso de solubilización.
171
RESULTADOS
En la última fase del proceso se registró la lixiviación del cromo,
principalmente, ya que es el metal que aun quedaba en mayor cantidad,
la concentración máxima de este metal en el lixiviado se mostró una vez
obtenidos 4,5 litros de lixiviado.
Finalmente, y tras hacer pasar 11,4 litros de medio ácido se obtuvo
una elevada solubilización de todos los metales: 55,4% de Cr(III), 100% de
Ni(II) y 100% de Zn(II).
Como se puede observar, el procedimiento seguido es adecuado
para llevar a cabo la solubilización de los metales estudiados cuando éstos
se encuentran presentes en medios contaminados, pero esto implica el
consumo de un elevado volumen de ácido y, para ello, el mantenimiento
de un cultivo de bacterias azufre-oxidantes en continuo durante unos 40
días. Cabe resaltar que, en la etapa final del proceso la cantidad de metal
solubilizado fue bastante baja a pesar del volumen de ácido invertido en el
proceso. Por tanto, habría que llegar a una situación de compromiso entre
la cantidad de metal solubilizado y el consumo de medio ácido de modo
que el proceso resulte viable, siempre que se consiga un residuo con
concentraciones permitidas por la legislación con el menor consumo de
medio ácido posible.
En este punto, sería necesario realizar una valoración técnica y
económica del proceso de solubilización continua de los metales presentes.
Por un lado, estimar económicamente el medio ácido necesario para llegar
a los niveles de solubilización deseados y establecer una comparación
respecto a la utilización de ácido obtenido por vía química, para
determinar la viabilidad económica del proceso. Por otro lado, habría que
estudiar la componente ambiental del proceso, de tal forma que se pueda
valorar la incidencia sobre el medio ambiente de un medio ácido generado
por un proceso biológico frente a un medio ácido mineral. De cualquier
172
RESULTADOS
forma, este aspecto se escapa de los objetivos planteados en este trabajo y
sería necesario realizar un estudio más detallado que permitiera llegar a
conclusiones adecuadas.
En general, la obtención biológica de ácido sulfúrico a partir de una
fuente relativamente barata, el azufre elemental, resulta económicamente
favorable frente al tratamiento con soluciones concentradas de ácido
sulfúrico, ya que se reducen los costes de obtención y transporte del ácido
y, a su vez, su impacto ambiental. Además, el pH en el medio de
crecimiento de la bacteria desciende gradualmente, de modo que, los
metales presentes en el medio pasan a solución a diferentes velocidades en
función de sus solubilidades, permitiendo así ser separados de la solución de
forma selectiva.
Al mismo tiempo, en este proceso se ha utilizado un reactor continuo
con la biomasa en suspensión y sería más adecuado, para favorecer la
generación de medio ácido por parte de las bacterias azufre-oxidantes, la
inmovilización de las bacterias en un soporte inerte, ya que esta operación
permite una mayor concentración de la población celular, un menor riesgo
de lavado celular, por lo que se puede trabajar a mayores velocidades de
dilución, y una menor influencia de los cambios de las condiciones externas
sobre el crecimiento del cultivo.
173
RESULTADOS
2 REDUCCION DEL Cr(VI)
2.1 EXPERIENCIAS DE REDUCCIÓN DEL Cr(VI) EN
DISCONTINUO
Como ya se ha reseñado en los antecedentes de la presente
memoria, en aquellos residuos que se encuentra contaminación por cromo
éste suele estar presente tanto en forma hexavalente como trivalente. Por
tanto, dada la alta toxicidad que presenta la primera de las formas
mencionadas se hace necesario disponer de algún tratamiento que
permita la reducción del Cr(VI) a Cr(III) para su posterior eliminación del
residuo contaminado. En este sentido, y aprovechando la habilidad que
tienen las bacterias acidófilas del género Acidithiobacillus para tolerar y
reducir el cromo hexavalente, se programaron una serie de experiencias
con Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans para
determinar los niveles de tolerancia a este iónde estas bacterias en régimen
discontinuo y, posteriormente, se aplicó esta propiedad para el tratamiento
de un residuo de cromo en régimen continuo.
Para estudiar la tolerancia al cromo (VI) y la capacidad de reducción
de este ión por parte de las bacterias azufre-oxidantes, se cultivó a At.
ferrooxidans y At. thiooxidans en presencia de varias concentraciones de
cromo hexavalente (1, 2,5, 5 y 10 ppm), mediante la adición de una
disolución de dicromato potásico. Al mismo tiempo, se preparó un control
estéril con una concentración de 10 ppm de este ión metálico para su
comparación con los cultivos bacterianos y poder discernir la posible
influencia de un mecanismo químico de reducción. Durante toda la
experimentación se siguió la evolución del pH, la concentración de
biomasa total y la concentración de cromo (VI) en solución.
174
RESULTADOS
Analizando el comportamiento de At. ferrooxidans frente a las
distintas concentraciones de cromo (VI) (figura 35), se puede observar que
la presencia de concentraciones menores de 5 ppm de Cr (VI) no afectan
significativamente al crecimiento microbiano, de tal forma que se pueden
alcanzar concentraciones microbianas similares al cultivo control sin
presencia de metal. Así, para una concentración mayor de 5 ppm se
observa un cierto grado de inhibición (se alcanza un 70% menos de
concentración bacteriana), aunque sí es posible registrar un alto grado de
reducción del Cr(VI) con un desfase de 48 horas respecto a las
concentraciones menores ensayadas. En presencia de 10 ppm de cromo
(VI), no se observa crecimiento celular y el pH permanece constante, lo cual
indica inhibición total de la actividad bacteriana, ya que no se observó
aumento de la concentración de protones en el medio y, por tanto,
oxidación del azufre suplementado.
Para las menores concentraciones ensayadas (1 y 2,5 ppm) se
registró una reducción completa del Cr(VI) en 24 horas, y hasta que no se
reduce todo el cromo no se observa descenso del pH, debido a la
oxidación de azufre y, por tanto, un aumento del crecimiento bacteriano.
Este hecho coincide con el observado por Sisti y col. (1998), quienes
recogen este hecho experimental, de tal forma que el crecimiento
bacteriano se empieza a detectar de forma considerable cuando
desaparece la presencia del cromo (VI) y comienza el mecanismo de
oxidación del azufre coloidal presente en el medio de cultivo.
Todos los experimentos realizados se detuvieron tras 11 días de cultivo,
bien porque se registró un descenso acusado del pH para aquellos que
habían conseguido la reducción del cromo (VI), o bien porque no se registró
actividad microbiana tras este tiempo de cultivo.
175
RESULTADOS
(a) pH
6
Af
pH
5
Af1
4
Af2,5
3
Af5
Af10
2
C10
1
0
0
2
4
6
8
10
12
(b) Población bacteriana
1200
Mcel/ml
1000
800
600
400
200
0
0
2
4
6
8
10
12
(c) Concentración de Cr(VI)
12
[Cr(VI)] (ppm)
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
Figura 35:Evolución del pH (a), población bacteriana (b) y concentración de Cr(VI) (c) pra
At. ferrooxidans
176
RESULTADOS
Cabe resaltar que no se produce reducción del cromo (VI) de tipo
químico ya que el cultivo estéril a 10 ppm de este metal, se mantuvo en los
niveles iniciales y además no registró descenso del pH.
Esta misma experiencia se realizó con At. thiooxidans
y la
representación de cada uno de los parámetros medidos se recoge en la
figura 36. A diferencia de los cultivos con At. ferrooxidans, se puede observar
que At. thiooxidans es un poco más sensible a la presencia de cromo (VI),
ya que aunque para el cultivo con la menor concentración se puede
registrar un comportamiento similar al observado para At. ferrooxidans, con
una reducción total y crecimiento similar, para las concentraciones
superiores se observa un comportamiento distinto. De esta forma, para una
concentración de 2,5 ppm de Cr(VI) se observa una fase de latencia de 96
horas, a pesar de que se puede conseguir la reducción completa del cromo
(VI) a las 24 horas de cultivo.
At. thiooxidans es inhibido notablemente por 5 ppm de Cr(VI), ya que
se puede observar una reducción inicial del 50% de la concentración a las
48 horas del cultivo, manteniéndose prácticamente constante en este nivel
hasta los 11 días de cultivo. Al mismo tiempo, no se observó un crecimiento
celular significativo, ni tampoco un descenso en el valor del pH. Por tanto, se
puede decir que, aunque la población bacteriana inicial del cultivo tiene
capacidad de reducción del cromo (VI) presente, no es capaz de continuar
dicha reducción hasta el 100% porque se encuentra inhibido el crecimiento
microbiano por la presencia del metal. Este misma discusión sería aplicable
al cultivo con 10 ppm de cromo (VI), ya que se registra un leve descenso de
la cantidad de cromo (VI) a las 24 horas de cultivo, pero no se detectó
crecimiento microbiano alguno debido a la inhibición completa de la
actividad bacteriana que se mantiene constante durante todo el tiempo de
cultivo.
177
RESULTADOS
(a) pH
5
At
4
At1
At2,5
pH
3
At5
At10
C10
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
(b) Población bacteriana
1000
Mcel/ml
800
600
400
200
0
0
2
4
6
8
10
12
(c) Concentración de Cr(VI)
12
[Cr(VI)] (ppm)
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
Figura 36: Evolución del pH. (a), población bacteriana (b) y concentración de Cr(VI) (c) para
At. thiooxidans
178
RESULTADOS
Por tanto, a la vista de los resultados obtenidos en estos experimentos,
se puede concluir que ambas especies bacterianas tienen una respuesta
similar a la presencia de este ión aunque no presentaron igual nivel de
tolerancia. Los datos obtenidos se resumen en la tabla siguiente:
% Cr(VI)
Tiempo
reducido
(días)
Af1
100
1
Af2,5
100
1
Af5
100
2
Af10
32,69
11
At1
100
1
At2,5
100
1
At5
64,7
11
At10
16,53
11
C10
1,53
11
Experiencia
Tabla 25: Porcentaje de reducción del Cr(VI) para At. ferrooxidans y At. thiooxidans y tiempo
empleado para obtener el nivel de reducción indicado
En el trabajo llevado a cabo por Quintana y col. (2001) se estudió la
reducción de una solución de 10 ppm de Cr(VI) a partir del medio
generado por un cultivo discontinuo de At. ferrooxidans. El proceso se realizó
de forma indirecta, sin poner en contacto la bacteria con el cromo
hexavalente, los compuestos reductores generados y adheridos al azufre
coloidal se hicieron pasar sobre la solución de cromo(VI). Este modo de
trabajo permitió una mayor reducción, obteniéndose para pH 2 una
reducción del 45%.
En un estudio realizado por Viera y col. (2003) de forma similar pero en
este caso con At. thiooxidans, se obtuvo la reducción de aproximadamente
el 60% del cromo(VI) para una solución de 10 ppm. No obstante, el volumen
de disolución tratada en cada caso fue de 5 y 20 ml respectivamente, con
lo que la cantidad total de cromo reducido es menor que en el presente
179
RESULTADOS
trabajo, pero, por otra parte, estos estudios presentan como ventaja el poco
tiempo de contacto necesario para llevar a cabo estos niveles de
reducción, que fue tan sólo de unos minutos.
Los resultados encontrados en la bibliografía acerca de la reducción
de forma indirecta del cromo (VI) con el medio generado por la bacterias
del género Acidithiobacillus, así como la baja tolerancia de estas bacterias
al cromo hexavalente hace pensar en la conveniencia de diseñar procesos
de reducción de este ión de forma indirecta, donde se puedan aprovechar
la capacidad para generar compuestos reductores y para reducir este ión
de dichas bacterias sin dañar su metabolismo celular. Con dicho objetivo, se
procedió al desarrollo de un sistema en régimen continuo y de contacto
indirecto entre el medio generado por las bacterias y el concentrado de
cromo.
180
RESULTADOS
2.2 REDUCCIÓN DE Cr(VI) Y SOLUBILIZACIÓN DE
Cr(III) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN
CONTINUO
El objetivo de esta experiencia fue aplicar la capacidad de las
bacterias azufre-oxidantes para reducir el Cr(VI) a Cr(III), y, a su vez,
solubilizar el Cr(III), presente en forma insoluble, de un residuo operando en
régimen continuo. El sistema empleado se muestra en la figura 37.
Figura 37: Sistema empleado para la reducción de Cr(VI) y solubilización de Cr(III) de un
residuo por la acción de At. thiooxidans inmovilizado sobre azufre elemental.
Para llevar a cabo este proceso se inmovilizó At. thiooxidans sobre
azufre elemental siguiendo el proceso descrito en la sección de Material y
Métodos de esta memoria. El uso de esta bacteria permite la producción de
181
RESULTADOS
un medio con mayor concentración de protones y en menor tiempo que At.
ferrooxidans, lo cual resulta ventajoso para la solubilización del Cr(III).
Se inoculó al 10% el medio 0K presente en la columna con un cultivo
At. thiooxidans en la fase exponencial de crecimiento y se realizaron varios
ciclos de inmovilización para asegurar una elevada concentración celular.
La finalización de cada ciclo se estableció cuando el pH en el reactor
alcanzó un valor próximo a 1, momento en el que se renovó el medio.
Después de varios ciclos de inmovilización, se consideró que la formación
de la biopelícula era estable cuando la concentración de protones y la
población celular en suspensión permanecieron constantes tras cada ciclo.
Los intervalos de tiempo en los que no se estuvo incorporando
alimentación a la columna, se trabajó en régimen discontinuo con
recirculación del medio para proporcionar homogeneidad y favorecer el
acceso del medio a todas las partículas de azufre contenidas en ésta.
En la figura 38 se presentan los valores de pH y población celular
durante toda la etapa de inmovilización. Como se puede observar, se
necesitaron 250 horas de operación para alcanzar una población celular
estable cercana a los 300 Mcél/ml en la columna. Alcanzado el estado
estacionario, se continuó operando por cargas, de tal forma que cuando el
pH era menor o igual a 1, se procedía a la descarga del medio y la carga
posterior con medio 0K hasta conseguir nuevamente un pH de 1
182
RESULTADOS
2,5
350
300
2
200
1,5
150
1
pH
Mcel/ml
250
100
0,5
50
0
0
50
100
150
200
0
300
250
Tiempo (horas)
Mcel/ml
pH
Figura 38: Evolución del crecimiento bacteriano de At. thiooidans inmovilizado sobre
partículas de azufre
El medio descargado de la columna de inmovilización se hizo pasar
por otra columna donde se encontraba un residuo que contenía cromo
trivalente y hexavalente. Los resultados obtenidos en la etapa de
7
16
6
14
12
5
10
4
8
3
6
2
[Cr(VI)] (mg/l)
[Cr(III)] (g/l) pH
reducción/solubilización del cromo se representan en la figura 39.
4
1
2
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0
4500
Volumen de lixiviado (ml)
pH
[Cr(III)] g/l
[Cr(VI)] mg/l
Figura 39 Evolución del pH y concentración de Cr(III) y Cr(VI) en el lixiviado obtenido en
función del volumen de medio ácido pasado a través de la columna de residuo
183
RESULTADOS
Inicialmente el medio ácido provocó dos efectos:
•
Se produjo la disminución de la alcalinidad propia del residuo.
El medio ácido puede solubilizar los compuestos arcillosos que
forman parte del residuo, pero el pH se mantiene en valores
elevados y en estas condiciones no se aprecia solubilización
del Cr(III).
•
La salida presenta una concentración significativa de Cr(VI), y
por tanto, este hecho indica un tiempo insuficiente de
contacto entre el medio y el residuo para que se lleve a cabo
la reducción o bien que la concentración de azufre coloidal y,
por tanto, de compuestos reductores, no fue suficiente para
producir la reducción del Cr(VI).
De esta forma, se puede observar que hasta que el volumen del
medio ácido pasado no superó los 2 litros, se siguieron observando
fluctuaciones en el pH del lixiviado y la concentración de Cr(III) estuvo
siempre por debajo de 10 ppm. Tan sólo en un caso (Vlixiviado = 1030 ml) en el
que se produjo una disminución notable del pH, se observó una lixiviación
importante de Cr(III) (69 mg). Esta disminución es de carácter puntual y
pudo deberse a la acidificación de una zona determinada por el
establecimiento de un camino preferencial del medio.
Por tanto, después de un tiempo de operación bajo estas
condiciones, se concluyó que el régimen por cargas no era el más
adecuado para llevar a cabo la reducción, ya que en aquellos períodos de
tiempo
sin
entrada
de
alimentación,
el
sistema
se
mantenía
en
recirculación, y pudo ocurrir que la poca cantidad de metal que se hubiera
lixiviado por la acción del medio ácido, volviera a precipitar en el residuo.
Este hecho está perfectamente justificado por el equilibrio ácido-base que
184
RESULTADOS
se establece entre el medio ácido y el residuo arcilloso, provocando que el
pH global aumente y no se registre lixiviación apreciable.
Por ello, a partir de los primeros 1900 ml se decidió interrumpir la
recirculación del medio ácido y se comenzó a operar de forma continua
con el medio obtenido directamente de la columna de inmovilización,
siendo el caudal de salida del lixiviado de la columna sensiblemente menor
que el de alimentación para facilitar un tiempo de contacto suficiente para
la solubilización. Una vez detenida la alimentación se mantenía la salida de
efluente hasta vaciar la columna de todo el medio líquido, quedando así
preparado para la siguiente carga.
Con este cambio en el régimen de operación de la columna se
registró una inmediata solubilización de cromo (III) y un descenso
considerable del pH que se mantuvo en un rango entre 1,8-3.
Durante las primeras horas de funcionamiento, las características del
lixiviado estuvieron fluctuando hasta alcanzar unos valores constantes una
vez que el volumen acumulado de medio ácido superó los 3300 ml. En este
momento, la concentración de Cr(III) se mantuvo en torno a los 4000 ppm y
el valor de pH estuvo siempre por debajo de 2,5. Después de hacer pasar 4
litros de medio ácido, se obtuvo un 12% de la solubilización del Cr(III) (5,68
gramos de los 47,1 presentes en el residuo), aunque habría que destacar
que un 8% se obtuvo en los últimos 900 ml recogidos, una vez alcanzada la
composición constante en el lixiviado.
Siguiendo la tendencia obtenida en esta última fase, se puede
realizar una estimación teórica del volumen necesario para lixiviar todo el
cromo presente. En estas condiciones se obtuvo una solubilización media de
421,14 mg Cr(III) / 100 ml de medio ácido, es decir, 4,21 g Cr(III) / L.
185
RESULTADOS
La cantidad de Cr(III) que permanece en la columna sería de:
47,1 g Cr(III) totales – 5,68 g Cr(III) lixiviados = 41,42 g Cr(III) sin lixiviar
que necesitarían:
41,42 g Cr(III) / 4,21 g Cr(III) / L = 9,83 l de medio ácido.
Aproximadamente 10 litros de medio serían necesarios para la
lixiviación del 100% del cromo contenido en el residuo. Se observa que un
volumen similar de medio ácido fue necesario para la solubilización de tan
sólo el 54,6% del cromo presente en la arena en la experiencia de
solubilización continua descrita con anterioridad, a pesar de que la
cantidad de cromo fue menor (se solubilizaron 41mg de 75mg totales). Este
hecho se debe, fundamentalmente, a la distinta solubilidad de los
compuestos de cromo tratados en cada caso. Además se corrobora que
para una mayor concentración de metal se da una mayor solubilización,
como se observó en la etapa de solubilización en discontinuo.
Con respecto a la reducción de Cr(VI), no se detectó la presencia de
este ión a partir de los 2900 ml de lixiviado obtenido, si bien la cantidad de
Cr(VI) acumulada en el lixiviado alcanzó los 11,5 mg de los 157 mg totales, lo
que indica que el 7,34% de Cr(VI) no fue reducido y que, por tanto, se
obtuvo una reducción del 92,66%. Se comprobó que el proceso de
reducción de forma indirecta y continua resulta viable ya que permite una
elevada reducción del cromo hexavalente sin interferir en el metabolismo
celular, y en mayor medida que en las experiencias de contacto indirecta
pero en régimen discontinuo presentadas por Quintana y col. (2001) y Viera
y col. (2003).
186
RESULTADOS
3 PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II)
3.1 ESTUDIO DE TOLERANCIA Y PRECIPITACIÓN DE
Cr(III), Ni(II) y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS EN DISCONTINUO
3.1.1 Estudio con Cr(III)
Para el estudio de la tolerancia de las bacterias sulfato-reductoras al
ion cromo(III) se emplearon las cepas Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio
sp. y se suplementó el medio de crecimiento Postgate C con Cr2(SO4)3 para
obtener las siguientes concentraciones iniciales: 1, 4,5, 9, 12 y 15 ppm de
Cr(III).
El crecimiento bacteriano se vio inhibido para las dos cepas por la
presencia de este metal (figura 40), incluso para la menor concentración
estudiada (1 ppm) la población no alcanzó el máximo de crecimiento
obtenido por la bacteria sin metal (control Dv y Dsp). Además se observó
que, a partir de los siete días, se produce una estabilización de la población.
El descenso de la concentración de sulfato (figura 41) fue paralelo al
crecimiento celular. Los cultivos con mayor crecimiento presentaron un
mayor consumo de este sustrato hasta los siete días, momento a partir del
cual la concentración de sulfato se mantiene prácticamente constante.
La medida de la concentración de cromo(III) soluble en el medio
permitió calcular el porcentaje de cromo precipitado con respecto al
suplementado inicialmente. Estos valores están representados en la figura
42.
A
simple
vista
se
puede
observar
que
el
porcentaje
de
bioprecipitación aumenta a lo largo del tiempo y que la cantidad de metal
precipitado es mayor cuanto mayor es la cantidad inicial, lo cual da lugar a
187
RESULTADOS
mayores
porcentajes
de
precipitación.
De
este
modo,
la
mayor
precipitación ocurre para los cultivos suplementados con 15 ppm de Cr(III) a
los once días, obteniéndose un 24,7 % de precipitación para la cepa pura y
un 24,13% para el cultivo mixto.
(a) Desulfovibrio vulgaris
600
Mcel/ml
500
1 ppm
4,5 ppm
9 ppm
12 ppm
15 ppm
control Dv
400
300
200
100
0
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
(b) Desulfovibrio sp.
700
600
1 ppm
4,5 ppm
9 ppm
12 ppm
15 ppm
control Dsp
Mcel/ml
500
400
300
200
100
0
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
Figura 40:Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en
presencia de cromo(III)
188
RESULTADOS
(a) Desulfovibrio vulgaris
sulfato (ppm)
4000
1 ppm
4,5 ppm
9 ppm
12 ppm
15 ppm
C 15 ppm
control Dv
3500
3000
2500
2000
1500
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
(b) Desulfovibrio sp.
4000
1 ppm
4,5 ppm
9 ppm
12 ppm
15 ppm
C 15 ppm
control Dsp
sulfato (ppm)
3500
3000
2500
2000
1500
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
Figura 41 Consumo de sulfato de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia
de cromo(III).
A los once días, los valores de precipitación son muy similares para
ambos casos, sin embargo, a los tres días, se observa una mayor
189
RESULTADOS
precipitación para el cultivo mixto, lo cual aporta una ventaja en el sentido
del tiempo, ya que en cuatro días se obtiene el 10-15% de precipitación.
(a) Desulfovibrio vulgaris
% bioprecipitación
25
20
15
10
5
0
4
7
Tiempo (dias)
1 ppm
4,5 ppm
9 ppm
12 ppm
11
15 ppm
C 15 ppm
(b) Desulfovibrio sp.
% bioprecipitación
25
20
15
10
5
0
4
7
11
Tiempo (dias)
1 ppm
4,5 ppm
9 ppm
12 ppm
15 ppm
C 15 ppm
Figura 42: Precipitación de cromo(III) con Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp.(b)
Para los ensayos estériles preparados con 15 ppm de Cr(III) se detectó
una precipitación menor del 1%, este hecho permite justificar que no hay
190
RESULTADOS
precipitación en ausencia de microorganismos, y que el compuesto
responsable de la precipitación sólo se produce por un mecanismo
biológico.
Además de la capacidad de precipitación, se puede determinar a
partir de este estudio la tolerancia de las bacterias sulfato-reductoras al ion
Cr(III). El límite de tolerancia está en torno a 15 ppm, ya que a dicha
concentración se observó una importante inhibición del crecimiento y un
descenso de la actividad metabólica con menor consumo de sulfato. A
pesar de ello, se obtuvo una precipitación de Cr(III) que puede justificarse
con la producción de sulfuro. En los estudios con concentraciones mayores
(20 ppm, datos no mostrados) se encontró una alta toxicidad para ambas
cepas, registrándose la muerte celular y la ausencia de actividad
metabólica.
Los valores de tolerancia (15 ppm) son mucho menores que los
obtenidos por Hao y col.(1994), que presentaron un cultivo mixto de
bacterias sulfato-reductoras que tolera 60 ppm de Cr(III). Sin embargo, Viera
y col. (2003) encontraron el mismo nivel de tolerancia para ambos cultivos a
20 ppm de Cr(III).
3.1.2 Estudio con Cr(VI)
Habitualmente, los medios contaminados por cromo presentan
cromo hexavalente junto con el cromo trivalente. Aunque un objetivo de
nuestro estudio es la reducción del Cr (VI) a Cr (III) mediante el trabajo de
las bacterias azufre-oxidantes, puede ocurrir que el lixiviado arrastre cromo
hexavalente si no se ha producido una reducción total. Por ello, parece
interesante estudiar la tolerancia de estas bacterias al ion Cr (VI).
Dado que la cepa mixta en el estudio de precipitación del Cr(III), y
de otros iones, mostró mayor actividad se decidió realizar la experiencia con
191
RESULTADOS
este cultivo. Para ello, se procedió de forma similar a los experimentos
anteriores. Se prepararon 50 ml de medio Postgate C con concentraciones
de 1, 5 y 10 ppm de Cr(VI) y se inóculo al 10% con Desulfovibrio sp. En este
caso, tan sólo se llevó a cabo el estudio de la tolerancia del cultivo mixto a
este ión metálico, por tanto, no se realizó el seguimiento de la
concentración de metal en el sobrenadante. A partir de los resultados
obtenidos de la población celular (figura 43) y el consumo de sulfato (figura
44),
se
deduce
claramente
la
tolerancia
de
Desulfovibrio
sp.
a
concentraciones de 1 y 5 ppm de Cr(VI) aunque se observa una ligera
inhibición si comparamos la evolución de estos dos parámetros para cultivos
suplementados con metal y el cultivo control. Sin embargo, una
concentración de 10 ppm de Cr(VI) resultó tóxica para la célula. Los datos
de tolerancia obtenidos permitieron realizar un estudio posterior con
Desulfovibrio sp. en presencia Cr(VI) y Cr(III) en solución.
1000
900
800
Mcel/ml
700
600
500
control Dsp
400
1 ppm
300
5 ppm
200
10 ppm
100
C 10ppm
0
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
Figura 43: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(VI).
192
RESULTADOS
4000
3500
sulfato (ppm)
3000
2500
control Dsp
2000
1 ppm
5 ppm
1500
10 ppm
C 10ppm
1000
500
0
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
Figura 44: Consumo de sulfato de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(VI.)
3.1.3 Estudio con Cr(III) y Cr(VI)
Estudiada la tolerancia al Cr(III) y Cr(VI) de forma independiente, se
procedió a realizar el estudio de ambos iones en combinación. A partir de
los datos obtenidos, se seleccionaron las concentraciones adecuadas para
llevar a cabo este estudio.
En esta experiencia, al igual que en las anteriores, se dispusieron
botes de vidrio de 50 ml, medio Postgate C suplementado con 15 ppm de
Cr(III) y 1, 2,5 y 5 ppm de Cr(VI). Para ello, se emplearon disoluciones de
Cr2(SO4)3 y K2Cr2O7. Se inoculó al 10% con Desulfovibrio sp. crecido en
Postgate C. Se preparó también un control estéril de 15 ppm de Cr(III) y 5
ppm de Cr(VI) (C15/5) para determinar si se produce precipitación debido
a factores no biológicos. Los ensayos se realizaron por duplicado y el
seguimiento del crecimiento fue muy similar al caso anterior (Figura 45).
193
RESULTADOS
600
Mcel/ml
500
400
300
control Dsp
200
15/1
100
15/2,5
15/5
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tiempo (días)
Figura 45: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(III) y Cr(VI).
La presencia de ambos iones afecta al crecimiento de la bacteria y
al séptimo día se produce el máximo crecimiento celular. El consumo de
sulfato se corresponde de forma directa con el crecimiento de la población
y la precipitación del metal.
En la figura 46 se muestran los porcentajes de precipitación de cada
uno de los ensayos realizados. En esta experiencia, el cultivo mixto se mostró
tolerante a las mayores concentraciones probadas. La respuesta tuvo una
tendencia similar al caso anterior, de tal forma que a mayor concentración
de metal presente en el medio mayor porcentaje de él precipita, este
hecho puede deberse a la posible reducción del Cr(VI) a Cr(III) por parte de
las bacterias sulfato-reductoras, lo cual hace que la cantidad de Cr(III) en
solución aumente y, por ello, se observe una mayor precipitación. De
cualquier modo el porcentaje de precipitación se situa en un valor cercano
al obtenido para 15 ppm de Cr(III).
194
RESULTADOS
30
% bioprecipitación
25
20
15
10
5
0
15
15/1
15/2,5
15/5
C15/5
Figura 46. Porcentaje de bioprecipitación para Desulfovibrio sp. En presencia de Cr(III) y
Cr(VI).
3.1.4 Estudio con Ni(II)
El estudio del efecto del ion Ni(II) sobre las bacterias sulfatoreductoras se realizó añadiendo al medio de crecimiento 1, 4, 8,5, 17 y 30
ppm de Ni(II) a partir de una disolución de sulfato de niquel (NiSO4 · H2O).
La evolución del crecimiento bacteriano se muestra en la figura 47.
La población aumentó de forma significativa hasta los siete días de cultivo y,
a partir de ahí, se produjo una ligera estabilización. Resulta evidente que la
concentración de metal afecta al metabolismo celular de tal modo que,
para ensayos con 17 ppm, el crecimiento fue muy bajo y para 25 ppm no se
observó crecimiento significativo. Se puede decir que la concentración de
25 ppm de Ni(II) resulta tóxica para el cultivo puro (Dv) y el mixto (Dsp) ya
que, además del descenso celular, no se observó consumo alguno de
sulfato.
195
RESULTADOS
(a) Desulfovibrio vulgaris
1200
Mcel/ml
1000
1 ppm
800
4 ppm
8,5 ppm
600
17 ppm
400
25 ppm
Control Dv
200
0
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
(b) Desulfovibrio sp .
1200
Mcel/ml
1000
1 ppm
4 ppm
8,5 ppm
17 ppm
25 ppm
Control Dsp
800
600
400
200
0
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
Figura 47. Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en
presencia de níquel(II)
Al igual que ocurre en ausencia de metal, el cultivo mixto en
presencia de las concentraciones más bajas de metal (1, 4 y 8,5 ppm)
alcanzó una mayor concentración celular que Desulfovibrio vulgaris a las
mismas concentraciones de metal.
196
RESULTADOS
Solo se produjo un consumo de sulfato significativo (Figura 48) en los
casos donde se observó crecimiento celular notable, siendo claramente
mayor el descenso de la concentración de sulfato para el cultivo mixto.
(a) Desulfovibrio vulgaris
4500
1 ppm
4 ppm
8,5 ppm
17 ppm
25 ppm
C 25 ppm
Control Dv
sulfato (ppm)
4000
3500
3000
2500
2000
1500
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
(b) Desulfovibrio sp .
4500
1 ppm
4 ppm
8,5 ppm
17 ppm
25 ppm
C 25 ppm
Control Dsp
sulfato (ppm)
4000
3500
3000
2500
2000
1500
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
Figura 48. Consumo de sulfato de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia
de níquel(II)
197
RESULTADOS
En cuanto a la precipitación de Ni(II) (Figura 49), se observó para
ambos cultivos una precipitación en torno al 65% para los ensayos de 1
ppm, de un 92% para los ensayos de 4 ppm y un 96% para los de 8,5 ppm.
Para el experimento con 17 ppm de Ni(II), se registró una leve precipitación
con el cultivo mixto(<20%), siendo nula para el cultivo puro.
(a) Desulfovibrio vulgaris
% bioprecipitación
120
100
80
60
40
20
0
4
7
11
Tiempo (dias)
1 ppm
4 ppm
8,5 ppm
17 ppm
C 25 ppm
(b) Desulfovibrio sp.
% bioprecipitación
120
100
80
60
40
20
0
4
1 ppm
4 ppm
7
Tiempo (dias)
8,5 ppm
17 ppm
11
C 25 ppm
Figura 49: Precipitación de níquel(II) para Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en
presencia de níquel(II)
198
RESULTADOS
En el cultivo puro se puede observar que la precipitación máxima
que se alcanza para el caso con 1 ppm ocurre en tan sólo cuatro días, pero
los ensayos de 4 y 8,5 ppm mejoraron su precipitación al cabo de los siete
días y este valor se mantiene constante en el siguiente muestreo.
Para el cultivo mixto los resultados de precipitación obtenidos a los
cuatro días alcanzaron un máximo, ya que un mayor tiempo de cultivo no
conlleva un aumento de esta cantidad. Se puede decir que en tan solo
cuatro días, con este cultivo se pueden precipitar 8,5 ppm de Ni(II) casi en
su totalidad.
Ambos cultivos toleran hasta 8,5 ppm, y concentraciones mayores
ralentizan el crecimiento y reducen la capacidad reductora del sulfato de
estas bacterias. El cultivo mixto de bacterias sulfato-reductoras empleado
por Hao y col. (1994) resultó más tolerante a la presencia de ion níquel (1020 ppm)
3.1.5 Estudio con Zn (II)
La experiencia fue realizada suplementando el medio de cultivo
Postgate C con sulfato de zinc (ZnSO4· 7H2O) para obtener unas
concentraciones iniciales de Zn(II) de 5, 7, 10, 15 y 20 ppm.
El crecimiento bacteriano (Figura 50) se ve afectado de una forma
gradual en función de la concentración de metal en el medio, siendo la
fase de latencia mayor a medida que aumenta la cantidad de zinc en
solución. Se puede observar que el cultivo puro (Dv) presenta un
crecimiento similar a los 14 días de incubación para los experimentos con
concentraciones menores de 10 ppm. De igual modo, el cultivo mixto (Dsp)
puede llegar a valores considerables de biomasa para concentraciones por
debajo de 15 ppm, encontrándose una importante inhibición para el caso
de 20 ppm. Este comportamiento vuelve a poner de manifiesto que el
199
RESULTADOS
cultivo mixto tolera mayores concentraciones del metal en solución, como
bien se ha observado con los metales ensayados anteriormente.
(a) Desulfovibrio vulgaris
1000
5 ppm
7 ppm
10 ppm
15 ppm
20 ppm
control Dv
Mcel/ml
800
600
400
200
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tiempo (días)
(b) Desulfovibrio sp .
1200
Mcel/ml
1000
5 ppm
7 ppm
10 ppm
15 ppm
20 ppm
control Dsp
800
600
400
200
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tiempo (días)
Figura 50: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en
presencia de zinc(II)
200
RESULTADOS
Como se observa en la figura 51, el consumo de sulfato se muestra
parejo al aumento de la población. Cabe resaltar que en presencia de
Zn(II) se obtiene mayor población celular y, por tanto, mayor consumo de
sulfato que en presencia de otros iones.
(a) Desulfovibrio vulgaris
5000
5 ppm
7 ppm
10 ppm
15 ppm
20 ppm
C 20 ppm
control Dv
sulfato (ppm)
4000
3000
2000
1000
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tiempo (días)
(b) Desulfovibrio sp .
sulfato (ppm)
5000
5 ppm
4000
7 ppm
10 ppm
3000
15 ppm
2000
20 ppm
C 20 ppm
1000
control Dsp
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tiempo (días)
Figura 51: Consumo de sulfato de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia
de zinc(II)
201
RESULTADOS
Si observamos los porcentajes de bioprecipitación, se puede ver que
el comportamiento de los dos cultivos de bacterias sulfato-reductoras fue
bastante distinto en este caso (Figura 52).
(a) Desulfovibrio vulgaris
% bioprecipitación
120
100
80
60
40
20
0
4
7
11
14
Tiempo (dias)
5 ppm
7 ppm
10 ppm
15 ppm
20 ppm
C 20 ppm
(b) Desulfovibrio sp .
120
% bioprecipitación
100
80
60
40
20
0
4
7
11
14
Tiempo (dias)
5 ppm
7 ppm
10 ppm
15 ppm
20 ppm
C 20 ppm
Figura 52:. Precipitación de zinc(II) para Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b)
202
RESULTADOS
Para el cultivo Desulfovibrio vulgaris con 5 ppm de Zn(II) se alcanzó
una precipitación cercana al 100% tras siete días de incubación y fueron
necesarios 11 días para alcanzar niveles similares en el experimento con 7 y
10 ppm. Para el resto de las concentraciones, tras 14 días de incubación,
sólo el caso de 15 ppm alcanzó una precipitación notable (20%), siendo tan
sólo de un 9% para el cultivo de 20 ppm.
Estos resultados indican que existe una correspondencia entre el
crecimiento del cultivo y la concentración de metal precipitado. De tal
modo que, la cantidad de metal precipitado aumenta en el tiempo hasta
alcanzar un máximo que coincide con el momento en que se supera la fase
exponencial de crecimiento en cada cultivo. Este hecho se corrobora
también para el cultivo mixto, donde a los 7 días se observa el máximo de
precipitación para el cultivo con 5 ppm, a los 11 días, coincidiendo con el
aumento de la población celular, se precipitó el 99-95% del metal de los
cultivos con 7-15 ppm y a los 14 días se obtuvo una precipitación del 93%
para el caso de 20 ppm. La concentración máxima tolerada de zinc (20
ppm) coincide con la obtenida por Utgikar y col. (2001) aunque algo menor
que la presentada por Hao y col. (1994) cuyo cultivo mixto toleró entre 25 y
40 ppm de este ion.
3.1.6 Estudio con Cr(III), Ni(II) y Zn(II)
Una
vez
estudiada
la
tolerancia
de
Desulfovibrio
vulgaris
y
Desulfovibrio sp. a los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) se llevó a cabo un estudio
similar combinando estos metales, por pares y todos juntos. El objetivo de
este estudio es determinar el comportamiento de las bacterias sulfatoreductoras en presencia de una mezcla de iones metálicos, de forma similar
a como ocurriría en un medio natural.
203
RESULTADOS
Las concentraciones seleccionadas de cada metal fueron aquellas
toleradas por ambos cultivos y que presentaron una precipitación
significativa. Con el fin de poder establecer comparaciones, dado que el
estudio con Cr(III) y Ni(II) se realizó hasta los 11 días de incubación se
consideraron los valores correspondientes a este mismo tiempo para los
cultivos con Zn(II) y se establecieron iguales tiempos de muestreo en la
experiencia con combinación de metales.
Se expuso a ambos cultivos a 15 ppm de Cr(III), 8,5 ppm de Ni(II) y 10
ppm de Zn(II). Las combinaciones se denominaron: CrNi, CrZn, NiZn y CrNiZn.
Figura 53: Experiencia de precipitación de los iones cromo, níquel y zinc combinados en un
cultivo de Desulfovibrio vulgaris (11 días).
La evolución de la concentración celular de Desulfovibrio vulgaris
(Figura 54) en presencia de los metales fue similar, el crecimiento fue mayor
cuando los metales se encuentran combinados en parejas que para el
cultivo con cada uno de ellos por separado. La prolongada fase de
latencia del cultivo puro con 10 ppm de Zn(II) no se detecta cuando el
metal se encuentra combinado con alguno más. Los datos de sulfato
(Figura 55) se muestran coherentes con el aumento de la población celular.
204
RESULTADOS
Desulfovibrio vulgaris
Mcel/ml
800
700
Cr
600
Ni
Zn
500
CrNi
400
CrZn
300
NiZn
200
CrNiZn
100
0
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
Figura 54: Crecimiento bacteriano para Desulfovibrio vulgaris en presencia de Cr(III), Ni(II) y
Zn(II).
Desulfovibrio vulgaris
4000
Cr
Ni
Zn
CrNi
CrZn
NiZn
CrNiZn
sulfato (ppm)
3500
3000
2500
2000
1500
1000
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
Figura 55: Consumo de sulfato para Desulfovibrio vulgaris en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II)
En el caso del cultivo mixto (figura 56), el comportamiento es similar,
el crecimiento es mayor cuando se combinan dos metales, que cuando se
205
RESULTADOS
suplementan cada uno de ellos por separado. Se puede observar también
correspondencia entre crecimiento y consumo de sulfato (figura 57).
Desulfovibrio sp.
800
Cr
700
Ni
Mcel/ml
600
Zn
500
CrNi
400
CrZn
300
NiZn
200
CrNiZn
100
0
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
Figura 56: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II).
sulfato (ppm)
Desulfovibrio sp.
4500
Cr
4000
Ni
Zn
3500
CrNi
3000
CrZn
2500
NiZn
2000
CrNiZn
1500
1000
0
2
4
6
8
10
12
Tiempo (días)
Figura 57: Consumo de sulfato de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II).
206
RESULTADOS
Podría pensarse en un efecto de co-precipitación de los metales
cuando se dan condiciones reductoras en el medio, ya que en ausencia de
bacterias, el propio medio no produce precipitación alguna, de tal forma
que los controles realizados con cada una de las combinaciones de metal
posibles no presentaron porcentaje de precipitación mayor del 5%.
En la tabla 26 se muestran los porcentajes de bioprecipitación de
cada metal individual y en combinación para los dos cultivos de bacterias
sulfato-reductoras.
Cepa
Metales
sólo
CrNi
CrZn
Cr(III)
24,7
28,0
29,2
Ni(II)
96,0
94,7
Zn(II)
92,9
Cr(III)
25,5
28,8
Ni(II)
96,1
95,4
Zn(II)
94,7
NiZn
CrNiZn
33,3
Desulfovibrio
100,0
95,1
100,0
100,0
vulgaris
Desulfovibrio
sp.
100,0
32,0
100,0
33,0
100,0
91,4
100,0
100,0
Tabla 26: Porcentajes de precipitación de los iones metálicos solos y en combinación para
Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp.
La cantidad de cromo precipitado aumenta en los ensayos en que se
encuentra combinado, aunque no se alcanzan los valores de precipitación
tan elevados obtenidos para otros metales. Esta mejora puede atribuirse a
una co-precipitación formando compuestos más complejos, aunque esta
presunción tendría que confirmarse mediante la determinación analítica del
precipitado obtenido.
207
RESULTADOS
Las cantidades de níquel y zinc precipitados son bastante similares
cuando se encuentran solos o en combinación, aproximadamente, se
alcanza el 100% de eliminación del metal en solución.
Para llegar a determinar las causas reales de este tipo de
comportamiento, sería necesario programar una nueva batería de
experimentos y profundizar en las técnicas analíticas para llegar a
determinar la naturaleza química de los precipitados obtenidos. Sin
embargo, estos experimentos no se han fijado como objetivos básicos del
trabajo realizado y pueden constituir nuevos trabajos de investigación
dentro de la línea iniciada con este estudio.
Otro de los factores que puede influir significativamente en la
precipitación de los metales en combinación es la respuesta de las
bacterias ante los distintos metales. En este sentido, Utgikar y col. (2001)
presentaron un mecanismo de inhibición de la reducción de sulfato de las
bacterias sulfato-reductoras por la deposición de las partículas del sulfuro
metálico formado sobre la membrana celular, lo que cual impide el acceso
de la materia orgánica y del ion sulfato a las inmediaciones de la célula,
reduciendo así la posibilidad de generar sulfuro y precipitar los iones
metálicos presentes en el medio. En la figura 17 se muestran fotografías
realizadas por microscopía electrónica donde se presenta un cultivo
Desulfovibrio sp. en presencia de una combinación de cromo, níquel y zinc
al inicio de la experiencia y a los 14 días. Se observa claramente la
deposición de precipitados sobre la superficie celular de las bacterias
cuando el proceso está por finalizar.
208
RESULTADOS
Figura 58: Fotografía de microscopía electrónica (x20000) de un cultivo Desulfovibrio sp. en
presencia de cromo, níquel y zinc para tiempo cero(izqda.) y a los 14 días (dcha)
Por tanto, la deposición del sulfuro metálico sobre la superficie celular
puede explicar claramente el descenso de la actividad metabólica de las
bacterias y de la bioprecipitación de los metales estudiados.
209
RESULTADOS
3.2 PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON
BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN CONTINUO
Para el estudio de la precipitación en continuo de los iones Cr(III),
Ni(II) y Zn(II) por la acción de las bacterias sulfato-reductoras se empleó un
reactor de tanque agitado donde se creció un cultivo de Desulfovibrio sp..
Se utilizó el cultivo mixto por presentar una mayor velocidad de crecimiento
y de reducción de sulfato que el cultivo puro, como ya se observó en el
estudio de precipitación discontinua.
Figura 59: Sistema empleado para la precipitación de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) presentes
en un lixiviado artificial por el medio generado por un cultivo Desulfovibrio sp.
El medio obtenido del reactor, rico en sulfuro de hidrógeno, se goteó
sobre un depósito donde se encontraba la solución metálica que había de
210
RESULTADOS
ser precipitada y a la disolución resultante se la denominó como
precipitado. El equipo empleado se muestra en la figura 59.
El reactor de bacterias sulfato-reductoras se mantuvo en régimen
discontinuo durante 2 días (figura 60), a partir de ese momento se trabajó a
caudales crecientes partiendo de 6 ml/h hasta 14 ml/h, caudal que se
establece a los 9 días. El cultivo se mantuvo con una población celular entre
300-500 Mcel/ml y una concentración de sulfato entre 2-2,5 g/l de sulfato a
700
3.0
600
2.5
Mcel/ml
500
2.0
400
1.5
300
1.0
200
100
0.5
0
0.0
0
10
20
30
[SO4=] (ppm)
lo largo de todo el período de experimentación.
40
Tiempo (días)
Mcel/ml
[SO4=]
Figura 60: Evolución de la población celular y la concentración de sulfato en el reactor de
Desulfovibrio sp.
Una vez conseguido el estado estacionario, el efluente del reactor se
introdujo en el reactor de precipitación.
Inicialmente, para evaluar la capacidad de estas bacterias para
precipitar iones metálicos se empleó una disolución a la que denominamos
lixiviado artificial. La solución, de 100 ml, se preparó con sulfato de cromo,
de níquel y de zinc, para obtener una composición final de: 766 ppm de
Cr(III), 376 ppm de Ni(II) y 3521 ppm de Zn(II), cantidades similares a las
211
RESULTADOS
tomadas como referencia en apartados anteriores del estudio. La figura 61
presenta un cuadro resumen de la cantidad de cada uno de los metales
durante el proceso de bioprecipitación.
Formato:
Lixiviado artificial
76,6
37,6
352,1
Lixiviado residual
66,6
32,5
188,3
Fracción
23,1
14,7
0,9 l medio
D. sp.
10
5,1
mg
Ni(II)
mg
Zn(II)
% de precipitación
163,8
13,1
13,6
46,5
Fracción sin tratar
43,5
5 etapas
51,1
Precipitación
mg
Cr(III)
4,51 l medio
D. sp.
17,8
137,2
% de precipitación
Precipitación
0,2
6,1
45
0,87
41,5
88,1
Datos globales
Cantidad de lixiviado
tratada
33,1
19,8
214,9
4,51 l medio
D. sp.
Precipitación
10,2
11,2
% de precipitación
208,8
30,8
56,6
97,2
Figura 61. Cuadro resumen del proceso de precipitación de iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) por
Desulfovibrio sp.
La adición de 900 ml de medio con sulfuro de hidrógeno, procedente
del reactor de crecimiento de las bacterias sulfato-reductoras, alcanzó una
reducción del 13,1% de Cr(III), 13,6% de Ni(II) y 46,5% de Zn(II). Dado que el
precipitado obtenido contenía una gran cantidad de metales en solución,
se tomaron distintas fracciones de esta disolución con el fin de poder llegar
a establecer el límite de precipitación que se puede conseguir bajo esta
metodología. De esta forma, del lixiviado residual que quedó de esta
primera etapa se trataron 23,1 mg de Cr(III), 14,7 mg de Ni(II) y 51,1 mg de
Zn(II) en total, y esta cantidad en solución fue procesada mediante cinco
etapas de precipitación que permitieron llegar a precipitar el 0,87% de
212
RESULTADOS
Cr(III), el 41,5% de Ni(II) y el 88,1% de Zn(II). Si consideramos que una fracción
de la disolución inicial no fue tratada, se puede calcular el porcentaje total
de precipitación respecto a la cantidad de metal procesada, y de esta
forma, se obtuvo un 30,8% de Cr(III), 55,8% de Ni(II) y 97,16% de Zn(II).
Se observa que la mayor precipitación ocurre para el ion Zn(II), como
ocurre en el caso de las experiencias en discontinuo. Este hecho puede
deberse a que la de solubilidad del sulfuro de zinc es menor a la solubilidad
de los demás compuestos en las condiciones en que se encuentra el medio,
con lo cual incluso para concentraciones muy bajas de sulfuro de
hidrógeno se obtiene precipitación de zinc, preferentemente.
De los resultados obtenidos se puede destacar que la mayor
precipitación ocurre cuando las concentraciones de los iones metálicos a
tratar son más elevadas, de modo que la mayor precipitación ocurre en la
etapa
inicial.
Las
últimas
fracciones
del
lixiviado
residual
tratadas
presentaron una precipitación nula o muy baja de cromo y níquel y la
precipitación de zinc se fue haciendo menor a medida que el contenido de
éste en las distintas fracciones iba disminuyendo. En general, se puede
deducir que este proceso no resulta viable para concentraciones
demasiado bajas, ya que implica un elevado consumo del medio generado
por las bacterias sulfato-reductoras. Este hecho se observa claramente en la
segunda parte del proceso, en la cual fueron necesarios más de 4,5 litros
para precipitar tan sólo 0,2 mg de Cr(III), 6,1 mg de Ni(II) y 45 mg de Zn(II).
Por
tanto,
resulta
conveniente
favorecer
la
precipitación
manteniendo unas concentraciones lo suficientemente elevadas en los
lixiviados a tratar como para que la precipitación sea notable con el menor
consumo de medio reductor posible.
213
RESULTADOS
4 INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS
4.1 INMOVILIZACIÓN
DE
BACTERIAS
AZUFREOXIDANTES SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO
Con el fin de obtener una producción de medio ácido suficiente
para realizar el proceso de solubilización de iones metálicos en continuo, se
estudió la conveniencia de inmovilizar las bacterias azufre-oxidantes sobre
un soporte inerte. En este sentido, dada la experiencia de la que se dispone
con la espuma de poliuretano, se procedió al estudio del proceso de
inmovilización de ambas especies bacterianas sobre este soporte.
El procedimiento constó de una primera etapa de inmovilización al
pH óptimo de crecimiento de cada bacteria de forma discontinua en
matraces erlenmeyers con las bacterias en suspensión y un gramo de
unidades cúbicas de espuma de poliuretano. Tras dos ciclos, se empleó
medio 0K ajustado a pH 4, por ser este valor más adecuado para el
incremento de la producción de ácido.
Inicialmente, se observó que las partículas de azufre elemental
suplementadas permanecieron en la superficie del líquido, debido a su
carácter hidrófobo, de modo que se pensó en la incompatibilidad de este
sustrato con el soporte elegido, ya que las bacterias retenidas en el interior
de la espuma difícilmente podrían acceder a la fuente de energía. Sin
embargo, la acción de las bacterias en suspensión hace que la oxidación
del azufre produzca partículas de menor tamaño que difunden fácilmente
en la matriz porosa o se adhieren a su superficie, teniendo lugar este
proceso en las primeras 24 horas (figura 62).
214
RESULTADOS
Figura 62: Cultivo discontinuo a de At. thiooxidans crecido sobre espuma de poliuretano.
El seguimiento de la experiencia se realizó midiendo diariamente el
pH, la concentración de sulfato y la concentración de protones que se
produce. Se fijó como criterio para finalizar un ciclo de inmovilización que el
pH estuviera próximo a un valor de 1; en este momento, se determinó la
concentración de biomasa inmovilizada de acuerdo a la metodología
descrita en el apartado de Material y Métodos de la presente memoria. En
estas condiciones la concentración de protones se encuentra en torno a los
0,25 g/l y la concentración de sulfato en 15 g/l.
En la figura 63 se muestra la evolución del pH a lo largo de los distintos
ciclos de inmovilización para At. ferrooxidans. La etapa de inicial se
compone de dos ciclos de menor extensión ya que al partir de un medio
más ácido (pH 1,8) el valor de pH 1 se alcanza en menor tiempo. Una vez
suplementado con medio 0K a pH 4, se pudo observar una tendencia muy
similar a partir del cuarto ciclo, tanto en la medida de pH como en la
215
RESULTADOS
concentración de los productos de reacción (figura 64), siendo la duración
media de un ciclo de inmovilización de 165 horas. La constancia en los
ciclos respecto del tiempo coincide con el estacionamiento de la cantidad
de bacterias inmovilizadas en un valor de 15 Mcél/mg de soporte (figura 65).
1.9
1.7
pH
1.5
1.3
1.1
0.9
0.7
0.5
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Tiempo (horas)
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
[H+] g/l
[SO4=] g/l
Figura 63:.Evolución del pH en el proceso de inmovilización de At. ferrooxidans sobre espuma
de poliuretano.
0,05
0
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Tiempo (horas)
[SO4] g/l
[H+] g/l
Figura 64: Evolución de la concentración de protones y de sulfato en el proceso de
inmovilización de At. ferrooxidans sobre espuma de poliuretano
216
RESULTADOS
Mcel/mg de soporte
30
25
20
15
10
At. thiooxidans
5
At. ferrooxidans
0
1
2
3
4
5
6
Ciclo
Figura 65: Evolución de la población celular inmovilizada por mg de espuma de poliuretano
en función de los ciclos realizados para At. ferrooxidans y At. thiooxidans.
La tendencia seguida en el proceso de inmovilización de At.
thiooxidans se muestra en las figuras 66 y 67, y cabe destacar que en este
caso, se necesita un menor tiempo para la inmovilización de esta especie
bacteriana. Los dos primeros ciclos fueron similares en extensión a los
observados para At. ferrooxidans, a pesar de que At. thiooxidans parte de
un pH inicial mayor (medio 0K pH 2,5). Una vez que el cultivo es
suplementado con medio a pH 4, la biomasa inmovilizada se establece en
torno a los 24 Mcél/mg de soporte (figura 65) en el cuarto ciclo y la
extensión de los ciclos no supera las 140 horas.
Por tanto, a la vista de los resultados se puede concluir que, tanto At.
ferrooxidans como At. thiooxidans pueden inmovilizarse en espuma de
poliuretano cuando se utiliza azufre elemental como fuente de energía,
siendo dicha inmovilización más efectiva para el segundo de ellos.
Teniendo en cuenta estos resultados y, persiguiendo el objetivo de su
aplicación para la producción de medio ácido, parece más conveniente
217
RESULTADOS
utilizar columnas de At. thiooxidans inmovilizado sobre espuma de
poliuretano.
2.1
1.9
1.7
pH
1.5
1.3
1.1
0.9
0.7
0.5
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Tiempo (horas)
Figura 66: Evolución del pH en el proceso de inmovilización de At. thiooxidans sobre espuma
de poliuretano
18
0.35
16
0.30
0.25
12
10
0.20
8
0.15
6
[H+ ] g/l
[SO4=] g/l
14
0.10
4
0.05
2
0
0.00
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Tiempo (horas)
[SO4] g/l
[H+] g/l
Figura 67: Evolución de la concentración de protones y de sulfato en el proceso de
inmovilización de At. thiooxidans sobre espuma de poliuretano.
218
RESULTADOS
4.2 INTEGRACIÓN
DE
LOS
PROCESOS
DE
SOLUBILIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN EN CONTINUO
La integración de los procesos de solubilización y precipitación en
régimen continuo estudiados se llevó a cabo en el sistema descrito en la
figura 68.
Figura 68: Sistema empleado para la integración de los procesos de solubilización y
precipitación de iones metálicos en continuo.
Para realizar el proceso de solubilización se llevó a cabo la
inmovilización de At. thiooxidans sobre espuma de poliuretano en matraces
erlenmeyers. Tras cuatro ciclos de inmovilización, la espuma colonizada se
incorporó a una columna de lecho fijo a la que se suplementó medio 0K (pH
4) y azufre elemental. Inicialmente, el sistema operó en discontinuo (figura
69) hasta alcanzar un pH igual a 1, comenzando a trabajar en ese momento
en régimen continuo con un caudal de alimentación de 14,5 ml/h. Bajo
estas condiciones de operación, el estado estacionario se estableció para
una población celular inmovilizada de 33 Mcél/mg de espuma.
219
RESULTADOS
14
2
10
1.5
8
pH
[sulfato] (ppm)
12
6
1
4
2
0
0.5
0
4
8
12
16
20
Tiempo (días)
[sulfato]
pH
Figura 69: Evolución de la concentración de sulfato y pH en la columna de At. thiooxidans
El medio ácido generado en la columna de At. thiooxidans se utilizó
como alimentación de otra columna que contenía 50 gramos de una arena
contaminada artificialmente con 75 mg de Cr(III), 50 mg de Cr(VI), 20 mg de
Ni(II) y 200 mg de Zn(II).
El aporte de cromo hexavalente a la arena se realizó con el objetivo
de determinar la reducción del cromo(VI) a cromo(III) mediante los
compuestos reductores obtenidos por la oxidación de azufre elemental por
parte de las bacterias azufre-oxidantes. El primer volumen de lixiviado
obtenido presentó una elevada concentración de cromo (VI). Este hecho
se debe a la elevada solubilidad del dicromato potásico que hace que este
ión se disuelva rápidamente en el medio ácido circulante y abandone con
facilidad la matriz sólida en la que se encuentra y, por otra parte, el tiempo
de residencia del medio fue insuficiente para que se produjese el contacto
adecuado entre los compuestos reductores y el cromo hexavalente. No
obstante, se observó una reducción parcial del Cr(VI), ya que sólo se
detectó la presencia de este ión en el primer lixiviado obtenido el cual
contenía 39,7 mg de Cr(VI) de los 50 mg totales, lo que supone que en los
primeros 210 ml de medio ácido se redujo el 20,6% de este ión. Un aumento
220
RESULTADOS
del tiempo de residencia permitiría el incremento de este porcentaje; de
cualquier modo la proporción de este ion en la arena es mucho mayor a la
que se suele encontrar en los medios contaminados de forma natural.
Después de esta primera etapa de solubilización, el contenido total
de Cr(III) en la arena se vió aumentado por la reducción de Cr (VI) en un
total de 10,3 mg de Cr (III) para pasar a un total de 85,3 mg de Cr(III) totales.
Al igual que en el estudio independiente de solubilización en
continuo, se produce una lixiviación inicial de cromo y níquel (figura 70)
cuando el pH del lixiviado no es muy ácido debido a la alcalinidad del
soporte sólido empleado. Alcanzadas las condiciones ácidas, se muestra
una elevada solubilización del zinc contenido en la arena que se
acompaña por una leve y lenta lixiviación de los otros metales. La figura 71
permite comprobar la evolución de la cantidad de metal lixiviada en
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
Volumen (litros)
[Zn(II)]
[Cr(III)]
4
[Ni(II)]
[Cr(III)], [Ni(II)] y pH
[Zn(II)]
función del volumen de ácido empleado para este proceso.
5
pH
Figura 70: Evolución de la concentración de metales en el lixiviado en función del volumen
de ácido pasado a través de la columna.
221
200
20
150
15
100
10
50
5
0
0
0
1
2
3
4
5
mg Cr(III) y mg Ni(II) lixiviados
mg Zn(II) lixiviados
RESULTADOS
6
Volumen (litros)
mg Zn(II)
mg Cr(III)
mg Ni(II)
Figura 71: Evolución de la cantidad de cada metal solubilizado en función del volumen de
ácido pasado a través de la columna.
En la tabla 27 se presentan algunos valores representativos del
proceso de solubilización y precipitación completo. En la etapa de
solubilización se puede observar que, después de hacer circular por la
columna de residuo 2,4 litros de medio ácido, las concentraciones de los
distintos metales toman valores muy bajos y se ha completado un alto
porcentaje de la solubilización total. En concreto, se solubilizó el 14,62% de
Cr(III), el 26,65% de Ni(II) y el 90,53% de Zn(II). De esta forma, después de
pasar 3 litros más de medio ácido tan sólo se consiguió un aumento del
2,07% del Cr(III), un 6,25% del Ni(II) y un 7,89% del Zn(II). Como se puede
observar, el proceso es más efectivo cuando los metales se encuentran a
mayores concentraciones, por lo que parece adecuado utilizar este
proceso para tratar cantidades similares a las iniciales e ir incorporando
posteriormente más fracciones de residuo con el fin de mantener
concentraciones que permitan unos porcentajes de solubilización elevados.
La baja solubilización del cromo se debe principalmente a dos
motivos, la extrema insolubilidad del compuesto de cromo (III) empleado
222
RESULTADOS
(Cr2O3), lo que hace pensar que la mayor parte del cromo (III) lixiviado
proceda de la reducción del cromo (VI), y la baja densidad del óxido de
cromo que provoca que gran parte de la cantidad aportada a la arena
sea arrastrada por el lixiviado, retirándolo de la arena y eliminando, por
tanto, la posibilidad de ser solubilizado.
Cromo
Níquel
Zinc
mg totales en la arena
85,30
20,00
200,00
mg lixiviados en 2,4 l de medio ácido
12,47
5,33
181,10
% lixiviado del total
14,62
26,65
90,53
medio reductor
0,27
2,88
50,73
% precipitado de 2,4 l de lixiviado
2,17
54,03
28,02
mg lixiviados en 5,5 l de medio ácido
14,24
6,58
196,84
% lixiviado del total
16,69
32,90
98,42
medio reductor
0,29
2,90
54,53
% precipitado de 5,5 l de lixiviado
2,05
44,12
27,70
mg precipitados de 2,4 l de lixiviado con 2,2 l de
mg precipitados de 5,5 l de lixiviado con 4,8 l de
Tabla I1. Datos generales obtenidos en el proceso de solubilización-precipitación.
Los porcentajes de solubilización finales obtenidos por este proceso
son menores a los mostrados para la solubilización con un cultivo At.
thiooxidans en suspensión. No obstante, el volumen de ácido empleado
mediante esa metodología fue mayor (11,4 litros). Para el mismo volumen
consumido en este proceso (5,5 litros), en el caso del cultivo de At.
thiooxidans en suspensión, se obtuvo una solubilización del 39,4% de Cr(III),
88,1% de Ni(II) y 97,7 % de Zn(II) frente al 17% de Cr(III), 34,3% de Ni(II) y 99,3%
de Zn(II) para At. thiooxidans inmovilizado. Como se puede observar estas
223
RESULTADOS
concentraciones fueron más altas para el caso del cromo y níquel pero el
tiempo necesario para alcanzar estos niveles fue de 26 días frente a los 19
días empleados con At. thiooxidans inmovilizado en espuma de poliuretano.
Por tanto, en función del parámetro que deseemos optimizar habría
que decidir de que modo resulta más conveniente operar. De cualquier
modo, si comparamos la cantidad de metal lixiviado en la primera etapa
(2,4 litros), que fue la que resultó más efectiva, con los porcentajes de
solubilización obtenidos para el proceso con At. thiooxidans en cultivo
sumergido, dichos valores fueron menores para el cromo y el zinc y muy
similares para el níquel (5,5% de Cr(III), 27,7% de Ni(II) y 69,9% de Zn(II)). Estos
resultados justifican la inmovilización de las bacterias azufre-oxidantes de
cara a obtener una mayor solubilización de los metales en un menor
tiempo,
siempre
y
cuando
trabajemos
dentro
de
un
rango
de
concentraciones de metales que permita una solubilización significativa.
La siguiente etapa, de precipitación, se realizó de forma similar al
proceso
descrito
anteriormente
en
la
presente
memoria
para
la
precipitación de un lixiviado artificial de cromo, níquel y zinc. Para ello, se
creció un cultivo de Desulfovibrio sp., en un reactor de tanque agitado, en
el cual, tras una primera etapa en cultivo discontinuo se comenzó a trabajar
en régimen continuo con un caudal de alimentación de medio de 12,5
ml/h. Alcanzado el estado estacionario, se operó de forma que el volumen
de medio lixiviado obtenido diariamente de la etapa de solubilización se
empleó como medio para la precipitación, el tiempo de contacto entre el
lixiviado y el efluente rico en sulfuro de hidrógeno procedentes del reactor
de Desulfovibrio sp. fue de 24 horas.
Durante toda la experimentación, el lixiviado obtenido se filtró a
través de una membrana de 0,22
m para retener el óxido de cromo
arrastrado en el proceso de solubilización, con el fin de no interferir en la
224
RESULTADOS
medida de la concentración de metales presentes en el sobrenadante del
precipitado.
De acuerdo con los resultados obtenidos (tabla 27), se puede decir
que el proceso de precipitación es posible para los distintos metales
presentes en el lixiviado, pero al igual que en el proceso de solubilización, la
eficacia
del
proceso
fue
mayor
para
aquellos
lixiviados
con
concentraciones mayores de los metales. De este modo, las distintas
fracciones de lixiviado tratadas en los primeros 2,4 litros obtenidos en el
proceso de solubilización presentaron un porcentaje de precipitación más
alto. En esta primera etapa se registra la mayor parte de la precipitación
total, de tal forma que se puede llegar a precipitar el 2,2% de Cr(III), el 54%
de Ni(II) y 28% de Zn(II) de la cantidad de lixiviado tratada, empleando para
ello 2,2 l de medio reductor. Se observa que, tal como ocurrió en el estudio
anterior, la precipitación de cromo es bastante baja mostrándose una
cierta preferencia por la precipitación de los otros metales.
El elevado porcentaje de precipitación del níquel frente al del zinc, se
debe a que las primeras fracciones presentan una concentración
significativa de níquel y, sin embargo, no se detectó aún la solubilización del
zinc, lo cual hace que el sulfuro de hidrógeno se consuma en la
precipitación del níquel en solución. La baja concentración de metales en
las fracciones de lixiviado tratadas posteriormente, dieron lugar a una baja
precipitación de cromo y níquel, observándose sólo precipitación del ion
zinc.
La etapa final no resulta tan efectiva como era de esperar, ya que, el
tratamiento total del lixiviado obtenido en la etapa de solubilización dio
lugar a la precipitación del 2,1% de Cr(III), 44,1% de Ni(II) y 27,7% de Zn(II)
empleando un total de 4,8 litros de medio procedente del reactor de
bacterias sulfato-reductoras.
225
RESULTADOS
4.3 COMPARACIÓN CON OTRO PROCESO
Finalizado el proceso integrado resulta interesante la comparación
de los resultados obtenidos con un proceso similar. Para ello, se recurrió al
trabajo realizado por White y Gadd (1998), en el cual se propone un
proceso de solubilización y precipitación de un suelo contaminado
artificialmente, y se calcularon una serie de parámetros para hacer posible
dicha comparación. Las tablas 12 y 13 presentan los datos referentes a la
etapa de solubilización y precipitación del proceso integrado llevado a
cabo por estos autores y el realizado en el presente trabajo
Parámetros
Unid.
White y Gadd (1998)
Proceso Integrado
Volumen de trabajo
l
9
0,85
Caudal volumétrico
ml/h
100
15
Velocidad de dilución
d-1
0,267
0,43
Tiempo empleado
d
190
19
Cantidad de residuo tratada
g
8000
50
Volumen de medio ácido
l
456
5,5
Metales estudiados
Cr(III)
Ni(II)
Zn(II)
Cr(III)
Ni(II)
Zn(II)
Concentración del residuo
mg/l
132,0
108,8
141,8
1500
400
4000
Cantidad tratada de metales
mg
1056
870,1
1134
85,3
20
200
Cantidad lixiviada
mg
950,4
817,9
1032,0
14,24
6,58
196,84
% lixiviado
-
90
94
91
16,7
32,9
98,4
Cant. lixiviada/vol. ácido
mg/l
2,08
1,79
2,26
2,59
1,20
35,78
Tabla 12 : Parámetros pertenecientes al proceso de solubilización continua llevado a cabo
por White y Gadd (1998) y en el proceso integrado propuesto en este trabajo.
El proceso de solubilización de White y Gadd (1998) empleaba un
reactor (9 l) suplementado con 8 kg de suelo e inoculado con un cultivo de
bacterias azufre-oxidantes acidófilas y neutrófilas. Dicho proceso se
mantuvo 190 días operando y, para ello, se emplearon 456 litros de medio.
226
RESULTADOS
Como puede observarse, la concentración del residuo tratado fue
mucho menor que en el proceso estudiado en este trabajo, aunque la
cantidad de cada metal tratada fue mayor. Estos autores obtuvieron
porcentajes de solubilización mayores del 90% para todos los metales,
mientras
que
en
el
estudio
detallado
en
la
memoria,
la
mayor
concentración de metales en el residuo y la utilización de una velocidad de
dilución mayor condujeron a unos porcentajes muchos menores en el caso
del cromo y el níquel. No obstante, cabe indicar que el proceso se detuvo
cuando se observó una baja solubilización con respecto al volumen de
ácido empleado pero la experiencia previa de solubilización continua con
At. thiooxidans en cultivo sumergido, permitió asegurarnos que un mayor
volumen de ácido empleado da lugar a la solubilización completa del
níquel y el zinc y una solubilización notable, mayor del 55%, del cromo.
Por otra parte, si comparamos la cantidad de metal solubilizado por
volumen de ácido empleado, en el presente trabajo se obtienen mayores
niveles de solubilización para el cromo y el zinc, destacando este último.
Este hecho viene a coincidir con el efecto observado de mayores
concentraciones en los lixiviados para aquellos casos en los que se parte de
una concentración de metal mayor en el residuo. De cualquier modo, la
menor capacidad de lixiviación en el sistema de White y Gadd (1998) se
puede deber a la forma en que se encuentran integrados los iones
metálicos en el suelo.
La etapa de precipitación llevada a cabo por White y Gadd (1998)
se realizó en un reactor de sedimentación interna con recirculación,
alimentado con lixiviado a 100 ml/h e inoculado con un cultivo mixto
formado por distintas cepas resistentes a los metales y procedentes de
distintos ambientes. La selección del cultivo bacteriano y el diseño del
227
RESULTADOS
reactor para favorecer la precipitación, dieron lugar a una elevada
precipitación de todos los iones.
Los bajos rendimientos obtenidos en el proceso de precipitación
llevado a cabo en el trabajo aquí presentado se corroboran si lo
comparamos con otros procesos como el de White y Gadd (1998), ya que
sólo en el caso del zinc se obtuvo una precipitación significativa con
respecto al volumen de medio procedente del reactor de bacterias sulfatoreductoras, debido a la alta concentración de este metal en el lixiviado.
Este hecho experimental puede deberse a que en este trabajo no se ha
realizado ningún tipo de selección de las bacterias y se ha trabajado con
cepas de colección.
Parámetros
Unid.
White y Gadd (1998)
Proceso Integrado
Volumen de trabajo
l
1
0,8
Caudal volumétrico
ml/h
100
12,5
Velocidad de dilución
d-1
2,4
0,375
Tiempo empleado
d
190
19
Cantidad de residuo tratada
g
8000
50
Volumen de medio D.sp.
l
456
4,8
Metales estudiados
Cr(III)
Ni(II)
Zn(II)
Cr(III)
Ni(II)
Zn(II)
Concentración del lixiviado
mg/l
1,31
1,81
2,49
2,59
1,20
35,78
Cantidad tratada de metales
mg
597,0
828,4
1134
14,24
6,58
196,84
Cantidad precipitada
mg
581,9
664,0
1092,7
0,29
2,90
54,53
% precipitado
-
97,5
80,2
96,4
2,1
44,1
27,7
Cant. precipitada/vol. D. sp.
mg/l
1,28
1,46
2,40
0,06
0,60
11,36
Tabla 13: Parámetros pertenecientes al proceso de precipitación continua llevado a cabo
por White y Gadd (1998) y en el proceso integrado propuesto en este trabajo.
228
E.-CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
•
Las bacterias azufre-oxidantes tienen la capacidad de solubilizar los
iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) presentes en compuestos de carácter
insoluble cuando éstos se encuentran solos y en combinación. En
concreto, operando en régimen discontinuo At. ferrooxidans es
capaz de solubilizar 1,5 % de Cr(III), 22,6 % de Ni(II) y 53,25% de Zn(II) y
At. thiooxidans 1,35% de Cr(III), 24,25% de Ni(II) y 55% de Zn(II) de una
disolución metálica compuesta por 75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y
200 mg de Zn(II) en 100 ml de medio.
•
La presencia de una matriz sólida como la arena en el cultivo
discontinuo de las bacterias azufre-oxidantes provoca alteraciones
en el medio que inhiben la actividad celular y, por tanto, impiden el
proceso de solubilización de compuestos metálicos.
•
El proceso de solubilización en continuo propuesto permite lixiviar los
compuestos metálicos presentes en una arena
contaminada
artificialmente. El crecimiento en continuo de At. thiooxidans en
cultivo sumergido produce un medio de elevada acidez que puede
ser empleado de forma continua como agente lixiviante sobre el
lecho de arena contenido en una columna. Los porcentajes de
solubilización obtenidos haciendo pasar 11,4 l de medio ácido por 50
g de arena (75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II)) fueron
de un 55,4% de Cr(III), 100% de Ni(II) y 100% de Zn(II) del total añadido.
•
Las bacterias azufre-oxidantes tienen la capacidad de reducir el
cromo hexavalente a cromo trivalente mediante la producción de
compuestos reductores obtenidos a partir de la oxidación de azufre
elemental. En cultivo discontinuo, At. ferrooxidans es capaz de reducir
totalmente un cultivo con 5 ppm de Cr(VI) en dos días y el 32,7% de
10 ppm, tras 11 días de incubación. Sin embargo, At. thiooxidans se
muestra más sensible a la presencia de este ion, y sólo es capaz de
231
CONCLUSIONES
alcanzar un reducción del 64,7% de 5 ppm de Cr(VI), tras 11 días de
incubación, y el 16,5% de 10 ppm, encontrándose una elevada
inhibición para esta concentración.
•
La capacidad de reducción del Cr(VI) y de solubilización del Cr(III) de
las bacterias azufre-oxidantes se puede aplicar de forma simultánea
en un proceso continuo con el fin de reducir la toxicidad de un
residuo de cromo (30% de Cr(III) y 0,1% de Cr(VI)). El proceso
diseñado permite la reducción de un 92,66% del Cr(VI) y la
solubilización de un 12% del Cr(III) de un total de 157 g de este residuo
cuando se hacen pasar 4 litros de medio ácido.
•
Las bacterias sulfato-reductoras, Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio
sp., pueden tolerar la presencia de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) y
precipitarlos a partir de compuestos solubles, como sulfatos, cuando
se encuentran solos y en combinación. El cultivo puro (Desulfovibrio
vulgaris) tolera la presencia de 15 ppm de Cr(III), 8,5 ppm de Ni(II) y 10
ppm de Zn(II) alcanzando para dichas concentraciones una
precipitación del 24,7% del Cr(III), 96% del Ni(II) y 92,7% del Zn(II). El
cultivo mixto (Desulfovibrio sp.) tolera la presencia de 15 ppm de
Cr(III), 8,5 ppm de Ni(II) y 20 ppm de Zn(II) obteniéndose la
precipitación en estos casos del 25,5% del Cr(III), 96,1% del Ni(II) y 93%
del Zn(II). Los porcentajes de precipitación de dichos iones son
bastante similares cuando éstos se encuentran en combinación para
los dos cultivos estudiados.
•
El proceso propuesto para la precipitación continua de cromo, níquel
y zinc en solución permite evitar el problema de inhibición y toxicidad
de estos metales sobre la actividad celular de las bacterias sulfatoreductoras. El tratamiento de un total de 33,08 mg de Cr(III), 19,74 mg
de Ni(II) y 214,84 mg de Zn(II) mediante este sistema permite la
232
CONCLUSIONES
precipitación del 30,8% de Cr(III), 56,6% de Ni(II) y 97,2% de Zn(II). Este
hecho hace que sea susceptible de ser empleado para la
precipitación de los metales presentes en las disoluciones obtenidas
en el proceso de solubilización en continuo llevado a cabo por las
bacterias azufre-oxidantes
•
Tanto At. ferrooxidans como At. thiooxidans pueden inmovilizarse en
espuma de poliuretano cuando se utiliza azufre elemental como
fuente de energía, siendo dicha inmovilización más efectiva para el
segundo de ellos. Por ello la producción de medio ácido puede ser
favorecida por la aplicación de esta operación empleando
columnas
de
At.
thiooxidans
inmovilizado
sobre
espuma
de
poliuretano.
•
El proceso de solubilización en régimen continuo resulta más efectivo
cuando el crecimiento de At. thiooxidans se realiza inmovilizando las
bacterias sobre espuma de poliuretano. Este hecho proporciona una
mayor producción de ácido y, por tanto, una mayor solubilización de
los metales si lo comparamos con la solubilización obtenida para un
volumen igual obtenido por At. thiooxidans en cultivo sumergido. Con
5,5 litros de medio ácido se obtuvo la solubilización del 17% de Cr(III),
34,3% de Ni(II) y 99,3% de Zn(II).
•
La adaptación de una etapa de precipitación con las bacterias
sulfato-reductoras al proceso de solubilización en continuo, proceso
integrado, da lugar a la alcalinización de los lixiviados pero la
precipitación de lixiviados de baja concentración metálica fue
insignificante, por lo que esta etapa sólo resulta efectiva cuando se
tratan concentraciones relativamente elevadas permitiendo la
eliminación de los metales en la solución y la acidez típica de este
tipo de medios.
233
CONCLUSIONES
•
El proceso propuesto resulta ventajoso para residuos contaminados
por metales y de características ácidas que puedan ser retirados de
su origen (lodos, aguas residuales) ya que permitiría la posterior
deposición o la reutilización del residuo, pero no sería favorable para
medios naturales contaminados que se deseen recuperar o devolver
a su forma habitual, como suelos o sedimentos, dado que la
transformación de estos medios mediante el proceso desarrollado
daría lugar a características diferentes (pH, conductividad, materia
orgánica, flora bacteriana…) a las originales de estos medios antes
de ser contaminados.
234
F.-BIBLIOGRAFÍA
BIBLIOGRAFIA
• Ahmann D, Roberts AL, Krumholtz LR, Morel FMM (1994) Microbe grows
by reducing arsenic. Nature. 371:750
• Armentia H, Webb C (1992) Ferrous sulphate oxidation using
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