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“ESTUDIO DE PROCESOS PARA LA SOLUBILIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN DE IONES METÁLICOS CONTAMINANTES MEDIANTE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES Y SULFATOREDUCTORAS” UNIVERSIDAD DE CÁDIZ FACULTAD DE CIENCIAS Departamento de Ingeniería Química, Tecnología de Alimentos y Tecnologías del Medio Ambiente Gema Cabrera Revuelta Mayo, 2005 “ESTUDIO DE PROCESOS PARA LA SOLUBILIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN DE IONES METÁLICOS CONTAMINANTES MEDIANTE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES Y SULFATOREDUCTORAS” Memoria presentada por la Licenciada Gema Cabrera Revuelta para optar al grado de Doctor por la Universidad de Cádiz Fdo: Gema Cabrera Revuelta Puerto Real, Mayo de 2005 La presente Tesis Doctoral ha sido co-dirigida por los Doctores D. Domingo Cantero Moreno, Catedrático de Ingeniería Química y D. Jose Manuel Gómez Montes de Oca, Profesor Titular de Ingeniería Química de la Universidad de Cádiz, y cumple los requisitos exigidos por la legislación vigente. Fdo: Dr. D. Domingo Cantero Moreno Fdo: Dr. D. José Manuel Gómez Montes de Oca Fdo.: Dr. D. José María Quiroga Alonso Director del Dpto. de Ingeniería Química, Tecnología de Alimentos y Tecnologías del Medio Ambiente Universidad de Cádiz Después de este largo camino siento la necesidad de dar las gracias a todas las personas que de alguna manera han contribuido para que esto sea posible: - Al Prof. Domingo Cantero Moreno, por brindarme la oportunidad de pertenecer a su grupo de investigación y permitirme estrenar la línea de Biorremediación. Su experiencia y su capacidad de crítica me han ayudado a creer en mi trabajo. - Al Prof. José Manuel Gómez Montes de Oca, por su entrega, su confianza, su disponibilidad y su eficacia, en realidad es difícil destacar sólo algunas de sus cualidades. Gracias Tete, por tu calidad humana y por saberme hacer poner los pies en la tierra. Tengo suerte de trabajar contigo. - Al Prof. Edgardo Donati, le agradezco su acogida, su disponibilidad y todo lo que he aprendido durante las estancias que realicé en su país, vos sabés que es mucho. Gracias por haberme dado la oportunidad de conocer y trabajar con tus chicas, a ellas gracias también. - A mis compañeros del departamento, cada acontecimiento que ocurre es, sin duda, fruto del trabajo de todos. Gracias por lo que me aportáis día a día. A mis padres, a mis hermanos y a Elsa A Jose, por todo lo que me quieres, por todo lo que te quiero. Querer es poder INDICE A.-INTRODUCCIÓN………….……………………………..………………. 1 B.-ANTECEDENTES………..………………...……………………………….. 7 1 9 CONTAMINACIÓN POR METALES PESADOS………...…..………………… 1.1 METALES PESADOS: TOXICIDAD Y TÉCNICAS DE REMEDIACIÓN………………………………………………………… 9 1.1.1 TÉCNICAS DE REMEDIACIÓN……………………….………………….. 12 1.1.1.1 Técnicas de contención………………..…………………….. 13 1.1.1.2 Técnicas ex-situ……………………………………………….…. 14 1.1.1.3 Técnicas in-situ…………………………….…………………….. 15 1.2 MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS……………………… 16 1.2.1 TÉCNICAS DE BIORREMEDIACIÓN…………………………………….. 18 1.2.1.1 Técnicas de movilización………………………….………….. 18 1.2.1.2 Técnicas de inmovilización……………….…………………... 20 1.3 RESIDUOS DE LA INDUSTRIA DE GALVANIZADO……….………… 21 1.4 CARACTERÍSTICAS Y TOXICIDAD DE LOS METALES 2 ESTUDIADOS…………………………………………………………… 26 1.4.1 CROMO……………………………………………………………………. 27 1.4.1.1 Características………………………………………………….. 27 1.4.1.2 Toxicidad…….…………………………………………………… 29 1.1.2. NÍQUEL……………………………………………….……………………. 30 1.1.2.1. Características………….……………………………………….. 30 1.1.2.2. Toxicidad……………………….………………………………… 32 1.4.2 ZINC………………………………………………………………………… 34 1.1.3.1. Características……….…….…………………………………… 34 1.4.2.1 Toxicidad……………….………………………………………… 35 1.5 LEGISLACIÓN SOBRE METALES PESADOS…………………….…… 36 BIOLIXIVIACIÓN CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES…………..… 43 2.1. BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES……………………………………. 44 INDICE 2.2. BACTERIAS AZUFRE OXIDANTES…………………..………………… 45 2.1.1 CARACTERÍSTICAS DE Acidithiobacillus ferrooxidans Y Acidithiobacillus thiooxidans……………………………………….….. 46 2.2 MECANISMOS INVOLUCRADOS EN LA BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES SULFURO…………………………..………………………. 49 2.2.1 MECANISMO DIRECTO………………………………….……………….. 49 2.2.2 MECANISMO INDIRECTO…………………………….………………….. 50 2.2.3 DISCUSIÓN DE LOS MECANISMOS…………………….………………. 52 2.3…FUNCIÓN DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN LA LIXIVIACIÓN DE MINERALES SULFURO………………..…………… 55 2.4 ADHESIÓN BACTERIA-MINERAL……………………….…………….. 56 2.5…FACTORES QUE INFLUYEN EN LA BIOLIXIVIACIÓN………….…… 59 2.6…TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES……………………….………………………….. 61 2.7 APLICACIONES DE LA BIOLIXIVIACIÓN CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES…………..…………………………………….... 66 2.7.1 BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES………………………..………………. 66 2.7.2 BIOLIXIVIACIÓN DE LODOS………..…………………..…….…………. 70 2.7.3 BIOLIXIVIACIÓN DE SUELOS…………………………………………….. 75 2.7.4 BIOLIXIVIACIÓN DE OTROS RESIDUOS…………………………...…… 77 2.7.5 APLICACIONES INDUSTRIALES………………………………………….. 78 2.8 REDUCCIÓN DEL Cr(VI) POR LA ACCIÓN DE LAS BACTERIAS 3 AZUFRE-OXIDANTES…………………………………….…………….. 81 BIOPRECIPITACIÓN CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS…….. 84 3.1 PRECIPITACION DE METALES DISUELTOS………..…………………. 84 3.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS…………….………………….. 85 3.2.1 CARACTERÍSTICAS………...……………………………………………… 88 3.2.2 GÉNERO Desulfovibrio………..…………………………………………. 89 3.2.3 METABOLISMO DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS………. 90 INDICE 3.2.4 METABOLISMO DEL GÉNERO Desulfovibrio……..…………………… 91 3.3 FUNCION DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN LA BIOPRECIPITACIÓN DE METALES……….………………………….. 93 3.3.1 ADHESIÓN BACTERIA-MINERAL………………...………………………. 94 3.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA REDUCCION DE SULFATO….… 94 3.5 TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS….………………………... 98 3.6 APLICACIÓN DE LA BIOPRECIPITACIÓN DE METALES POR BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS……….………………………… 102 3.7 INTEGRACIÓN DE PROCESOS DE BACTERIAS AZUFREOXIDANTES Y BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS…..…………… 106 INMOVILIZACIÓN DE CELULAS…………………………….……………. 109 4.1 EMPLEO DE LA INMOVILIZACIÓN…………….…………..………… 109 4.2 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN…………….………………..…….. 109 4.2.1 ADHESIÓN………………..…………………………..……………………. 110 4.2.2 ATRAPAMIENTO……………………….……………..…………………… 111 4.3 INMOVILIZACION DE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES….………. 112 4.4 INMOVILIZACION SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO….……….. 113 C.-MATERIAL Y MÉTODOS…………….…………………………………... 117 1 MATERIAL Y MÉTODOS……………………….…………………………… 119 1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS…………………………………... 119 4 1.1.1 BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES……………………….………... 119 1.1.1.1 Características………………………………………………….. 119 1.1.1.2 Mantenimiento de las cepas………………………………… 119 1.1.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS…………………………………… 122 1.1.2.1 Características………………………………………………….. 122 1.1.2.2 Mantenimiento de las cepas………………………………… 123 1.2 MÉTODOS DE ANÁLISIS………………………………………………. 127 1.2.1 pH Y POTENCIAL REDOX………………………………………………... 127 INDICE 1.2.2 CONCENTRACIÓN CELULAR…………………………………………... 127 1.2.2.1 Bacterias en suspensión………………………………………. 127 1.2.2.2 Bacterias inmovilizadas……………………………………….. 128 1.2.3 CONCENTRACIÓN DE PROTONES……………………………………. 129 1.2.4 CONCENTRACION DE SULFATO………………………………………. 129 1.2.5 CONCENTRACION DE IONES METÁLICOS…………………………… 130 1.2.6 CONCENTRACION DE CROMO HEXAVALENTE…………………….. 131 1.2.7 PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA 2 ELECTRÓNICA…………………………………………………………….. 131 1.2.8 DIGESTIÓN DE COMPUESTOS INSOLUBLES DE METAL………........… 132 PROTOCOLOS EXPERIMENTALES……………………………………….. 133 2.1 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO……… 134 2.2 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO…………... 136 2.2.1 REACTOR DE At. thiooxidans…………………………………………... 137 2.2.2 SOLUBILIZACIÓN DE METALES PRESENTES EN ARENA……………… 137 2.3 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIÓN DE Cr(VI) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO………..…….. 138 2.4 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIÓN DE Cr(VI) Y SOLUBILIZACIÓN DEL Cr(III) CON BACTERIAS AZUFREOXIDANTES EN CONTINUO…………………………………………… 139 2.4.1 REACTOR DE At. thiooxidans…………………………………………... 139 2.4.2 COLUMNA CON RESIDUO DE CROMO……………………………… 140 2.5 PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN DISCONTINUO… 141 2.6…PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN CONTINUO… 142 2.6.1 REACTOR DE Desulfovibrio sp…………………………………………. 143 INDICE 2.6.2 REACTOR DE PRECIPITACIÓN………………………………………….. 144 2.7…PROTOCOLO PARA LA INMOVILIZACIÓN DE At. ferrooxidans Y At. thiooxidans SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO…..………. 145 2.8 PROTOCOLO PARA LA INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS DE SOLUBILIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) EN CONTINUO……………………….……………………………………. 147 D.-RESULTADOS…………………………………………………..…............ 149 1 151 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)……………………..… 1.1 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO………………………..….. 151 1.2 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON At. thiooxidans EN CONTINUO………………………………...………………………. 2 168 REDUCCION DEL Cr(VI)…………………………………………….. 174 2.1 EXPERIENCIAS DE REDUCCIÓN DEL Cr(VI) EN DISCONTINUO.... 174 2.2 REDUCCIÓN DE Cr(VI) Y SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III) CON 3 BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO……….………... 181 PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II)………………………… 187 3.1 ESTUDIO DE TOLERANCIA Y PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN DISCONTINUO…………………………………………………………. 187 3.1.1 ESTUDIO CON Cr(III)………………….………………………………….. 187 3.1.2 ESTUDIO CON Cr(VI)…………………………………………….………. 191 3.1.3 ESTUDIO CON Cr(III) y Cr(VI)……………………………….………….. 193 3.1.4 ESTUDIO CON Ni(II)………………………………….…………………… 195 3.1.5 ESTUDIO CON Zn (II)………………………………….………………….. 199 3.1.6 ESTUDIO CON Cr(III), Ni(II) y Zn(II)………………………….………….. 203 3.2 PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN CONTINUO…………………………… 210 INDICE 4 INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS……………………..………… 214 4.1 INMOVILIZACIÓN DE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO……….…………………………………. 214 4.2 INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS DE SOLUBILIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN EN CONTINUO…………….……………………… 219 4.3 COMPARACIÓN CON OTRO PROCESO…………….……………. 226 E.-CONCLUSIONES…………………..………………………………….….. 231 F.-BIBLIOGRAFÍA…………………………..………………………….…….. 235 A.-INTRODUCCIÓN INTRODUCCION En el último siglo, se ha generado un aumento considerable del contenido de metales pesados en el medio ambiente provocado, principalmente, por el gran número de procesos industriales que emplean como materias primas los metales, así como por las explotaciones mineras y sus industrias derivadas. Por este motivo, el estudio de técnicas que traten de reducir la contaminación causada por éstos constituye un tema de gran actualidad. Normalmente estos metales se encuentran presentes en aguas y suelos y, en ocasiones, en forma de pequeñas partículas dispersas en el aire. Hoy en día, el tratamiento de medios contaminados con iones metálicos, como efluentes industriales, lodos, sedimentos y suelos, puede llevarse a cabo mediante distintas técnicas tales como precipitación, intercambio iónico, filtración por membrana o métodos electroquímicos. Sin embargo, estos tratamientos están restringidos por problemas técnicos y económicos; provocando la aparición de otras técnicas alternativas que involucran bioprocesos. En ocasiones, los iones metálicos se encuentran en los medios contaminados en formas insolubles. La acción de determinados microorganismos permite la transformación de compuestos insolubles a otros solubles, de modo que los iones pasan a solución acuosa. A esta operación de solubilización de iones mediante microorganismos se le conoce con el nombre de biolixiviación. Las bacterias azufre-oxidantes del género Acidithiobacillus (en concreto Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans) son conocidas por su capacidad para solubilizar iones metálicos a partir de sulfuros y óxidos complejos dando lugar a otras formas solubles como los sulfatos. Por otra parte, cuando los metales se presentan en formas solubles en los medios contaminados de forma natural, o como consecuencia de procesos químicos o biológicos, podría ocurrir que debido a su movilidad las 3 INTRODUCCION especies metálicas pasen de capas superficiales a capas más internas y, en consecuencia a los posibles acuíferos. Una de las vías para evitar la movilización de los metales presentes en un medio es la bioprecipitación de dichos iones. Algunas especies microbianas tienen la capacidad de oxidar o reducir ciertos iones, de manera que modifican la solubilidad de las especies metálicas provocando su precipitación y, por tanto, su separación y posterior eliminación del medio. Las bacterias sulfato-reductoras, entre las que se encuentra el género Desulfovibrio, tienen la habilidad de precipitar iones metálicos a partir de formas metálicas solubles. Habitualmente el contacto directo entre la biomasa y la solución que contiene los iones metálicos no es sencillo y presenta algunos problemas técnicos. La inmovilización previa de la biomasa en estructuras sólidas proporciona el tamaño, la rigidez y la porosidad necesarios para realizar este tipo de procesos. Esta técnica, además, facilita la recuperación de los iones metálicos y la reactivación de la biomasa para su reutilización. El presente trabajo se realizó con el objeto de estudiar los procesos que permiten la solubilización y precipitación de metales pesados presentes en medios contaminados empleando la capacidad de las bacterias azufreoxidantes y sulfato-reductoras para tolerar la presencia de iones metálicos y llevar a cabo estos procesos. Para ello, en primer lugar, se seleccionaron los metales a estudiar: cromo, níquel y zinc. Estos metales se encuentran presentes de forma común en los residuos de las plantas de tratamiento de superficies y en los efluentes o lodos de industrias relacionadas con la minería. Debido a su toxicidad y a su presencia en variedad de medios contaminados parece de interés tomarlos como referencia en el estudio de bioprocesos que permitan la disminución o eliminación de estas especies metálicas en dichos medios. 4 INTRODUCCION El estudio de la solubilización de estos metales por la acción de las bacterias azufre-oxidantes se realizó en discontinuo para determinar de esta forma la viabilidad del proceso y la tolerancia de At. ferrooxidans y At. thiooxidans a los distintos metales. El estudio se llevó a cabo en distintas condiciones y los resultados obtenidos permitieron desarrollar un proceso de solubilización de dichos metales en forma continua, donde compuestos insolubles de éstos metales se encontraban soportados en arena. Las bacterias azufre-oxidantes tienen además la capacidad de generar compuestos reductores a partir de la oxidación de azufre elemental, esta propiedad les permite reducir el cromo hexavalente a cromo trivalente, menos tóxico. Por tanto, debido a la evidente presencia del Cr(VI) en distintos tipos de residuos, se consideró de interés el estudio de la reducción de éste ion por parte de las bacterias azufre-oxidantes en régimen discontinuo y continuo. El estudio de la bioprecipitación de metales en solución con las bacterias sulfato-reductoras (Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp.) se realizó de forma discontinua empleando varias concentraciones de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II). El estudio se realizó determinando la precipitación de cada metal individualmente y, posteriormente, se estudió dicho proceso con una combinación de todos los metales. El desarrollo del proceso de precipitación en continuo persiguió una mayor disminución de la movilidad de cada uno de los metales en solución en un medio acuoso. Con el fin de integrar ambos procesos de una forma efectiva se decidió inmovilizar previamente las bacterias azufre-oxidantes sobre espuma de poliuretano. Para ello, se estudió previamente la dinámica de inmovilización de cada una de las bacterias para determinar cual de ellas podría resultar más ventajosa. 5 INTRODUCCION Finalmente la integración de los procesos de solubilización y precipitación en continuo estudiados permitió evaluar la transformación y la disminución del contenido metálico de un residuo contaminado con cromo, níquel y zinc. En definitiva, el objetivo general del presente trabajo fue el estudio de los procesos de solubilización con bacterias azufreoxidantes y de precipitación con bacterias sulfato-reductoras para el tratamiento de residuos contaminados por metales pesados. Este objetivo general se concretó en los siguientes objetivos específicos desarrollados en el trabajo realizado: - Estudio de la solubilización de compuestos insolubles de cromo, níquel y zinc mediante la acción de las bacterias azufre-oxidantes, At. ferrooxidans y At. thiooxidans, en régimen discontinuo y continuo. - Estudio de la reducción de Cr(VI) a Cr(III) por parte de las bacterias azufre-oxidantes en régimen discontinuo y continuo. - Estudio de la precipitación de iones metálicos (Cr(III), Ni(II) y Zn(II)) mediante el empleo de las bacterias sulfato-reductoras, Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp., en régimen discontinuo y continuo. - Estudio de la integración de los procesos de solubilización y precipitación de metales pesados en régimen continuo. 6 B.-ANTECEDENTES ANTECEDENTES 1 CONTAMINACIÓN POR METALES PESADOS 1.1 METALES PESADOS: TOXICIDAD Y TÉCNICAS DE REMEDIACIÓN Los metales se encuentran de forma habitual formando parte de depósitos minerales los cuales son procesados física y químicamente para la obtención de metales puros. Esta actividad ha sido desarrollada a lo largo de los siglos debido al elevado interés que representan estos elementos o sus compuestos por su extensa aplicación en un gran número de industrias (construcción, aeronáutica, automovilística…). En la tabla 1 se recogen las aplicaciones más importantes de algunos de los metales más comunes. Metal Aplicaciones más comunes Referencia Ag Fotografía, joyería Gordon(2001) Au Joyería, electrónica, láminas Gordon(2001) Cd Co Cr Cu Ni Galvanizado, baterías, pigmentos de plásticos y pinturas Imanes, superaleaciones Acero inoxidable, materiales refractarios, curtido de pieles Sistemas eléctricos, tuberías, equipos de calefacción, aleaciones Aceros, aleaciones para monedas, utensilios de cocina Beveridge y Doyle(1989) Gordon(2001) Gordon(2001) Beveridge y Doyle(1989) Beveridge y Doyle(1989) Pb Baterías, cables, pigmentos y aleaciones. Beveridge y Doyle(1989) Pt Joyería, catalizadores, electrónica Gordon(2001) Zn Aleaciones, galvanizado, gomas, papel, productos cosméticos y farmacéuticos, pinturas. Mulligan y col.(2001) Tabla 1: Principales aplicaciones de algunos metales pesados Estos elementos han sido extraídos y utilizados ampliamente por el hombre desde la antigüedad pero en las últimas décadas la rápida 9 ANTECEDENTES expansión de la industria, el incremento de las actividades domésticas y el carácter consumista de la sociedad actual han dado lugar a un aumento desorbitado de la cantidad de metal emitida al medio ambiente. Los metales se introducen en el medio ambiente como residuos procedentes de la actividad minera o de otras fuentes como son la combustión del petróleo, procesos industriales, restos de pesticidas y residuos domésticos, entre otros. Los metales pesados se acumulan mayoritariamente en suelos y sedimentos cercanos a zonas industriales y mineras. Los efluentes procedentes de estas zonas son habitualmente sometidos a tratamientos de depuración de aguas pero una vez que vuelven al medio natural persisten en él, no pueden ser biodegradados y pueden además participar de un gran número de reacciones que lo pueden hacer más o menos tóxico. En general, pueden quedar adsorbidos en el suelo, incorporarse a ríos y lagos, lixiviar hasta acceder a aguas subterráneas o expandirse en la atmósfera. La movilidad de estos metales de un medio a otro ocurre mediante procesos físicos, químicos o biológicos (Figura 1). La exposición a los metales pesados a través del agua y los alimentos da lugar a la acumulación de éstos en microorganismos, plantas, animales y seres humanos lo que puede desembocar en la alteración o extinción de estos seres vivos (Mulligan y col., 2001). 10 ANTECEDENTES n ció ala ión Inh sorc n Ab estió Ing te sin De co nd en n ció gra Pr e cip ita c ió n Desintegración S Reacciones químicas y biológicas n ció olu Reacciones químicas y biológicas sedimento suelo Me teo riza ció n rocas Sedimentación Ev ap or ac ión sac ión hidrosfera biosfera Desintegración ev ap ora ció n atmósfera S e im ed n c ió nta Figura 1: Procesos de movilización de los metales en el medio ambiente (Board, 1996). Los metales pesados se pueden definir como aquellos metales con una densidad por encima de 5 g/cm3, de forma que los elementos de transición desde el vanadio hasta el semi-metal arsénico, del circonio al bismuto y del lantano al polonio se consideran metales pesados junto con el grupo de los lantánidos y los actínidos (Nies, 1999) que no son considerados como tales por otros autores (Beveridge y Doyle, 1989). De cualquier modo, la definición de metal pesado está asociada a aquellos metales que en pequeña concentración resultan nocivos para los seres vivos. De los 90 elementos que existen de forma natural en la Tierra, 21 son no-metales, 16 son metales ligeros y los 53 restantes incluyendo el arsénico son metales pesados. La mayoría de los metales pesados son elementos de transición con orbitales d incompletos, que dan lugar a cationes con la habilidad de formar compuestos complejos susceptibles de actuar en reacciones redox y variar de este modo su movilidad en el medio en que se 11 ANTECEDENTES encuentran o interaccionar con otros compuestos que se encuentren en él. Habitualmente estos cationes juegan un importante papel como elementos traza en complejas reacciones bioquímicas. Sin embargo, a elevadas concentraciones los metales pesados forman compuestos complejos no específicos en las células que pueden producir efectos tóxicos. Algunos cationes de metales pesados como Hg(II), Cd(II) y Ag(I) forman fuertes complejos que lo hacen demasiado tóxicos para cualquier función fisiológica. Incluso algunos elementos traza básicos en la alimentación, como el zinc, el níquel o el cobre, se convierten en tóxicos a mayores concentraciones. Entre los mecanismos moleculares que determinan la toxicidad de los metales pesados se encuentran (Cañizares-Villanueva, 2000): • desplazamiento de iones metálicos esenciales de moléculas y bloqueo de sus grupos funcionales. • modificación de la conformación activa de biomoléculas (enzimas, polinucleótidos). • ruptura de la integridad de biomoléculas. • modificación de otros agentes biológicamente activos. 1.1.1 TÉCNICAS DE REMEDIACIÓN En vista de la extensión de los metales pesados en el medio ambiente, en los últimos tiempos se han venido desarrollando una serie de técnicas que tratan de reducir su contenido o, mejor dicho, transformarlos en formas más estables que no accedan con tanta facilidad a ciclos biológicos. Entre ellos se distinguen las técnicas de contención que tratan de retener físicamente los contaminantes de modo que queden depositados 12 ANTECEDENTES de forma controlada; las técnicas ex-situ que emplean transformaciones físicas, químicas o biológicas para modificar la toxicidad o disponibilidad de los contaminantes, pero tratándolos fuera de su ubicación original; y las técnicas in-situ que se basan en la transformación de los contaminantes presentes en el medio sin modificar su ubicación, habitualmente se aprovechan propiedades de los microorganismos o las plantas para tratar de reducir la contaminación propia del medio 1.1.1.1 Técnicas de contención - Aislamiento y contención: Los medios contaminados se aíslan y se confinan para prevenir posteriores movimientos, reducir la permeabilidad del residuo e incrementar la capacidad de resistencia al residuo. Las barreras físicas se realizan de acero, cemento, bentonita o ladrillo en capas horizontales y/o verticales dispuestas de forma que eviten las infiltraciones. - Solidificación/estabilización: Estas técnicas no implican barreras físicas. La solidificación consiste en la encapsulación de los contaminantes en una matriz sólida y la estabilización incluye la adición de un compuesto (polímeros orgánicos y silicatos) que reacciona con el contaminante reduciendo su movilidad. Estos tratamientos se hacen complejos in-situ debido a la dificultad de mezcla de los componentes adicionados. - Vitrificación: Es un proceso de solidificación/estabilización que requiere el aporte de energía térmica. Esto implica la inserción de electrodos en el medio contaminado transmitiéndose una corriente que desplaza los iones metálicos y la posterior solidificación cuando el medio se enfría. 1.1.1.2 Técnicas ex-situ - Separación mecánica: El objetivo de estos procesos de selección del tamaño de partícula es eliminar contaminantes que por su tamaño se 13 ANTECEDENTES puedan distinguir de otras menos contaminantes. Para determinar si estos procesos son adecuados resulta esencial caracterizar los tamaños de partícula y el nivel de contaminación de cada fracción. Para la separación física se emplean hidrociclones, tanques de sedimentación, columnas de lecho fluidizado, flotación o separación magnética. - Separación pirometalúrgica: Este tipo de procesos emplea hornos a alta temperatura (200-700ºC) para volatilizar los metales presentes en suelos contaminados y, posteriormente, los metales se recuperan o inmovilizan. Se aplica actualmente al mercurio ya que éste es fácil de convertir a su forma metálica a altas temperaturas. Otros metales como el arsénico, cromo, cadmio y plomo requieren de un pretratamiento. - Tratamientos químicos: Los tratamientos químicos por mecanismos reductores u oxidantes se emplean para reducir la toxicidad o la movilidad de los metales contaminantes. Se emplean habitualmente en el tratamiento de aguas residuales. Las reacciones de oxidación, que pueden disminuir la toxicidad, precipitando o solubilizando metales, implican la adición de permanganato potásico, peróxido de hidrógeno, hipoclorito o cloro gaseoso. Las reacciones de neutralización se emplean para ajustar el pH de suelos ácidos o básicos. Las reacciones de reducción se inducen por la adición de compuestos alcalinos como sodio, dióxido de azufre, sales de sulfito y sulfato ferroso. Esta técnica se emplea a veces como pretratamiento de otras como la solidificación/estabilización. Por otra parte, al tratarse de reacciones no específicas se corre el riesgo de que otros metales se transformen en formas más tóxicas o más móviles. 1.1.1.3 Técnicas in-situ - Barreras permeables: Son barreras que contienen una sustancia reactiva (física, química o biológica o una combinación de ellas) que está dispuesta para reducir la movilidad de metales presentes en aguas 14 ANTECEDENTES subterráneas cercanas a lugares contaminados. Hasta el momento se han empleado como material zeolita, hidroxiapatita, hierro elemental y piedra caliza - Técnicas de electrocinética: Estos procesos implican el paso de una corriente eléctrica de baja intensidad entre un cátodo y un ánodo introducidos en el medio contaminado, los iones y pequeñas partículas cargadas se transportan entre los electrodos. Un gradiente eléctrico inicia el movimiento por electromigración (movimiento de las especies químicas cargados), electroósmosis (movimiento del fluido), electroforésis (movimiento de partículas cargadas) o electrolisis (reacción química producida por un campo eléctrico). - Técnicas de biorremediación: Estos procesos bioquímicos aprovechan la capacidad de los microorganismos de tolerar elevadas concentraciones de metales pesados y de transformar las especies metálicas en función del estado de oxidación en que se encuentran y de las condiciones que existan en el medio. Los procesos más conocidos son la biolixiviación, solubilización de un metal en estado insoluble en forma de óxidos o sulfuros, permitiendo su extracción; la bioprecipitación, precipitación de un metal que se encuentra soluble y móvil en el medio favoreciendo su deposición y separación, y la biosorción, retención de metales por interacción fisicoquímica del metal con componentes de la superficie celular. - Fitoremediación: Estos procesos aprovechan la habilidad de algunas plantas de acumular metales pesados en sus raíces, ramas y hojas mediante mecanismos de adsorción o por la excreción de componentes que pueden variar las condiciones del suelo dando lugar a la formación de complejos metálicos. La elección del método más adecuado depende de las condiciones climáticas y de la biodisponilidad del metal en el suelo. Estas 15 ANTECEDENTES técnicas tienen el inconveniente de requerir un tiempo elevado para la obtención de resultados, habitualmente se emplean plantas que se caracterizan por un rápido crecimiento. (Mulligan y col., 2001) 1.2 MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS Algunos metales son esenciales para los microorganismos mientras que otros son tóxicos incluso en pequeña cantidad. La habilidad para crecer a altas concentraciones de metal se ha encontrado en muchos microorganismos (Nies, 1999) y puede ser el resultado de mecanismos intrínsecos o inducidos (Ledin, 2000). Gadd (1992) definió tolerancia como la habilidad para soportar la presencia de metales tóxicos por medio de propiedades intrínsecas y resistencia como la habilidad para sobrevivir en presencia de metales tóxicos por medio de mecanismos de disminución de toxicidad producidos como respuesta directa a la presencia de metal. Así, muchos microorganismos se han adaptado adecuadamente a la presencia de metales mediante sistemas de resistencia cromosómicos. Las mejoras en las técnicas de manipulación genética pueden aumentar la resistencia a los metales de gran número de microorganismos haciéndolos susceptibles de ser aplicados para la remediación a mayor escala de medios contaminados (Bruins y col., 2000). Existe una gran diversidad de formas por las que los microorganismos pueden interaccionar con los metales y variar su toxicidad (figura 2), principalmente: 16 ANTECEDENTES Membrana celular/espacio periplasmático Adsorción/Intercambio iónico Reacciones redox/Transformaciones Precipitación Difusión y transporte Pared celular Adsorción/Intercambio iónico Unión covalente Atrapamiento de partículas Reacciones redox Precipitación Intracelular Metalotioninas Péptidos de metal gamma-glutamilcisteína Enlazamiento no específico/Quelación Compartimentalización en organelos Reacciones redox/Transformaciones Materiales asociados a células (Polisacáridos, cápsulas) Intercambio iónico Atrapamiento de particulas Enlazamientono específico Precipitación Reacciones extracelulares Precipitación por productos excretados Formación de complejos y quelación Sideróforos Figura 2: Procesos que contribuyen a la captación microbiana y disminución de la toxicidad de metales. (Gadd y White, 1993). • Transformación mediante procesos redox, alquilación, etc. modificando la movilidad y toxicidad de los metales. • Acumulación de metales, que puede ser por un metabolismo independiente (acumulación pasiva), sorción o por un metabolismo dependiente que implica transporte intracelular (acumulación activa), consumo. Pueden ocurrir ambos mecanismos en el mismo organismo. • Producción o eliminación de sustancias, como compuestos orgánicos que varían la movilidad de los metales, o sulfuros que reducen la movilidad de éstos. • Participación en el ciclo del carbón, influyendo en la cantidad y características de la materia orgánica, lo cual puede variar en la movilidad de ciertos metales, ya que los compuestos 17 ANTECEDENTES orgánicos formación podrían de formar complejos enlace con los metales. La organo-metálicos modifica la especiación de los metales. • Modificación de la movilidad de los metales de forma indirecta por cambios en el pH, potencial redox, etc. consecuencia de su propio metabolismo. 1.2.1 TÉCNICAS DE BIORREMEDIACIÓN Los avances tecnológicos desarrollados actualmente para la remediación de medios contaminados por metales pesados consisten en el uso selectivo y la mejora de procesos naturales para el tratamiento de residuos particulares. Las distintas interacciones entre microorganismo y metal han dado lugar al desarrollo de distintos bioprocesos, algunos de los cuales, se describen a continuación. La descripción de estos bioprocesos (Figura 3) se puede realizar atendiendo a si movilizan o inmovilizan las especies metálicas presentes en el medio contaminado (CañizaresVillanueva, 2000). 1.2.1.1 Técnicas de movilización Biolixiviación Los procesos de biolixiviación están basados en la habilidad de ciertos microorganismos (bacterias, hongos) para transformar compuestos sólidos dando lugar a elementos solubles y extraíbles, los cuales pueden ser recuperados (Krebs y col., 1997). Esta capacidad implica principalmente: • reacciones redox. • formación de ácidos orgánicos e inorgánicos. • excreción de agentes complejantes. 18 ANTECEDENTES MOVILIZACIÓN INMOVILIZACIÓN M-org M org Eliminación/producción de sustancias movilizadoras de metal Acumulación de metales M activa M pasiva Fe(II) U (ox) Reducción de metal Reducción de metal U (red) Fe(III) Fe(II) oxidación de metal Oxidación de azufre Fe(III) descenso de pH Biodegradación de compuestos organo-metálicos Movilización de metal M sulfuro Reducción de azufre aumento de pH Inmovilización de metal M-org Figura 3: Interacciones entre metales y microorganismos (Ledin, 2000) Existe una gran diversidad de microorganismos de los que se conoce su capacidad de lixiviar metales, entre ellos hay autótrofos, de cómo los microorganismos del género Thiobacillus, y heterótrofos, como especies del género Aspergillus y Penicillium, entre otros. La lixiviación de minerales con sulfuro se basa en la actividad de bacterias quimiolitotrófas, principalmente Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans, las cuales convierten los sulfuros metálicos insolubles en sulfatos metálicos solubles mediante una reacción de oxidación. La lixiviación de minerales sulfurados por la acción de este tipo de bacterias con el objetivo de la extracción de metales valiosos es una bioindustria ya establecida, sin embargo, hasta hace unos años no se han comenzado a dar aplicaciones de la lixiviación dirigidas a la reducción de la contaminación de suelos y otras matrices contaminadas con metales pesados. La lixiviación de minerales no sulfurosos (óxidos, carbonatos o silicatos) se lleva a cabo por bacterias y hongos 19 ANTECEDENTES heterótrofos que excretan ácidos orgánicos o agentes quelantes o complejantes que disuelven el metal presente en el medio. La biolixiviación representa una tecnología limpia con bajo coste económico y bajo requerimiento energético (Bosecker, 1997, Krebs y col., 1997) 1.2.1.2 Técnicas de inmovilización Bioacumulación Este tipo de técnicas se basan en la capacidad de algunos microorganismos para interaccionar con especies metálicas por medio de su superficie celular. Los microorganismos más adecuados para este tipo de procesos son aquellos que tienen una relación área superficial/volumen elevada para garantizar una superficie de contacto suficiente y poder así interaccionar con el metal que se encuentra en sus alrededores. La bioacumulación puede ser pasiva, llamada entonces biosorción, y depende principalmente de las propiedades de superficie como la carga, la orientación de los grupos funcionales sobre la superficie celular y de la especiación del metal y su estado químico en la fase acuosa. La bioacumulación consta básicamente de dos etapas, primero ocurre la interacción electrostática entre los iones metálicos y los grupos reactivos dispuestos sobre la superficie celular y, segundo, estos lugares se comportan como núcleos de deposición de más metales. Actualmente se han desarrollado procesos de biosorción con biomasa viva y muerta (CañizaresVillanueva, 2000). Pero, además, los microorganismos tienen mecanismos de consumo o acumulación de metales esenciales para su metabolismo y, en ocasiones, pueden desarrollar esta capacidad para acumular metales no esenciales en su interior. La bioacumulación activa o bioacumulación intracelular requiere que se produzcan reacciones o componentes metabólicos por 20 ANTECEDENTES parte de la célula, para ello necesitan de una fuente de energía. El mecanismo intracelular se realiza mediante un sistema de transporte específico que permite inmovilizar el metal en el interior de la célula. La bioacumulación pasiva y activa puede darse de forma simultánea en un mismo microorganismo (Ledin, 2000). Bioprecipitación Los microorganismos pueden inmovilizar de forma efectiva ciertos metales pesados a través de su capacidad para reducir esos elementos a estados de oxidación menores que los transforman en especies metálicas menos activas, es decir, de menor movilidad. A veces este fenómeno está muy ligado al de biosorción (Valls y Lorenzo, 2002). Uno de los mejores ejemplos de este tipo de procesos lo representa la producción de sulfuro de hidrógeno por parte de bacterias sulfato-reductoras, el cual reacciona con metales pesados en forma soluble para transformarlos en compuestos sulfuro, insolubles. Las bacterias del género Citrobacter tiene la capacidad de precipitar metales pesados en forma de fosfatos (Beveridge y Doyle, 1989). 1.3 RESIDUOS DE LA INDUSTRIA DE GALVANIZADO Una de las mayores fuentes de contaminación por metales pesados la constituyen los residuos (emisiones, efluentes, lodos, etc.) procedentes de las industrias. Como ejemplo de los residuos a tratar por los procesos propuestos en esta memoria podemos considerar los residuos de galvanizado. Las industrias dedicadas al galvanizado de piezas metálicas destacan por su elevado contenido en este tipo de elementos. La legislación actual establece los límites de vertido de los residuos procedentes de este tipo de industrias por la toxicidad que suponen para el medio ambiente. Como métodos prioritarios para la disminución del 21 ANTECEDENTES contenido metálico en estos residuos se han comenzado a tomar medidas en el proceso de fabricación tales como la separación de efluentes o la sustitución de compuestos por otros menos nocivos. Los métodos galvánicos o de recubrimiento electrolítico consisten en depositar por vía electroquímica finas capas de metal sobre la superficie sumergida en una solución hídrica con iones metálicos, electrolitos, al hacer pasar una corriente (Figura 4). El objetivo es aportarle propiedades de resistencia mecánica, conductoras o decorativas. El balance general de este tipo de procesos se recoge en la figura 4. No obstante, es evidente que en función del recubrimiento electrolítico que se utilice se van a generar distintos de residuos. Así se pueden distinguir: RECUBRIMIENTO ELECTROLÍTICO e- e- Ánodo Cátodo Electrolito M+n M Recubrimiento de M Figura 4: Esquema de un baño de recubrimiento electrolítico. 22 ANTECEDENTES Pieza metálica Agua residual de enjuague Agua Electrodos contaminados o usados Sales metálicas Aditivos Ánodos Recubrimiento electrolítico Material auxiliar (filtros, carbón activo). Lodos anódicos o de limpieza Material auxiliar usado Electricidad Emisiones Pieza recubierta Figura 5: Diagrama de balance de materiales para las operaciones de recubrimiento electrolítico Cobrizado: Los baños de cobre pueden ser ácidos (sulfato de cobre) o alcalinos (cianuro de cobre). Los ácidos requieren un mayor control pero se prefieren a los cianurados por su toxicidad para el medio ambiente y la salud. Niquelado: En el galvanizado con níquel se pueden utilizar baños de sulfamatos o baños “Watts” con sulfatos de níquel. La mezcla con otros componentes del proceso puede generar complejos de níquel muy estables y difíciles de tratar. Cromado: los baños de cromado emplean cromo trivalente y hexavelente. Debido a la elevada toxicidad del cromo (VI) sobre los seres vivos, se realiza un control más exhaustivo de los residuos emitidos en esta etapa y, generalmente, se someten sus aguas residuales a procesos con bisulfito de sodio para reducir el Cr(VI) a Cr(III), menos tóxico. Zincado: Los baños de zinc pueden ser cianurados (alcalinos) y existen otros (ácidos) basados en potasio y amonio. Los baños cianurados, 23 ANTECEDENTES por la toxicidad que representan, están comenzando a ser sustituidos por otros compuestos como sales de sodio. Actualmente, los residuos de galvanizado se suelen derivar a: • confinamiento controlado • reciclaje/reutilización • almacenamiento temporal en la planta • relleno sanitario • tratamiento fisicoquímico • drenaje municipal Durante los últimos años, se han tomado las siguientes medidas para reducir la contaminación por metales pesados en este tipo de plantas: Enjuagues de recuperación y prolongación del escurrido: la pieza recubierta se enjuaga y se trata de recuperar, aumentando la eficacia del escurrido, el metal implicado en esa etapa para volver a emplearlo en el baño electrolítico. Sustitución de los compuestos metálicos más dañinos: los baños cianurados de zinc se sustituyen por baños neutros de cloruro de zinc o baños ácidos de sulfato, cloruro o fluoroboratos de zinc. Los baños cianurados de cobre se sustituyen por baños ácidos de sulfato o fluoroborato de cobre. Además se comienza a sustituir el cromo hexavalente por cromo trivalente en el proceso de cromado, aunque esto supone mayor coste y mantenimiento. Eliminación de compuestos quelantes: en algunos baños de recubrimiento electrolítico se emplean este tipo de compuestos para controlar la concentración de iones libres en la solución pero pueden inhibir 24 ANTECEDENTES la precipitación de los metales, por ello la tendencia es no emplearlos para favorecer el tratamiento posterior de los lodos con metales. Recuperación de metales y sales metálicas de los baños mediante procesos de: • Ósmosis inversa • Electrodiálisis • Precipitación y separación. • Separación electrolítica. • Evaporación • Intercambio iónico Entre los factores que determinan si la recuperación del metal es económicamente justificable se incluyen el volumen de residuo que contiene el metal, su concentración, el potencial para reutilizar el metal una vez recuperado y los costos de tratamiento y deposición. Algunas de las características más relevantes de estos procesos se recogen en la tabla 2. Habitualmente, los métodos convencionales para eliminar los metales pesados de los efluentes industriales resultan muy costosos. La necesidad de encontrar procesos más económicos hace atractivos a los procesos biológicos que pueden reducir el contenido de estos contaminantes de forma eficaz y sin implicar elevados costes (Atkinson y col, 1996). En este sentido, se vienen desarrollando algunos trabajos que van desde la utilización de corteza de árbol cuyos componentes actúan como agentes quelantes sobre los metales pesados (Gaballah y Kilbertus, 1998), el uso de subproductos de algunas industrias (barros, cenizas, etc.) u otros soportes (arena, silica, etc.) para actuar como base para procesos de adsorción (Santos y Oliveira, 2003, Ciccu y col., 2003), el empleo de bacterias, hongos 25 ANTECEDENTES o algas como biosorbentes (Atkinson y col., 1996, Malik, 2004) o el desarrollo de procesos con otros microorganismos para la solubilización de los metales presentes en un residuo industrial (Bosecker, 2001). Técnica Intercambio iónico Ósmosis inversa o electrodiálisis Objetivo Recuperación del electrolito Recuperación del electrolito y el agua desionizada Requisitos Costos Relación costo/ beneficio Aplicación Limitantes equipo de intercambio iónico, agua desionizada, energía electrica Alto Separación electrolítica Recuperación interna de metales en enjuagues o soluciones concentradas Evaporación Concentración de los enjuagues para retornarlos al baño Energía eléctrica, membranas Equipo de electrolisis, energía eléctrica Equipo de evaporación atmosférica, energía Alto Bajo-medio alto Regular-/mala Buena Buena Regular -mala Recuperación de metales presentes como electrolitos Recuperación de metales en el primer enjuague de cascada Recuperación de metales en enjuagues de recuperación o de cascada Recuperación d metales en baños calientes Uso de agua desionizada. Resistencia de las membranas a cambios en el pH y la temperatura. No aplicable al cromo Solo para soluciones concentradas. No aplicable al cromo Baños calientes sin tensioactivos Es recomendable el agua desionizada Exige alto control de proceso. No se puede usar para algunos electrolitos Tabla 2: Principales características de algunos de los tratamientos empleados para recuperar metales en las plantas de galvanizado (GTZ, 1998) 1.4 CARACTERÍSTICAS Y TOXICIDAD DE LOS METALES ESTUDIADOS Existe un gran número de metales que se encuentran de forma habitual en los medios contaminados por la actividad industrial, principalmente. De todos ellos, se han seleccionado para el estudio de su posible eliminación o reducción por medio de la actividad bacteriana, los 26 ANTECEDENTES iones cromo (III), niquel (II) y zinc(II). Estos iones se encuentran a distintas concentraciones en los efluentes industriales y existe una legislación que detalla los niveles máximos permitidos en el medio ambiente. 1.4.1 CROMO 1.4.1.1 Características El cromo es un metal de color blanco plateado, duro y quebradizo, relativamente suave y dúctil cuando se encuentra en estado puro y no está tensionado. No se encuentra en estado elemental en la naturaleza. Su mineral más importante por abundancia es la cromita (FeCr2O4 o FeO· Cr2O3). El cromo puro se obtiene por reducción del óxido de cromo(III) con aluminio (procedimiento aluminotérmico), mediante electrolísis o a partir de ioduro crómico. Sus características más relevantes y las de sus compuestos más comunes se recogen en la tabla 3. (Página web 1) Existen cuatro isótopos naturales del cromo: 50Cr, 52Cr, 53Cr y 54Cr. Se han producido otros mediante reacciones radioquímicas de los cuales el más importante es el 51Cr. El cromo galvanizado y pulido es de color blanco azulado brillante y su poder reflejante es el 77% del de la plata. El cromo forma fundamentalmente compuestos con el oxígeno: óxido de cromo (II) (CrO), óxido de cromo(III) (Cr2O3) y óxido de cromo (VI) (CrO3). Se conocen también los peróxidos, ácido percrómico y percromatos y son muy comunes los halogenuros. 27 ANTECEDENTES Nombre Cromo Símbolo Cr Nº atómico 24 Masa atómica (g/mol) 51,996 Valencia 2, 3, 4, 5, 6 Aspecto metal blanco-azul plateado Nº CAS 7440-47-3 Punto de ebullición (ºC) 2665 Punto de fusión (ºC) 1857 Densidad (g/ml) a 20ºC 7,19 Solvólisis en H2SO4 y HCl diluidos Presión vapor (Pa, 844ºC) 10-6 Configuración electrónica [Ar] 3d54s1 Electronegatividad 1,66 1er 6,80 Pot. de ionización (eV) Radio atómico (Å) 1,27 Radio covalente (Å) 1,27 Radio iónico (Å) (e.o +3) 0,69 Tabla 3a: Datos generales y características fisico-químicas del cromo. Nombre Dicromato de sodio (dihid) Óxido de cromo(VI) Fórmula Na2Cr2O7·2H2O CrO3 Masa molecular (g/mol) 298 (anhidro 261,98) 99,99 Aspecto agujas anaranjadas-rojas Cristales rojo oscuro Nº CAS 7789-12-0 1333-82-0 Punto de ebullición (ºC) > 400 ºC descomposición No destilable Punto de fusión (ºC) 357ºC (>86º sal anhidra) 198ºC Densidad (g/ml) 2,35-2,52 2,7 Solvólisis 73,18% en H2O a 20ºC 1660 g/l a 20ºC Tabla 3b: Características de algunos compuestos comunes de cromo (VI) Sus propiedades mecánicas, dureza y resistencia a la tensión, le proporcionan una gran variedad de aplicaciones. El cromo tiene una capacidad relativamente baja de forjado, enrrollamiento y propiedades de 28 ANTECEDENTES manejo, pero cuando se encuentra libre de oxígeno, hidrógeno, carbono y nitrógeno es muy dúctil y se puede forjar y manejar. Las principales aplicaciones del cromo son: su uso como catalizador en la síntesis del amoniaco, en la fabricación de aceros de cromo y aceros inoxidables, en aleaciones con cromo y en el cromado galvánico. Los compuestos orgánicos del cromo se emplean como pigmentos para pinturas y las sales de cromo(VI) se emplean para la preservación de la madera y el curtido de cueros (Pais y Benton, 2000). 1.4.1.2 Toxicidad El cromo es un elemento natural que se encuentra en rocas, animales, plantas, suelos y en polvos y gases volcánicos. Las formas más comunes en el medio ambiente son Cr elemental, Cr(III) y Cr(VI). No se asocia un olor o sabor característico a este tipo de compuestos. El cromo (III) aparece de forma natural en el ambiente y es un elemento nutritivo esencial ya que interviene en algunos procesos metabólicos. El cromo elemental y el cromo (VI) se producen generalmente por procesos industriales. Resultado de las actividades industriales, el cromo en sus distintas formas entra en contacto con el medio natural, es decir, con el aire, agua, suelo y, consecuentemente, en la cadena alimenticia. Agua: En los sistemas acuáticos, la toxicidad de los compuestos solubles de cromo varía según la temperatura, pH, dureza del agua y organismos que la pueblan. Los compuestos de cromo (VI) se disuelven con facilidad, pero en condiciones naturales y en presencia de materia orgánica oxidable, se reducen rápidamente a compuestos de cromo (III) más estables y menos hidrosolubles. 29 ANTECEDENTES Suelo: La movilidad del cromo se evalúa considerando la capacidad de adsorción y reducción de los suelos y sedimentos. Los hidróxidos de cromo (III), una vez sedimentados, difícilmente vuelven a movilizarse, ya que la oxidación a cromo (VI) no ocurre de forma natural. El cromo (VI) resulta tóxico aun en concentraciones muy bajas, siendo el pH del suelo un factor muy influyente. El uso de fosfatos incrementa la entrada de cromo en el suelo. Cadena alimentaria: Los compuestos de cromo (III) asimilados junto con los alimentos resultan relativamente inocuos, sin embargo, los de cromo (VI) son altamente tóxicos. Los animales y seres humanos incorporan al organismo cantidades relativamente bajas de cromo por inhalación. La mayor entrada de cromo se produce por el agua o los alimentos que se ingieren, la resorción en el intestino depende de la forma en que se encuentre este metal. Se asimilan el 20-25% del cromo de complejos orgánicos y un 0,5% del cromo inorgánico. La gran parte del cromo que se encuentra en el medio ambiente se atribuye a emisiones industriales. Las emisiones naturales hacia la atmósfera son de unas 58000 t/a y las de origen industrial cerca de las 100000 t/a. Riesgos sobre la salud humana: Respirar niveles altos de cromo (VI) provoca irritación y hemorragias nasales y úlceras y perforaciones en el tabique nasal. Los efectos agudos que puede provocar el contacto con derivados del cromo hexavalente son fuerte irritación de la piel e incluso quemaduras, así como alteraciones hepáticas y renales. Como efectos crónicos se conocen la dermatitis alérgica de contacto y el cáncer de pulmón (OIT, 2001). 30 ANTECEDENTES 1.1.2.NIQUEL 1.1.2.1.Características El níquel es un metal blanco plateado. Es duro, maleable, dúctil, algo ferromagnético y buen conductor del calor y de la electricidad. Este metal es estable al aire y al agua y no se suele encontrar de forma libre en la naturaleza pero es muy común encontrarlo de forma elemental en los meteoritos (5-20%) y se cree que hay gran cantidad de este elemento en el núcleo terrestre. Los minerales más comunes de este metal son la pirrotina (pirita de cobre [CuFeS2], pentlandita [NiS]), garnierita [(Ni,Mg)3H4Si2O11], millerita [NiS], niquelina [NiAs] y algunos más. Existen cinco isótopos naturales del níquel: 58Ni, 60Ni, 61Ni, 62Ni y 64Ni. Además se han identificado siete isótopos radiactivos. En la tabla 4 se resumen las principales características del níquel y algunos de sus compuestos. Los compuestos más comunes del níquel son: el tetracarbonilo de níquel [Ni(CO4)], líquido incoloro sumamente venenoso, el óxido de níquel [NiO] , el cloruro de níquel [NiCl2] y el sulfato de níquel [NiSO4]. Entre las aplicaciones principales del níquel destacan su uso formando parte de aleaciones, forma aleaciones con casi todos los metales, en técnicas de niquelado para recubrimiento de metales como protección a la corrosión, fabricación de monedas y blindajes, catalizadores, baterías de níquel-cadmio y pigmentos para pinturas entre otras (Pais y Benton, 2000). 31 ANTECEDENTES Nombre Níquel Símbolo Ni Nº atómico 28 Masa atómica (g/mol) 58,71 Valencia 2, 3 Aspecto Blanco plateado Nº CAS 7440-02-0 Punto de ebullición (ºC) 2730 Punto de fusión (ºC) 1455 Densidad (g/ml) a 20ºC 8,9 Solvólisis en H2SO4 y HCl diluidos Presión vapor (Pa, 20ºC) 0 Configuración electrónica [Ar] 3d84s2 Electronegatividad 1,8 1er 7,68 Pot. de ionización (eV) Radio atómico (Å) 1,24 Radio covalente (Å) 1,21 Radio iónico (Å) (e.o +2) 0,78 Tabla 4a: Datos generales y características fisico-químicas del níquel. Nombre Tetracarbonilo de níquel cloruro de níquel Fórmula Ni(CO4) NiCl2(·6H2O) Masa molecular (g/mol) 170,75 129,6 Aspecto Líquido incoloro Cristales amarillo pálido Nº CAS 13463-39-3 7718-54-9 Punto de ebullición (ºC) 42,2 Punto de fusión (ºC) -19,3 987 Densidad (g/ml) 1,31 3,55 Solvólisis Disolventes orgánicos En agua: 1170 g/l Tabla 4b: Características de algunos compuestos comunes de níquel. 1.1.2.2.Toxicidad El níquel es liberado al aire por las plantas de producción de energía y las incineradoras de basuras y es, posteriormente, depositado en el suelo. También puede llegar al medio ambiente en las aguas residuales. La mayor 32 ANTECEDENTES parte de los compuestos de níquel liberados al ambiente se absorben por los sedimentos o partículas del suelo donde el níquel es finalmente inmovilizado. Agua: En los sistemas acuáticos el níquel, habitualmente, se encuentra en estado de oxidación (II), la forma en que se encuentra en el agua depende del pH. Los compuestos de níquel ingresan en el agua generalmente de modo antropogénico y se pueden encontrar sales solubles, óxidos insolubles o polvo de níquel metálico. Aire: El níquel en el aire se encuentra en forma de aerosol. En el aire la forma metálica es estable. Con respecto a las emisiones, las mayores corresponden a sulfatos, óxidos simples y óxidos complejos de níquel y, en menor medida, el polvo de níquel metálico. Suelo: Se suele encontrar como mineral cristalino inorgánico, en complejos quelados o como ión libre. El comportamiento de estos compuestos en el suelo depende de su naturaleza y, principalmente, del tipo de suelo. Generalmente la disminución del pH incrementa la desorción y, por tanto, aumenta el contenido de níquel en solución en el suelo. Cadena alimentaria: Numerosas plantas acumulan níquel que toman, principalmente, del suelo a través de su sistema radicular, lo cual hace que la ingestión de níquel por el ser humano se pueda deber al consumo de vegetales. Para muchas plantas el níquel constituye un nutriente importante para el crecimiento vegetal. Riesgos sobre la salud humana: El metal y sus compuestos inorgánicos se pueden considerar inocuos pero el contacto permanente con la piel puede provocar la “sarna del níquel”. Los compuestos orgánicos, como el tetracarbonilo de níquel son extremadamente tóxicos. Los riesgos principales derivados de la exposición continuada a compuestos de níquel son: 33 ANTECEDENTES alergias, rinitis, sinusitis, enfermedades respiratorias y cáncer (cavidades nasales, pulmón) (OIT, 2001). 1.4.2 ZINC 1.1.3.1.Características El zinc puro y recientemente pulido es de color blanco azulado y brillante, es dúctil y maleable pudiéndose enrollar y tensar pero cantidades pequeñas de otros metales pueden volverlo quebradizo. Es buen conductor del calor y de la electricidad. El zinc puro no es ferromagnético. Los minerales de zinc son muy comunes y se suelen encontrar acompañados de otros metales (plomo, cadmio, hierro, cobre…), entre ellos destacan: la blenda (esfarelita) [ZnS], la wurzita [ZnS], la smithsonita o calamina [ZnCO3], la hemimorfita y willemita (silicatos de zinc) y la cincita [ZnO] (Tabla 5). Se conocen un gran número de isótopos del zinc de los cuales los cinco más estables son: 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn y 70Zn. El zinc normalmente forma los compuestos en estado divalente, los más importantes son: el óxido de zinc [ZnO] que se emplea como pigmento blanco, relleno de materiales de caucho, farmacia, cosmética, tintas y equipos eléctricos; el sulfuro de zinc [ZnS] que se emplea como fluorescente en señales, televisiones, radioscopia y pinturas, y el sulfato de zinc [ZnSO4] útil en la fabricación de pinturas, tratamiento de maderas y obtención de zinc hidrolítico. Las aplicaciones del zinc más importantes son su uso en aleaciones, sobretodo con aluminio y cobre que aumentan su solidez, su empleo como protección superficial de otros metales en chapas y alambres de hierro, cubos y techados y el agregado de magnesio es muy empleado en la industria del automóvil (Pais y Benton, 2000). 34 ANTECEDENTES Nombre Zinc, cinc Símbolo Zn Nº atómico 30 Masa atómica (g/mol) 65,38 Valencia +2 Aspecto Blanco-azulado brillante Nº CAS 7440-66-6 Punto de ebullición (ºC) 907 Punto de fusión (ºC) 419,5 Densidad (g/ml) a 20ºC 7,14 Solvólisis En ácidos y bases Presión vapor (Pa, 103,3ºC) 1,3 x 10-7 Configuración electrónica [Ar] 3d104s2 Electronegatividad 1,6 1er Pot. de ionización (eV) 9,42 Radio atómico (Å) 1,38 Radio covalente (Å) 1,31 Radio iónico (Å) (e.o +2) 0,74 Tabla 5a: Datos generales y características fisico-químicas del zinc. Nombre Óxido de zinc Sulfato de zinc Fórmula ZnO ZnSO4 Masa molecular (g/mol) 81,37 161,43 Aspecto Cristales o polvo blanco Cristales incloros Nº CAS 1314-13-2 7733-02-0 Punto de fusión (ºC) 1975 >600 Densidad (g/ml) 5,6 Solvólisis En agua: 1,6 x 3,54 103 Tabla 5b: Características de algunos compuestos comunes de zinc 1.4.2.1 Toxicidad El zinc se encuentra de forma natural en el aire, el agua y el suelo pero actualmente las concentraciones están aumentando por las 35 ANTECEDENTES actividades industriales como la minería, la combustión del carbón y los residuos y el procesado del acero. Agua: La presencia de zinc en el agua se debe principalmente a los vertidos de aguas residuales que no son depuradas de forma satisfactoria, lo cual puede provocar el aumento de la acidez del suelo. Este metal permanece estable en agua dulce y salada debido a la capa de óxido que lo recubre. En polvo, debido a la gran superficie de contacto, es muy reactivo, creando peligro de explosión. Suelo: Se puede detectar acumulación de zinc en suelos hasta un radio de varios kilómetros de distancia de las plantas metalúrgicas y en las cercanías inmediatas no es posible la explotación agrícola. La presencia de zinc afecta a las plantas y puede interrumpir la actividad biológica en los suelos, dificultando la descomposición orgánica. Cadena alimentaria: En suelos ricos en zinc sólo un número limitado de plantas tiene la capacidad de sobrevivir ya que la presencia de este metal produce necrosis, clorosis e inhibe el crecimiento. Algunos peces pueden acumular zinc cuando viven en cursos contaminados de agua. La acumulación de zinc en seres vivos y plantas afecta claramente a la cadena alimentaria. Riesgos sobre la salud humana: El zinc es nutriente esencial para los humanos y los animales (cofactor enzimático) su deficiencia provoca problemas en el crecimiento y la madurez y anemia. En contraposición un exceso de zinc produce úlceras de estomago, irritación de la piel, vómitos, daños en el páncreas, disturbios en el metabolismo de las proteínas y arteriosclerosis. La exposición continuada en el ambiente de trabajo produce la fiebre o los escalofríos del zinc (OIT, 2001). 36 ANTECEDENTES 1.5 LEGISLACIÓN SOBRE METALES PESADOS Los metales pesados son considerados como residuos tóxicos y peligrosos por la ley 20/1986, de 14 de Mayo, Básica de Residuos Tóxicos y Peligrosos. Dicha ley fue modificada por el Real Decreto 952/1997, de 20 de junio, y en ella se exponen la clasificación de residuos, los modos de gestión y las obligaciones del productor de residuos. La generación de residuos con presencia de metales pesados proviene de muchas y diversas fuentes. La orden del Ministerio de Medio Ambiente MAM/304/2002, de 8 de Febrero, publica las operaciones de valorización y eliminación de residuos y la lista europea de residuos. En la tabla 6 se recopilan los principales residuos que contienen metales pesados obtenidos a partir de la clasificación europea de residuos procedente de la decisión 2000/532/CE de 3 de Mayo de 2000. Por otra parte esta orden presenta un listado de las operaciones de eliminación y valorización de residuos, entre ellas se consideran algunas de las actividades relacionadas con el tipo de residuos que se tratan en este estudio (tabla 7). Resulta complicado establecer unos valores límite de metales pesados en suelos, lodos, aguas y sedimentos, ya que estas concentraciones dependen del tipo de residuo en que se encuentren y de la legislación propia de cada estado o comunidad autónoma. Ya que el residuo a tratar bajo el proceso estudiado en el presente trabajo se constituye de una matriz sólida en la que se encuentran inmovilizados los metales pesados, podemos hacer referencia a la legislación existente respecto a la aplicación de lodos a suelos. 37 ANTECEDENTES 01 Residuos de la prospección, extracción de minas y canteras y tratamientos físicos y químicos de minerales 010101 Residuos de la extracción de minerales metálicos 010304 Estériles que generan ácido procedentes de la transformación de sulfuros 010307 Otros residuos que contienen sustancias peligrosas transformación física y química de minerales metálicos. procedentes de la 04 Residuos de las industrias del cuero, de la piel y textil 040104 Residuos líquidos de curtición que contienen cromo 040106 Lodos, en particular los procedentes del tratamiento in situ de efluentes, que contienen cromo. 040108 Residuos de piel curtida (serrajes, rebajaduras, recortes, polvo de esmerilado) que contienen cromo. 06 Residuos de procesos químicos inorgánicos 060313 Sales sólidas y soluciones que contienen metales pesados 060315 Óxidos metálicos que contienen metales pesados 060405 Residuos que contienen otros metales pesados 060502 Lodos de tratamiento in situ de efluentes que contienen sustancias peligrosas 10 Residuos de procesos térmicos 1005 Residuos de la termometalurgia del zinc 1006 Residuos de la termometalurgia del cobre 1008 Residuos de la termometalurgia de otros metales no férreos 11 Residuos del tratamiento químico de superficie y del recubrimiento de metales y otros materiales; residuos de la hidrometalurgia no férrea 110109 Lodos y tortas de filtración que contienen sustancias peligrosas 110111 Líquidos acuosos de enjuague que contiene sustancias peligrosas 110202 Lodos de la hidrometalurgia del zinc 110502 Cenizas de zinc 12 Residuos del moldeado y tratamiento físico y mecánico de superficies de metales y plásticos 120103 Limaduras y virutas de metales no férreos. 38 ANTECEDENTES 120118 Lodos metálicos que contienen aceites 16 Residuos no especificados en otros capitulos 160118 Metales no férreos 160601 Baterías de plomo 160602 Acumuladores de Ni-Cd 160802 Catalizadores usados que contienen metales de transición peligrosos o compuestos de metales de transición peligrosos 17 Residuos de la construcción y demolición 19 Residuos de las instalaciones para el tratamiento de residuos de las plantas externas de tratamiento de aguas residuales y de la preparación de agua para consumo humano y de agua para uso industrial 1903 Residuos estabilizados/solidificados 1904 Residuos vitrificados y residuos de la vitrificación 1905 Residuos del tratamiento aeróbico de residuos sólidos 190702 Lixiviados de vertedero que contienen sustancias peligrosas 190805 Lodos del tratamiento de aguas residuales urbanas 190808 Residuos procedentes de sistemas de membranas que contienen metales pesados 190811 Lodos procedentes del tratamiento biológico de aguas residuales industriales, que contienen sustancias peligrosas 190813 Lodos procedentes de otros tratamientos de aguas residuales industriales, que contienen sustancias peligrosas 1910 Residuos procedentes del fragmentado de residuos que contienen metales 191202 Metales férreos 191301 Residuos sólidos, de la recuperación de suelos, que contienen sustancias peligrosas 20 Residuos municipales incluidas las fracciones recogidas selectivamente 200133 Baterías y acumuladores especificados en los códigos 160601, 160602 ó 160603 y baterías y acumuladores sin clasificar que contienen esas baterías 200140 Metales Tabla 6: Clasificación de residuos que contienen metales pesados 39 ANTECEDENTES código D2 Tratamiento en medio terrestre (biodegradación residuos líquidos o lodos en el suelo) D8 Tratamiento biológico que da como resultado compuestos o mezclas que puedan eliminarse por un procedimiento autorizado R4 Reciclado o recuperación de metales y de compuestos metálicos Operaciones de eliminación Operaciones de valorización Operacion de Tabla 7: Operaciones relacionadas con el trabajo desarrollado. La directiva 86/278/CEE, de 12 de junio, se refiere a la protección del medio ambiente y, en particular, de los suelos, en la utilización de los lodos de depuradora en agricultura. Esta ley tiene por objeto regular el uso de lodos para evitar efectos nocivos sobre suelos, plantas, animales y seres humanos y fomentar su correcto uso. En ella se considera: • que los lodos pueden tener propiedades agronómicas útiles, lo que conlleva a su valorización en la agricultura. • que ciertos metales pesados pueden ser tóxicos para las plantas y para el ser humano por su presencia en las cosechas. • que es necesario fijar valores límite para dichos elementos en el suelo. • que es necesario prohibir la utilización de lodos con metales pesados cuando la concentración de éstos supera los valores límite. Para ello, se establecen los niveles permitidos de ciertos metales para tres condiciones diferentes: • valores límite de concentraciones de metales pesados en los suelos que reciben lodos. 40 ANTECEDENTES • valores límite de concentraciones de metales pesados en los lodos. • valores de las cantidades máximas anuales de metales pesados que pueden ser introducidos en los suelos destinados a la agricultura. Dichos valores se recogen en la tabla 8. En esta directiva queda pendiente el establecimiento de los valores límite para el cromo. Valores límite de metales pesados en suelos tratados con lodos (mg/kg mat. seca) Valores límite de metales pesados en lodos (mg/kg mat. seca) Cantidades máximas anuales (g/ha/año) Cd 1-3 20-40 150 Cu 50-140 1000-1750 12000 Hg 1-1,5 16-25 100 Ni 30-75 300-400 3000 Pb 50-300 750-1200 15000 Zn 150-300 2500-4000 30000 Tabla 8: Valores límite de concentraciones de metales pesados recogidos en la directiva 86/278/CEE En el borrador para una nueva Directiva relativa a la aplicación de lodos en el suelo (Bruselas 12/01/2000) se definen los tipos de lodos y se presentan valores límite de concentración de metales pesados algo más restrictivos y en función del pH del suelo. En dicho trabajo además: • se exige comprobar mediante un test si es posible que el Cr(III) se oxide a Cr(VI) y si es así, se prohíbe el uso de lodos que produzcan mas de 1 M de Cr(VI). 41 ANTECEDENTES • se establecen los valores límite para concentraciones de compuestos orgánicos y dioxinas La legislación española, en el Real Decreto 1310/1990 regula la utilización de lodos de depuración en el sector agrario y traspone al derecho español la Directiva de la UE 86/278/CEE. En ella se presentan los valores límite de concentración de metales pesados, incluyendo el cromo, en suelos tratados con lodos, en lodos para ser utilizados con fines agrícolas y las cantidades máximas anuales aplicables de lodos en suelos (tabla 9) Valores límite de metales pesados en suelos tratados con lodos (mg/kg mat. seca) Suelo pH<7 Suelo pH>7 Valores límite de metales pesados en lodos (mg/kg mat. seca) Suelo pH<7 Cantidades máximas anuales (g/ha/año) Suelo pH>7 Cd 1 3 20 40 150 Cu 50 210 1000 1750 12000 Ni 30 112 300 400 100 Pb 50 300 750 1200 3000 Zn 150 450 2500 4000 15000 Hg 1 1,5 16 2,5 Cr 100 150 1000 1500 30000 Tabla 9: Valores límite de concentraciones de metales pesados recogidos en el Real Decreto 1310/1990 El tratamiento de residuos sólidos que contienen metales pesados puede dar lugar a la movilidad de estos elementos y su paso a medios líquidos. Por tanto, resulta de interés conocer los valores límite de vertido de los metales pesados. 42 ANTECEDENTES La ley 29/1985, de 2 de Agosto, ley de Aguas, modificada principalmente por la Ley 46/1999, de 13 de Diciembre, recoge los valores límite de diversos parámetros en los vertidos de agua residuales. Los principales metales pesados se recogen en la tabla 10. Elemento Valores límite (mg/l) Cadmio 0,1-0,5 Cobre 0,2-10 Cromo (III) 2-4 Cromo (IV) 0,2-0,5 Niquel 2-10 Mercurio 0,05-0,1 Plomo 0,2-0,5 Zinc 3-20 Tabla 10: Valores límite de concentración de metales pesados (mg/l) permitidos en vertidos de aguas residuales para efluentes con pH 5,5-9,5. 43 ANTECEDENTES 2 BIOLIXIVIACIÓN CON BACTERIAS AZUFRE- OXIDANTES 2.1.BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES Los metales valiosos han sido obtenidos a partir de minerales por lixiviación desde hace cientos de años. Este proceso se creyó que era una reacción química mediada por la presencia de oxígeno y agua hasta 1947, cuando fue demostrada la catálisis bacteriana de la oxidación del hierro y la formación de ácido sulfúrico en las aguas de mina (Colmer y Hinkle, 1947) En la actualidad, el uso de microorganismos para extraer metales a partir de minerales, denominado como biominería, es bien conocido. Los microorganismos participan en la deposición y solubilización de metales pesados de la corteza terrestre desde siempre y esta actividad mayoritariamente ha estado ligada al ciclo del hierro y del azufre. El uso de microorganismos en el procesado de minerales tiene algunas ventajas sobre los métodos fisicoquímicos tradicionales: son compatibles con el medio ambiente, no requieren un elevado costo energético y son útiles en la recuperación de minerales de baja ley (Rawlings, 2002). La biominería incluye términos como biolixiviación y biooxidación. La biolixiviación consiste en la conversión de un metal formando parte de un compuesto insoluble mediante un proceso de oxidación que lo transforma en una forma soluble, permitiendo así la extracción del metal en el medio acuoso. La biooxidación se refiere a los procesos en los cuales la recuperación de un metal es facilitada por la descomposición microbiana del mineral, pero el metal extraído no es solubilizado. Un ejemplo es la recuperación de oro a partir de la arsenopirita, la oxidación se produce 44 ANTECEDENTES sobre otros compuestos del mineral que acompañan al oro, permitiendo la liberación de éste que es posteriormente extraído por cianurización. La aplicación de procesos basados en la biolixiviación permite la obtención de metales a partir de minerales de forma natural pero también a partir de residuos industriales que no pueden ser manejados por técnicas convencionales. No obstante, los procesos de biolixiviación sólo han tomado importancia recientemente en algunas industrias minerales, mientras que la lixiviación hidrometalúrgica química en condiciones ácidas ha sido muy desarrollada (Krebs y col., 1997). Una variedad de microorganismos catalizan la lixiviación de minerales a partir de depósitos minerales y pilas en las minas. Entre ellos, las especies autótrofas Thiobacillus y las especies heterótrofas Aspergillus y Penicillium son las más estudiadas. Krebs y col. (1997), recoge una selección de los microorganismos conocidos por su capacidad potencial para la lixiviación. 2.2. BACTERIAS AZUFRE OXIDANTES Los microorganismos más activos en la biolixiviación de minerales sulfurados son las bacterias que pertenecen al género Thiobacillus, aunque también se conocen especies de otros géneros (Acidianus, Sulfolobus, Leptospirillum) que actúan sobre este tipo de minerales. La lixiviación bacteriana es llevada a cabo en los ambientes ácidos, a valores de pH entre 1,5-3, a los cuales la mayoría de los iones metálicos se mantienen en solución. En estas condiciones las especies acidófilas Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans son las de mayor importancia. Otros miembros de este género son también capaces de oxidar azufre y sulfuros pero sólo crecen a valores de pH mayores a los cuales no todos los iones metálicos se mantienen disueltos. 45 ANTECEDENTES Como resultado del análisis de la secuencia 16S rARN (ARN ribosomial) se incluyen desde el año 2000 dentro del género Thiobacillus las bacterias azufre-oxidantes pertenecientes a las divisiones , y de las Proteobacterias. Con lo cual, el género Thiobacillus fue subdividido en un nuevo género, Acidithiobacillus (At.), para acomodar a los miembros altamente acidófilos que componían el género. Éste incluye At. ferrooxidans, At. thiooxidans y At. caldus (anteriormente conocidos como Thiobacillus ferrooxidans, thiooxidans y caldus, respectivamente)(Nelly y Wood, 2000). 2.1.1 CARACTERÍSTICAS DE Acidithiobacillus ferrooxidans Y Acidithiobacillus thiooxidans. Son bacterias gram-negativas, de forma cilíndrica no esporulada y que habitualmente se encuentran de forma natural en las aguas ácidas de minas (Johnson y Hallberg, 2003; Dopson y col., 2003). Sus características más destacables son (Nemati y col., 1998; Bosecker, 1997; Norris, 1990): • Quimiolitotrófas: obtienen la energía necesaria para su metabolismo a partir de compuestos reducidos o parcialmente reducidos de azufre siendo el producto final de la oxidación el sulfato. • Autótrofas: la fuente de carbono para la síntesis de nuevo material celular la obtienen mediante la fijación de dióxido de carbono atmosférico. Requieren de otros nutrientes como N y P junto con algunos elementos traza. • Aerobias: el oxígeno es el principal aceptor de electrones. • Mesófilas: su óptimo de temperatura se encuentra en torno a 30ºC aunque el rango de temperaturas es muy amplio debido a la gran diversidad de las distintas cepas de estas especies. 46 ANTECEDENTES • Acidófilas: viven en ambientes ácidos (pH<6). A pesar de su similitud estas bacterias difieren en otras características muy relevantes que se describen a continuación y algunas de las cuales se recogen en la Tabla 11. Característica Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus thiooxidans 0,5 x 1-1,5 m 0,3 x 1-1,2 m 15-37 ºC 10-37 ºC Temperatura óptima 30 ºC 30 ºC Rango de pH 1,4-6 0,5-6 2,0 2,0-3,5 Fuente de energía Fe2+,S0, S2-, S2O32-, UO22+ S0, S2O32-, S4O62- Fuente de carbono CO2 CO2 Fuente de nitrógeno NH4+ NH4+ O2, Fe3+ O2 Tamaño Rango de temperatura pH óptimo Aceptores electrónicos Tabla 11: Principales características de Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans. Acidithiobacillus ferrooxidans: es el protagonista en los procesos de biolixiviación (Norris, 1990; Bosecker, 1997). Esta bacteria fue aislada por primera vez en 1947 por Colmer y Hinkle de un drenaje ácido de minas. Morfológicamente es muy similar a At. thiooxidans pero la principal característica que las diferencia es su capacidad para derivar la energía también de compuestos del ión ferroso, por lo que es una bacteria hierrooxidante y esta capacidad la hace partícipe en los distintos mecanismos implicados en la lixiviación de minerales ya que regenera el férrico, que es un importante agente lixiviante. At. ferrooxidans además no es aerobio estricto, y es capaz de crecer anaerobiamente en sustratos de azufre bajo ciertas condiciones empleando Fe(III) como aceptor de electrones (Das y col., 1992; Pronk y col.; 1992, Leduc y Ferroni, 1994) Acidithiobacillus thiooxidans: fue aislado por primera vez en 1922 por Walksman y Joffe, tienen forma de varilla corta, su longitud no supera el 47 ANTECEDENTES micrón y eventualmente poseen un flagelo polar que les confiere una movilidad superior a la observada en At. ferrooxidans. Obtienen la energía necesaria para su metabolismo únicamente a partir de azufre elemental o de compuestos reducidos de azufre (sulfuros, tiosulfatos). La principal diferencia con At. ferrooxidans es su menor contenido en GC (guaninacitosina) en su ADN y su imposibilidad para oxidar hierro, lo cual no le permite la lixiviación por el mecanismo indirecto, ya que ésta involucra la presencia de Fe(III) y, como consecuencia, no solubiliza algunos minerales como la pirita y la calcopirita (Norris, 1990). En la oxidación de los compuestos de azufre, donde el oxígeno molecular es el último aceptor de electrones, se forman una serie de especies intermedias (sulfito, tiosulfato) que tienen diversidad de aplicaciones por sus características reductoras (Donati y Curutchet, 1995). En presencia de la bacteria, la oxidación se completa hasta la formación de ácido sulfúrico, lo que provoca una disminución del pH en el medio que puede alcanzar valores incluso menores de 1 (Imai, 1978). La elevada producción de ácido a partir de una fuente relativamente barata, el azufre elemental, permite su uso como agente lixiviante en variedad de situaciones (Imai, 1978; Schröter y Sand, 1992): descomposición de rocas, solubilización de fósforo procedente de rocas fosfáticas (Donati y Curutchet, 1995) y lixiviación de metales a partir de sulfuros minerales (Suzuki, 2001; Gómez y col., 1999). En cultivo mixto con otras bacterias acidófilas hierro-oxidantes (At. ferrooxidans o Leptospirillum ferrooxidans) pueden contribuir en la disolución de concentrados minerales a través de la oxidación del azufre depositado sobre la superficie mineral que impide el ataque del Fe(III) regenerado por las bacterias hierro-oxidantes (Sasaki y col., 1998, Giaveno y Donati, 2000, Falco y col., 2003) 48 ANTECEDENTES 2.2 MECANISMOS INVOLUCRADOS EN BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES SULFURO. LA En los últimos años se ha profundizado en el estudio de los mecanismos involucrados en la biolixiviación de sulfuros minerales llevada a cabo por las bacterias azufre-oxidantes Actualmente existen aplicaciones de estos procesos implantados comercialmente, como son la recuperación de cobre, uranio y oro (Bosecker, 1997; Rohwerder y col., 2003; Suzuki, 2001). Por ello, es importante conocer los mecanismos que rigen la relación bacteria-mineral. La biolixiviación de minerales sulfuro con bacterias del género Acidithiobacillus ocurre a través de dos mecanismos: directo e indirecto. Existe gran diversidad de trabajos que discuten la existencia o no de éstos o que tratan de describir las reacciones o compuestos involucrados en cada uno de ellos (Suzuki, 2001; Sand y col., 2001; Crundwell, 2003) 2.2.1 MECANISMO DIRECTO Para que ocurra lixiviación bacteriana por mecanismo directo debe existir un contacto directo entre la bacteria y la superficie del sulfuro mineral. La oxidación a sulfato tiene lugar mediante una serie de etapas catalizadas enzimaticamente, que se puede resumir en la siguiente reacción. bacteria MeS + O2 → MeSO4 [1] Donde MeS representa un sulfuro mineral. En el caso de la pirita, el mecanismo es distinto y se necesita la intervención de bacterias hierro-oxidantes, la pirita es oxidada a sulfato férrico de acuerdo con las reacciones: bacteria 4FeS 2 + 14O2 + 4H2 O → 4FeSO4 + 4H2 SO4 [2] 49 ANTECEDENTES bacteria 4FeSO4 + O2 + 2H2 SO4 → 2Fe2(SO4 )3 + 2H2O [3] que se pueden resumir en la reacción: bacteria 4FeS2 + 15O2 + 2H2O → 2Fe2(SO4 )3 + 2H2 SO4 [4] Existen trabajos de Torma (1971 y 1977) que describen la oxidación de algunos minerales sulfuro no ferrosos por parte de At. ferrooxidans: covelita (CuS), calcocita (Cu2S), esfalerita (ZnS), galena (PbS), antimonita (Sb2S3), cobaltita (CoS) y millerita (NiS). Las cuales seguirian una reacción similar a la descrita en la reacción [1]. Existen evidencias de que la bacteria tiene que estar en íntimo contacto con la superficie mineral. El mecanismo de adhesión y el inicio de la solubilización del metal no están aún completamente comprendidos. Si resulta obvio que la bacteria no se adhiere en cualquier lugar de la superficie mineral sino que lo hace en lugares específicos de imperfecciones del cristal y que la solubilización del metal es debida a interacciones electroquímicas. 2.2.2 MECANISMO INDIRECTO En este mecanismo la bacteria genera un agente lixiviante que oxida químicamente al sulfuro mineral. En soluciones ácidas este lixiviante es el ión férrico y la solubilización del metal se puede describir por la reacción: MeS + Fe2(SO4 )3 → MeSO4 + 2FeSO4 + S o [5] Para mantener suficiente hierro en solución la oxidación química del sulfuro metálico debe ocurrir en ambientes ácidos, pH inferior a 5. La cantidad de ferroso formada por la reacción [5] puede ser regenerada por la acción de las bacterias hierro-oxidantes (At. ferrooxidans o Leptospirillum ferrooxidans) que oxidan el ferroso dando lugar a férrico, el cual puede 50 ANTECEDENTES actuar de nuevo como lixiviante. En este mecanismo la bacteria no necesita estar en contacto con la superficie mineral. Las bacterias sólo tienen una función catalítica ya que aceleran la reoxidación de ferroso, que sería mucho más lenta en ausencia de bacteria. Lacey y Lawson(1970) muestran que en el rango de pH 2-3, la oxidación bacteriana de ferroso es aproximadamente 105-106 veces más rápida que la oxidación química. El azufre formado de forma simultánea en la reacción [5] puede ser oxidado a ácido sulfúrico por acción de las bacterias azufre-oxidantes, reacción [6], en este caso la reacción es mucho más rápida para At. thiooxidans que para At. ferrooxidans. bacteria 2 S0 + 3O2 + 2H2O → 2H2 SO4 [6] Un ejemplo bien conocido del proceso de biolixiviación indirecta es la extracción de uranio de minerales; el uranio tetravalente, insoluble, es oxidado a uranio hexavalente, soluble en agua. UIV O2 + Fe2(SO4 )3 → UIV O2 SO4 + 2FeSO4 [7] El lixiviante puede ser generado por At. ferrooxidans por oxidación de la pirita [4] que está frecuentemente asociada a los minerales de uranio. Además del mecanismo indirecto hay evidencias de que esta bacteria puede oxidar UIV a UVI enzimáticamente y empleando parte de la energía de esta reacción para la asimilación del CO2. Aunque, de forma clásica, la biolixiviación está basada en la interacción de procesos de oxidación químicos y biológicos, se le debe atribuir una importancia particular al ciclo de ferroso a férrico. En la naturaleza y en las aplicaciones técnicas ambos mecanismos, directo e indirecto, ocurren simultáneamente. 51 ANTECEDENTES 2.2.3 DISCUSIÓN DE LOS MECANISMOS Como ya se ha referido, existe un debate acerca de la interacción de las bacterias hierro-oxidantes y azufre-oxidantes y los minerales sulfuro. Los defensores del mecanismo directo argumentan que la bacteria posee un mecanismo biológico específico para degradar el mineral y obtener así energía directamente del mineral. Por otra parte, los autores que se decantan por el mecanismo indirecto sostienen que son los iones férricos en solución los que disuelven el mineral y que la bacteria gana la energía necesaria para su metabolismo de la regeneración de los iones férricos (Crundwell, 2003). El mecanismo directo indudablemente ocurre pero algunos creen que no es la ruta predominante. Existen argumentos en la bibliografía que tratan de demostrar la existencia de este mecanismo, basados en la estequiometría, la adhesión bacteriana o mediciones sobre la superficie mineral (Hansford y Drossou, 1988) que no pueden resolver el debate. Crundwell (2003) deduce que la cinética de cada uno de las vías propuestas parece ser el factor crítico y plantea su demostración a partir de un estudio cinético Sin embargo, recientes publicaciones realizadas por Sand y colaboradores (Sand y col., 1995: Schippers y col., 1996; Sand y col., 1996 y 2001; Rohwerder y col., 2003; Kinzler y col., 2003) dudan sobre la existencia del mecanismo directo. Estos investigadores defienden que las bacterias pueden realizar la disolución del sulfuro por mecanismos de contacto o nocontacto. El mecanismo de no-contacto asume que la bacteria sólo oxida los iones Fe(II) a Fe(III) el cual, posteriormente, ataca al sulfuro mineral y es reducido de nuevo a Fe(II). El mecanismo de contacto requiere la adhesión de la bacteria a la superficie del sulfuro y el mecanismo primario para la adhesión a la pirita es de tipo electrostático. En el caso de At. ferrooxidans, exopolímeros de la pared celular contienen iones Fe(III) formando complejos 52 ANTECEDENTES con dos tipos de residuos de ácido urónico, la carga positiva resultante se adhiere a la carga negativa de la pirita. Así, la primera función del férrico es la adhesión, seguida de su función como lixiviante del sulfuro al igual que en el mecanismo de no-contacto. La principal característica del modelo que describen es que los iones Fe(III) y/o los protones son los únicos agentes (químicos) que disuelven un mineral sulfuro. El mecanismo es estrictamente indirecto y la bacteria tiene la función de regenerar los iones Fe(III) y/o H+ y concentrarlos en la interfase mineral/agua o mineral/bacteria para aumentar el ataque del lixiviante y así la degradación. El factor determinante es la capa de exopolímeros ya que en ella tienen lugar los procesos químicos que disuelven el mineral. Basándose en esto, diferencian dos mecanismos de lixiviación: vía tiosulfato y vía polisulfuros. En general, la disolución es alcanzada por combinación de procesos de ataque de protones y oxidación. La vía de lixiviación depende de la especie mineral, el criterio relevante es la reactividad del sulfuro con los protones, es decir, su solubilidad en ácido. Esta propiedad está directamente relacionada con la configuración electrónica. Los sulfuros metálicos cuya banda de valencia es derivada sólo de orbitales del átomo metálico del sulfuro no pueden ser atacados por protones (sulfuros no solubles en ácido). Estos sulfuros se disuelven vía tiosulfato, pertenecen a este grupo la pirita (FeS2), molibdenita (MoS2) y tungstenita (WS2). Aquellos sulfuros cuya banda de valencia está conformada por orbitales del átomo metálico y del sulfuro pueden ser atacados por protones (son más o menos solubles en ácido) y lixivian via polisulfuro. En este grupo están la esfalerita (ZnS), galena (PbS), arsenopirita (FeAsS), calcopirita (CuFeS2) y hauerita (MnS2). La descripción de estos mecanismos se esquematiza en la figura 6 y se puede describir como: 53 ANTECEDENTES A. Vía tiosulfato B. Vía polisulfuro Fe3+ Af, Lf Fe3+ O2 Af, Lf MS Fe2+ H+ O2 MS Fe2+ M2+ + S2O32(Af, At ) M2+ + H2S+ (H2S2) Fe3+, O2 (Af, At ) SnO62- , S6 H2Sn2- , Fe3+, O2 (Af, At) Fe3+, O2 S6 Af, At SO42- + H+ Fe3+, O2 SO42- + H+ Figura 6: Esquema comparativo de los mecanismos de ataque indirecto propuestos por Sand. (A) Via tiosulfato y (B) Vía polisulfuro. (Rohwerder y col., 2003) Los reactivos recuadrados indican que son los productos mayoritarios del proceso. El nombre de las bacterias aparece entre paréntesis cuando la reacción no es sólo llevada a cabo por las bacterias sino también de forma abiótica. Via tiosulfato: El ión férrico ataca al mineral sulfuro mediante la extracción de un electrón reduciéndose a ferroso y obteniéndose del mineral el catión metálico y compuestos de azufre intermedios solubles en agua. Las bacterias hierro-oxidantes (At. ferrooxidans (Af) y Leptospirillum ferrooxidans (Lf)) catalizan el reciclado del ión férrico en condiciones ácidas. El primer compuesto de azufre liberado es el tiosulfato que es oxidado por las bacterias azufre-oxidantes vía tetrationato y otros politionatos para dar finalmente sulfato. También puede darse la acumulación de azufre sino existen bacterias azufre-oxidantes. Para la extracción del electrón se concluye que solo las bacterias oxidantes de ferroso pueden lixiviar sulfuros no solubles en ácido en condiciones ácidas. 54 ANTECEDENTES Vía polisulfuros: En el caso de los sulfuros solubles en ácido la disolución se realiza por la acción combinada de la extracción de electrones por iones férricos y el ataque del protón, es decir, el enlace del protón a la parte sulfuro del mineral mediante los electrones de la banda de valencia. La unión metal-sulfuro en el mineral puede ser rota por el ataque del protón, después de que dos protones se hayan unido se libera sulfuro de hidrógeno. A su vez, el férrico puede oxidar el azufre del mineral liberando catión sulfuro que dimeriza espontáneamente a disulfuro(H2S2) y se oxida, posteriormente, vía polisulfuro y radicales polisulfuro a azufre elemental. La acción oxidante del ión férrico no es prerrequisito para la vía polisulfuro, ya que, en este caso, la unión metal-sulfuro puede ser rota por el ataque de protones, así que los sulfuros metálicos solubles en ácido pueden ser disueltos por la actividad de las bacterias azufre-oxidantes. En ausencia de Fe(III), estas bacterias oxidan el sulfuro de hidrógeno liberado del ataque del protón al mineral a azufre elemental y luego a ácido sulfúrico, regenerando así los protones previamente consumidos por la disolución del mineral. 2.3 FUNCIÓN DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN LA LIXIVIACIÓN DE MINERALES SULFURO. En las dos rutas descritas, las bacterias hierro-oxidantes tienen un papel primordial en la regeneración de Fe(III), que es el principal agente lixiviante en este tipo de ambientes ácidos. Los microorganismos oxidantes de ferroso controlan el potencial redox de éstos ambientes, el cual se determina principalmente por la relación Fe(III)/Fe(II) en solución. Por su parte, las bacterias oxidantes de azufre contribuyen a la transformación de los compuestos intermedios de azufre a ácido sulfúrico, fuente de protones (Schippers y Sand, 1999; Schippers y col., 1999). En el caso del azufre elemental esta transformación es llevada a cabo 55 ANTECEDENTES exclusivamente por las bacterias ya que esta especie es inerte a la oxidación abiótica en medios ácidos. Esto hace que en ausencia o estado de inhibición de estas bacterias el azufre elemental se acumule en el curso del proceso de disolución del mineral sulfuro. El azufre elemental puede estar suspendido, en forma de agregados o cristales libres, o formando una capa sobre la superficie del mineral (Fowler y col., 1999; Mustin y col., 1993). En este último caso, las propiedades electroquímicas de la superficie mineral podrían cambiar y/o formarse una barrera que reduciría la velocidad de difusión de los iones lixiviantes y el oxígeno para interaccionar con el mineral, lo cual influye negativamente en la velocidad de lixiviación. Las bacterias azufre-oxidantes tienen entonces una doble función en la lixiviación de minerales sulfuro: • la producción de ácido sulfúrico a partir de compuestos de azufre reducido para la regeneración de los protones consumidos en la etapa inicial de la lixiviación (vía polisulfuros). • la eliminación del azufre acumulado sobre la superficie mineral. 2.4 ADHESIÓN BACTERIA-MINERAL La mayoría de las bacterias lixiviantes crecen adheridas a la superficie de los minerales sulfuro. Se conoce que el proceso de adhesión es predominantemente mediado por la presencia de sustancias poliméricas extracelulares, conocidas como EPS (del inglés “extracellular polymeric substances”) (Sand y col., 2001, Gehrke y col., 1995). Hay suficientes evidencias que demuestran la función de una capa orgánica en la interacción bacteria-sustrato. Estas películas han sido observadas en células de At. ferrooxidans crecidas en pirita y para comprender su función en los procesos de biolixiviación se ha estudiado su composición en este sistema 56 ANTECEDENTES (Gehrke y col., 1995). Para llevar a cabo la lixiviación de la pirita, las células de At. ferrooxidans atacan la superficie mineral por medio de sustancias exopoliméricas excretadas (lipopolisacáridos) y oxidan el mineral a ácido sulfúrico e iones férrico. El ataque primario a la pirita (pH 2) es mediado por un complejo exopolímero-Fe(III). Se cree que la especie de hierro se une a subunidades de ácido glucurónico, este complejo tiene una carga neta positiva que interacciona electrostáticamente con la carga negativa de la superficie del sustrato, pirita. La figura 7 representa un modelo de mecanismo de lixiviación de la pirita por adhesión de células de At. ferrooxidans. membrana externa Medio de lixiviación espacio periplasmático (O2, Fe3+, Fe2+, SO42-) membrana citoplasmática glóbulos de azufre bacteria EPS S2O32Fe2+ Fe3+ pirita Figura 7: Representación de lixiviación por mecanismo de contacto catalizada por una célula de At. ferrooxidans. La célula queda embebida en la capa de EPS adhiriéndose a la pirita por interacción electrostática. Durante la oxidación de tiosulfato y tetrationatos puede formar agregados de azufre elemental y politionatos en el espacio periplasmático (glóbulos de azufre) (Rohwerder y col., 2003) 57 ANTECEDENTES La capa de exopolímeros formando complejos con Fe(III) constituye un lugar de reacción en el cual el proceso de disolución tiene lugar (Fowler y col., 1999; Tributsch, 1999). Este puede ser interpretado como un compartimento donde algunas condiciones especiales, aunque todavía no bien conocidas, prevalecen (pH, potencial redox, concentración de iones, etc.) (Sand y col., 1999). Existen estudios dirigidos a determinar la correlación entre la cantidad de iones férrico que se encuentran dentro de la capa formada por los EPS y la actividad oxidativa de At. ferrooxidans (Kinzler y col., 2003). Otros estudios tratan de demostrar la importancia de este tipo de compuestos realizando estudios con bacterias At. ferrooxidans a las cuales se les ha desprendido la capa de sustancias exopoliméricas. Se observa una disminución de la capacidad oxidativa pero en pocas horas la capa de EPS es producida de nuevo. La adición de compuestos exocelulares a las células previamente desprendidas de ellos también regenera la capacidad oxidativa en poco tiempo, alcanzando niveles de lixiviación similares a los obtenidos con las células sin tratar (sin modificar sus EPS) (Sand y col., 2001). Las células que crecen sobre azufre, sin hierro, exhiben una composición diferente de sus exopolímeros, constituyen una superficie fuertemente hidrofóbica y no atacan la pirita. En el estudio de sus EPS no se ha detectado la presencia de acido glucurónico ni férrico pero si un aumento del fosfato. Por tanto, es evidente que el sustrato influye en la estructura química de los exopolímeros, aunque no todos los mecanismos de regulación están aún clarificados. Considerando las propiedades de superficie de la bacteria, la adhesión al azufre se piensa que está regida por fuerzas de atracción de carácter hidrófobo (Van de Waals), mientras que la adhesión a la pirita es debida a fuerzas electrostáticas. 58 ANTECEDENTES En ausencia de iones Fe(III) At. ferrooxidans actúa del mismo modo que At. thiooxidans, por oxidación del azufre. El conocido como mecanismo directo de lixiviación de sulfuros metálicos puede no ser más que la oxidación biológica del azufre elemental formado químicamente para dar sulfato. 2.5 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA BIOLIXIVIACIÓN La efectividad de la biolixiviación depende en gran medida de la eficiencia de los microorganismos y de la composición química y mineralógica del mineral a ser lixiviado. La extracción máxima de metal puede ser alcanzada sólo cuando las condiciones de lixiviación corresponden a las condiciones óptimas de crecimiento de la bacteria. Entre los factores que intervienen en este proceso destacan: Nutrientes: Los microorganismos que se emplean para la extracción de metales de minerales sulfuro son bacterias quimiolitotrófas, con lo cual, sólo requieren compuestos inorgánicos para su crecimiento. En general, los nutrientes minerales son obtenidos del medio ambiente y a partir del mineral lixiviado. Para un crecimiento óptimo es necesaria la presencia de la cantidad adecuada de hierro, azufre y sales de amonio, fosfato y magnesio. O2 y CO2: Para el adecuado crecimiento y actividad oxidativa se requiere suplemento de oxígeno. En el laboratorio puede ser obtenido por aireación o agitación. A mayor escala, como en las acumulaciones al aire libre de mineral (dump o heap leaching) el suministro del oxígeno requerido puede tener ciertas dificultades. El dióxido de carbono es la única fuente de carbono requerida pero normalmente no es necesaria una adición externa de CO2. 59 ANTECEDENTES pH: es importante el correcto ajuste del pH al valor óptimo para el crecimiento de la bacteria y su capacidad de solubilización. El pH óptimo, así como el rango de pH, en el que la bacteria trabaja con efectividad varía de una cepa a otra, por tanto, es importante conocerlos por medio de la literatura o mediante trabajos experimentales. Temperatura: El óptimo de temperatura para el crecimiento y la lixiviación de las bacterias azufre-oxidantes se encuentra en torno a 30ºC, aunque al igual que para el pH existe una gran variabilidad en función de la cepa empleada y del pH al que se encuentre el medio. Sustrato mineral: La composición mineralógica del sustrato a lixiviar es de gran importancia. Un alto contenido en carbonato del mineral puede aumentar el pH del líquido lixiviado inhibiendo o suprimiendo la actividad bacteriana. Los bajos valores de pH necesarios para la lixiviación pueden ser alcanzados por un aporte externo pero esto puede provocar la formación o precipitación de algunos compuestos (yeso) y afectar al coste del proceso. La velocidad de lixiviación depende también de la superficie total del sustrato. Una disminución del tamaño de partícula se traduce en un aumento del área superficial dando lugar a una mayor cantidad de metal producido para una masa igual de mineral. Metales pesados: La lixiviación de sulfuros metálicos da lugar al incremento de la concentración de metales disueltos en el lixiviado. En general, las bacterias lixiviantes, y entre ellas las azufre-oxidantes, tienen la capacidad de tolerar concentraciones relativamente elevadas de metales pesados (De y col., 1997). Diferentes cepas de una misma especie presentan sensibilidades muy diferentes a un mismo metal. Por ello, es importante conocer la tolerancia de las bacterias que se van a emplear en un proceso de lixiviación a los metales concretos que se encuentran en el mineral. Con bastante frecuencia, estos microorganismos también 60 ANTECEDENTES presentan la capacidad de adaptarse a niveles mayores de un metal por continuos subcultivos a concentraciones incrementadas gradualmente del metal a estudiar (Novo y col., 2000; Boyer y col., 1998; Baillet y col., 1997 y 1998). Agentes surfactantes y “extractantes” orgánicos: estos compuestos empleados como disolventes en la extracción generalmente tiene efectos inhibitorios sobre la lixiviación bacteriana, principalmente porque disminuye la tensión superficial y la transferencia de oxígeno. 2.6 TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES La extensa aplicación de las bacterias azufre-oxidantes a la biolixiviación se debe a su capacidad de oxidación mediante los mecanismos ya descritos y a su elevada tolerancia a los metales pesados en solución. Esto hecho provoca que una vez lixiviado el mineral, si el metal que pasa a la solución está a una concentración no tóxica para la bacteria, no afectaría de forma significativa al metabolismo celular, de lo contrario produciría su inhibición o muerte. Para la aplicación de estas bacterias a procesos concretos de lixiviación es necesario conocer los límites de tolerancia de la bacteria frente a los metales presentes en el mineral y a las condiciones en que se va a trabajar posteriormente, esto permite diseñar un proceso que trabaje con concentraciones de metal adecuadas para el crecimiento y capacidad oxidativa de la bacteria. Existen muchos estudios dedicados a conocer la tolerancia de estas bacterias a distintos metales pesados. En su mayoría se refieren a Acidithiobacillus ferrooxidans debido a su tradicional uso en la biolixiviación y los numerosos trabajos desarrollados para estudiar el efecto de diversos 61 ANTECEDENTES parámetros sobre la capacidad de oxidación del ión ferroso de esta bacteria. En las tablas 12 y 13 se recogen datos de tolerancia de distintas cepas de At. ferrooxidans y At. thiooxidans a varios metales pesados. Se pueden observar que no existen niveles absolutos de tolerancia para los iones metálicos, ya que dependen de la cepa utilizada y su estado fisiológico, su historial previo de exposición al tóxico en cuestión y las condiciones ambientales durante la exposición, así como el método utilizado para la determinación de la toxicidad o la tolerancia. Además, los niveles de tolerancia pueden incrementarse por reinoculación del microorganismo a concentraciones más altas del ión tóxico de manera progresiva. Así, la resistencia ligada a la adaptación de una especie a un metal en concreto puede incrementar o disminuir la tolerancia del organismo a otros metales (Tuovinen y col., 1971). Los mecanismos de toxicidad de los metales y la resistencia bacteriana son complejos y no están completamente comprendidos, no obstante, se han propuesto algunos mecanismos para ciertos metales (Hutchins y col., 1986). En los estudios acerca de la resistencia de Acidithiobacillus ferrooxidans a determinados metales pesados se encuentra una gran disparidad de datos debidos, principalmente, a que las cepas que se estudian en cada caso son distintas y a que las condiciones experimentales de los estudios no son siempre las mismas. Los primeros trabajos acerca de la tolerancia de At. ferrooxidans a los metales pesados fueron realizados por Tuovinen y col.(1971) e Imai y col.(1979). En los últimos años, un gran número de trabajos se han enfocado al estudio de la tolerancia natural de esta especie y al aumento de su capacidad para tolerar un metal por continuos subcultivos en cantidades iguales o crecientes del metal. 62 ANTECEDENTES Ion metálico Cobre Cadmio Zinc Níquel Cromo Limite tolerancia (g/l) Referencia 4,5 Tuovinen y col. (1971) 0,63 Imai y col. (1975) 5 Brahmaprakash y col. (1988) 10 Hubber y nStetter (1990) 63,5 Rossi (1990) 10 Leduc (1997) 25 Das y col. (1997) 19 Boyer y col. (1998) 12,7 Novo y col. (2000) 10 Cabrera y col. (2005) 1,12 Imai y col. (1975) 0,112 Rossi (1990) 56,2 Baillet y col. (1997) 10 De y col. (1997) 0,5 Cerruti y col. (1998) 67,2 Novo y col. (2000) 10 Cabrera y col. (2005) 10 Trevors y col. (1985) 70 Kondratyeva y col. (1995) 6,5 Rossi (1990) 40 Das y col. (1997) 30 Cabrera y col. (2005) 0,006 Tuovinen y col. (1971) 0,06 Imai y col.(1975) 10 Hubber y Stetter (1990) 9,4 Leduc (1997) 19 Chisholm y col. (1998) 58,7 Dew y col. (1999) 35,2 Novo y col. (2000) 30 Cabrera y col. (2005) 0,02 Sisti y col. (1998) 3,9 Baillet y col. (1998) 0,4 Cabrera y col. (2005) Tabla 12: Límites de tolerancia de At. ferrooxidans a distintos iones metálicos 63 ANTECEDENTES Ion metálico Limite tolerancia (g/l) Referencia Zinc 39 Sakamoto y col. (1989) Cadmio 45 Sakamoto y col. (1989) As(III) 5 Collinet y Morin (1990) As(IV) 40 Collinet y Morin (1990) Fe(II)/Fe(III) 30/10 Sluszny (1995) Al(III) 10 Sluszny (1995) Cu(II) 6,5 Matlakosvka y Sklodowska (2001) Tabla 13: Límites de tolerancia de At. thiooxidans a distintos iones metálicos Baillet y col. (1997) estudiaron la tolerancia de una cepa de At. ferrooxidans exponiéndolo a un amplio rango de concentraciones de ion cadmio(II). Una vez encontrado el límite de tolerancia (56,25 g Cd(II)/l) expusieron al cultivo a dicha concentración hasta observar que el tiempo de oxidación de ferroso y la producción bacteriana toman valores similares a los encontrados para el cultivo sin presencia de metal. A esto lo llaman cultivo adaptado y, posteriormente, lo suplementan con cantidades superiores de metal. Se observa que en presencia del ión cadmio se produce una adaptación genética, tras varios subcultivos sin añadir metal, la adición de cadmio al cultivo provoca una respuesta mejor a la obtenida cuando se añade metal por primera vez, lo que indica que la exposición previa al tóxico ha generando un cambio permanente en la bacteria. De lo contrario, si el cultivo, tras varios subcultivos sin presencia del tóxico, hubiera respondido de forma similar a cuando se añade por primera vez metal, la exposición al tóxico produce un cambio no permanente o reversible, la bacteria vuelve a su estado normal cuando el estímulo (metal) cesa, adaptación fisiológica. En otro trabajo, Baillet y col. (1998) estudiaron la tolerancia al cromo, en este caso el límite de tolerancia fue encontrado para 3,9 g Cr(III)/l, encontrándose que para posteriores subcultivos no mejora de forma 64 ANTECEDENTES significativa el tiempo necesario para la oxidación del sustrato ni aumenta la producción bacteriana. Sisti y col. (1998) estudiaron la tolerancia de At. ferrooxidans y At. thiooxidans al ion cromo (III), observando efecto inhibitorio a partir de los 20 mg Cr(III)/l pero tras varios subcultivos, se alcanza una tolerancia de 0,5 g Cr(III)/l. Das y col. (1997) presentaron valores de tolerancia para distintas cepas de esta bacteria al cobre y al zinc. Por distintos subcultivos consiguieron obtener cultivos adaptados a estas concentraciones con un tiempo de oxidación de ferroso similar al de un cultivo control (sin metal). Existen otros estudios de adaptación al cobre, Boyer y col. (1998) que encontraron el límite de tolerancia a este metal para At. ferrooxidans en 19 g Cu(II)/l, la adaptación del cultivo les permitió doblar este valor, alcanzando los 38 g Cu(II)/l. Por otra parte, Novo y col. (2000) presentaron la inhibición de una cepa At. ferrooxidans LR para 12,7 g Cu(II)/l. El cultivo una vez crecido en presencia de este metal se puso en presencia de cobre, cadmio, níquel o zinc a concentraciones conocidas como toleradas. Sólo se observó una mejora en el crecimiento bacteriano en el cultivo con cobre, lo cual sugiere la implicación de un mecanismo de especiación de la bacteria en la resistencia a metales. Posiblemente, debido al estrés al que se somete la célula por la exposición al metal, se produce un cambio en la ruta de síntesis de proteínas que impide o disminuye la capacidad para resistir otras especies metálicas. En algunos de estos trabajos el estudio del límite de tolerancia se realiza como paso previo a la utilización de esta bacteria como biosorbente (Boyer y col., 1998, Baillet y col., 1997 y 1998). 65 ANTECEDENTES 2.7 APLICACIONES DE LA BIOLIXIVIACIÓN BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES. CON La aplicación de las bacterias azufre-oxidantes en la obtención de metales a partir de minerales ha permitido conocer las condiciones favorables y los mecanismos involucrados en la disolución de metales. El desarrollo de investigaciones con minerales simples ha provocado, en primer lugar, la aplicación y el estudio de esta capacidad bacteriana a residuos contaminados habitualmente por metales (lodos, sedimentos, suelos…) y, en segundo lugar, la aplicación a escala industrial de los procesos con resultados más ventajosos. En este capítulo se realiza un recorrido general por las tendencias observadas en los trabajos desarrollados por distintos autores dirigidos al estudio de los procesos de biolixiviación con bacterias azufre-oxidantes en distintos sustratos. 2.7.1 BIOLIXIVIACIÓN DE MINERALES La capacidad de las bacterias azufre-oxidantes para la extracción de metales a partir de minerales de baja ley ha sido muy estudiada. (Tipre, 2004; Gómez y col., 1999; Donati y col., 1996). Existen trabajos dedicados al estudio de la lixiviación de la pirita con Acidithiobacillus ferrooxidans. Estos procesos se basan en la oxidación del Fe(II) a Fe(III) por parte de esta bacteria y el ataque del ion férrico al mineral (Fowler y col., 1999). La tendencia en los últimos años es la selección de una cepa o consorcio de ellas más adecuadas para la solubilización del mineral, determinar la cantidad de sustrato necesaria para llevar a cabo este proceso, así como estudiar el mecanismo responsable del proceso de lixiviación. 66 ANTECEDENTES La biolixiviación de covelita (CuS) ha sido estudiada en numerosos trabajos. Así, Donati y col. (1996) estudiaron la influencia del sustrato sobre la biolixiviación de la covelita empleando cultivos puros y mixtos de At. ferrooxidans y At. thiooxidans. En presencia de Fe(II) At. ferrooxidans lo oxida generando Fe(III) que ataca el mineral hasta que el proceso se ralentiza por la presencia de jarositas, lo cual no permite una lixiviación elevada. La lixiviación en estas condiciones con At. thiooxidans comienza por la oxidación química del ferroso y el ataque del férrico a la covelita, que da lugar a cobre soluble y azufre, que es oxidado por la bacteria. El ácido obtenido ataca al mineral y proporciona un ambiente de bajo pH donde se evita la formación jarositas. En presencia de azufre elemental la biolixiviación se debe al ataque ácido, siendo mayor para At. thiooxidans por su tendencia a crecer hasta un pH más bajo, esta bacteria produjo el mayor porcentaje de biolixiviación. En un trabajo posterior (Pogliani y Donati, 2000) se intentó comprobar que la biolixiviación de covelita por la acción de At. ferrooxidans y At. thiooxidans se podía extrapolar a un sistema más complejo que un sulfuro puro (mineral de covelita, magnetita y pirita). El estudio se realizó con adición de ferroso o de férrico o ninguno de ellos. Cuando no se adiciona hierro la mayor lixiviación es obtenida por At. ferrooxidans, esencialmente debido a un mecanismo directo, y At. thiooxidans una vez que el hierro presente en el propio mineral es oxidado por el aire, la bacteria oxida el azufre formado. Los cultivos inoculados con férrico y el cultivo At. ferrooxidans con ferroso (oxidación casi instantánea a férrico) muestran una disolución del cobre similar en el tiempo. La extracción de cobre no fue máxima, dado que la presencia de férrico produce la precipitación de jarositas, impidiendo en cierto grado la solubilización. La mayor solubilización se obtuvo para At. thiooxidans suplementado con ferroso, lo cual corrobora 67 ANTECEDENTES el mecanismo propuesto en el estudio de la biolixiviación de la covelita pura. En un trabajo más reciente (Falco y col., 2003) se consideró la posibilidad de obtener una mayor lixiviación de la covelita mediante un cultivo mixto de At. thiooxidans y la bacteria hierro-oxidante Leptospirillum ferrooxidans. El estudio también se realizó con y sin adición de ferroso. En esta ocasión también se comprobó la mayor lixiviación para At. thiooxidans en presencia de ferroso. Está comprobado que la biolixiviación de metales procedentes de minerales está regida en gran parte por la adhesión previa de la bacteria al mineral (Pogliani y Donati, 1999; Sand y col., 2001; Porro y col., 1997). Por ello algunos trabajos han sido desarrollados para intentar relacionar ambas propiedades. Porro y col. (1997) desarrollaron un trabajo para tratar de establecer la relación existente entre las propiedades superficiales (hidrofobicidad) de At. ferrooxidans y At. thiooxidans crecidos en diferentes fuentes de energía, no sólo con la capacidad de adhesión sino también con la eficacia de biolixiviación de diferentes sustratos (azufre (Sº), molibdenita (MoS2) y covelita (CuS)). Las bacterias crecidas en azufre, sustrato hidrófobo, se adhieren en gran medida a sustratos de carácter hidrófobo como la molibdenita y el azufre. At. ferrooxidans crecido en medios con ferroso presentó una elevada adhesión a la covelita, un sustrato más hidrofílico, que cuando es crecido sobre azufre. Se demostró una clara relación entre la adhesión sobre diferentes sustratos y la fuente de energía empleada. Sin embargo, no se observó una relación tan directa entre las células adheridas y la eficacia de biolixiviación, el ataque de At. thiooxidans a la covelita fue elevado a pesar de que no se dio una elevada adhesión celular. 68 ANTECEDENTES El estudio de biolixiviación de minerales no sólo se ha realizado sobre los sulfuros minerales más comunes. Existen, entre otros, trabajos acerca de la biolixiviación de molibdeno a partir de un mineral de cobre (Nasernejad y col., 1999) o de la lixiviación de níquel de un sulfuro de níquel poco común, Ni3S2 (Giaveno y Donati, 2001). Los resultados positivos obtenidos en los estudios básicos de biolixiviación de ciertos minerales hace pensar en la aplicabilidad real de éstos y se han desarrollado estudios con el objetivo de conocer las condiciones óptimas para la biolixiviación de minerales complejos. En su trabajo, Gómez y col. (1999) estudiaron las condiciones óptimas para la biolixiviación de un mineral complejo mediante un cultivo mixto de At. ferrooxidans, At. thiooxidans y Leptospirillum ferrooxidans. Se estudio la influencia del medio nutriente, la agitación, la densidad de pulpa del mineral, la adición o no de dióxido de carbono y la temperatura. Los mejores resultados se obtienen con medio 9K sin hierro, densidad de pulpa del 5% y agitación mecánica. La mayor lixiviación para cobre ocurrió a 30ªC y fue por ataque directo, para el zinc aumenta con la temperatura y la disolución fue mayoritariamente química. Tipre y col. (2004) estudiaron la biolixiviación de otro concentrado mineral de cobre, plomo y zinc con un consorcio bacteriano formado por At. ferrooxidans, At. thiooxidans, Leptospirillum ferrooxidans y organismos heterótrofos. El experimento en discontinuo mostró para 20% p/v de mineral la mayor solubilización (73% de Cu y 84% de Zn). La extracción mediante un sistema en semi-continuo y densidad de pulpa del 25% p/v solubilizó 79% de Cu y 82% de Zn y la operación en continuo en un reactor de tanque agitado obtuvo extracciones del 85,3% y 80% de Cu y Zn, respectivamente. La biolixiviación en continuo con la adición controlada del mineral se prevé 69 ANTECEDENTES como una tecnología viable económicamente para la extracción de metales de un concentrado mineral. La capacidad oxidativa de las bacterias azufre-oxidantes también se aplica en procesos de biooxidación, como en los minerales refractarios de oro, donde la tarea de estas bacterias es lixiviar los metales constituyentes del concentrado de minerales que acompaña al metal valioso para favorecer su extracción, este proceso está aplicado tecnológicamente en algunos lugares (Nestor y col., 2001). 2.7.2 BIOLIXIVIACIÓN DE LODOS En las plantas de tratamiento biológico de aguas se procesan elevados volúmenes de aguas residuales urbanas y de aguas residuales industriales, lo cual genera una cantidad desmesurada de lodos, que la mayoría de las veces son depositados en el medio ambiente sin tratamiento previo (incineración, landfilling, descargas en el mar, aplicación a suelos agrícolas… (Xiang y col., 2000)). Se ha demostrado que la aplicación agrícola de los lodos es un medio factible y efectivo por la aportación de constituyentes beneficiosos para el crecimiento de las plantas y, a su vez, la mejora de las propiedades físicas del suelo (Chang y col., 1984). Aunque los lodos de aguas residuales poseen buenas características fertilizantes, la presencia de metales pesados restringe su uso. La reducción de metales pesados por medio del control de la fuente que los genera es un proceso caro y complicado ya que, con frecuencia, es difícil identificar las fuentes de origen de los metales presentes en el lodo por la diversidad de contribuciones que puede tener una planta de aguas residuales. La eliminación de metales antes de la aplicación a la tierra de los lodos puede ser una mejor opción. Existen varios métodos químicos, como la extracción con AEDT o el tratamiento con ácidos, que han sido aplicados con este objetivo. La 70 ANTECEDENTES extracción con AEDT muestra una elevada eficacia de eliminación para el Cu, Pb y Cd pero, sin embargo, baja para Fe, Ni y Cr (Jenkins y col., 1981). En los tratamientos ácidos se emplean ácidos orgánicos y minerales para solubilizar metales a bajos pH, se obtienen elevadas eficacias pero las dificultades de operación y el elevado consumo de agentes químicos hace poco atractivos estos métodos (Hayes y col., 1980). Se ha desarrollado y demostrado que los procesos de biolixiviación aplicados a este tipo de residuos constituyen una tecnología prometedora. En las últimas décadas, muchos trabajos han sido dirigidos a investigar la eficacia de la eliminación de metales pesados procedentes de lodos residuales por medio de métodos de biolixiviación, empleando bacterias acidófilas hierro-oxidantes y/o azufre-oxidantes como At. ferrooxidans y At. thiooxidans (Tyagi y col., 1988 y 1991; Jenkins, 1988; Chartier y Couillard, 1997). Estos procesos pueden disminuir en un 80% los costes si lo comparamos con un método químico tradicional. Los distintos estudios realizados hasta el momento han sido, en su mayoría, enfocados a determinar la influencia de los diversos parámetros que intervienen en la biolixiviación. Algunos estudios previos (Tyagi y col., 1988; Blais y col., 1993) indican la necesidad de la preacidificación del lodo a pH menores de 4,5, lo cual limita su aplicación industrial por el consumo de ácido que esto implica. Además, esto puede provocar otros efectos como la acidificación del suelo enmendado con lodo. Por otra parte, la biolixiviación genera un ambiente fuertemente oxidante y una disminución del pH que, además de solubilizar los metales, digiere gran parte la materia orgánica presente en el lodo, lo cual puede provocar la pérdida de algunos nutrientes que le restan valor nutritivo al lodo resultante. 71 ANTECEDENTES Entre los estudios acerca de la biolixiviación de lodos existen muchos enfocados a determinar la influencia de algunos parámetros sobre este tipo de procesos. Así, Wong y col. (2001) estudiaron el efecto del pH inicial en la biolixiviación de lodos anaerobios mediante un cultivo indígena de At. ferrooxidans. Se observó una disminución del pH de 3-7 a 2,1-2,4 en tan sólo 6 días. En cuanto a la biolixiviación, después de 16 días de incubación se obtuvieron porcentajes de eliminación bastante elevados: 50,2-78,4 % de Cr, 63,7-74,1% de Cu, 74,9-88,2% de Zn y 15,5-38,6% de Ni. Xiang y col. (2000) estudiaron la influencia del sulfato ferroso presente en el medio sobre la biolixiviación de lodos anaerobios realizada por un cultivo indígena de bacterias azufre-oxidantes. La biolixiviación de los distintos metales fue dispar. La solubilización de cromo se mostró dependiente del crecimiento del cultivo, sin embargo, la solubilización del zinc ocurrió en función del pH del medio. Cobre, níquel y plomo tras llegar a un máximo de lixiviación presentaron fluctuaciones por efectos de readsorción o formación de complejos. Se consiguió solubilizar: 70,6 % de Cr(III), 87% de Zn(II), 91,5% de Cu(II), 54% de Ni(II) y 16% de Pb. Los niveles de los metales que quedaron en el lodo estaban dentro de los límites permitidos por la legislación. La solubilización en el rango de temperaturas de 20-40ºC mostró valores entre 37-41% de Cr, 53-56% de Cu, 63-68% de Ni, 50-59% de Pb y 7785% de Zn. Tras una mayor fase de latencia, los cultivos a 20ºC alcanzan valores de solubilización similares en torno a los 10 días. Otros trabajos tratan de estudiar como influye la presencia de sólidos y de una fuente de energía en la biolixiviación de metales presentes en lodos por parte de las bacterias azufre-oxidantes. 72 ANTECEDENTES Lombardi y col. (2001) estudiaron la biolixiviación del zinc presente en un lodo con cultivos At. ferrooxidans con y sin presencia de Fe(II), At. thiooxidans con y sin presencia de Sº y un control. El porcentaje de solubilización del Zn fue aproximadamente del 85-90% para At. thiooxidans con azufre y el 80% para At. ferrooxidans con hierro, At. thiooxidans produce una mayor solubilización pero At. ferrooxidans lo realiza en un menor tiempo, ya que At. thiooxidans requiere una primera etapa de oxidación de azufre para producir ácido sulfúrico para la lixiviación del metal, mientras At. ferrooxidans puede solubilizar el metal por ataque del férrico generado por la oxidación del ferroso presente en el medio. Por otra parte, es importante verificar, tras el proceso de biolixiviación, como afecta la especiación química a los metales que quedan en el lodo. Con este objetivo en varios trabajos (Villar y col., 2001; Lombardi y Garcia Jr, 2001) se realizan procedimientos de extracción secuencial para determinar el reparto de los metales en cada una de las fracciones del lodo y determinar la biodisponibilidad del metal residual que permanece tras la biolixiviación ya que, en ocasiones, los metales pueden mostrar una mayor movilidad y afectar en mayor medida al suelo y las plantas, una vez que el lodo sea aplicado con fines agrícolas, con lo cual, el proceso de biolixiviación podría producir un efecto global negativo. El estudio realizado por Matlakowska y Sklodowska (2001) se dirigió a evaluar la efectividad de biolixiviación de cobre y cadmio por un cultivo puro de At. ferrooxidans o mixto con At. thiooxidans, con distintos sustratos (azufre, covelita y calcocita) en distintos tipos de lodos (lodos primarios, lodos anaerobios, lodos deshidratados y lodos deshidratados preacidificados). Los lodos anaerobios y deshidratados parecen ser los más indicados para ser lixiviados, tras 21 días se alcanzó una extracción del 40- 73 ANTECEDENTES 50% de Cd y Cu. La biolixiviación en todos los casos fue más efectiva en el caso del cultivo mixto suplementado con azufre. Habitualmente los lodos son sometidos a procesos de incineración, esto hace que la idea de biolixiviación de metales también sea trasportada a este tipo de residuos. Existen diversos trabajos enfocados al estudio de procesos de biolixiviación con bacterias azufre-oxidantes sobre las cenizas resultantes de la incineración de residuos. Ting y col. (2001) realizaron un estudio comparativo entre la lixiviación química y la biolixiviación por At. ferrooxidans de algunos metales para diferentes densidades de pulpa de estas cenizas. La lixiviación química para 1% p/v de cenizas con ácido sulfúrico 1M (77,5% Al, 42,3% Zn, 15,9% Pb, 7,0% Cu y 26,9% Mn) fue más eficiente en el tiempo y la solubilización del plomo pero la biolixiviación con At. ferrooxidans (75,3% Al, 44,7% Zn, 4,4% Pb, 11,6% Cu y 84,5% Mn) mostró mayor solubilización de cobre y manganeso, los resultados para aluminio y zinc fueron similares. Krebs y col. (2001) estudiaron también la biolixiviación de metales presentes en cenizas con cultivos Acidithiobacillus en función de la cantidad de ceniza presente y de la adición o no de lodos anaerobios (fuente de nutrientes, energía y flora indígena). La incorporación de lodos produce un aumento de la población bacteriana y un mayor descenso del pH, dando lugar a un menor tiempo necesario para la solubilización. Para densidades entre 0,5-4%, pH 1-1,5, se obtuvo la solubilización del 80% de Cd, Cu y Zn, el 60% de Al, 30% de Ni, 10% de Cr y 5% de Pb, lo que supone el 50% del total de metales presente en la ceniza. Otros trabajos se han dirigido a la aplicación de la biolixiviación a residuos concretos, como pueden ser los lodos procedentes de la actividad industrial. Solisio y col. (2002) aplicaron At. ferrooxidans a la remediación de lodos procedentes de dos tipos de industrias, lodos de la producción de 74 ANTECEDENTES aleaciones de hierro-manganeso (alto contenido en Zn) y lodos procedentes de una planta de oxidación anódica de aluminio (alto contenido en aluminio). En el lodo rico en zinc se presentó una solubilización del 73% de zinc para un 10% de contenido en lodo, sin embargo, el lodo rico en aluminio sólo presentó una solubilización importante (78-77%) para un contenido en lodo menor del 3%. Al igual que los lodos, los sedimentos también presentan elevado contenido en metales pesados. En su trabajo Chartier y Couillard (1997) presentaron el estudio de los parámetros que influyen en la biolixiviación de sedimentos por At. ferrooxidans (pH inicial, % de inóculo, incorporación de nutrientes). Se observó que la biolixiviación del cobre dependía de la presencia de bacteria y la lixiviación el zinc y el plomo se debió a la presencia de ácido en el medio. En general, se obtuvo una lixiviación aceptable del contenido en cobre (60-80%) y zinc (80-90%) pero no para el plomo (< 30%), el pH afecta la solubilidad de este metal, el nivel de plomo queda en valores superiores a los permitidos por la legislación. Otro trabajo realizado por estos autores (Mercier y col., 1996) se dirige a la mejora de las condiciones para la solubilización del plomo en sedimentos acuáticos. Para evitar una elevada concentración de sulfato se sustituyó el sulfato ferroso por cloruro ferroso, como fuente de energía para At. ferrooxidans, obteniendo la solubilización de 5 mg Pb/l. Cuando la acidificación previa del lodo se realizó con ácido clorhídrico en lugar de ácido sulfúrico se biolixiviaron 11 mg Pb/l. En contraposición el bajo contenido en sulfato no permite el desarrollo adecuado de la bacteria y, por consiguiente, la eficacia en la solubilización de otros metales es menor. 2.7.3 BIOLIXIVIACIÓN DE SUELOS La actividad industrial ha provocado una elevada deposición de metales pesados y compuestos orgánicos en sus alrededores, siendo uno de 75 ANTECEDENTES los mayores acumuladores de esta contaminación el suelo. La complejidad de la aplicación de la biolixiviación con bacterias azufre-oxidantes reside en que éstas son sensibles a bajas concentraciones de una gran variedad de compuestos orgánicos frecuentemente presentes en el suelo (Tuttle y Dugan, 1976). Algunos investigadores han tratado de demostrar que algunas cepas Acidithiobacillus son tolerantes a ciertas sustancias orgánicas (Zagury y col., 1994) y este hecho ha dado la posibilidad de aumentar la aplicación de este proceso a los suelos y sedimentos contaminados. Gómez y Bosecker (1999) estudiaron la biolixiviación de metales pesados de varios suelos con cultivos aislados del propio suelo. El medio empleado para el crecimiento de los cultivos, el tipo y la cantidad de suelo fueron los parámetros de estudio. La biolixiviación fue mayor del 50% de los metales presentes. At. ferrooxidans logró la solubilización total de Cd, Co, Cu y Ni y At. thiooxidans solubilizó mas del 80% de Cd, Co, Cu y Zn. No se detectó plomo ni bario en el lixiviado, dada la insolubilidad de sus sulfatos correspondientes. Gourdon y Funtowicz (1995) aplicaron la capacidad de producir ácido sulfúrico de las bacterias azufre-oxidantes para eliminar los metales pesados presentes en suelos contaminados de un área industrial. El 80-90% de los metales (Zn, Pb, Cu y As) esta fuertemente unido a la matriz del suelo, en la fracción residual. El proceso de biolixiviación, que se llevó a cabo con cepas de At. ferrooxidans y At. thiooxidans con y sin suplemento de azufre. Se eliminó 45-50% de zinc y 35-40% de cobre en 90 días, mientras que el plomo y el arsénico no fueron apenas solubilizados. Los mejores resultados se obtuvieron para At. thiooxidans con azufre en el medio. White y col. (1998) también realizaron un proceso similar. El estudio de biolixiviación se llevó a cabo con un suelo contaminado de forma artificial y un suelo contaminado por la actividad industrial. En el suelo artificial (Cd, 76 ANTECEDENTES Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Zn) se consiguió la solubilización de mayor cantidad de metal que la añadida, es decir, se solubilizó parte del metal mineralizado en el suelo anteriormente. El porcentaje de biolixiviación de estos metales fue del 90-99%, excepto para el plomo (66%) cuya solubilización se mantenía incompleta tras 180 días. En el suelo industrial, con alto contenido en Cu y Ni, se obtuvo una solubilización algo menor y la lixiviación fue más lenta debido a que todo el metal está formando parte de la matriz del suelo, de forma más arraigada, y a un mayor tamaño de partícula de este soporte. 2.7.4 BIOLIXIVIACIÓN DE OTROS RESIDUOS El estudio las bacterias azufre-oxidantes y su aplicación en residuos comunes (minerales, suelos, sedimentos, lodos, etc), ha dado lugar a que algunos investigadores traten de aplicar esta capacidad a residuos más concretos o de otro tipo. A continuación se citan algunos ejemplos. Idachaba y col. (2004) evalúan la lixiviación del cromo presente en un residuo procedente de un proceso de estabilización/solidificación mediante la acción de At. thiooxidans formando una película. El tiempo de formación de ésta influye de forma positiva en la extracción. A modo general, se observó que el 50% del cromo se lixivia en las primeras 24 horas. Uno de los residuos más tóxicos y numerosos que contienen metales pesados son las pilas. Cerruti y col. (1998) tratan de aplicar la producción de ácido sulfúrico de las bacterias azufre-oxidantes para disminuir el contenido en metales de las baterías de níquel/cadmio. El trabajo se realizó en biorreactores con At. ferrooxidans. Tras 93 días, se solubilizó el 100% del cadmio, 96,5 % de níquel y 95% de hierro. 77 ANTECEDENTES 2.7.5 APLICACIONES INDUSTRIALES Durante los últimos 25 años la biolixiviación ha abierto nuevas oportunidades para la extracción metalúrgica y la biohidrometalurgia ha sido implantada en la industria del cobre y el uranio, especialmente en el tratamiento de minerales de baja ley (Bosecker, 1997). Actualmente existen 11 plantas a gran escala que operan procesos de biolixiviación en tanque agitado que emplean tres tecnologías diferentes para procesar concentrados minerales refractarios de metales preciosos y concentrados de pirita, cobalto y calcopirita (Brierley y Briggs, 2002). La biolixiviación en pilas para recuperar cobre se ha convertido en una práctica común en la industria. Desde 1980 hasta ahora 13 plantas han trabajado realizando operaciones de biolixiviación (tabla 14), pero no todas están en la actualidad en producción, debido al agotamiento de reservas minerales o, en otros casos, por problemas operativos. Estas plantas recuperan cobre a partir de la calcocita (Cu2S). El cobre es lixiviado de dos formas: mediante ácido sulfúrico pasando a covelita (CuS) o por la acción del férrico, formado a partir de la oxidación bacteriana de ferroso. El cobre en la forma de calcopirita (CuFeS2) lixivia pobremente. Actualmente, se están desarrollando nuevas tecnologías empleando microorganismos termófilos para la biolixiviación de calcopirita, utilizando pilas o sistemas de reactor de tanque agitado. La lixiviación en pilas de la calcocita es llevado a cabo en aglomerados minerales de tamaño de partícula entre 1-4 cm, que se acumulan en pilas de 6-10 metros de altura y cientos de metros de ancho y de largo. La lixiviación es aplicada mediante regado por goteo. La solución lixiviada que drena de las pilas es rica en sulfato de cobre y se envía a un circuito de extracción para la recuperación del cobre. La producción de cobre está en el rango de 10000-100000 t Cu/año según el tamaño de las plantas de operación. 78 ANTECEDENTES Planta y localización Tamaño (t mineral/día) Años en operación Lo Aguirre, Chile 16000 1980-1996 Gunpowder’s Mammoth Mine, Australia In situ 1991-presente Mt. Leyson, Australia 1370 1992-1997 Cerro Colorado, Chile 16000 1993-presente Girilambone, Australia 2000 1993-clausurada Ivan-Zar, Chile 1500 1994-presente Quebrada Blanca, Chile 17300 1994-presente Andacollo, Chile 10000 1996-presente Dos Amigos, Chile 3000 1996-presente Cerro Verde, Perú 32000 1996-presente Zaldívar, Chile 20000 1998-presente S&K Copper, Myanmar 18000 1998-presente Ecuatorial Tonopah, USA 24500 2000-2001 Tabla 14. Plantas industriales de lixiviación de cobre. Olson y col. (2003) En el campo de la biooxidación, como pretratamiento para la obtención de metales preciosos, la primera planta comercial de biolixiviación en tanque agitado fue abierta en 1986 para el tratamiento de un concentrado de oro sulfídico. En la Tabla 15 se muestra un listado de las plantas de pretratamiento de concentrados de oro refractario. Normalmente, las plantas de este tipo operan con un 15-20% de densidad de concentrado. Las plantas emplean mezclas de microorganismos mesófilos y termófilos, de este modo, la oxidación de la pirita aumenta en áreas internas de las pilas donde la temperatura puede ser de hasta 81ºC. Brierley y Briggs (2002) han publicado una descripción de los equipos y procesos empleados en la biooxidación comercial. La aplicación comercial de la biolixiviación para la obtención del uranio a partir de minerales de baja ley se practica desde los años 60. Las más conocidas son las lixiviaciones in situ en las minas subterráneas de Canadá. En ese tiempo la producción anual era entre 50-60 t de U3O8 (Olson y col., 2003). 79 ANTECEDENTES Tamaño Planta y localización (t concentrado/día) Tecnología Años de operación Inicialmente 10 Fairview, South Africa Expandido a 35 BIOX 1986-presente Expandido a 40 Sao Bento, Brazil Harbour Lights, Australia Wiluna, Australia Sansu, Ghana Inicialmente 150 BIOX Expandido Eldorado 40 BIOX 1992-1994 BIOX 1993-presente BIOX 1994-presente Inicialmente 115 Expandido a 158 Inicialmente 720 Expandida a 960 1990-presente Youanmi, Australia 120 Bac Tech 1994-1998 Tamboraque, Perú 60 BIOX 1990-presente Beaconsfield, Australia 70 Bac Tech 2000-presente Laizhou, China 100 Bac Tech 2001-presente Tabla 15. Plantas comerciales de biolixiviación en tanque agitado para el pretratamiento de concentrados de oro. Olson y col. (2003) La biolixiviación está siendo utilizada comercialmente sólo para la recuperación de cobre, uranio y oro, sin embargo, en el futuro estos procesos se podrían convertir en importantes para la recuperación de zinc, níquel, cobalto y molibdeno. La infraestructura y los costes de operación son mucho más bajos que los métodos convencionales pirometalúrgicos e hidrometalúrgicos. Las plantas de proceso pueden ser construidas en las proximidades de los depósitos minerales, salvando así los costes de transporte. Los procesos no son complejos y son fáciles de controlar. 80 ANTECEDENTES 2.8 REDUCCIÓN DEL Cr(VI) POR LA ACCIÓN DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES Los compuestos de cromo tienen varias aplicaciones industriales como la obtención de cromita, el galvanizado o el curtido de pieles entre otras (Lawson, 1997). El cromo es acumulado en el medio ambiente por su almacenamiento inapropiado o por la disposición de residuos de forma inadecuada. El cromo hexavalente es clasificado como un contaminante primario dada su movilidad en suelos y aguas subterráneas y sus efectos dañinos sobre los seres vivos. La reducción de Cr(VI) conduce a la formación de Cr(III), más estable y menos tóxico, por tanto, este proceso se considera adecuado para ser implementado como una tecnología limpia. La reducción o inmovilización del Cr(VI) puede ser llevada a cabo de forma abiótica por distintas sustancias (Palmer y Wittbrodt, 1991; Namasivayam y Raganathan, 1993, James, 1996), pero estudios recientes han demostrado la idoneidad del uso de la reducción biológica para el tratamiento de residuos que contienen cromo (Quintana y col., 2001). Generalmente, la biorreducción se realiza en presencia de fuentes de carbono complejas y, de forma general, los microorganismos realizan la reducción en condiciones anaerobias, empleando el Cr(VI) como aceptor de electrones (Turick y col., 1996). La reducción del cromo hexavalente con bacterias aerobias y que no requieren una fuente de carbono supone una alternativa más atractiva. Las bacterias azufre-oxidantes, At. ferrooxidans y At. thiooxidans obtienen la energía de la oxidación de una variedad de compuestos de azufre. La oxidación de dichos compuestos inorgánicos, en concreto del azufre elemental, genera una serie de compuestos intermedios de azufre 81 ANTECEDENTES (sulfitos, tiosulfatos y politionatos) con un alto poder reductor (Steudel y col., 1987). La capacidad de los cultivos Acidithiobacillus para reducir el Cr(VI) en condiciones aerobias ha sido estudiada en algunos trabajos (Baillet y col., 1998; Sisti y col., 1998; Quintana y col., 2001; Viera y col., 2003). Aunque los completamente mecanismos elucidados, se de oxidación sabe que At. de azufre thiooxidans no están requiere glutationato reducido (GSH) como intermedio para la oxidación de azufre elemental (Schlegel y Bowien, 1989) y, por tanto, se piensa que At. ferrooxidans puede actuar de igual modo (Rossi, 1990): Sn + GSH → GSSnH [8] El polisulfuro formado es oxidado sucesivamente a diferentes compuestos como sulfito (ecuación [9]), tiosulfato, otros politionatos y, finalmente, sulfato (ecuación [10]). 2− GSSnH + O2 + H2O → GSSn−1H + SO3 + 2H+ [9] 1 2− 2− SO3 + O2 → SO4 2 [10] Si este mecanismo es correcto, la reacción [9] genera compuestos reductores y es responsable de la aparición de protones en solución, hecho que está de acuerdo con algunos trabajos realizados (Quintana y col., 2001; Viera y col., 2003) donde la reducción del Cr(VI) viene acompañada de un aumento de la concentración de protones en el medio. Se ha demostrado recientemente que la capacidad de reducción del Cr(VI) por las bacterias azufre-oxidantes se puede relacionar con los compuestos reductores asociados a las partículas de azufre y las células (Quintana y col., 2001). De esta forma, el estudio realizado por Steudel 82 ANTECEDENTES (1989) indicó que el azufre coloidal de los cultivos de Acidithiobacillus se presenta como una larga cadena de politionatos formando micelas o glóbulos de unas pocas micras. Con el objeto de estudiar la capacidad de estas bacterias para reducir el Cr(VI) en distintas condiciones se han llevado a cabo diversos trabajos. Así, Sisti y col.(1998) estudiaron la reducción del Cr(VI) con At. ferrooxidans y At. thiooxidans en cultivo discontinuo y formando biopelículas con las cepas previamente adaptadas al Cr(III). En cultivo discontinuo se registró inhibición completa de At. ferrooxidans para concentraciones mayores de 2 mM, y de At. thiooxidans para concentraciones superiores a 1 mM. La inmovilización de las células sobre azufre produjo una mayor reducción del Cr(VI), llegando At. ferrooxidans hasta 7mM. En un estudio posterior, Quintana y col. (2001) evaluaron la capacidad de reducción del Cr(VI) por At. ferrooxidans a diferentes valores de pH y en condiciones aerobias y anaerobias. El estudio se realizó separando el azufre coloidal obtenido del cultivo bacteriano por filtración, con el objeto de poner en contacto éste con la solución de cromo. Se observó que la habilidad de reducción del azufre coloidal tiene lugar a un amplio rango de pH, aunque la reducción aumenta al disminuir el pH. Además se observó que la reducción fue mayor cuando la fase de crecimiento del cultivo fue más avanzada y se demostró la habilidad de At. ferrooxidans para emplear el Cr(VI) como aceptor de electrones. Viera y col (2003) presentaron la reducción de Cr(VI) mediante At. thiooxidans para diferentes valores de pH y la integración de este proceso con la inmovilización de Cr(III) por la acción de dos cultivos del género Desulfovibrio. Ambos procesos operaron secuencialmente en condiciones de flujo continuo permitiendo la transformación de una solución de 5 mg/l de Cr(VI). 83 ANTECEDENTES 3 BIOPRECIPITACIÓN CON BACTERIAS SULFATO- REDUCTORAS 3.1 PRECIPITACION DE METALES DISUELTOS Las aguas residuales generadas como producto de actividades mineras, el procesado de metales y las industrias petroquímicas se caracterizan por tener un elevado nivel de metales, sulfato, otras sales y un bajo pH. Si no son tratadas de forma apropiada estas aguas pueden causar un serio impacto en el medio ambiente. Además de los metales y la acidez, el sulfuro de hidrógeno producido a partir del sulfato en condiciones anaerobias puede también causar efectos nocivos. Por ello, se hace necesario el desarrollo de métodos de tratamiento con el objeto de eliminar los metales, el sulfato y la acidez de estas aguas. Convencionalmente se han empleado métodos químicos, como la neutralización con cal, para el tratamiento de aguas de estas características. Sin embargo, estos métodos se consideran costosos y producen una elevada cantidad de lodos químicos que requieren de un posterior tratamiento. Los métodos biológicos de tipo pasivo o llevados a cabo en reactores han venido siendo estudiados y desarrollados para el tratamiento de estos medios, aunque las aplicaciones a gran escala son aun limitadas (Tuppurainen y col., 2002). Entre estos tratamientos se encuentra la bioprecipitación, una técnica que aprovecha la capacidad de los microorganismos para reducir los metales pesados presentes en un medio pasándolos a un estado de oxidación menor dando lugar a compuestos más estables por su menor solubilidad y, por tanto, también menor movilidad o biodisponibidad. Los metales pueden ser eliminados biológicamente por diferentes mecanismos de precipitación, ya sea como sulfuros, carbonatos e hidróxidos o por 84 ANTECEDENTES sorción sobre la biomasa ocurriendo a veces ambos fenómenos de forma simultánea. El proceso biológico anaerobio de reducción de sulfato es potencialmente superior a otros procesos de precipitación ya que puede eliminar tanto los metales como el sulfato presentes, siendo uno de los procesos más baratos para la eliminación de metales de aguas residuales (Bowell, 2000). En el proceso de reducción de sulfato los metales son precipitados con el sulfuro producido por microorganismos sulfatoreductores formándose sulfuros metálicos insolubles (Drury, 1999; Groudev y col., 1999). Aunque muchos microorganismos generan metabolicamente sulfuro de hidrógeno, siendo el sulfato un sustrato primario, este proceso sucede a pequeña escala e implica la incorporación de azufre dentro de la célula y su consiguiente degradación catabólica. Esta vía de producción de sulfuro de hidrógeno se conoce como reducción de sulfato asimilatoria. En contraste, la reducción no asimilatoria de sulfato es un proceso directo que produce 10-100 veces más sulfuro de hidrógeno y es de gran interés fisiológico debido a su similitud con la respiración de oxígeno y nitrógeno (Postgate, 1984). La habilidad de las bacterias sulfato-reductoras para realizar la reducción no asimilatoria de sulfato ha dado lugar al desarrollo de gran número de investigaciones dirigidas a su estudio general y a su aplicación a distintos niveles. 3.2 BACTERIAS SULFATO REDUCTORAS Las bacterias sulfato-reductoras (BSR) constituyen un único grupo fisiológico de procariotas ya que tienen la capacidad de utilizar sulfato como aceptor final de electrones en la respiración. En un principio se tomaron como una curiosidad pero luego el interés creció por su relación 85 ANTECEDENTES con otras formas de vida. En las últimas décadas el estudio de los procesos metabólicos de las bacterias sulfato-reductoras ha recibido una atención considerable y, a partir de los estudios, realizados se puede decir que éstas son muy similares a otras bacterias y que la característica que más las distingue es la forma en que metabolizan el sulfato (Barton, 1995). Las bacterias sulfato-reductoras están ampliamente distribuidas en la Tierra, se sabe que estos microorganismos juegan un papel significativo en la naturaleza por medio de numerosas interacciones (Figura 8) Asociación con animales Producción de combustibles Transformaciones geoquímicas Tratamiento de aguas residuales y pantanos Biocorrosión Bacterias sulfatoreductoras Bioremediación Descomposición de alimentos Ciclos de nutrientes medioambientales Figura 8: Interacciones de las bacterias sulfato-reductoras. (Barton, 1995) Durante un tiempo se pensó que sólo existían unas pocas especies sulfato-reductoras y que exclusivamente empleaban lactato o piruvato para su crecimiento. Sin embargo, en la actualidad se conoce que estas bacterias tienen capacidad y diversidad para utilizar varios compuestos como donador de electrones (Hansen, 1993). En un principio también se pensó que la única reacción inorgánica asociada a estas bacterias era la 86 ANTECEDENTES reducción de sulfato, pero actualmente se conoce que interaccionan con gran variedad de compuestos en su medio ambiente. La figura 9 muestra algunas de las reacciones de oxidación-reducción asociadas a varios miembros de la familia de las sulfato-reductoras. H2 S2- N2 NO2- CO e- + H+ SO42- S0 Compuestos orgánicos-S NO3- NH3 Compuestos orgánicos-S O2 CO2 HO· Compuestos orgánicos-C H2O2 H2O Bacterias sulfato-reductoras Se0 SeO32- U6+ Fe3+ Seleniometionina U4+ Fe2+ Hg0 Hg(metil)2 Cr6+ Cr3+ Figura 9: Transformaciones químicas atribuidas a las bacterias sulfato-reductoras. (Barton, 1995) Existen tres grupos celulares básicos de bacterias sulfato-reductoras: eubacterias gram-negativas, eubacterias gram-positivas y arqueobacterias. Las bacterias sulfato-reductoras mesófilas y gram-negativas son las más ampliamente distribuidas en la naturaleza. Este grupo incluye cinco géneros que oxidan compuestos orgánicos de forma incompleta a acetato (Tabla 16) (Desulfovibrio, Desulfobotulus, Desulfobulbus, Desulfohalobium, Desulfomicrobium) y siete géneros que oxidan compuestos orgánicos de forma completa a dióxido de carbono (Desulfoarculus, Desulfobacer, 87 ANTECEDENTES Desulfobacerium, Desulfococcus, Desulfomonile, Desulfonema, Desulfoarcina) (Barton, 1995). Especie Cepa Habitat Sustrato Fijación N2 D. africanus NCIB 8401 Agua Lactato + D. desulfuricans DSM 642 Suelo Lactato + D. frutosovorans DSM 3604 Sedimentos de estuarios Fructosa NR D. furfuralis DSM 2590 Residuos de papel Furfural NR D. giganteus DSM 4123 Sedimentos Glicerol + D. gigas NICB 9332 Agua de laguna Lactato + D. longus DSM 6739 Productos del petróleo Lactato NR D. pager ATCC 29098 Heces humanas Lactato NR D. sulfodismutans DSM 3696 Barro de agua dulce Tiosulfato NR D. vulgaris NCIB 8303 Suelo Lactato + Dbu. marinus DSM 2058 Barros marinos Propionato + Dbu. propionicus DSM 2032 Barro de agua dulce Propionato + Dsm. apsheronum AUCCM 1105 Depósitos de petróleo Lactato NR Dsm. Baculatum AUCCM 1378 Mineral de manganeso Lactato + Dbo. Sapovorans DSM 2055 Barro de agua dulce Butarato NR Dh. Retbaense DSM 5692 Sedimentos de lago hipersalino Lactato NR Tabla 16: Algunas características de bacterias sulfato-reductoras mesófilas gram-negativas. NR: no recogida en bibliografía. (Barton, 1995) 3.2.1 CARACTERÍSTICAS Las bacterias sulfato-reductoras son bacterias heterótrofas que requieren condiciones anaerobias estrictas con un poder de oxidoreducción menor de -200mV. El principal sustrato orgánico empleado como fuente de carbono y energía para los organismos que tienen mayor velocidad de crecimiento, como Desulfovibrio sp., es un ácido orgánico de bajo peso molecular como el ácido acético y láctico o alcoholes como el etanol (Postgate, 1984; White y col., 1997). El metabolismo del carbono es esencialmente similar en todos los casos, el sustrato orgánico es oxidado completamente a CO2 o de forma incompleta a algún compuesto 88 ANTECEDENTES intermedio. Se genera un ATP vía una cadena de transporte electrónico con el sulfato como aceptor terminal de electrones que se reduce a sulfuro. Las bacterias sulfato-reductoras mesófilas tienen su máximo de crecimiento a pH 6-8, aunque, algunos aislados pueden crecer en condiciones moderadamente ácidas, pH 3-4. En esas condiciones las bacterias son encontradas en sedimentos y su aparente tolerancia al ácido se deriva de la existencia de un microambiente más neutral dentro del hábitat, el cual es mantenido mediante la actividad de las propias bacterias. Tanto la reducción de sulfato como la reducción de metales utilizan protones contribuyendo a la alcalinidad en el ambiente de la bacteria (Postgate, 1984). 3.2.2 GÉNERO Desulfovibrio Beyerinck (1895) presentó un aislado de Spirillum desulfuricans y apuntó la importancia de la producción microbiana de sulfuro de hidrógeno para su estudio y su aplicación. La descripción morfológica de esta bacteria deja pocas dudas acerca de que se aisló y caracterizó la primera especie Desulfovibrio. Muchos investigadores han ampliado el conocimiento sobre las eubacterias sulfato-reductoras gram-negativas, la clase a la cual pertenece el género Desulfovibrio (Voordouw, 1995). Postgate (1984) realizó un amplio estudio en el que se incluye el descubrimiento del citocromo c3. Otros investigadores (LeGall y Fauque, 1988; Peck Jr, 1994) han documentado una amplia variedad de enzimas y proteínas que han sido encontradas en especies Desulfovibrio y han sugerido su participación en el metabolismo de estas bacterias. Widdel (1991 y 1992) amplió el conocimiento actual de las bacterias sulfato-reductoras gram-negativas mediante el descubrimiento de otros géneros en los que se incluyen entre otras: Desulfobulbus, Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfomonile, Desulfonema, 89 ANTECEDENTES Desulfobotulus y Desulfoarculus. Los avances en biología molecular han permitido descubrir la composición, metabolismo y diversidad de las bacterias Desulfovibrio en el medio ambiente. 3.2.3 METABOLISMO DE LAS BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS El metabolismo del carbono por las bacterias sulfato-reductoras ocurre vía mecanismo respiratorio (Hansen, 1993; Postgate, 1984). Los sustratos empleados incluyen alcoholes, ácidos orgánicos, e hidrocarburos, aunque los alcanos no son metabolizados y los azucares no se utilizan. Sin embargo, cada cepa sólo es capaz de metabolizar un rango limitado de estos sustratos. La preferencia por los sustratos ha sido empleada para clasificar las bacterias sulfato-reductoras en tres grupos que pueden diferir también en la velocidad de crecimiento (White y Gadd, 1998). El grupo hidrogeno-lactato lo constituyen principalmente especies Desulfovibrio y Desulfomaculum. Utilizan los ácidos orgánicos, lactato, piruvato, succinato, fumarato y malato y pueden emplear también etanol siendo el producto final acetato y/o CO2. Ciertos miembros de este grupo pueden utilizar hidrogeno como donador de electrones en presencia de CO2, acetato y otras fuentes de carbono. Es el grupo con crecimiento más rápido (t1/2= 3-4 h en lactato). Un segundo grupo incluye la especie Desulfobacter, bacterias que son capaces de oxidar completamente acetato a CO2, aunque algunas pueden emplear lactato o etanol. El rango de sustratos es muy limitado y no son capaces de emplear hidrogeno como donador de electrones. El crecimiento es más lento (t1/2= 20 h). El último grupo se caracteriza por emplear ácidos grasos de mayor peso molecular que el acetato. Son algunas especies Desulfobulbus y 90 ANTECEDENTES Desulfovibrio, algunas oxidan sólo un número limitado de estos sustratos a acetato y otras oxidan un gran rango de estos ácidos grasos hasta CO2. Este grupo incluye algunos organismos extremadamente versátiles que degradan compuestos fenólicos como ácidos aromáticos (Postgate, 1984). 3.2.4 METABOLISMO DEL GÉNERO Desulfovibrio El sulfato es el aceptor de electrones preferente de las especies Desulfovibrio (Voordouw, 1995). Éste es reducido a sulfuro mediante una serie de reacciones en las que intervienen varias enzimas: SO4 2− + ATP + 8H+ int → HS + AMP + 2Pi [11] Hidrógeno, formato, lactato o piruvato y muchos otros compuestos orgánicos, incluidos hierro metálico y algunos compuestos del petróleo, pueden servir como donadores de electrones para la reducción del sulfato. El crecimiento quimiolitotrófo de Desulfovibrio con el hidrógeno como donador de electrones requiere de acetato o CO2 como fuente de carbono e implica un gradiente de protones del interior al exterior celular. El primero en describir este proceso fue Badziong y col. (1979). La habilidad para utilizar hidrógeno como donador de electrones para la producción de energía es general en el género Desulfovibrio (White y Gadd, 1998). Cuando lactato o piruvato son empleados como donadores de electrones, se oxidan de forma incompleta a acetato y CO2, como se muestra en la reacciones [12] y [13] Lactato → piruvato + 2Hint + 2e− + [12] Y el piruvato es oxidado a acetato y dióxido de carbono Piruvato + ADP + Pi → acetato + CO2 + ATP + 2Hint + 2e− + [13] 91 ANTECEDENTES De este modo, considerando la reacción de conversión energética [14] AMP + ATP → 2 ADP [14] y las ecuaciones [11], [12] y [13] se llega a una reacción que relaciona dos moles de lactato por mol de sulfato 2 lactato + SO4 2− → 2 acetato + 2CO2 + HS [15] y combinando [11], [13] y [14] se obtiene para el piruvato: 4 piruvato + 2 ADP + 2Pi + SO4 2− → 4 acetato + 4CO2 + 2 ATP + HS − [16] Una gran variedad de alcoholes y aldehídos de cadena corta pueden servir como donadores de electrones, se ha purificado y caracterizado la enzima alcohol-deshidrogenasa de la especie Desulfovibrio gigas (Hensgens y col., 1993) y el gen de la aldehido-oxidasa ha sido clonado y secuenciado. También se conoce la habilidad de algunas cepas sulfato-reductoras en zonas industriales para utilizar el hierro elemental como donador de electrones (Little y col., 1991), este hierro es producido industrialmente mediante el calentamiento de óxidos de hierro en un ambiente reductor y revierte a su forma oxidada mediante procesos de corrosión. Además de la diversidad de donadores de electrones, las especies Desulfovibrio pueden utilizar otros aceptores de electrones distintos del sulfato. Algunas cepas Desulfovibrio desulfuricans pueden reducir nitrato a nitrito o amonio (Dalsgaard y Bak, 1994). A pesar de considerarse a las bacterias sulfato-reductoras estrictamente anaerobias, existen especies Desulfovibrio que pueden emplear oxígeno como aceptor de electrones (Dilling y Cypionka, 1990). Otros organismos son capaces de reducir arsenato a arsenito (Ahman y col., 1994) y el Fe(III) ha sido sugerido como un 92 ANTECEDENTES importante aceptor de electrones para Desulfovibrio sp. en sedimentos anaerobicos (Coleman y col., 1993). Las bacterias sulfato-reductoras contribuyen a la reducción e inmovilización de metales pesados. Las condiciones reductoras creadas por las sulfato-reductoras generan la reducción de algunos iones metálicos. En particular, pueden contribuir a la eliminación de Cr(VI), convirtiendo oxianiones como CrO42- a especies catiónicas menos tóxicas como el Cr(III) que son precipitadas o bioadsorbidas (Fude y col., 1994; Lovley y Philips, 1994), y a la transformación de U(VI) soluble reduciéndolo a U(IV) insoluble (Lovley y col., 1993; Lovley, 1995), se piensa que el citocromo c3 periplasmático sirve como metal reductasa en todos los casos. 3.3 FUNCION DE LAS REDUCTORAS EN LA METALES BACTERIAS SULFATOBIOPRECIPITACIÓN DE La generación de sulfuros por parte de las bacterias sulfatoreductoras tiene una serie de consecuencias de especial relevancia en la eliminación de metales: creación de un ambiente reductor, eliminación de la acidez y precipitación de metales en forma de sulfuros. Los sulfatos metálicos se encuentran con frecuencia en aguas contaminadas, como las aguas ácidas de mina, normalmente por la acción de bacterias azufreoxidantes en los ambientes relacionados con la actividad minera. La presencia de metales en forma de sulfatos también es resultado de procesos metalúrgicos como la fundición de minerales sulfuro (Barnes y col., 1991; White y col., 1997). Los productos de solubilidad de la mayoría de los sulfuros metálicos son muy bajos, de modo que la producción de una cantidad moderada de sulfuro puede eliminar los metales de forma efectiva, reduciéndolos a 93 ANTECEDENTES concentraciones por debajo de los niveles permitidos en el medio ambiente (Cathorne y Dobbs, 1990). Además, estos microorganismos son necesariamente anaerobios y en estas condiciones los sulfuros son más estables (White y Gadd, 1998). Adicionalmente, el aumento de pH puede resultar en la precipitación de metales como el hierro y el aluminio su forma hidróxidos (Weast, 1978). 3.3.1 ADHESIÓN BACTERIA-MINERAL Las bacterias sulfato-reductoras generan sustancias poliméricas extracelulares (EPS) que les permiten desarrollarse fácilmente en forma de película. Las EPS comprenden una mezcla de polisacáridos, mucopolisacáridos y proteínas que varían en función de la especie y el cultivo y pueden unirse a metales solubles o partículas finas. Algunos estudios indican la adhesión de los sulfuros precipitados sobre la biopelícula formado por las bacterias sulfato-reductoras (White y Gadd, 2000a y b) Pero las EPS pueden afectar a las características de superficies metálicas cuando forman complejos con iones metálicos. La interacción bacteria-metal, en este caso, tiene un efecto negativo, por el cual las bacterias sulfato-reductoras son objeto de estudio en numerosos trabajos (Beech y Sunner, 2004; Fang y col, 2002). La formación de estas biopelículas con frecuencia se da sobre superficies como canalizaciones industriales, tuberías de aguas residuales o intercambiadores de calor, originando lo que se conoce como biocorrosión. El sulfuro producido por estas bacterias causa lo que se conoce como la despolarización catódica de hidrógeno y daña el pasivado de aceros y otros tratamientos de superficies metálicas acelerando la interacción anódica. 94 ANTECEDENTES 3.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA REDUCCION DE SULFATO Para llevar a cabo de forma efectiva la reducción de sulfato por parte de las bacterias sulfato-reductoras, es necesario controlar una serie de factores principales, aunque el valor de estos parámetros depende ampliamente de las características del medio que se pretende remediar. Estos factores son: • Nutrientes: Las bacterias sulfato reductoras por tratarse de organismos heterótrofos, requieren de una fuente de carbono. Suelen ser ácidos orgánicos de cadena corta, alcoholes y otros compuestos menos comunes. Algunas cepas metabolizan diferentes fuentes, con lo cual es importante conocer cual aporta un mayor crecimiento bacteriano o una mayor actividad bacteriana (White y Gadd, 1996). Habitualmente estas bacterias se encuentran en hábitats donde cuentan con una fuente de carbono cercana (lodos, sedimentos). Además requieren de la presencia de otros nutrientes esenciales como nitrógeno, fósforo, sales de amonio y magnesio. Cuando el hidrógeno es empleado como aceptor de electrones se requiere de dióxido de carbono y otros sustratos como fuente de carbono para la bacteria. • Fuente de energía: habitualmente, la fuente de carbono también actúa como donador de electrones. • Aceptor de electrones: para llevar a cabo su actividad es necesario que exista una proporción de sulfato suficiente en el medio. Existen estudios que tratan de relacionar la cantidad óptima de sulfato o la velocidad de reducción de sulfato 95 ANTECEDENTES necesarias para un mayor crecimiento bacteriano (Moosa y col., 2002). Mantener la cantidad de sulfato adecuada es importante también para evitar la proliferación de bacterias metanógenicas que habitualmente coexisten con las bacterias sulfato-reductoras compitiendo por el acetato o el hidrógeno. • Condiciones anaerobias: Las bacterias sulfato-reductoras son anaerobias estrictas, es indispensable crear un ambiente anóxico que se obtiene por el desplazamiento del oxígeno presente en el medio mediante una corriente de gas libre de éste, normalmente nitrógeno, o por el aporte de compuestos reductores (acido tioglicólico, ácido ascórbico) que consumen el oxígeno que pueda quedar en un sistema cerrado. • pH: las bacterias sulfato-reductoras crecen mejor bajo condiciones ligeramente alcalinas en un rango de 7,0-7,8 y toleran valores entre 5,5 y 9,0. El valor óptimo de pH difiere mucho según la cepa y del habitat en el que se encuentre previamente la bacteria ya que habitualmente se pueden encontrar en efluentes industriales o aguas ácidas de mina (Barton, 1995). • Potencial redox: es un factor clave para el inicio de la reducción de sulfato y depende del sustrato orgánico seleccionado, debe estar por debajo de -200 mV. • Temperatura: Las bacterias sulfato-reductoras mesófilas crecen mejor entre 28-38 ºC y su temperatura límite está entorno a 45 ºC, aunque también existen algunas cepas termófilas. La temperatura es un factor muy influyente, hay autores que 96 ANTECEDENTES hablan de cambios estacionales en la reducción de sulfato en estudios llevados a cabo en sedimentos (Jorgensen, 1977). El rango de temperatura óptimo para las bacterias sulfatoreductoras se encuentra en torno a los 30 ºC. • Composición del medio: El medio a tratar puede contener compuestos como carbonatos o fosfatos que pueden influir en el pH del medio o favorecer el crecimiento de bacterias que coexistan con este grupo de bacterias. • Ion sulfuro: producto de la reducción de sulfato, es tóxico para las bacterias sulfato-reductoras y otras bacterias anaerobias. La distribución del sulfuro en ambientes acuosos en sus diversas formas (S2-, HS-, H2S) es dependiente del pH. La forma disociada o libre de hidrógeno (S2-) es la responsable de la toxicidad e inhibición de la bacteria. Las bacterias metanogénicas son afectadas a una concentración de sulfuro de 150 mg/l aproximadamente (Kalyuzhnyi y col., 1998), mientras que las sulfato-reductoras tienen relativamente una alta tolerancia al sulfuro, en torno a 1000 mg/l de sulfuro (libre de hidrógeno) inhiben a éstas bacterias pero solo un 50% (Isa y col., 1986). No obstante, el sulfuro producido a partir de la reducción de sulfato puede aislar a las SRB de los efectos tóxicos de metales pesados mediante la precipitación de éstos, un efecto llamado “protección sulfuro” (Utgikar y col., 2002). • Metales pesados: Los metales pesados presentes en forma soluble pueden afectar de forma negativa a la bacteria, con lo cual es importante conocer los máximos niveles permitidos por la bacteria antes de aplicarlas para la remediación de un medio contaminado. Por otra parte, a medida que transcurre 97 ANTECEDENTES el proceso la cantidad de metal disminuye en el medio por la propia actividad bacteriana, retirándose a la vez, sulfuro. 3.5 TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS Muchos metales son tóxicos a los microorganismos, incluidas las bacterias sulfato-reductoras, ya que pueden desactivar enzimas reaccionando con sus grupos funcionales, desnaturalizar proteínas y competir con cationes esenciales (Mazidji y col., 1992). Las concentraciones de metales pesados tóxicas para las bacterias sulfato-reductoras están en un rango que va desde unas ppm hasta más de 100 ppm según la cepa y el ion metálico. La Tabla 17 recoge las concentraciones tóxicas de diversos metales por distintos autores. Por otra parte, en la literatura también se recoge el efecto estimulatorio que producen los metales pesados en cantidades traza sobre la producción de sulfuro de hidrógeno. En los últimos años Utgikar y col. (2002 y 2003) han llevado a cabo varios estudios acerca de la inhibición y toxicidad que producen los metales pesados sobre las bacterias sulfato-reductoras. Su estudio se dirigió a conocer la toxicidad de los metales pesados para la posible aplicación de estas bacterias para la reducción de la contaminación de las aguas ácidas de mina, disminuyendo la elevada concentración de sulfato y metales pesados así como la acidez características de este tipo de ambientes, mediante la precipitación de las especies metálicas en forma de sulfuros. El objetivo de la investigación fue determinar el efecto tóxico y/o inhibitorio de los metales disueltos sobre un cultivo mixto de bacterias sulfato-reductoras. La exposición a un agente externo puede resultar en la muerte celular (efecto tóxico) o en la disminución de la actividad metabólica (efecto inhibitorio). 98 ANTECEDENTES Metal Cu Zn Cepa SRB Cd Ni Referencia tóxica (mg/l) Cepas Desulfovibrio 20-50 Booth y Mercer (1963) Cepas Desulfovibrio 3 Temple y Le Roux (1964) Cepas Desulfovibrio 2-20 Saleh y col. (1964) Cultivo mixto 4-20 Hao y col.(1994) Cultivo mixto 12 Utgikar y col. (2003) Cultivo mixto 25-40 Hao y col.(1994) Cultivo mixto 20 Utgikar y col. (2003) 13 Poulson y col.(1997) Cultivo mixto 75-80 Hao y col.(1994) Cepa L60 125 Loka Bharath y col.(1990) Cultivo mixto >4-20 Hao y col.(1994) Cepa L60 54 Loka Bharath y col.(1990) Cultivo mixto 10-20 Hao y col.(1994) 10 Poulson y col.(1997) Desulfovibrio desulfuricans Pb Concentración Desulfovibrio desulfuricans Cr Cultivo mixto 60 Hao y col.(1994) Hg Cepa L60 74 Loka Bharath y col.(1990) Cultivo mixto 20 Hao y col.(1994) Mezcla (Cr, Ni,Cu, Cd, Zn, Pb) Tabla 17: Toxicidad de varios metales pesados sobre bacterias sulfato-reductoras El estudio se realizó en botes sellados suplementados con cobre (618,5 mg Cu(II)/l) y zinc (6,5-20 mg Zn(II)/l) y en un reactor en discontinuo (1l) suplementado con 25 mg Cu(II)/l. El estudio en menor escala mostró un descenso de todas las concentraciones probadas para los dos metales pero solo llega hasta cero para los niveles menores de metal, encontraron que los cultivos suplementados con cantidades mayores no precipitaron totalmente. Para la mayor concentración estudiada de cobre se insolubilizó aproximadamente un 16% y para la mayor de zinc un 37%. 99 ANTECEDENTES Es destacable que la precipitación ocurre mayoritariamente en las primeras 50 horas y luego se produce una disminución de la velocidad de producción de sulfuro metálico. Los autores sugieren que esta ralentización se debe a la no disponibilidad de ion bisulfuro, ya que los metales están presentes en solución y, por tanto, se deduce que la velocidad de la reacción de reducción de sulfato también disminuye. La inhibición no puede deberse a los metales disueltos ya que la concentración es menor a la inicial, por ello la hipótesis es que el sulfuro metálico formado inhibe a la bacteria a través de un obstáculo físico. El metal precipitado actúa como barrera y dificulta el acceso del par donador-aceptor de electrones al lugar activo de la bacteria o la enzima. Esta adhesión fue comprobada por microscopía electrónica. Una ilustración de este proceso de inhibición se representa en la figura 10. Debido a este efecto los bioreactores para el tratamiento de efluentes, tipo agua ácida de mina, debe contar en su diseño con un dispositivo que permita la sedimentación y separación del sulfuro metálico precipitado. En un trabajo posterior se desarrolló matemáticamente una expresión de velocidad que incorpora los efectos adversos que influyen en la biocinética de la reducción de sulfato. La reducción de sulfato por las bacterias sulfato-reductoras puede ser representada por una expresión tipo Monod: − dS kSX = dt K s + S 100 ANTECEDENTES sustrato orgánico sulfuro de metal ion metálico precipitado sustrato orgánico ion sulfato ion bisulfuro ion sulfato bacteria (a) Célula activa ion bisulfuro bacteria capa de sulfuro de metal precipitado (b) Precipitación en torno a la célula bacteria (c) Inhibición celular Figura 10: Mecanismo de inhibición de sulfuros metálicos. (Utgikar y col., 2002) La reducción del número viable de células (efecto tóxico) se traduce en una disminución de X, y una disminución en la velocidad metabólica se traduce en una disminución de la constante de velocidad k, estos términos, dependientes de la cantidad de metal presente en el medio, se expresan: Efecto tóxico: X(M)=Xo exp(-KTM) Efecto inhibitorio: k(M)=ko exp(-KIM) Incorporando ambos términos a la expresión se obtiene una disminución de la velocidad cuando la concentración de metal aumenta. Esta expresión fue aplicada al estudio de la toxicidad del cobre y el zinc sobre un cultivo mixto de bacterias sulfato-reductoras. Los resultados mostraron una mayor toxicidad del cobre que del zinc (KT=10,6 y 2,9 mM-1 respectivamente). Las constantes de inhibición fueron aproximadamente 18 101 ANTECEDENTES y 25 mM-1 para cobre y zinc, lo que indica que el zinc resulta algo más inhibitorio. 3.6 APLICACIÓN DE LA BIOPRECIPITACIÓN DE METALES POR BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS La posibilidad de eliminación de metales disueltos en medios ácidos con alto contenido en sulfato mediante el empleo de bacterias sulfatoreductoras ha dado lugar al desarrollo de numerosos trabajos dirigidos a evaluar los distintos factores que influyen en el proceso, así como estimular la actividad de estas bacterias. La mayoría de los trabajos han sido desarrollados a escala de laboratorio y planta piloto, algunos enfocados al desarrollo de este proceso in situ, aunque también existen tratamiento ex situ y algunas aplicaciones industriales (White y col., 1997). En Hammack y Edenborg (1992) se presenta un estudio llevado a cabo en un reactor de lecho empaquetado de 900 ml con compost como soporte de un cultivo de bacterias sulfato-reductoras. Se eliminó el 75% del níquel presente cuando no se contó con una fuente de carbono adicional y un 95% cuando se añadió lactato al medio. Con este mismo soporte, Dvorak y col. (1992) llevaron a cabo un estudio a escala piloto de dos tipos de sistemas para el tratamiento de aguas contaminadas por metales. El sistema Pittsburg (tres reactores de 200 l en serie), en el que se eliminó la totalidad del hierro y el aluminio, y el sistema Palmerton (reactor de 4500 l), que eliminó la mayoría del Zn, Mn, Ni y Cd del medio. La aplicación más extensa de un proceso empleando las bacterias sulfato-reductoras es el tratamiento de aguas subterráneas procedentes de una planta de fundición de zinc en Holanda. La planta piloto comprende un reactor de acero inoxidable de 9 m3 con un lecho de lodo. Esta planta 102 ANTECEDENTES eliminó los metales tóxicos (principalmente zinc) y el sulfato procedentes de las aguas contaminadas. El reactor empleó un consorcio indefinido, pero seleccionado, de bacterias sulfato-reductoras con etanol como sustrato orgánico. El proceso fue expandido en 1992 a escala comercial (reactor de cemento de 1800 m3) con capacidad para tratar 7000 m3/día de agua contaminada (Barnes y col., 1991). En su trabajo, Christensen y col. (1996) estudian la posibilidad de un tratamiento in-situ de las aguas ácidas de minas empleando como base para el proceso material de mina. El objetivo del estudio se centra en estimular la actividad de las bacterias sulfato-reductoras presentes añadiendo una solución sustrato (lactato, proteínas, cenizas, ácidos grasos) y la incorporación adicional de estiércol o un inóculo crecido de bacterias sulfato-reductoras. La experiencia suplementada con sustrato e inóculo adicional resultó la más positiva, ya que acorta la fase de latencia y mejora la actividad bacteriana dando lugar a la eliminación de metales en menor tiempo. Elliot y col. (1998) trataron la remediación de drenajes ácidos de mina con bacterias sulfato-reductoras. Para ello operaron con una columna de flujo ascendente y su objetivo fue estudiar la influencia de la disminución del pH del medio para así alcanzar valores similares a los que se encuentran en este tipo de medio. Las bacterias toleraron un pH de aproximadamente 3. El trabajo de Kim y col. (1999) se dirigió también a la aplicación in-situ de las bacterias sulfato-reductoras. El estudio evalúa la habilidad de las bacterias sulfato-reductoras para prevenir la generación de aguas ácidas de mina procedentes de las pilas de residuos piríticos. En la experiencia, llevada a cabo en columnas con residuos de mina, se evaluó el efecto del pH del medio. En 30 días se redujo el 80-100% del carbono orgánico total y la concentración de metales (Cu, Cd, Ni, Zn). En concreto, para un lixiviado de 103 ANTECEDENTES pH 2-3 se consiguió la alcalinización hasta pH 7 en 4 días y se obtuvo un 99% de eliminación para cadmio, cobre y zinc y un 87% para el níquel. La formación de los sulfuros sucedió en el orden esperado CuS, CdS, NiS y ZnS de menor a mayor producto de solubilidad. Por su parte, Foucher y col. (2001) propusieron el tratamiento de drenajes ácidos de minas mediante un proceso en dos etapas. El estudio lleva a cabo el tratamiento a escala piloto de un agua ácida artificial y, posteriormente, un efluente real de una zona minera. En la primera etapa se empleó un biorreactor de lecho fijo donde se produjo el crecimiento de las bacterias sulfato-reductoras en condiciones anaerobias. El sulfuro de hidrógeno generado se dirige a una columna y de allí la mezcla gaseosa se introduce en un reactor de mezcla completa donde se encuentra el medio contaminado y en el cual se produce la etapa de precipitación de metales en forma de sulfuros. En el efluente real la precipitación de metales se produjo de forma selectiva: Cu y Zn a pH 2,8 y 3,5, respectivamente, y otros metales (Ni, Fe) a pH 6. Un estudio similar para el tratamiento de aguas ácidas de mina con cadmio y cobre fue llevado a cabo por Luptakova y Kusnierova (2002). El método incluye tres etapas: la producción biológica de H2S en discontinuo en un reactor anaerobio inoculado con Desulfovibrio desulfuricans, la precipitación de metales con el H2S generado de forma selectiva (Cu pH 2,8 y Cd pH 3,5) y la separación de los sulfuros metálicos formados mediante filtración por membrana. La aplicación de las bacterias sulfato-reductoras también se realiza en procesos combinados cuando el medio contaminado posee otros tipos de compuestos o tóxicos además de sulfato y metales pesados. Groudeva y col. (2001) presentan el tratamiento de aguas contaminadas con petróleo y metales pesados. El estudio se realiza en pantanos donde se almacenan 104 ANTECEDENTES este tipo de residuos. Los pantanos contienen una flora autóctona que incluye distintos hongos y bacterias capaces de degradar los compuestos de petróleo y a su vez bacterias sulfato-reductoras. Éstas se encuentran en la base de los pantanos donde se dan condiciones anóxicas y llevan a cabo la reducción del contenido en sulfato de las aguas y la eliminación de metales pesados (Cd, Cu, Pb, Mn y Fe). El uso de este tipo de técnicas in situ, como el tratamiento en pantanos, va tomando mayor importancia frente a las técnicas ex situ en biorreactores. En Gibert y col. (2002) se describe la aplicación de las bacterias sulfato-reductoras en barreras permeables reactivas. Las barreras permeables se instalan en acuíferos con un material reactivo adecuado que induce la realización de procesos biológicos y físico-químicos para la biorremediación de las aguas subterráneas que fluyen a través de él. En el trabajo se desarrollan los distintos aspectos necesarios para el diseño de esta técnica. Tuppurainen y col. (2002) investigaron la eliminación de zinc y sulfato de un agua residual sintética de forma paralela en cuatro reactores de flujo ascendente a escala de laboratorio. Estudiaron la influencia del soporte, la adaptación o no previa al residuo y el contenido en zinc (50 o 200 mg/l). Durante el proceso el 30-40% del sulfato y sobre el 98% del zinc fue eliminado y más de 150-200 mg de H2S fueron producidos en cada reactor. Las columnas que operaban durante 48 días en presencia del residuo antes de introducir el metal eliminaron una mayor cantidad en los primeros días pero al final de la experiencia (150 días) la eliminación fue similar para adaptadas y no adaptadas. Jong y Perry (2003) estudiaron la recuperación de unas aguas contaminadas por sulfato, arsénico y varios metales pesados (Cu, Zn, Ni, Fe, Al, As, Mg) en un reactor anaerobio de lecho empaquetado de flujo 105 ANTECEDENTES ascendente. El cultivo empleado fue un aislado mixto de bacterias sulfatoreductoras procedente de una zona minera. Realizaron una primera etapa de adaptación de 14 días, etapa discontinua, en la que el cultivo se puso en contacto con el medio contaminado y se estudió el nivel de precipitación de los metales para distintas concentraciones (5, 10, 20 y 50 mg/l de cada metal). Esta investigación demostró la reducción de sulfato y eliminación consecutiva de Cu, Zn, Ni, Fe y As. La eficacia de eliminación fue de un 97,5% para Cu, Zn y Ni, >82% para Fe y >77,5% para As, sin embargo no fue nada efectivo para Mg y Al. Hulshof y col. (2003) realizaron un estudio con el objeto de evaluar la efectividad de la adición directa de virutas de madera o residuos de pulpa de papel a residuos de mina y la inhibición potencial de los constituyentes de los residuos sobre el crecimiento bacteriano. En la columna con residuos de pulpa de papel se obtuvo una mayor reducción de sulfato y se requirió menor tiempo de residencia, posiblemente sea debido al mayor contenido en nutrientes (N, P, C) de este material. En ambas columnas se obtuvo la remoción total del zinc (80 mg/l), el presente en mayor cantidad, y de otros metales. 3.7 INTEGRACIÓN DE PROCESOS DE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES Y BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS Existen trabajos que tratan de integrar la biolixiviación de los metales existentes en un medio y la bioprecipitación de estos mismos metales presentes en el lixiviado obtenido. Con esta integración se logra extraer los metales presentes en un medio aumentando su movilidad por la acción de las bacterias acidófilas y, posteriormente, inmovilizar las especies metálicas para su deposición de 106 ANTECEDENTES forma controlada o para su reutilización, de esta acción se encargan las bacterias sulfato-reductoras. Con este fin, White y col. (1998) presentaron un proceso biológico integrado de este tipo, compuesto por una etapa de lixiviación realizada por bacterias azufre-oxidantes seguida de la reducción de sulfato y la precipitación de metales presentes en el lixiviado. En el estudio a escala de laboratorio, emplearon un suelo contaminado artificialmente con metal. A medida que decrecía el pH los metales fueron lixiviados en el orden: Mn, Cr, Ni, Co, Cd, Zn, Cu, Pb, aunque se dieron periodos donde hubo lixiviación simultánea de varios. En la etapa de bioprecipitación se empleo un reactor de sedimentación interna con recirculación, capaz de retener una elevada concentración de biomasa, con un cultivo indefinido de bacterias sulfatoreductoras resistentes a los metales por su exposición previa a éstos en los ambientes en que habitan. Los metales precipitaron principalmente como sulfuros aunque también se formaron carbonatos e hidróxidos. La eliminación de los metales alcanzó una eficacia global de más del 98%. Groudev y col. (2001) realizaron el tratamiento de tierras agrícolas contaminadas por elementos radiactivos (uranio, radio, torio) y metales pesados (cobre, zinc, cadmio) mediante dos métodos biotecnológicos diferentes, el estudio fue llevado a cabo en dos porciones de suelo de unos 200 m2. En ambos métodos se realizó una solubilización inicial de los contaminantes mediante la acción de la microflora indígena del suelo, principalmente bacterias autótrofas mesófilas acidófilas y algunas basófilas y ciertos organismos heterótrofos. En condiciones naturales la oxidación de los sulfuros minerales se produce a velocidades relativamente bajas, debido a algunos factores como son el elevado pH, la limitación de oxígeno en el suelo, la insuficiente humedad durante relativamente largos periodos de tiempo y la ausencia de nutrientes como nitrógeno y fósforo. Para tratar de 107 ANTECEDENTES mejorar las condiciones de aireación y humedad se realizó el arado y la irrigación del suelo y el aporte de nutrientes necesarios. Tras la solubilización, una de las porciones de tierra se trató mediante un sistema de “enjuague” y el efluente procedente del suelo cargado de metales disueltos fue tratado por un sistema pasivo, como los pantanos, y las soluciones agotadas se reciclaron al suelo. En la otra porción, no se lavó el suelo y una gran cantidad de metales quedó retenida en las capas más profundas de suelo, donde los contaminantes son inmovilizados como resultado de la actividad de las bacterias sulfato-reductoras que habitan esta zona del suelo. La actividad de estas bacterias fue estimulada por la inyección al suelo de una solución de compuestos orgánicos. Viera y col. (2003) presentaron un proceso combinado dirigido a la reducción de Cr(VI) y precipitación del Cr(III) obtenido. Para ello, aprovechan la capacidad Acidithiobacillus thiooxidans para reducir de forma indirecta el Cr(VI). Esta primera etapa fue llevada a cabo en un reactor de tanque agitado y en ella se obtuvo la reducción casi total del Cr(VI) a Cr(III). La solución de Cr(III) generada pasó al reactor de bioprecipitación (reactor de tanque agitado), donde las bacterias sulfatoreductoras han sido previamente crecidas en condiciones anaerobias durante seis días, a partir de los cuales la solución metálica suplementada con lactato (4,5 g/l) ingresa en el reactor (75 ml/día). En esta etapa, del Cr(III) introducido durante 8 días (6 mg) sólo 0,3 mg Cr(III) no precipitaron. El elevado contenido en metales de lodos, sedimentos y aguas procedentes de la actividad minera e industrial hace pensar en la necesidad de técnicas que traten de solventar este problema. El uso de este tipo de procesos combinados permite, no solo extraer de forma natural el metal, sino volver a obtenerlo en forma de sulfuro pero fuera del medio contaminado. La diversidad de medios posibles hace necesario el estudio 108 ANTECEDENTES en profundidad de cada caso pero, no obstante, una vez sentadas las bases en las cuales se generan las condiciones adecuadas para la obtención del metal, estos procesos muestran una alta aplicabilidad y versatilidad. 4 INMOVILIZACIÓN DE CELULAS 4.1 EMPLEO DE LA INMOVILIZACIÓN Algunos microorganismos y otros materiales celulares tienen una tendencia natural a adherirse a superficies y, de esta forma, ser inmovilizados. Muchos biocatalizadores que biorreactores intervienen avanzados en el requieren proceso que los (microorganismos, enzimas,…) estén inmovilizados en un soporte sólido con el fin de reducir el lavado celular e incrementar la concentración de biocatalizador en el proceso. Desde que se propuso la primera aplicación de los microorganismos inmovilizados, se han desarrollado un gran número de procesos de este tipo en diferentes campos: biomédica (producción de fármacos y reactivos), biosensores (medida de concentración de solutos mediante reacciones catalizadas por enzimas), química (producción de etanol, combustibles gaseosos,…), macromoléculas, producción de alimentos y bebidas, tratamientos de aguas residuales (Scott, 1987). 4.2 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN La inmovilización de microorganismos se puede definir como una técnica que limita la libertad de movimiento de las células. Esta movilidad puede ser restringida por una agregación celular, por adhesión a un soporte o por atrapamiento. Las técnicas de inmovilización se suelen clasificar en dos tipos: 109 ANTECEDENTES Adhesión: los microorganismos se adhieren a la superficie de otros microorganismos o de un soporte por autoadhesión o por un enlace químico. Atrapamiento: los microorganismos quedan retenidos en los intersticios de un material poroso o son físicamente envueltos por una matriz porosa como un gel o una membrana. 4.2.1 Adhesión Los métodos de adhesión aprovechan la capacidad de los microorganismos de adherirse a otros microorganismos, formando agregados, o a superficies sólidas. Esta habilidad puede ser natural o inducida, y constituye la base de una técnica de inmovilización celular de bajo coste pero efectiva. La formación de agregados o flóculos ocurre principalmente cuando se tiene un cultivo con alta concentración celular en suspensión. Este hecho ocurre tanto con levaduras (Saccharomyces cerevisiae) como bacterias (Zymomonas mobilis). La agregación microbiana puede ser inducida o mejorada variando las condiciones ambientales, como puede ser la adición de polielectrólitos o la aireación. En la adhesión a superficies sólidas, dependiendo de la naturaleza del soporte, el enlace entre microorganismo y superficie puede ser el resultado de interacciones iónicas, físicas, hidrofóbicas o de Van der Waals. El mecanismo de adhesión, aunque no está totalmente elucidado para todos los microorganismos, en general se debe a la secreción por parte de la célula de ciertas macromoléculas, como mucopolisacáridos, que actúan como adhesivos para iniciar la interacción microorganismo-superficie. 110 ANTECEDENTES La principal ventaja de estas técnicas es su simplicidad y su mayor inconveniente la posible desorción de los microorganismos después de su utilización. 4.2.2 ATRAPAMIENTO Los métodos de atrapamiento consisten en el confinamiento de microorganismos dentro de la red de un polímero, o bien en membranas semipermeables que presentan poros de un tamaño tal que evitan la salida del microorganismo pero permiten la difusión del sustrato y productos. Estas técnicas no dependen de una forma significativa de la naturaleza de las células. Normalmente la encapsulación o atrapamiento implica la ubicación de las células en los huecos intersticiales de la red de un polímero, éstas se obtienen a partir de sus precursores (monómeros, olígomeros o poliméricos), mediante cambios en las variables de solubilidad (disolvente, temperatura, fuerza iónica y pH). Desde el punto de vista físico, la interacción de microorganismos con superficies se da en tres etapas sucesivas: • Adhesión reversible debida a energías débiles. • Adhesión firme, denominada adhesión irreversible, que contempla la formación de uniones por puentes de hidrógeno y enlaces iónicos. • Secreción de material extracelular, adhesión más lenta. Desde el punto de vista de los microorganismos y una vez producida la interacción, el desarrollo y formación de la película bacteriana se da en tres pasos. • Adsorción o inmovilización de los microorganismos sobre la superficie soporte. 111 ANTECEDENTES • Adherencia o consolidación de la interfase entre microorganismos y soporte. • Colonización por crecimiento y división de los microorganismos sobre la superficie. 4.3 INMOVILIZACION OXIDANTES La tendencia natural DE de BACTERIAS las bacterias azufre AZUFREoxidantes, Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans para crecer sobre superficies los convierte en organismos ideales para la inmovilización celular. Un gran número de investigadores han tratado de desarrollar esta capacidad para la mejora de los procesos en los que se ven involucrados este tipo de microorganismos (Armentia y Webb, 1992). Con el propósito de mejorar la capacidad de Acidithiobacillus ferrooxidans para oxidar ferroso se han desarrollado gran número de trabajos dirigidos a la inmovilización de este microorganismo sobre diferentes soportes y condiciones de operación. De este modo, se han usado muchos tipos de reactores, operando tanto en régimen discontinuo como en continuo, con el fin de obtener los mejores resultados. Para la inmovilización de At. ferrooxidans se han empleado varias matrices, existiendo trabajos de adhesión sobre esferas de vidrio (Grishin y Tuovinen, 1988), resinas de intercambio iónico (Karamanev y Nikolov, 1988) o carbón activo (Grishin y Tuovinen, 1988, Carranza y García, 1990, Halfmeier y col., 1993) y de atrapamiento en alginato, carragenato y perlita (Wakao y col., 1994, Lancy y Tuovinen, 1984). Otros soportes, como la espuma de poliuretano (Armentia y Webb, 1992) o la fibra de aleación de níquel (Gómez y col., 2000) combinan las ventajas de la adhesión y el atrapamiento. Este tipo de trabajos se dirigen a la mejora de las condiciones 112 ANTECEDENTES experimentales para la obtención de una mayor oxidación del ferroso, sin embargo, existen pocos estudios acerca de la inmovilización de At. ferrooxidans con azufre como sustrato, en ausencia de ferroso. El estudio de Acidithiobacillus thiooxidans no está tan avanzado como el de At. ferrooxidans, de modo que el número de trabajos desarrollados en cuanto a la inmovilización de esta bacteria es mucho menor. No obstante, la estructura celular y la capacidad para adherirse a las superficies hacen pensar en la posibilidad de inmovilización de esta bacteria en los mismos soportes que se han estudiado para la otra bacteria. De este modo, se conocen algunos trabajos sobre At. thiooxidans inmovilizado sobre azufre para distintos tamaños de partícula (Pogliani, 1999). 4.4 INMOVILIZACION POLIURETANO SOBRE ESPUMA DE La espuma de poliuretano ha tomado últimamente una gran relevancia como soporte para las técnicas de inmovilización, debido al elevado número de aplicaciones de éste que se recoge en la literatura: eliminación de compuestos orgánicos (Manohar y col., 2001, Moe e Irvine, 2001a y b, Hori y col., 2001, Yang y col., 2003), control de olores de residuos (Burguess y col., 2001), fermentación de ácido acético (de Ory y col., 2004), eliminación de hidrocarburos (Holubar y col., 1994), oxidación de sulfato ferroso (Armentia y Webb, 1992), etc. En dichos trabajos, se inmovilizaron (o coinmovilizaron) varios microorganismos dentro de los soportes empleando diferentes tipos de reactores: tanque agitado, columnas empaquetadas o biofiltros (de Ory y col., 2005). La espuma de poliuretano es un material inerte con unas buenas propiedades mecánicas (alta resistencia y elasticidad) y un bajo coste 113 ANTECEDENTES comercial. Presenta una alta porosidad (cercana al 97%) y, por tanto, una alta superficie de adsorción. Además, este material no sufre los inconvenientes de escalamiento que se experimentan con otras matrices de encapsulación ya que pueden ser preparados fácilmente grandes volúmenes de este soporte. Otra ventaja importante de este soporte es que los problemas de difusión de oxígeno se pueden reducir debido al elevado tamaño de poro, hecho que es muy importante para el metabolismo de los microorganismos aerobios. En la Figura 11 se muestran algunas unidades cúbicas de espuma de poliuretano comercial y una fotografía de microscopía electrónica de su estructura interna. Un aspecto a tener en cuenta para la correcta comprensión del fenómeno involucrado en el proceso de inmovilización sobre espuma de poliuretano es el equilibrio de adsorción-desorción en la biopelícula. Figura 11: fotografía de algunas unidades de espuma de poliuretano y estructura interna (x50) de la espuma de poliuretano. Cuando la biopelícula de microorganismos inmovilizados está en formación (adsorción) ocurre simultáneamente una pérdida continua de células (desorción), especialmente si el reactor es agitado enérgicamente. De modo que, debe ser establecida una velocidad de agitación adecuada para encontrar un balance satisfactorio entre los dos efectos. Por un lado, una agitación vigorosa mejora las condiciones generales de transferencia 114 ANTECEDENTES de masa a la biomasa sumergida y, como consecuencia, aumenta la población microbiana total así como el número de células adsorbidas dentro del soporte. Por otro lado, los efectos de erosión y las colisiones pueden aumentar por una agitación turbulenta frenando seriamente los procesos de adsorción de la superficie celular. Al mismo tiempo, la concentración de biomasa intersticial (células sumergidas en el líquido retenido dentro de la estructura interna del soporte) constituye una fuente potencial importante de biomasa para ser inmovilizada por el continuo equilibrio de adsorción-desorción y tiene, además, una gran importancia en las sucesivas fermentaciones posteriores. 115 C.-MATERIAL Y MÉTODOS MATERIAL Y MÉTODOS 1 MATERIAL Y MÉTODOS 1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS 1.1.1 BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES 1.1.1.1 Características Las bacterias azufre oxidantes empleadas en este estudio son cepas de la colección alemana de microorganismos DSMZ, en concreto, Acidithiobacillus ferrooxidans DSM 11477 y Acidithiobacillus thiooxidans DSM 11478. 1.1.1.2 Mantenimiento de las cepas El medio de sales empleado para el mantenimiento de ambas bacterias es de idénticas características y contiene nutrientes esenciales tales como magnesio, fósforo, potasio y nitrógeno. La composición del medio se describe en la Tabla 18 y es similar al propuesto para el crecimiento de Acidithiobacillus ferrooxidans en presencia de ión ferroso por Silverman y Lundgren (1959). Este medio sin la adición de Fe(II) se denomina medio 0K. El medio ha de ser suplementado con la fuente de energía propia de cada bacteria, así • Acidithiobacillus ferrooxidans: es una bacteria hierro y azufre oxidante, es decir, toma energía de la oxidación de hierro (II) o de compuestos de azufre reducido. Por tanto, el medio puede ser suplementado con Fe (II), en forma de sulfato ferroso, o con azufre elemental. • Acidithiobacillus thiooxidans: al ser exclusivamente azufre oxidante el mantenimiento consiste en el aporte de las sales nutrientes y el azufre elemental necesarios. 119 MATERIAL Y MÉTODOS Compuesto g/l (NH4)2SO4 3,0 MgSO4 0,5 K2HPO4 0,5 KCl 0,1 Ca(NO3)2 0,01 Tabla 18: Composición del medio de nutrientes para las bacterias azufre-oxidantes. Mantenimiento con ión ferroso Para el crecimiento de las bacterias azufre-oxidantes con ión ferroso se utiliza el medio denominado como 9K, ya que contiene 9 g/l de Fe (II). Para la preparación de un litro de este medio se disuelven las sales del medio 0K en 1000 ml de agua destilada, se ajusta el pH a 1,8 con H2SO4 5M y se esteriliza en autoclave (121ºC, 20 min). Posteriormente, se disuelve el ión ferroso (44,8 g FeSO4·7H2O) en 300 ml del medio preparado, se ajusta a pH 1,8 y se esteriliza mediante un sistema de filtración a vacío. Por último, se incorpora la disolución estéril de ferroso al medio 0K reservado y se conserva a 4ºC. El mantenimiento de la cepa en volumen final de 100 ml consiste en la adición de 90 ml de medio 9K en un matraz estéril de 250 ml. Este volumen se inocula con 10 ml de cultivo en fase exponencial de crecimiento y se incuba en un agitador a 30ºC y 150 rpm. Mantenimiento con azufre elemental La preparación del medio de crecimiento requiere preparar el volumen necesario de medio 0K, ajustado a pH 1,8 para At. ferrooxidans ó pH 2,5 para At. thiooxidans. A continuación, se procede a la esterilización en 120 MATERIAL Y MÉTODOS autoclave (121ºC, 20 min). Por último se esteriliza el azufre elemental en microondas (3 pulsos de 30 s). Para el mantenimiento de la cepa en un volumen final de 100 ml se depositan 90 ml de medio 0K en un matraz estéril de 250 ml y se le añade 1 g de azufre elemental. Posteriormente, se inocula con 10 ml de cultivo en fase exponencial de crecimiento y se incuba en un agitador a 30ºC y 150 rpm. Debido a que los experimentos se han realizado tomando como fuente de energía el azufre, el mantenimiento se realizó siempre en presencia de éste. Los cultivos de At. ferrooxidans crecidos en hierro que se emplean en una experiencia con azufre como única fuente de energía, necesitaron de subcultivos continuados en azufre para eliminar por completo la presencia de hierro. Seguimiento de las cepas El azufre elemental, por su carácter hidrofobo, se mantiene en la superficie del cultivo cuando lo incorporamos al medio. A medida que se va consumiendo por la acción de las bacterias pasa a formar una suspensión coloidal (Figura 12). Los cultivos de bacterias azufre-oxidantes han de ser refrescados, es decir, se ha de renovar su medio de crecimiento cuando se han alcanzado valores constantes de pH y población celular. Dicha renovación no se ha de realizar cuando hay agotamiento de sustrato, ya que esto suele ocurrir a un pH muy bajo y provoca situaciones de estrés a las células dando lugar a cultivos posteriores con una larga fase de latencia y de baja población bacteriana. 121 MATERIAL Y MÉTODOS Figura 12: Medio 0K suplementado con azufre y At. ferrooxidans y At. thiooxidans crecidos en dicho medio (5 días) Los cultivos se encuentran en la fase exponencial de crecimiento cuando alcanzan un valor de pH igual a 1,0, aproximadamente, y la población bacteriana se encuentra en torno a 1· 108 células/ml. En este momento se encuentran en condiciones idóneas para ser utilizadas como inóculo de las distintas experiencias que se deseen realizar. Para cultivos crecidos con ión ferroso como fuente de energía, se renueva el medio cuando la concentración de Fe(II) en el medio es de aproximadamente 20 mg/l. La determinación de la concentración de este ión se realiza por el método de la 1,10-fenantrolina propuesto por Vogel (1989). 1.1.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS 1.1.2.1 Características Las bacterias sulfato-reductoras empleadas fueron Desulfovibrio vulgaris ATCC 29579 y Desulfovibrio sp. ATCC 49975, siendo esta última un cultivo mixto de varias cepas de éste género. 122 MATERIAL Y MÉTODOS 1.1.2.2 Mantenimiento de las cepas Los medios para la conservación y el crecimiento de estas bacterias fueron propuestos por Postgate en 1979. Debido al carácter anaerobio de estas bacterias, su mantenimiento es más complejo y se pueden distinguir dos medios diferentes en función de la finalidad que se le vaya a dar al cultivo: el medio Postgate B para el mantenimiento y el medio Postgate C para el crecimiento y la realización de experimentos que requieran una elevada reducción de sulfato. Medio de mantenimiento El medio Postgate B se caracteriza porque no facilita la producción de biomasa en elevadas cantidades pero contiene compuestos reductores que producen la anaerobiosis de este. La composición del medio Postgate B se presenta en la Tabla 19 Compuesto g/l KH2PO4 0,50 NH4Cl 1 CaSO4 1 Mg SO4 2 Lactato de sodio 3,5 Extracto de levadura 1 FeSO4·7H2O 0,5 Ácido ascórbico 0,1 Ácido tioglicólico 0,1 Tabla 19: Composición del medio Postgate B Para su preparación se realiza el siguiente procedimiento experimental, se incorporan los compuestos en el orden descrito en la Tabla 123 MATERIAL Y MÉTODOS 19 excepción de los ácidos, se preajusta el pH a 7 con NaOH o KOH 2N y se añaden los compuestos reductores (ácido tioglicólico y ácido ascórbico). A continuación, se vuelve a ajustar el pH a 7,0-7,5 y se preparan botes de vidrio de 10 ml, con tapón de goma y virola metálica (tipo penicilina) para asegurar el sellado hermético. Posteriormente, se fracciona el medio depositando 9 ml en cada bote y cerrándolo inmediatamente. Durante este tiempo es necesario mantener el medio en agitación para evitar que se forme un precipitado coloidal y para favorecer la acción de los compuestos reductores. Se debe proceder al sellado de los botes con la mayor urgencia posible. Finalmente, se esterilizan a 121ºC durante 20 minutos y se mantiene a 4ºC hasta su uso. Para realizar los subcultivos, se utilizan frascos ya esterilizados con medio Postgate B y se desinfectan con alcohol en la zona donde se va a introducir el inóculo, así como aquellos que se utilizan como inóculo. Se toma 1 ml de cultivo crecido en Postgate B y se inyecta en un frasco con medio fresco teniendo especial cuidado de no introducir aire. Esta operación se realiza por triplicado y se incuban de forma estática a 30ºC. Seguimiento de las cepas La presencia de sulfato ferroso en el medio provoca que las bacterias reduzcan éste, dando lugar a sulfuro ferroso, que se caracteriza por ser un precipitado negro (Figura 13). La presencia de este precipitado suele ocurrir a las 24-48 horas y nos indica el óptimo crecimiento de estas bacterias. En este momento se puede realizar un recuento de la biomasa para comprobar el crecimiento y se mantienen los cultivos a 4ºC. La actividad de la cepa se mantiene durante 20 días, tras los cuales es necesario realizar un nuevo cultivo. 124 MATERIAL Y MÉTODOS Figura 13: Medio Postgate B y Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp. crecidos en medio Postgate B (48 horas). Medio de crecimiento El medio Postgate C se caracteriza por no contener compuestos reductores y se emplea cuando se persigue un crecimiento bacteriano elevado. Este medio permite una mayor reducción de sulfato y es una modificación del propuesto por Postgate (1984) ya que omite la adición de sulfato ferroso y ácido cítrico, con el objetivo de facilitar la precipitación de los iones metálicos de interés. Su composición se detalla en la Tabla 20 Compuestos g/l KH2PO4 0,50 NH4Cl 1 Na2SO4 4,5 CaCl· 6 H2O 0,06 MgSO4· 7 H2O 0.06 Lactato de sodio 6 Extracto de levadura 1 Tabla 20: Composición del medio Postgate C modificado. 125 MATERIAL Y MÉTODOS Para la preparación del medio Postgate C, se añaden los compuestos en el orden descrito en la tabla 20, se ajusta el pH a 7,5 con NaOH ó KOH 2N y se esteriliza en autoclave (121ºC y 20 minutos). Una vez enfriado se conserva a 4ºC durante un tiempo limitado ya que es un medio rico y pueden aparecer contaminaciones. La inoculación de bacterias sulfato-reductoras en medio Postgate C se realiza utilizando un bote estéril de 100 ml con un volumen de 90 ml de medio. A continuación, se hace pasar una corriente de gas inerte (normalmente nitrógeno), que pasa previamente por un filtro, durante 5-10 minutos. Al mismo tiempo, se utiliza un cultivo crecido en Postgate B y se filtra con papel Whatman nº4 para eliminar los precipitados de sulfuro ferroso y se realiza una nueva filtración a vacío con membrana de 0,22 m. Las células retenidas se resuspenden en 10 ml de medio Postgate C y se añade al medio contenido en el bote, sin dejar de pasar la corriente gaseosa. Después de 5 minutos, se retira el aporte gaseoso, se procede a cerrar y sellar el bote, para cultivar en estufa a 30ºC. Seguimiento del cultivo El crecimiento del cultivo se puede comprobar de forma visual, observando el espesamiento del medio y la concentración celular en forma de mucosidad (Figura 14). El seguimiento cuantitativo del crecimiento se realiza con el control de varios parámetros como son la concentración celular, el pH y la concentración del sulfato residual en el medio. Se suele observar crecimiento favorable hasta unos 14 días. 126 MATERIAL Y MÉTODOS Figura 14: Medio Posgate C y Desulfovibrio sp. crecido en este medio (14 días) 1.2 MÉTODOS DE ANÁLISIS 1.2.1 pH Y POTENCIAL REDOX La medida de estos parámetros se realizó mediante un electrodo de plata (CRISON 52-02) empleando un pHmetro CRISON micropH 2002. 1.2.2 CONCENTRACIÓN CELULAR 1.2.2.1 Bacterias en suspensión Para la determinación de la población bacteriana se utilizó el método directo de recuento en microscopio óptico mediante una cámara Neubauer (Gómez, 1997). La cámara Neubauer es un dispositivo similar a un portamuestras, con la diferencia de que cuenta con una cuadrícula en su zona central. La cuadrícula aloja un volumen de 1 l de la muestra. Utilizando los objetivos adecuados es posible contar las unidades celulares situadas sobre la zona cuadriculada. En este caso se empleó un microscopio óptico Olympus BH-2 que dispone de oculares con 15 aumentos y objetivos de 4, 10, 20, 40 y 100 127 MATERIAL Y MÉTODOS aumentos. Previo a la medida se requiere realizar la dilución correspondiente para tener una concentración a la que puedan distinguirse y contarse las células. Las diluciones se realizaron con el medio de cultivo característico de cada cepa para no someter a unas condiciones desfavorables a las células que puedan provocar la muerte celular y, por tanto, un recuento erróneo. El recuento se llevó a cabo considerando ocho casillas, no siempre contiguas, tomadas de la diagonal de la cuadrícula. La concentración celular se obtiene aplicando la siguiente expresión: [Celular ] = nº de células contadas· factor de dilución· 4 ⋅10 6 nº de casillas consideradas = Mcel ml Los recuentos celulares se realizaron por duplicado para disminuir los posibles errores en la determinación experimental. 1.2.2.2 Bacterias inmovilizadas Los procesos de inmovilización de bacterias acumulan una elevada concentración de éstas en los intersticios del soporte y adheridas en él. Para realizar una estimación de la concentración de células que existe se ha de realizar el recuento de la biomasa ocluida y la biomasa adherida. Biomasa ocluida Se toman varias unidades de soporte y se elimina el líquido intersticial de cada una de ellas realizando presión con pinzas Millipore. En las suspensiones obtenidas se realiza el recuento celular por cámara Neubauer y se toma un valor medio. Biomasa adherida Cada una de las unidades de soporte se depositó en un recipiente de 25 ml y se le añade un volumen exacto del medio de cultivo utilizado para el crecimiento de la bacteria a un pH similar al que se encuentra en la muestra (10 ml). Se introducen en un baño de ultrasonido (vetrasons-H 128 MATERIAL Y MÉTODOS selecta) durante 15 minutos. Las bacterias adheridas se desprenden de la superficie del soporte y pasan al medio líquido. Se realiza el recuento celular de cada una de las muestras. Los soportes se secan en estufa (80 ºC, 24 horas) y se pesan en balanza analítica. La biomasa adherida se expresa como Mcélulas/miligramos de soporte. Mcelulas 10 ml Mcelulas ⋅ = ml mg de soporte mg de soporte 1.2.3 CONCENTRACIÓN DE PROTONES La medida de la concentración de protones en el medio se realizó mediante una valoración con hidróxido sódico 0,02 N factorizada con biftalato potásico. 1.2.4 CONCENTRACION DE SULFATO La concentración de sulfato en el medio se realizó mediante el método turbidimétrico clásico (Clesceri y col., 1989) con algunas adaptaciones. Este método consiste en la reacción del ion sulfato con cloruro de bario para dar sulfato de bario, que se caracteriza por formar una suspensión blanca que enturbia el medio acuoso. La medida de esta turbidez se relaciona con la concentración de sulfato. El protocolo a seguir para la realización de esta medida requiere preparar patrones entre 20 y 100 ppm de sulfato. Para ello se utiliza una disolución de 1000 ppm de sulfato de sodio. Las muestras se centrifugan durante 2 minutos o se filtran por membrana de 0,22 micras para evitar la interferencia de otros componentes en la medida. Tanto los patrones como las muestras se llevan a un volumen final de 25 ml en matraces aforados, el contenido de éstos se deposita en tubos de 129 MATERIAL Y MÉTODOS vidrio de 40-50 ml, para facilitar la agitación. A continuación se añade 1 ml de una solución tampón (45 ml de H2O destilada, 4,5 ml de HCl concentrado, 15 ml de etanol absoluto, 7,5 ml de glicerina y 11,25 g de NaCl), se agita y se añade una punta de espátula de BaCl2. La mezcla se agita un minuto en vortex (Heildolph REAX2000) y se deja reposar otro minuto. La medida se realizó en un espectrofotómetro Hewlett-Packard 8453 a una longitud de onda de 450 nm. 1.2.5 CONCENTRACION DE IONES METÁLICOS La concentración de iones metálicos se determina por espectroscopia de emisión atómica por plasma de acoplamiento inducido. El espectrómetro empleado fue un Iris Intrepid de Thermo Elemental. Antes de realizar la medida se requiere realizar un procedimiento para la adecuación de la muestra. Para ello, se toma la muestra con jeringa de 10 ml y se filtra por un filtro de jeringa de nylon de 0,22 micras (ALBET-JNY-02025-100) para separar el metal no soluble y las bacterias que pueden influir en el deterioro de la muestra antes de su medida. A continuación se diluye la muestra filtrada en agua destilada o en el medio en que se encuentra hasta un volumen total de 3 ml, de modo que la medida quede dentro de la recta de calibrado preparada y supere el límite mínimo de detección. Posteriormente, se acidifica con ácido nítrico (60%) para conservar la muestra a un pH menor a 2, en el caso de que sea necesario. Esta mezcla se conserva a 4ºC hasta el momento de la medida. El procedimiento de medida realiza la media de tres lecturas de cada muestra. 130 MATERIAL Y MÉTODOS 1.2.6 CONCENTRACION DE CROMO HEXAVALENTE La determinación del Cr(VI) se realiza por el método de la difenilcarbazida (Clesceri y col, 1989). Para ello, en matraces aforados de 5 ml se preparan patrones entre 0,5 y 1 ppm de Cr(VI) a partir de una disolución de 1000 ppm de dicromato potásico. Se prepara un blanco con agua destilada de igual volumen. Las muestras se llevan a un volumen de 5 ml en matraces aforados de modo que su medida entre en el rango de determinación y a continuación se vierten estas muestras en tubos de 10 ml y se acidifica con una gota de ácido sulfúrico concentrado. Se añaden 0,25 ml de difenilcarbazida (0,1 g en 20 ml de acetona) y se agita en vortex para favorecer la reacción. Tras diez minutos en reposo, la medida se realiza en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm. 1.2.7 PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA La visualización de las bacterias empleadas así como de las experiencias realizadas sobre distintos soportes (espuma, precipitados metálicos) se realizó en un microscopio electrónico Quanta 200 previo pretratamiento de las muestras. La toma de la muestra se realiza de distinta forma en función de su estado: • Muestras sólidas: se centrifugan y se deposita el pellet en un tubo de 5 ml (si es muy grande se separa en varias porciones) • Muestras líquidas: las bacterias en suspensión, se concentran y se depositan sobre un cubreobjetos tratado con polilisina 131 MATERIAL Y MÉTODOS durante 10 min. La polilisina se deposita previamente y se retira el exceso antes de poner la muestra con papel absorbente. Los cubreobjetos (20 mm) se colocan en un recipiente diseñado para ello donde quedan almacenados en vertical. A continuación se procede a la fijación con glutaraldehido al 2,5 % en tampón de cacodilato de sodio 3-hidrato (0,1M, pH 7,2) y se deja actuar durante 1 hora. Para retirar el glutaraldehido, se añade cacodilato (0,1M, pH 7,2) por las paredes sin tocar la muestra. Se realizan 2 lavados de 10 minutos cada uno. Seguidamente, se realiza una nueva fijación con OsO4 al 1% (disolución tampón cacodilato 0,2M-OsO4 al 2%) durante 1 hora. Este paso no siempre es necesario, se realiza siempre y cuando no se haya conseguido una fijación con los pasos anteriores. Por último, se realiza el secado por punto crítico y el metalizado (100150 s). Las muestras se conservan en campana de secado hasta que se observan al microscopio. 1.2.8 DIGESTIÓN DE COMPUESTOS INSOLUBLES DE METAL Esta técnica se empleó para determinar la cantidad de metal que permanece insoluble en una solución o matriz sólida, antes o después de aplicar un proceso de solubilización. Para un medio de, aproximadamente 100 ml, se añadieron 10 ml de HNO3 y 10 ml de HCl , ambos concentrados. Se calentó y agitó durante 1 hora. Tras dejar enfriar se filtró y se llevó a un volumen conocido para determinar su contenido en metales por espectroscopía de emisión atómica. 132 MATERIAL Y MÉTODOS 2 PROTOCOLOS EXPERIMENTALES El estudio de los procesos de solubilización y precipitación de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II), así como, la reducción del Cr(VI), por la acción de bacterias azufre-oxidantes y sulfato-reductoras se llevó a cabo mediante la sucesión de las etapas experimentales descritas a continuación: • Solubilización de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias azufreoxidantes en discontinuo. • Solubilización de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias azufreoxidantes en continuo. • Reducción de Cr(VI) con bacterias azufre-oxidantes en discontinuo. • Reducción de Cr(VI) y solubilización de Cr(III) con bacterias azufre-oxidantes en continuo. • Precipitación de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias sulfatoreductoras en discontinuo. • Precipitación de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias sulfatoreductoras en continuo. • Inmovilización de At. ferrooxidans y At. thiooxidans sobre espuma de poliuretano. • Integración de los procesos de solubilización y precipitación de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) en continuo. 133 MATERIAL Y MÉTODOS 2.1 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO El estudio de la solubilización de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) por la acción de las bacterias azufre-oxidantes se llevó a cabo primeramente en régimen discontinuo. Se tomaron como referencia las concentraciones máximas de estos metales en lodos para ser aplicadas al suelo: 1500 mg Cr/kg materia seca, 400 mg Ni/kg materia seca y 4000 mg Zn/kg materia seca. Estas mismas cantidades en disolución dan lugar a concentraciones mayores a los que se pueden encontrar habitualmente en efluentes contaminados. Por otra parte, los estudios previos indicaron que algunas de estas concentraciones no son toleradas por este tipo de bacterias. Por tanto, se decidió trabajar con el 20% y el 50% de estas cantidades en el medio de cultivo. La cantidad necesaria de cada metal se suplementó empleando, óxido de cromo (III) (Cr2O3), sulfuro de níquel (NiS) y sulfuro de zinc (ZnS), respectivamente. Se prepararon ensayos con cada metal sólo y combinando todos ellos. En la Tabla 21 se recogen las concentraciones de metal empleadas en cada uno de ellos. En matraces erlenmeyers de 250 ml se añadieron 90 ml de medio 0K (ajustado a pH 4), 1 g de azufre elemental y la cantidad necesaria de metal. A continuación se inoculó al 10% con un cultivo de At. ferrooxidans o At. thiooxidans en fase exponencial de crecimiento. Se realizó un control estéril (C50) al que se suplementaron todos los metales a la máxima concentración de cada uno de ellos. 134 MATERIAL Y MÉTODOS Ensayo [Cr(III)] ppm Cr20 300 Cr50 750 [Ni(II)] ppm Ni20 80 Ni50 200 [Zn(II)] ppm Zn20 800 Zn50 2000 M20 300 80 8000 M50 750 200 2000 C50 750 200 2000 Tabla 21 Concentraciones de los metales empleados en cada uno de los ensayos El seguimiento de la experiencia se realizó tomando muestras cada 34 días, reponiendo previamente el volumen de agua evaporado. A cada muestra se le determinó el pH, la población celular y la concentración de metales en solución. Al final de la experiencia se determinó la cantidad de metal residual de cada ensayo mediante digestión ácida. Dado que los metales habitualmente se encuentran integrados en matrices sólidas como lodos, sedimentos o suelos, se estudió también la solubilización de estos metales en las mismas condiciones en presencia de una matriz sólida como la arena. Para ello, se prepararon arenas contaminadas artificialmente con cromo, níquel y zinc individualmente y los tres al mismo tiempo. La cantidad de arena agregada en cada ensayo dio lugar a las mismas concentraciones iniciales que en el estudio de solubilización anterior y el seguimiento de la experiencia se realizó siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente. 135 MATERIAL Y MÉTODOS 2.2 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO La solubilización en continuo de los iones metálicos Cr(III), Ni(II) y Zn(II) se llevó a cabo preparando un cultivo de At. thiooxidans en un reactor de tanque agitado de modo que el medio ácido que sale de forma continúa se hizo pasar por una columna de lecho fijo en la que se encontraba una arena contaminada artificialmente con los metales citados. La descripción del equipo se detalla a continuación y se encuentra representado en la figura 15. sensor pH Sensor de temperatura At. t. Arena con Cr(III), Ni(II) y Zn(II) Aireación 30ºC 300 rpm Medio 0K pH4 Lixiviado Figura 15: Equipo para la solubilización continua de cromo, níquel y zinc mediante un cultivo de At. thiooxidans. 136 MATERIAL Y MÉTODOS 2.2.1 REACTOR DE At. thiooxidans Para el crecimiento de esta bacteria azufre-oxidante se empleó un reactor de tanque agitado con un volumen de trabajo de 800 ml sobre un volumen total de 1 litro. El reactor estaba provisto de un sensor de temperatura y un sensor de pH para el control del proceso. La agitación (300 rpm) se obtuvo por agitación magnética y el oxígeno necesario se proporcionó mediante un compresor que suministraba un caudal de aire de 1,04 vvm. El cultivo se realizó añadiendo al reactor 720 ml de medio 0K (a pH 4), 8 g de azufre elemental y 72 ml de un cultivo de At. thiooxidans en fase exponencial de crecimiento (1020 Mcel/ml y pH 0,96) y se mantuvo a 30ºC y 300 rpm. Tras una primera fase en régimen discontinuo, cuando el pH se encontró en un valor de 1, se conectó la alimentación en continuo mediante una bomba peristáltica. Diariamente se realizó la medida de pH, concentración de protones, concentración de sulfato, población bacteriana y volumen alimentado. 2.2.2 SOLUBILIZACIÓN DE METALES PRESENTES EN ARENA Para llevar a cabo el estudio de la solubilización de los metales presentes en una arena contaminada artificialmente, se colocaron 50 g de ésta en una columna de vidrio de 60 ml de volumen total. La arena se preparó con aquellas concentraciones de cada uno de los metales estudiados que según la legislación vigente marcan el mínimo para que sea considerado como un lodo contaminado. De este forma, los 50 g de arena contenían: 75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II) aportados en forma de Cr2O3, NiS y ZnS, respectivamente. 137 MATERIAL Y MÉTODOS A través de la columna se hizo pasar un caudal de medio ácido procedente del reactor de crecimiento exactamente igual al de entrada de alimentación del reactor de At. thiooxidans. Diariamente se le determinó al lixiviado obtenido el pH, la concentración de protones, la concentración de sulfato, la concentración de cada uno de los metales y el volumen obtenido. 2.3 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIÓN DE Cr(VI) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO Para la determinación de la capacidad de reducción del cromo hexavalente por At. ferrooxidans y At. thiooxidans en discontinuo se siguió el protocolo descrito a continuación. Se preparó una disolución de dicromato potásico (K2Cr2O7) de 1000 ppm y se esterilizó por filtración a vacío por membrana de 0,22 m. Una serie de erlenmeyers de 250 ml fueron suplementados con 90 ml de medio 0K (pH 4,0) y 1 g de azufre elemental. A este medio se le añadió el volumen necesario para obtener una concentración final de 1, 2,5, 5 y 10 mg/l; y finalmente, se inoculó al 10% con cultivos en la fase exponencial de crecimiento. Se realizó un control sin inóculo a la mayor concentración de Cr(VI) considerada (10 ppm) y dos controles inoculados (uno de cada bacteria) sin metal. El seguimiento de esta experiencia se realizó mediante la medida del pH, la población celular, la concentración de Cr(VI), empleando el método de la difenilcarbazida, y la concentración de cromo total, por espectroscopia de emisión atómica. 138 MATERIAL Y MÉTODOS 2.4 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIÓN DE Cr(VI) Y SOLUBILIZACIÓN DEL Cr(III) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO Para el estudio de la reducción del Cr(VI) y la solubilización del Cr(III) presentes en un residuo por la acción de las bacterias azufre-oxidantes, se empleó un reactor para el crecimiento de un cultivo At. thiooxidans y una columna de lecho empaquetado, que soportaba el residuo, donde se produjo la reducción/solubilización del cromo por la acción del medio procedente del reactor de At. thiooxidans. La descripción del proceso se detalla a continuación y se encuentra representado en la figura 16. Aireación At. thiooxidans + azufre Residuo de cromo pH1 Medio 0K pH5 Lixiviado Figura 16: Esquema del sistema empleado para la reducción del Cr(VI) y la solubilización del Cr(III) presentes en un residuo mediante la acción de At. thiooxidans 2.4.1 Reactor de At. thiooxidans El reactor empleado fue una columna de lecho empaquetado constituida por 170 g de azufre elemental (tamaño de partícula 2-4 mm). El 139 MATERIAL Y MÉTODOS azufre tiene una doble finalidad: actuar como soporte para la inmovilización de las bacterias y como sustrato. La columna disponía de 150 ml de volumen útil sobre un total de 300 ml. Inicialmente se añadió a la columna medio 0K a pH 2,5 y se inoculó al 10% con un cultivo At. thiooxidans en fase exponencial de crecimiento. La alimentación del reactor constaba de medio 0K ajustado a pH 5. El oxígeno necesario para el metabolismo celular se proporcionó mediante un sistema de aireación conectado a un difusor (1,10 vvm). Para la entrada de alimentación y salida de medio se empleó una bomba peristáltica de doble cabezal. El seguimiento del reactor se realizó diariamente mediante la medida del pH, la concentración de protones y la población celular. El sistema operó inicialmente en discontinuo hasta alcanzar un pH igual a 1, es entonces cuando se dispuso en régimen continuo para obtener la renovación de todo el medio presente en la columna y se mantuvo de nuevo en discontinuo. Este proceso se repitió hasta asegurar la formación de la biopelícula, momento en que se mantiene en régimen continuo. 2.4.2 Columna con residuo de cromo En una columna de características similares a la empleada para la inmovilización de At. thiooxidans, se añadieron 157 g del residuo de cromo a tratar. El residuo empleado procedía de un filtro prensa de una planta de galvanizado. Dicho filtro, constituido principalmente de compuestos arcillosos, retiene el cromo procedente de los baños de cromado y cuando se colmata se desecha y es renovado por otro; este hecho supone una acumulación elevada de cromo en el medio donde se almacenan. 140 MATERIAL Y MÉTODOS El contenido del residuo es 30% de Cr(III) y 0,1% de Cr(VI). La columna estaba conectada a una bomba peristáltica que permitía la salida de lixiviado a un caudal similar al de entrada de medio a pH 1. El seguimiento de la columna se realizó midiendo el volumen recolectado de lixiviado y determinando a éste el pH, la concentración de protones, la concentración de sulfato y la concentración de cromo hexavalente y total. 2.5 PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS EN DISCONTINUO Las experiencias realizadas tenían el objetivo de estudiar la tolerancia de las bacterias sulfato-reductoras a los iones metálicos, así como cuantificar la capacidad de precipitación de dichos iones por estas bacterias. Durante la experimentación fueron necesarios cultivos crecidos en medio Postgate C, y para ello, con la antelación suficiente, se sembraron en medio Postgate C las cepas de bacterias sulfato-reductoras necesarias mantenidas en medio Postgate B, de acuerdo al protocolo descrito anteriormente en el apartado 1.1.2.2 de esta misma sección. Una vez crecido el cultivo y, antes de utilizarlo en la experiencia, es necesario retirar el sulfuro que existe en el medio, con el fin de que no se produzca una precipitación inicial de los metales solubles que se vayan a suplementar al medio. Para ello se centrifuga (5000 G, 30 min, 20 ºC) o se filtra a vacío por membrana de 0,22 micras y se resuspende en el volumen necesario de medio Postgate C fresco 141 MATERIAL Y MÉTODOS Las disoluciones de los metales objeto del estudio se prepararon a partir de una disolución stock de 1000 ppm para cada ión metálico con Cr2(SO4)3, NiSO4 ·6H2O y ZnSO4 ·7H2O, respectivamente, filtrados a vacío por membranas de 0,22 micras para asegurar su esterilización. Se prepararon recipientes de vidrio con medio Postgate C estéril a los que se añadió el volumen de disolución metálica necesario para disponer de la concentración metálica deseada en cada ensayo. Cada prueba se realiza por duplicado. A continuación se burbujeó una corriente de N2 gaseoso durante unos minutos, y se añadió 5 ml de inóculo a cada prueba manteniendo la corriente de nitrógeno unos minutos más. Se cerraron herméticamente con tapón de goma y virola metálica. Los cultivos se incubaron a 30ºC en estufa. El muestreo se realizó cada 3-4 días extrayendo con aguja y jeringa 1,5-2 ml de cada experimento cuidando de no introducir aire en el bote, hecho que se evita haciendo pasar la corriente de nitrógeno durante unos minutos después del muestreo. De cada muestra se tomó una fracción para la determinación de la concentración celular, que se diluye si es necesario, y el resto se filtró por filtro de membrana de 0,22 micras. Al sobrenadante obtenido se le determinó la concentración de sulfato y se acondicionó para la medida del ión o iones metálicos que existan en la muestra. 2.6 PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS EN CONTINUO Para el estudio de la precipitación de iones metálicos en solución mediante bacterias sulfato-reductoras se procedió a realizar un cultivo 142 MATERIAL Y MÉTODOS continuo de estas bacterias en un reactor de tanque agitado. El sulfuro de hidrógeno obtenido se puso en contacto con una disolución metálica de cromo, níquel y zinc. El proceso se detalla a continuación y se encuentra representado en la figura 17. sensor pH Sensor de temperatura Nitrógeno D. sp 30ºC 500 rpm Medio Postgate C Precipitado Figura 17 Sistema empleado para la precipitación de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) en solución con un cultivo Desulfovibrio sp. en continuo. 2.6.1 REACTOR DE Desulfovibrio sp. Para el crecimiento de este cultivo mixto de Desulfovibrio sp. se utilizó un reactor de tanque agitado de 800 ml cerrado herméticamente. El reactor disponía de una entrada para el paso de una corriente de N2 gaseoso que permitió asegurar las condiciones anaerobias necesarias tanto 143 MATERIAL Y MÉTODOS al inicio como a lo largo de la experiencia cuando se producía algún cambio que implicase entrada de aire al sistema. El reactor cuenta además con un sensor de temperatura y un sensor de pH. La toma de muestra se realizó mediante una jeringa en la conducción de salida del reactor para evitar la manipulación en el interior del reactor y la entrada no deseada de aire al sistema. El cultivo se preparó con 720 ml de medio Postgate C y 72 ml de un cultivo de Desulfovibrio sp. en fase exponencial de crecimiento. El cultivo se mantuvo en régimen discontinuo durante dos días y, transcurrido este tiempo, necesario para el crecimiento de la biomasa hasta la fase exponencial, se comenzó a operar en régimen continuo con la entrada de medio Postgate C. El seguimiento del cultivo continuo se realizó con la medida diaria del pH, la población bacteriana y la concentración de sulfato. 2.6.2 REACTOR DE PRECIPITACIÓN Para determinar la capacidad para precipitar iones metálicos del medio generado por las bacterias sulfato-reductoras se preparó una disolución con los sulfatos comunes de cromo, níquel y zinc hasta obtener una concentración de 1500 ppm de Cr(III), 400 ppm de Ni(II) y 4000 ppm de Zn(II). Se realizó un seguimiento diario del volumen que se fue descargando en el reactor de precipitación. En dicho reactor se dispone de un medio líquido procedente del reactor de crecimiento de las bacterias sulfatoreductoras, la disolución metálica bajo estudio y una cantidad de precipitado generado. A una muestra de dicha mezcla se le determinó el pH, la concentración de sulfato y la concentración de metales en solución. En aquellos casos en los que se detectó una escasa precipitación, el 144 MATERIAL Y MÉTODOS volumen recogido en el reactor de precipitación se volvió a reutilizar para continuar con la precipitación de los metales en solución, a fin de completar la precipitación total. 2.7 PROTOCOLO PARA LA INMOVILIZACIÓN DE At. ferrooxidans Y At. thiooxidans SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO Para el seguimiento de la dinámica de inmovilización de las bacterias azufre-oxidantes sobre espuma de poliuretano se realizó un cultivo en discontinuo, la metodología empleada se representa en la figura 18. Se emplearon matraces erlenmeyers de 500 ml a los que se le añadió 180 ml de medio 0K ajustado a pH 1,8 para el cultivo At. ferrooxidans o a pH 2,5 para At. thiooxidans. El medio se suplementó con 2 g de azufre elemental, 1 g de espuma de poliuretano (cubos de 0,5 cm de lado) y 20 ml de inóculo del cultivo correspondiente en fase exponencial. Los cultivos se incubaron a 30ºC y 150 rpm. Y cuando alcanzaron un pH de 1, se retiró el medio filtrando el cultivo por un embudo Buchner y un filtro de papel Whatman nº4. La espuma retenida se llevó a un nuevo matraz erlenmeyer estéril y se añadieron 200 ml de medio 0K al mismo pH que en la etapa inicial y se incubó en las mismas condiciones. Cuando el pH fue 1, se volvió a repetir el procedimiento pero empleando medio 0K ajustado a pH 4, ya que este medio será el que se emplee en los procesos de solubilización de metales con las bacterias inmovilizadas sobre espuma. 145 MATERIAL Y MÉTODOS 2 g Sº 2 g Sº 180 ml medio 0K pH óptimo 200 ml medio 0K pH óptimo 20 ml inóculo pH 1 pH 1 30ºC 150 rpm 2 g Sº 30ºC 150 rpm 200 ml medio 0K pH 4 pH 1 NUEVO CICLO 30ºC 150 rpm Figura 18: Procedimiento de inmovilización de bacterias azufre-oxidantes sobre espuma de poliuretano Los ciclos se continuaron realizando en estas últimas condiciones hasta observar que la cantidad de biomasa inmovilizada se mantiene constante al final de cada etapa y que los ciclos tienen una duración similar. El seguimiento de la experiencia se realizó midiendo diariamente el pH, la concentración de protones y la concentración de sulfato. Al final de cada ciclo se determinó la biomasa ocluida y la biomasa retenida en el soporte. 146 MATERIAL Y MÉTODOS 2.8 PROTOCOLO PARA LA INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS DE SOLUBILIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) EN CONTINUO. La integración de los procesos de solubilización y precipitación se llevó a cabo en el sistema experimental descrito en la figura 19. La etapa de solubilización se desarrolló con un cultivo de At. thiooxidans inmovilizado sobre espuma de poliuretano. Para ello, se inocularon al 10% dos erlenmeyers de un litro los cuales contenían 650 ml de medio 0K, 4 g de cubos de espuma de poliuretano y 6,5 g de azufre elemental. Se realizaron cuatro ciclos de inmovilización en discontinuo y, a continuación, se depositaron en una columna de vidrio donde se llevó a cabo el crecimiento de este cultivo en continuo. Inicialmente la columna se preparó con 7,5 g de espuma de poliuretano con una densidad celular de 12 Mcel/mg de espuma sumergidas en 650 ml de medio 0K a pH 4 y con 6,5 g de azufre elemental. sensor pH At. thiooxidans inmovilizado sobre espuma de poliuretano Sensor de temperatura pH1 Arena contaminada Nitrógeno 30ºC 500 rpm Aireación Medio Postgate C Lixiviado Medio 0K Precipitado Figura 19. Esquema del sistema empleado para la integración de los procesos de solubilización y precipitación de cromo, níquel y zinc en continuo. Una vez que se alcanzó un valor de pH 1 el sistema comenzó a operar en régimen continuo mediante el uso de una bomba peristáltica de 147 MATERIAL Y MÉTODOS doble cabezal. La alimentación continua consistió en medio 0K a pH 4 y el aporte de azufre elemental se realizó de forma puntual cuando se detectó un descenso en la producción de ácido sulfúrico. El efluente procedente de la columna se hizo pasar a través de una columna de lecho empaquetado con la arena contaminada. En concreto, la columna se preparó con 50 gramos de una arena que contenía 75 mg de Cr(III), 50 mg de Cr(VI), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II). El lixiviado procedente de la columna se recogió en un erlenmeyer de un litro y, tras tomar muestra, se filtró para eliminar los posibles sólidos arrastrados del lecho antes de someter esta solución al proceso de bioprecipitación. Diariamente se siguió el estado del proceso midiendo el pH, la concentración de protones y la concentración de sulfato tanto a la salida del reactor como al lixiviado, y a éste también se le determinó el volumen obtenido y la concentración de los iones metálicos. La etapa de precipitación se realizó en condiciones similares a las empleadas en el proceso de precipitación en continuo descrito con anterioridad en el que se empleaba un lixiviado artificial. Se empleó un reactor de tanque agitado para el crecimiento del cultivo mixto de bacterias sulfato-reductoras, Desulfovibrio sp., en medio Postgate C. Una vez obtenido el estado estacionario, el medio procedente del reactor se goteó sobre un embudo de decantación donde se encontraba la fracción de lixiviado diaria obtenida de la etapa de solubilización. Se siguió la concentración celular, el pH y la concentración de sulfato en el reactor de crecimiento de Desulfovibrio sp. y al volumen de precipitado obtenido se le determinó el pH, la concentración de sulfato y la concentración de metales en solución. 148 D.-RESULTADOS RESULTADOS 1 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) 1.1 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO Se estudió la solubilización de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II), aislados o combinados entre sí a dos concentraciones distintas de cada uno de ellos en presencia de At. ferrooxidans y At. thiooxidans. Se tomaron como referencia concentraciones de 1500 ppm de Cr(III), 400 ppm de Ni(II) y 4000 ppm de Zn(II), siendo estos valores los máximos permitidos por la legislación vigente para lodos que pueden ser aplicables a suelos. Sin embargo, estas concentraciones pueden resultar tóxicas para los microorganismos, por lo que se decidió trabajar con el 20% y el 50% de éstas en solución, esto da lugar a concentraciones que se pueden encontrar de forma habitual en lodos (Matlakoska y Sklodowska, 2001; Villlar y col. 2001), sedimentos (Chen y Lin, 2000; Seidel y col. 1998) y suelos (Gómez y Bosecker, 1999) contaminados. De esta forma, se denominó a estas experiencias como 20 o 50 según el porcentaje de estas cantidades que se encuentran en solución. Durante la experimentación se siguió la evolución del pH, la concentración del metal en solución y la concentración de biomasa, la evolución de las concentraciones de cada uno de ellos se representa en un mismo gráfico para cada bacteria en presencia de las dos concentraciones de metal estudiada en cada caso. Para ambas bacterias se observó que, en presencia de la concentración menor de cromo y de níquel se produjo un descenso acusado del pH parejo al cultivo control. 151 RESULTADOS Figura 20: Fotografía de microscopía electrónica (x 20000) de las bacterias azufre-oxidantes empleadas en el estudio, At. ferrooxidans (izqda.) y At. thiooxidans (dcha.) En el experimento de At. ferrooxidans en presencia de cromo (III) (figura 21) se observa una solubilización inicial significativa y luego se mantiene prácticamente constante durante todo el estudio para las dos concentraciones estudiadas. En el caso del experimento AfCr20 se observa un aumento de la biomasa pasado el tercer día, a partir de este momento se estabiliza la cantidad de metal solubilizado independientemente de la disminución progresiva del pH (1,8-0,7) y del crecimiento de la población bacteriana. Este comportamiento es distinto cuando se trabaja con la concentración más alta de metal (AfCr50), de tal forma que la biomasa se mantiene en los valores iniciales, lo que hace pensar que la cantidad de metal solubilizado al principio, puede inhibir la actividad metabólica de At. ferrooxidans. A pesar de ello, la cantidad de cromo solubilizado es muy pequeña en ambos casos (< 2%) y sólo es posible su justificación en base a la baja solubilidad del óxido de este metal. 152 RESULTADOS At. ferrooxidans + Cr(III) 14 900 800 12 700 Mcel/ml 500 8 400 6 300 [Cr(III)] (ppm) 10 600 4 200 2 100 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tiempo (días) Mcel/ml AfCr20 Mcel/ml AfCr50 [Cr] AfCr20 [Cr] AfCr50 Figura 21: Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At. ferrooxidans en presencia de 300 y 750 de ppm de Cr(III) En la figura 22 se representa la evolución de la concentración bacteriana y la concentración de Cr(III) en solución para los cultivos de At. thiooxidans. Al igual que para el experimento con At. ferrooxidans, tan sólo el cultivo de menor concentración registra un crecimiento apreciable de la biomasa, llegando a niveles similares de población que éste otro microorganismo. Este aumento de la biomasa tiene relación directa con el descenso registrado en el valor del pH (2,0-0,5). En este experimento, también se observa una solubilización inicial del metal que se mantiene prácticamente constante a lo largo del tiempo. 153 RESULTADOS At. thiooxidans + Cr(III) 900 16 800 14 700 Mcel/ml 600 10 500 8 400 6 300 [Cr(III)] (ppm) 12 4 200 2 100 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tiempo (días) Mcel/ml AtCr20 [Cr] AtCr20 Mcel/ml AtCr50 [Cr] AtCr50 Figura 22: Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At. thioooxidans en presencia de 300 y 750 de ppm de Cr(III) Por tanto, se puede decir que, a las concentraciones ensayadas, At. thiooxidans no es capaz de solubilizar el óxido de cromo presente en el medio. Las figuras 23 y 24 representan la evolución del proceso de solubilización de Ni(II) por At. ferrooxidans y At. thiooxidans, respectivamente. Así, en el caso de At. ferrooxidans se puede observar que la presencia de la menor concentración de níquel no afecta al crecimiento de esta especie bacteriana ya que, tras una fase de latencia de 3 días, se observa un crecimiento exponencial del cultivo. Este aumento se corresponde con un descenso en el pH (1,8-0,6) y un aumento gradual en la solubilización del sulfuro metálico. 154 RESULTADOS At. ferrooxidans + Ni(II) 1400 40 1200 35 Mcel/ml 25 800 20 600 15 400 [Ni(II)] (ppm) 30 1000 10 200 5 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tiempo (días) Mcel/ml AfNi20 [Ni] AfNi20 Mcel/ml AfNi50 [Ni] AfNi50 Figura 23: Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At. ferrooxidans en presencia de 80 y 200 ppm de Ni(II) La cantidad final solubilizada fue mayor de 17,5 ppm, lo que supone un 22,1% del metal agregado. Por el contrario, la concentración mayor de níquel estudiada afecta claramente al crecimiento celular, de tal forma que ni el pH ni la biomasa varían con respecto a los valores iniciales y la cantidad de metal solubilizada inicialmente se mantiene constante. 155 RESULTADOS 1200 60 1000 50 800 40 600 30 400 20 200 10 0 [Ni(II)] (ppm) Mcel/ml At. thiooxidans + Ni(II) 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tiempo (días) Mcel/ml AtNi20 [Ni] AtNi20 Mcel/ml AtNi50 [Ni] AtNi50 Figura 24 Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At. thiooxidans en presencia de 80 y 200 ppm de Ni(II) En los experimentos realizados con At. thiooxidans se puede observar un comportamiento similar, de modo que con la menor concentración de sulfuro, se registra un crecimiento microbiano importante, mientras que la concentración de biomasa permanece prácticamente invariable cuando se encuentra presente una mayor concentración del sulfuro (AtNi50). De esta forma, se puede llegar a registrar una solubilización del 21,7% de Ni(II) para el caso de AtNi20, mientras que en el experimento de mayor concentración, la solubilización que se consigue es la inicial del sulfuro (16,7%) permaneciendo invariable con el tiempo. En las figuras 25 y 26, se muestra la evolución de los distintos parámetros seguidos para las experiencias en presencia de sulfuro de zinc. 156 RESULTADOS En general, se puede decir que la presencia del zinc inhibe la actividad bacteriana, ya que se registran fases de latencia un poco más acusadas que para el resto de los compuestos metálicos ensayados. Este comportamiento puede tener su explicación en una mayor solubilidad inicial del sulfuro de zinc, de tal forma, que en las primeras horas de cultivo se pueden alcanzar valores de 600 - 900 ppm de Zn(II) en solución para los experimentos con At. ferrooxidans y 600 – 700 ppm de Zn(II) para los cultivos de At. thiooxidans, de tal forma que nos encontramos ante elevadas concentraciones del metal en solución que provocan la inhibición parcial o total de la actividad bacteriana. Este hecho no ocurre en los ensayos con compuestos de cromo o níquel ya que la solubilización propia de éstos no llega a superar tales niveles de solubilización inicial, principalmente porque la cantidad aportada de estos metales es mucho menor. At. ferrooxidans + Zn(II) 450 1200 400 Mcel/ml 300 800 250 600 200 150 400 100 [Zn(II)] (ppm) 1000 350 200 50 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tiempo (días) Mcel/ml AfZn20 [Zn] AfZn20 Mcel/ml AfZn50 [Zn] AfZn50 Figura 25 Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At. ferrooxidans en presencia de 800 y 2000 ppm de Zn(II) 157 RESULTADOS De las dos cepas ensayadas, At. ferrooxidans es más sensible a la presencia de Zn en solución, ya que no se registra crecimiento para el caso del 50%, mientras que si es posible encontrar un aumento de la población bacteriana para At. thiooxidans. Esta evidencia tiene una relación directa con el grado de solubilización, de tal forma, que se registran valores de 78,4% y 43% para las dos concentraciones estudiadas en los cultivos de At. thiooxidans. Una vez que se estudiaron los comportamientos de las dos cepas frente a cada uno de los compuestos metálicos de forma individual, el siguiente paso en la experimentación fue determinar la influencia que tiene la presencia de los compuestos de cromo (III), níquel (II) y zinc (II) de forma conjunta para acercarnos a lo que puede ocurrir de forma natural en un residuo contaminado At. thiooxidans + Zn(II) 600 1000 900 500 800 Mcel/ml 600 300 500 400 200 [Zn(II)] (ppm) 700 400 300 200 100 100 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tiempo (días) Mcel/ml AtZn20 [Zn] AtZn20 Mcel/ml AtZn50 [Zn] AtZn50 Figura 26: Evolución del crecimiento bacteriano y concentración de metal para At. thiooxidans en presencia de 800 y 2000 ppm de Zn(II) 158 RESULTADOS En cuanto al comportamiento de At. ferrooxidans en presencia de la mezcla de metales, la tendencia está claramente condicionada por la presencia de zinc. De tal forma que, para el caso de las experiencias con el 20% de cada cantidad referencia de metal (figura 27), se obtuvo un crecimiento celular importante a partir del décimo día de incubación y, para el caso de las experiencias con 50% no se detectó crecimiento microbiano relevante (figura 28). At. ferrooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (20%) 25 Mcel/ml - [Zn(II)] (ppm) 600 20 500 15 400 300 10 200 5 100 0 [Cr(III)], [Ni(II)] (ppm) - pH 700 0 0 5 10 15 Tiempo (días) Mcel/ml [Zn] [Cr] [Ni] pH Figura 27: Evolución del pH, crecimiento bacteriano y concentraciones de metales para At. ferrooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (20% de concentraciones máximas, 300ppm de Cr(III), 80 ppm de Ni(II) y 800 ppm de Zn(II)). 159 RESULTADOS At. ferrooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (50%) 1200 50 Mcel(ml) - [Zn(II)] (ppm) 40 35 800 30 600 25 20 400 15 10 200 [Cr(III)], [Ni(II)] (ppm) - pH 45 1000 5 0 0 0 5 10 15 Tiempo(días) Mcel/ml [Zn] pH [Cr] [Ni] Figura 28: Evolución del pH, crecimiento bacteriano y concentraciones de metales para At. ferrooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (50% de concentraciones máximas, 750ppm de Cr(III), 200 ppm de Ni(II) y 2000 ppm de Zn(II)) Si se comparan los porcentajes de solubilización de estas experiencias, se puede comprobar que se encuentran en el mismo nivel a los obtenidos de forma individual. Es decir, que la presencia de varios tipos de compuestos metálicos en el medio no afecta de forma significativa al comportamiento de estas cepas. At. thiooxidans se comporta de manera similar, la combinación de metales parece que no afecta al porcentaje de solubilización final y la evolución del crecimiento celular (figuras 29 y 30) fue pareja a la vista para At. thiooxidans en presencia de zinc. 160 RESULTADOS At. thiooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (20%) 700 Mcel/ml - [Zn(II)] (ppm) 600 20 500 15 400 300 10 200 5 100 0 [Cr(III)], [Ni(II)] (ppm) - pH 25 0 0 5 10 15 Tiempo (días) Mcel/ml [Zn] [Cr] [Ni] pH Figura 29: Evolución del pH, crecimiento bacteriano y concentraciones de metales para At. thiooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (20% de concentraciones máximas, 300ppm de Cr(III), 80 ppm de Ni(II) y 800 ppm de Zn(II)) Con el objetivo de comparar los resultados obtenidos mediante solubilización biológica con aquellos que pueden obtenerse por métodos químicos, se llevo a cabo la digestión ácida de cantidades iguales de los compuestos metálicos empleados en 100 ml de medio 0K a pH 4. Tras la adición de ácido nítrico y ácido clorhídrico, se llevó la mezcla a ebullición, tal como se describe en el apartado de Material y Métodos de la presente memoria Los resultados también se compararan con la solubilización obtenida por un control estéril realizado con medio 0K ajustado a pH 1,8 para una composición de metales igual a la estudiada con las bacterias. En la tabla 22 se puede muestran los porcentajes de solubilización obtenidos con el cultivo At. ferrooxidans, el cultivo At. thiooxidans, la debida al ataque 161 RESULTADOS con ácidos fuertes y la obtenida con el control estéril para una mezcla metálica de cromo, níquel y zinc. 60 1000 50 800 40 600 30 400 20 200 10 Mcel(ml) - [Zn(II)] (ppm) 1200 0 [Cr(III)], [Ni(II)] (ppm) - pH At. thiooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (50%) 0 0 5 10 15 Tiempo(días) Mcel/ml [Zn] pH [Cr] [Ni] Figura 30: Evolución del pH, crecimiento bacteriano y concentraciones de metales para At. thiooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (50% de concentraciones máximas, 750ppm de Cr(III), 200 ppm de Ni(II) y 2000 ppm de Zn(II)) Modo de Solubilización Cr2O3 NiS ZnS At. ferrooxidans 1,13 (1,5%) 4,52 (22,6%) 106,5 (53,25%) At. thiooxidans 1,01 (1,35%) 4,85 (24,25%) 110 (55%) Digestión ácida 1,12 (1,49%) 18,51 (92,5%) 168,9 (84,45%) Control pH 1,8 1,14 (1,51%) 2,21 (11,05%) 42,22 (21,11%) Tabla 22:. Cantidad en mg y porcentaje (%) de cada metal solubilizado de una combinación de compuestos metálicos (75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II) en 100 ml de medio 0K) por At. ferrooxidans, At. thiooxidans, digestión ácida y control ésteril a pH 1,8 l. 162 RESULTADOS Como se puede observar la solubilización del cromo(III) es prácticamente igual independientemente del método empleado. Este hecho se debe, fundamentalmente, a la insolubilidad característica del óxido de cromo empleado, ya que éste presenta una elevada resistencia a su disolución en presencia de una gran variedad de agentes químicos. Por el contrario, el ataque químico con ácidos fuertes permite una elevada solubilización del sulfuro de níquel (92,5%) y del sulfuro de zinc (84,45%) frente a la obtenida por un método biológico. No obstante, el porcentaje de solubilización biológica obtenidos para las dos bacterias empleadas permite reducir en gran medida el contenido metálico de ciertos residuos hasta alcanzar niveles aceptables para ser depositados o reutilizados según la legislación. Al mismo tiempo, la solubilización de níquel y zinc con medio a pH 1,8 es mucho menor a la obtenida en los demás casos, pero permite asegurar que una proporción del metal solubilizado se debe a la acción de los compuestos del medio ácido generado por las bacterias azufre-oxidantes. Por tanto, cuando se desea llevar a cabo la solubilización de los metales presentes en un medio contaminado, existe la necesidad de realizar una evaluación de las ventajas e inconvenientes que presenta cada una de ellas en función de la cantidad de metal que se desea solubilizar y del uso posterior que se le quiera dar al residuo. De esta forma, si mediante una técnica de tipo químico nos podemos asegurar un elevado grado de solubilización, su aplicación resulta mucho más costosa y genera un ataque más agresivo al medio ambiente que mediante la aplicación de una técnica de tipo biológico. En ese sentido, para concentraciones bajas de los metales ensayados, la solubilización biológica se presenta como una alternativa viable y de menor coste económico y ambiental que la digestión 163 RESULTADOS ácida, ya que no requiere del uso de compuestos químicos ni de un aporte energético. Los resultados de solubilización en este estudio son menores a los obtenidos por Villar y col. (2001). Estos autores estudiaron la lixiviación de los metales presentes en lodos anaerobios mediante un cultivo indígena de bacterias azufre-oxidantes en cultivo discontinuo. El lodo empleado contenía concentraciones de cromo, níquel y zinc dentro del rango de las concentraciones consideradas en el presente trabajo (685 mg Cr(III)/kg, 38 mg Ni(II)/kg y 888 mg Zn(II)/kg). En dicho trabajo se calcula la eficacia de solubilización (r) como la razón entre la cantidad de metal disuelto y la cantidad de metal total en el lodo. r= mg metal disuelto mg metal total El cálculo de este término permite hallar la constante de velocidad de solubilización del metal (k (d-1)) asumiendo una cinética de solubilización de primer orden. d(1 − r ) = − kt → ln(1 − r ) = − kt dt La pendiente de la representación de ln(1-r) en función del tiempo proporciona el valor de la constante k. En la tabla 23 se presentan los valores de la constante de velocidad y el porcentaje de solubilización para cada metal para la experiencia a 30ºC llevada a cabo por Villar y colaboradores, a las concentraciones que más se asemejan a las empleadas en el presente trabajo. 164 RESULTADOS metal k (d-1) % solubilización Cromo 0,125 40 Níquel 0,377 64 Zinc 1,000 80 Tabla 23: Constante y porcentaje de solubilización de los metales presentes en un lodo presentados por Villar y col. (2001) De igual manera se realizó el cálculo de estas constantes para cada una de las experiencias realizadas en este trabajo, tanto para At. ferrooxidans como para At. thiooxidans, dichos valores se presentan en la tabla 24 junto a los porcentajes de solubilización. Dado que la mayor solubilización ocurre en los primeros 3 días se calculó la velocidad en este periodo y, por ello, se presenta el porcentaje de solubilización a los 3 días y al final del proceso (día 14). Si se realiza la comparación entre los resultados obtenidos se observa que las constantes de velocidad obtenidas en este estudio son siempre menores a las obtenidas en el experimento con lodos. Este hecho se debe principalmente a que en ocasiones la cantidad de metal dispuesta para solubilizar es mayor, el compuesto de cromo empleado para el estudio de solubilización en el presente trabajo destaca por su baja solubilidad incluso en condiciones ácidas extremas y, por otra parte, el cultivo empleado por Villar y colaboradores se constituye de un consorcio de bacterias azufreoxidantes aislado del propio lodo y, por tanto, habituadas a la presencia de los metales existentes en el lodo. En cuanto al porcentaje de solubilización, sólo en el caso del zinc, se obtienen valores similares a los encontrados por Villar y col. (2001), la insolubilidad del óxido de cromo y una mayor cantidad de níquel suplementada en el presente trabajo dan lugar a unos porcentajes mucho más bajos. El grado de solubilización obtenido coincide con los resultados presentados por otros autores (Chen y Lin, 2000; Xiang y 165 RESULTADOS col. 2000; Krebs y col. 2001), de tal forma que la solubilización es mayor para el ion zinc, en menor extensión para níquel y luego para cromo, el cual muestra mucha resistencia a la biolixiviación. At. ferrooxidans Experiencia Cr20 Metal día 14 k(d-1 ) día 3 día 14 0,002 1,2 1,25 0,0015 1,06 1,38 0,0023 1,68 1,73 0,0016 1,62 1,86 0,051 16,5 22,07 0,051 15,96 21,74 0,055 16,65 18,42 0,077 21,98 24,48 0,472 76,56 80,81 0,391 70,25 78,38 0,182 43,16 48,63 0,127 32,95 43,05 Cr 0,027 0,93 0,98 0,0018 1,29 1,31 Ni 0,0504 16,36 25,71 0,046 16,55 25,54 Zn 0,432 74 76,94 0,426 73,43 78,81 Cr 0,003 1,53 1,51 0,0027 1,31 1,36 Ni 0,583 18,98 22,62 0,069 21,62 24,28 Zn 0,187 44,38 53,25 0,138 35,1 55 Cr Ni Zn Zn50 M20 M50 % solubilización día 3 Ni50 Zn20 At. thiooxidans k(d-1 ) Cr50 Ni20 % solubilización Tabla 24: Constante y porcentaje de solubilización de cada uno de los metales para las distintas experiencias de solubilización con At. ferrooxidans y At. thiooxidans. Hasta el momento se ha estudiado el comportamiento de las bacterias con los metales presentes en forma de compuestos insolubles en el medio de crecimiento, sin embargo, para acercarnos un paso más a la configuración de un suelo o lodo contaminado real, es necesario que estos sulfuros se encuentren confinados en una matriz sólida. En este sentido, se realizó un estudio en el que se preparó una arena contaminada con los mismos compuestos metálicos en la misma proporción que los experimentos anteriores y, ésta se agregó al medio de cultivo de ambas cepas para el seguimiento de la solubilización. La primera consecuencia de la adición de arena es el aumento del pH inicial en torno a 2,5 - 3, sensiblemente superior a las experiencias 166 RESULTADOS realizadas sin la presencia de arena. Además, transcurridos 3 días de incubación, se produce la solubilización de algunos componentes de la arena ya que se registra una alcalinización del medio y el pH se sitúa en un rango de entre 7 y 8,5. En estas condiciones, nos encontramos añadiendo una variable adicional y las bacterias no pueden crecer ni realizar su actividad oxidativa debido a su carácter acidófilo. Por tanto, no se observó ningún tipo de solubilización de los iones metálicos presentes. Los resultados indicaron la imposibilidad de poder solubilizar los compuestos metálicos tomados empleando arena como soporte. Se puede pensar que un mayor tiempo de contacto entre bacteria y metal podría llevar a la acidificación del medio para bajas concentraciones de metal. Por tanto, se puede concluir que la solubilización de metales en forma de compuestos insolubles, tanto libres como alojados en una matriz de un soporte (como la arena) que puedan interferir en la actividad metabólica de estas bacterias, sería más conveniente realizarlo de forma indirecta, es decir, creciendo el cultivo de las bacterias en su medio de crecimiento óptimo con azufre como fuente de energía. A continuación, se utiliza el medio ácido generado en el metabolismo microbiano para ponerlo en contacto con el residuo sólido donde se encuentre el metal objeto de lixiviación. 167 RESULTADOS 1.2 SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON At. thiooxidans EN CONTINUO Para el estudio de solubilización de cromo, níquel y zinc por la acción de At. thiooxidans en continuo se empleó un cultivo de este microorganismo crecido en un reactor de tanque agitado y cuyo medio, una vez alcanzado un pH igual a 1, se hacía pasar a través de una columna de lecho fijo con una arena contaminada por estos metales. El sistema empleado se muestra en la figura 31. Figura 31: Sistema empleado para la solubilización continua de una arena contaminada de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) mediante el medio ácido generado por At. thiooxidans crecido en cultivo sumergido. Inicialmente, el crecimiento de At. thiooxidans (figuras 32 y 33) en cultivo sumergido se mantuvo 3 días en régimen discontinuo hasta alcanzar un pH de 0,99 (800 Mcel/ml, 0,23 g H+/l, 15,5 g SO4=/l) y, a partir de ese 168 RESULTADOS momento, se comenzó a trabajar con alimentación continua. Inicialmente se estableció un caudal de 12 ml/h, que resultó muy bajo, y provocó gran inestabilidad en el cultivo, de forma que se llegaron a alcanzar valores de pH por debajo de 1 y grandes fluctuaciones en la población celular. Sin embargo, a partir de los 12 días, el pH del cultivo se estabilizó en un valor próximo a 1 y una población de 300 Mcel/ml, para un caudal de 15 ml/h (THR 2,2 días). Esta situación se mantuvo, hasta que la población subió en el día 30 de operación hasta un valor de 700 Mcel/ml, sin que hubiese ningún otro cambio aparente, posiblemente por una adaptación del cultivo a las condiciones de operación. De cualquier forma, esta nueva situación termina en un nuevo estado estacionario que resulta adecuado para el objetivo que se persigue en esta experiencia. En ambos casos, se puede observar que se trabaja en régimen de estado estacionario, ya que el resto de parámetros (concentración de sulfato y protones) también permanecen en valores casi constantes durante los períodos anteriormente reseñados. 1600 2.5 1400 Mcel/ml 1000 1.5 800 1 600 400 pH 2 1200 0.5 200 0 0 0 10 20 30 40 Tiempo (días) Mcel/ml pH Figura 32: Seguimiento de la población bacteriana y el pH en el reactor de At. thiooxidans. 169 [SO4=] g/l 20 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 15 10 5 0 0 10 20 30 [H+] g/l RESULTADOS 40 Tiempo (días) [SO4] [H+] g/l Figura 33: Seguimiento de la concentración de sulfato y de protones en el reactor de At. thiooxidans. El medio ácido generado en este reactor se empezó a circular a través de la columna una vez alcanzado el estado estacionario en el reactor de At. thiooxidans. Inicialmente, el lixiviado obtenido presentó un pH básico debido a la alcalinidad de la arena, y a medida que fue pasando el medio ácido por el lecho se produjo la neutralización de los compuestos del residuo hasta alcanzar un pH menor a 1, cuando se había obtenido un volumen de lixiviado de 600 ml. De esta forma, mientras el lixiviado obtenido fue básico, no se observó solubilización alguna de zinc, sin embargo fue más significativa para el níquel, alcanzando su concentración máxima, y también se observó solubilización del cromo (figura 34). Una vez que el pH fue menor a 2, se incrementó considerablemente la lixiviación del zinc, alcanzándose una concentración máxima de 186,8 ppm. Pasados 5 litros de medio ácido, la cantidad lixiviada de este metal fue insignificante. 170 9 140 8 120 7 100 6 80 5 60 4 40 3 2 20 1 0 0 [Zn(II)] [Cr(III)], [Ni(II)] y pH RESULTADOS -20 0 2 4 6 8 10 12 Volum en de liviviado (l) [Cr(III)] [Ni(II)] pH [Zn(II)] Figura 34: Concentración de los iones metálicos en el volumen de total de lixiviado. En este período de solubilización de zinc, se solubilizó una pequeña fracción de cromo y níquel que permanecieron prácticamente constantes en un rango entre 1-3 ppm. Cuando el volumen de lixiviado obtenido alcanzó los 4,5 litros se registró un incremento notable de la lixiviación de los tres metales estudiados. Este hecho no se observó en otros experimentos posteriores de solubilización continua llevados a cabo en este trabajo, con el mismo tipo de residuo aunque en distintas condiciones de producción de ácido y cantidad de metal. Por tanto, esta anomalía pudo deberse a que la compactación de la arena hizo que se formaran caminos preferenciales del medio ácido a través del lecho, de modo que, a partir de un momento, al producirse la solubilización de algunos compuestos se redujo la compactación del lecho facilitándose así el contacto del medio ácido con otra porción aún muy rica en metal y, por tanto, la lixiviación de una gran proporción del metal presente. Este comportamiento viene a resaltar la necesidad de una adecuada homogeneización previa del residuo a tratar para evitar cambios indeseables en el proceso de solubilización. 171 RESULTADOS En la última fase del proceso se registró la lixiviación del cromo, principalmente, ya que es el metal que aun quedaba en mayor cantidad, la concentración máxima de este metal en el lixiviado se mostró una vez obtenidos 4,5 litros de lixiviado. Finalmente, y tras hacer pasar 11,4 litros de medio ácido se obtuvo una elevada solubilización de todos los metales: 55,4% de Cr(III), 100% de Ni(II) y 100% de Zn(II). Como se puede observar, el procedimiento seguido es adecuado para llevar a cabo la solubilización de los metales estudiados cuando éstos se encuentran presentes en medios contaminados, pero esto implica el consumo de un elevado volumen de ácido y, para ello, el mantenimiento de un cultivo de bacterias azufre-oxidantes en continuo durante unos 40 días. Cabe resaltar que, en la etapa final del proceso la cantidad de metal solubilizado fue bastante baja a pesar del volumen de ácido invertido en el proceso. Por tanto, habría que llegar a una situación de compromiso entre la cantidad de metal solubilizado y el consumo de medio ácido de modo que el proceso resulte viable, siempre que se consiga un residuo con concentraciones permitidas por la legislación con el menor consumo de medio ácido posible. En este punto, sería necesario realizar una valoración técnica y económica del proceso de solubilización continua de los metales presentes. Por un lado, estimar económicamente el medio ácido necesario para llegar a los niveles de solubilización deseados y establecer una comparación respecto a la utilización de ácido obtenido por vía química, para determinar la viabilidad económica del proceso. Por otro lado, habría que estudiar la componente ambiental del proceso, de tal forma que se pueda valorar la incidencia sobre el medio ambiente de un medio ácido generado por un proceso biológico frente a un medio ácido mineral. De cualquier 172 RESULTADOS forma, este aspecto se escapa de los objetivos planteados en este trabajo y sería necesario realizar un estudio más detallado que permitiera llegar a conclusiones adecuadas. En general, la obtención biológica de ácido sulfúrico a partir de una fuente relativamente barata, el azufre elemental, resulta económicamente favorable frente al tratamiento con soluciones concentradas de ácido sulfúrico, ya que se reducen los costes de obtención y transporte del ácido y, a su vez, su impacto ambiental. Además, el pH en el medio de crecimiento de la bacteria desciende gradualmente, de modo que, los metales presentes en el medio pasan a solución a diferentes velocidades en función de sus solubilidades, permitiendo así ser separados de la solución de forma selectiva. Al mismo tiempo, en este proceso se ha utilizado un reactor continuo con la biomasa en suspensión y sería más adecuado, para favorecer la generación de medio ácido por parte de las bacterias azufre-oxidantes, la inmovilización de las bacterias en un soporte inerte, ya que esta operación permite una mayor concentración de la población celular, un menor riesgo de lavado celular, por lo que se puede trabajar a mayores velocidades de dilución, y una menor influencia de los cambios de las condiciones externas sobre el crecimiento del cultivo. 173 RESULTADOS 2 REDUCCION DEL Cr(VI) 2.1 EXPERIENCIAS DE REDUCCIÓN DEL Cr(VI) EN DISCONTINUO Como ya se ha reseñado en los antecedentes de la presente memoria, en aquellos residuos que se encuentra contaminación por cromo éste suele estar presente tanto en forma hexavalente como trivalente. Por tanto, dada la alta toxicidad que presenta la primera de las formas mencionadas se hace necesario disponer de algún tratamiento que permita la reducción del Cr(VI) a Cr(III) para su posterior eliminación del residuo contaminado. En este sentido, y aprovechando la habilidad que tienen las bacterias acidófilas del género Acidithiobacillus para tolerar y reducir el cromo hexavalente, se programaron una serie de experiencias con Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans para determinar los niveles de tolerancia a este iónde estas bacterias en régimen discontinuo y, posteriormente, se aplicó esta propiedad para el tratamiento de un residuo de cromo en régimen continuo. Para estudiar la tolerancia al cromo (VI) y la capacidad de reducción de este ión por parte de las bacterias azufre-oxidantes, se cultivó a At. ferrooxidans y At. thiooxidans en presencia de varias concentraciones de cromo hexavalente (1, 2,5, 5 y 10 ppm), mediante la adición de una disolución de dicromato potásico. Al mismo tiempo, se preparó un control estéril con una concentración de 10 ppm de este ión metálico para su comparación con los cultivos bacterianos y poder discernir la posible influencia de un mecanismo químico de reducción. Durante toda la experimentación se siguió la evolución del pH, la concentración de biomasa total y la concentración de cromo (VI) en solución. 174 RESULTADOS Analizando el comportamiento de At. ferrooxidans frente a las distintas concentraciones de cromo (VI) (figura 35), se puede observar que la presencia de concentraciones menores de 5 ppm de Cr (VI) no afectan significativamente al crecimiento microbiano, de tal forma que se pueden alcanzar concentraciones microbianas similares al cultivo control sin presencia de metal. Así, para una concentración mayor de 5 ppm se observa un cierto grado de inhibición (se alcanza un 70% menos de concentración bacteriana), aunque sí es posible registrar un alto grado de reducción del Cr(VI) con un desfase de 48 horas respecto a las concentraciones menores ensayadas. En presencia de 10 ppm de cromo (VI), no se observa crecimiento celular y el pH permanece constante, lo cual indica inhibición total de la actividad bacteriana, ya que no se observó aumento de la concentración de protones en el medio y, por tanto, oxidación del azufre suplementado. Para las menores concentraciones ensayadas (1 y 2,5 ppm) se registró una reducción completa del Cr(VI) en 24 horas, y hasta que no se reduce todo el cromo no se observa descenso del pH, debido a la oxidación de azufre y, por tanto, un aumento del crecimiento bacteriano. Este hecho coincide con el observado por Sisti y col. (1998), quienes recogen este hecho experimental, de tal forma que el crecimiento bacteriano se empieza a detectar de forma considerable cuando desaparece la presencia del cromo (VI) y comienza el mecanismo de oxidación del azufre coloidal presente en el medio de cultivo. Todos los experimentos realizados se detuvieron tras 11 días de cultivo, bien porque se registró un descenso acusado del pH para aquellos que habían conseguido la reducción del cromo (VI), o bien porque no se registró actividad microbiana tras este tiempo de cultivo. 175 RESULTADOS (a) pH 6 Af pH 5 Af1 4 Af2,5 3 Af5 Af10 2 C10 1 0 0 2 4 6 8 10 12 (b) Población bacteriana 1200 Mcel/ml 1000 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 10 12 (c) Concentración de Cr(VI) 12 [Cr(VI)] (ppm) 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) Figura 35:Evolución del pH (a), población bacteriana (b) y concentración de Cr(VI) (c) pra At. ferrooxidans 176 RESULTADOS Cabe resaltar que no se produce reducción del cromo (VI) de tipo químico ya que el cultivo estéril a 10 ppm de este metal, se mantuvo en los niveles iniciales y además no registró descenso del pH. Esta misma experiencia se realizó con At. thiooxidans y la representación de cada uno de los parámetros medidos se recoge en la figura 36. A diferencia de los cultivos con At. ferrooxidans, se puede observar que At. thiooxidans es un poco más sensible a la presencia de cromo (VI), ya que aunque para el cultivo con la menor concentración se puede registrar un comportamiento similar al observado para At. ferrooxidans, con una reducción total y crecimiento similar, para las concentraciones superiores se observa un comportamiento distinto. De esta forma, para una concentración de 2,5 ppm de Cr(VI) se observa una fase de latencia de 96 horas, a pesar de que se puede conseguir la reducción completa del cromo (VI) a las 24 horas de cultivo. At. thiooxidans es inhibido notablemente por 5 ppm de Cr(VI), ya que se puede observar una reducción inicial del 50% de la concentración a las 48 horas del cultivo, manteniéndose prácticamente constante en este nivel hasta los 11 días de cultivo. Al mismo tiempo, no se observó un crecimiento celular significativo, ni tampoco un descenso en el valor del pH. Por tanto, se puede decir que, aunque la población bacteriana inicial del cultivo tiene capacidad de reducción del cromo (VI) presente, no es capaz de continuar dicha reducción hasta el 100% porque se encuentra inhibido el crecimiento microbiano por la presencia del metal. Este misma discusión sería aplicable al cultivo con 10 ppm de cromo (VI), ya que se registra un leve descenso de la cantidad de cromo (VI) a las 24 horas de cultivo, pero no se detectó crecimiento microbiano alguno debido a la inhibición completa de la actividad bacteriana que se mantiene constante durante todo el tiempo de cultivo. 177 RESULTADOS (a) pH 5 At 4 At1 At2,5 pH 3 At5 At10 C10 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 (b) Población bacteriana 1000 Mcel/ml 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 10 12 (c) Concentración de Cr(VI) 12 [Cr(VI)] (ppm) 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) Figura 36: Evolución del pH. (a), población bacteriana (b) y concentración de Cr(VI) (c) para At. thiooxidans 178 RESULTADOS Por tanto, a la vista de los resultados obtenidos en estos experimentos, se puede concluir que ambas especies bacterianas tienen una respuesta similar a la presencia de este ión aunque no presentaron igual nivel de tolerancia. Los datos obtenidos se resumen en la tabla siguiente: % Cr(VI) Tiempo reducido (días) Af1 100 1 Af2,5 100 1 Af5 100 2 Af10 32,69 11 At1 100 1 At2,5 100 1 At5 64,7 11 At10 16,53 11 C10 1,53 11 Experiencia Tabla 25: Porcentaje de reducción del Cr(VI) para At. ferrooxidans y At. thiooxidans y tiempo empleado para obtener el nivel de reducción indicado En el trabajo llevado a cabo por Quintana y col. (2001) se estudió la reducción de una solución de 10 ppm de Cr(VI) a partir del medio generado por un cultivo discontinuo de At. ferrooxidans. El proceso se realizó de forma indirecta, sin poner en contacto la bacteria con el cromo hexavalente, los compuestos reductores generados y adheridos al azufre coloidal se hicieron pasar sobre la solución de cromo(VI). Este modo de trabajo permitió una mayor reducción, obteniéndose para pH 2 una reducción del 45%. En un estudio realizado por Viera y col. (2003) de forma similar pero en este caso con At. thiooxidans, se obtuvo la reducción de aproximadamente el 60% del cromo(VI) para una solución de 10 ppm. No obstante, el volumen de disolución tratada en cada caso fue de 5 y 20 ml respectivamente, con lo que la cantidad total de cromo reducido es menor que en el presente 179 RESULTADOS trabajo, pero, por otra parte, estos estudios presentan como ventaja el poco tiempo de contacto necesario para llevar a cabo estos niveles de reducción, que fue tan sólo de unos minutos. Los resultados encontrados en la bibliografía acerca de la reducción de forma indirecta del cromo (VI) con el medio generado por la bacterias del género Acidithiobacillus, así como la baja tolerancia de estas bacterias al cromo hexavalente hace pensar en la conveniencia de diseñar procesos de reducción de este ión de forma indirecta, donde se puedan aprovechar la capacidad para generar compuestos reductores y para reducir este ión de dichas bacterias sin dañar su metabolismo celular. Con dicho objetivo, se procedió al desarrollo de un sistema en régimen continuo y de contacto indirecto entre el medio generado por las bacterias y el concentrado de cromo. 180 RESULTADOS 2.2 REDUCCIÓN DE Cr(VI) Y SOLUBILIZACIÓN DE Cr(III) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO El objetivo de esta experiencia fue aplicar la capacidad de las bacterias azufre-oxidantes para reducir el Cr(VI) a Cr(III), y, a su vez, solubilizar el Cr(III), presente en forma insoluble, de un residuo operando en régimen continuo. El sistema empleado se muestra en la figura 37. Figura 37: Sistema empleado para la reducción de Cr(VI) y solubilización de Cr(III) de un residuo por la acción de At. thiooxidans inmovilizado sobre azufre elemental. Para llevar a cabo este proceso se inmovilizó At. thiooxidans sobre azufre elemental siguiendo el proceso descrito en la sección de Material y Métodos de esta memoria. El uso de esta bacteria permite la producción de 181 RESULTADOS un medio con mayor concentración de protones y en menor tiempo que At. ferrooxidans, lo cual resulta ventajoso para la solubilización del Cr(III). Se inoculó al 10% el medio 0K presente en la columna con un cultivo At. thiooxidans en la fase exponencial de crecimiento y se realizaron varios ciclos de inmovilización para asegurar una elevada concentración celular. La finalización de cada ciclo se estableció cuando el pH en el reactor alcanzó un valor próximo a 1, momento en el que se renovó el medio. Después de varios ciclos de inmovilización, se consideró que la formación de la biopelícula era estable cuando la concentración de protones y la población celular en suspensión permanecieron constantes tras cada ciclo. Los intervalos de tiempo en los que no se estuvo incorporando alimentación a la columna, se trabajó en régimen discontinuo con recirculación del medio para proporcionar homogeneidad y favorecer el acceso del medio a todas las partículas de azufre contenidas en ésta. En la figura 38 se presentan los valores de pH y población celular durante toda la etapa de inmovilización. Como se puede observar, se necesitaron 250 horas de operación para alcanzar una población celular estable cercana a los 300 Mcél/ml en la columna. Alcanzado el estado estacionario, se continuó operando por cargas, de tal forma que cuando el pH era menor o igual a 1, se procedía a la descarga del medio y la carga posterior con medio 0K hasta conseguir nuevamente un pH de 1 182 RESULTADOS 2,5 350 300 2 200 1,5 150 1 pH Mcel/ml 250 100 0,5 50 0 0 50 100 150 200 0 300 250 Tiempo (horas) Mcel/ml pH Figura 38: Evolución del crecimiento bacteriano de At. thiooidans inmovilizado sobre partículas de azufre El medio descargado de la columna de inmovilización se hizo pasar por otra columna donde se encontraba un residuo que contenía cromo trivalente y hexavalente. Los resultados obtenidos en la etapa de 7 16 6 14 12 5 10 4 8 3 6 2 [Cr(VI)] (mg/l) [Cr(III)] (g/l) pH reducción/solubilización del cromo se representan en la figura 39. 4 1 2 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 0 4500 Volumen de lixiviado (ml) pH [Cr(III)] g/l [Cr(VI)] mg/l Figura 39 Evolución del pH y concentración de Cr(III) y Cr(VI) en el lixiviado obtenido en función del volumen de medio ácido pasado a través de la columna de residuo 183 RESULTADOS Inicialmente el medio ácido provocó dos efectos: • Se produjo la disminución de la alcalinidad propia del residuo. El medio ácido puede solubilizar los compuestos arcillosos que forman parte del residuo, pero el pH se mantiene en valores elevados y en estas condiciones no se aprecia solubilización del Cr(III). • La salida presenta una concentración significativa de Cr(VI), y por tanto, este hecho indica un tiempo insuficiente de contacto entre el medio y el residuo para que se lleve a cabo la reducción o bien que la concentración de azufre coloidal y, por tanto, de compuestos reductores, no fue suficiente para producir la reducción del Cr(VI). De esta forma, se puede observar que hasta que el volumen del medio ácido pasado no superó los 2 litros, se siguieron observando fluctuaciones en el pH del lixiviado y la concentración de Cr(III) estuvo siempre por debajo de 10 ppm. Tan sólo en un caso (Vlixiviado = 1030 ml) en el que se produjo una disminución notable del pH, se observó una lixiviación importante de Cr(III) (69 mg). Esta disminución es de carácter puntual y pudo deberse a la acidificación de una zona determinada por el establecimiento de un camino preferencial del medio. Por tanto, después de un tiempo de operación bajo estas condiciones, se concluyó que el régimen por cargas no era el más adecuado para llevar a cabo la reducción, ya que en aquellos períodos de tiempo sin entrada de alimentación, el sistema se mantenía en recirculación, y pudo ocurrir que la poca cantidad de metal que se hubiera lixiviado por la acción del medio ácido, volviera a precipitar en el residuo. Este hecho está perfectamente justificado por el equilibrio ácido-base que 184 RESULTADOS se establece entre el medio ácido y el residuo arcilloso, provocando que el pH global aumente y no se registre lixiviación apreciable. Por ello, a partir de los primeros 1900 ml se decidió interrumpir la recirculación del medio ácido y se comenzó a operar de forma continua con el medio obtenido directamente de la columna de inmovilización, siendo el caudal de salida del lixiviado de la columna sensiblemente menor que el de alimentación para facilitar un tiempo de contacto suficiente para la solubilización. Una vez detenida la alimentación se mantenía la salida de efluente hasta vaciar la columna de todo el medio líquido, quedando así preparado para la siguiente carga. Con este cambio en el régimen de operación de la columna se registró una inmediata solubilización de cromo (III) y un descenso considerable del pH que se mantuvo en un rango entre 1,8-3. Durante las primeras horas de funcionamiento, las características del lixiviado estuvieron fluctuando hasta alcanzar unos valores constantes una vez que el volumen acumulado de medio ácido superó los 3300 ml. En este momento, la concentración de Cr(III) se mantuvo en torno a los 4000 ppm y el valor de pH estuvo siempre por debajo de 2,5. Después de hacer pasar 4 litros de medio ácido, se obtuvo un 12% de la solubilización del Cr(III) (5,68 gramos de los 47,1 presentes en el residuo), aunque habría que destacar que un 8% se obtuvo en los últimos 900 ml recogidos, una vez alcanzada la composición constante en el lixiviado. Siguiendo la tendencia obtenida en esta última fase, se puede realizar una estimación teórica del volumen necesario para lixiviar todo el cromo presente. En estas condiciones se obtuvo una solubilización media de 421,14 mg Cr(III) / 100 ml de medio ácido, es decir, 4,21 g Cr(III) / L. 185 RESULTADOS La cantidad de Cr(III) que permanece en la columna sería de: 47,1 g Cr(III) totales – 5,68 g Cr(III) lixiviados = 41,42 g Cr(III) sin lixiviar que necesitarían: 41,42 g Cr(III) / 4,21 g Cr(III) / L = 9,83 l de medio ácido. Aproximadamente 10 litros de medio serían necesarios para la lixiviación del 100% del cromo contenido en el residuo. Se observa que un volumen similar de medio ácido fue necesario para la solubilización de tan sólo el 54,6% del cromo presente en la arena en la experiencia de solubilización continua descrita con anterioridad, a pesar de que la cantidad de cromo fue menor (se solubilizaron 41mg de 75mg totales). Este hecho se debe, fundamentalmente, a la distinta solubilidad de los compuestos de cromo tratados en cada caso. Además se corrobora que para una mayor concentración de metal se da una mayor solubilización, como se observó en la etapa de solubilización en discontinuo. Con respecto a la reducción de Cr(VI), no se detectó la presencia de este ión a partir de los 2900 ml de lixiviado obtenido, si bien la cantidad de Cr(VI) acumulada en el lixiviado alcanzó los 11,5 mg de los 157 mg totales, lo que indica que el 7,34% de Cr(VI) no fue reducido y que, por tanto, se obtuvo una reducción del 92,66%. Se comprobó que el proceso de reducción de forma indirecta y continua resulta viable ya que permite una elevada reducción del cromo hexavalente sin interferir en el metabolismo celular, y en mayor medida que en las experiencias de contacto indirecta pero en régimen discontinuo presentadas por Quintana y col. (2001) y Viera y col. (2003). 186 RESULTADOS 3 PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) 3.1 ESTUDIO DE TOLERANCIA Y PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS EN DISCONTINUO 3.1.1 Estudio con Cr(III) Para el estudio de la tolerancia de las bacterias sulfato-reductoras al ion cromo(III) se emplearon las cepas Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp. y se suplementó el medio de crecimiento Postgate C con Cr2(SO4)3 para obtener las siguientes concentraciones iniciales: 1, 4,5, 9, 12 y 15 ppm de Cr(III). El crecimiento bacteriano se vio inhibido para las dos cepas por la presencia de este metal (figura 40), incluso para la menor concentración estudiada (1 ppm) la población no alcanzó el máximo de crecimiento obtenido por la bacteria sin metal (control Dv y Dsp). Además se observó que, a partir de los siete días, se produce una estabilización de la población. El descenso de la concentración de sulfato (figura 41) fue paralelo al crecimiento celular. Los cultivos con mayor crecimiento presentaron un mayor consumo de este sustrato hasta los siete días, momento a partir del cual la concentración de sulfato se mantiene prácticamente constante. La medida de la concentración de cromo(III) soluble en el medio permitió calcular el porcentaje de cromo precipitado con respecto al suplementado inicialmente. Estos valores están representados en la figura 42. A simple vista se puede observar que el porcentaje de bioprecipitación aumenta a lo largo del tiempo y que la cantidad de metal precipitado es mayor cuanto mayor es la cantidad inicial, lo cual da lugar a 187 RESULTADOS mayores porcentajes de precipitación. De este modo, la mayor precipitación ocurre para los cultivos suplementados con 15 ppm de Cr(III) a los once días, obteniéndose un 24,7 % de precipitación para la cepa pura y un 24,13% para el cultivo mixto. (a) Desulfovibrio vulgaris 600 Mcel/ml 500 1 ppm 4,5 ppm 9 ppm 12 ppm 15 ppm control Dv 400 300 200 100 0 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) (b) Desulfovibrio sp. 700 600 1 ppm 4,5 ppm 9 ppm 12 ppm 15 ppm control Dsp Mcel/ml 500 400 300 200 100 0 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) Figura 40:Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de cromo(III) 188 RESULTADOS (a) Desulfovibrio vulgaris sulfato (ppm) 4000 1 ppm 4,5 ppm 9 ppm 12 ppm 15 ppm C 15 ppm control Dv 3500 3000 2500 2000 1500 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) (b) Desulfovibrio sp. 4000 1 ppm 4,5 ppm 9 ppm 12 ppm 15 ppm C 15 ppm control Dsp sulfato (ppm) 3500 3000 2500 2000 1500 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) Figura 41 Consumo de sulfato de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de cromo(III). A los once días, los valores de precipitación son muy similares para ambos casos, sin embargo, a los tres días, se observa una mayor 189 RESULTADOS precipitación para el cultivo mixto, lo cual aporta una ventaja en el sentido del tiempo, ya que en cuatro días se obtiene el 10-15% de precipitación. (a) Desulfovibrio vulgaris % bioprecipitación 25 20 15 10 5 0 4 7 Tiempo (dias) 1 ppm 4,5 ppm 9 ppm 12 ppm 11 15 ppm C 15 ppm (b) Desulfovibrio sp. % bioprecipitación 25 20 15 10 5 0 4 7 11 Tiempo (dias) 1 ppm 4,5 ppm 9 ppm 12 ppm 15 ppm C 15 ppm Figura 42: Precipitación de cromo(III) con Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp.(b) Para los ensayos estériles preparados con 15 ppm de Cr(III) se detectó una precipitación menor del 1%, este hecho permite justificar que no hay 190 RESULTADOS precipitación en ausencia de microorganismos, y que el compuesto responsable de la precipitación sólo se produce por un mecanismo biológico. Además de la capacidad de precipitación, se puede determinar a partir de este estudio la tolerancia de las bacterias sulfato-reductoras al ion Cr(III). El límite de tolerancia está en torno a 15 ppm, ya que a dicha concentración se observó una importante inhibición del crecimiento y un descenso de la actividad metabólica con menor consumo de sulfato. A pesar de ello, se obtuvo una precipitación de Cr(III) que puede justificarse con la producción de sulfuro. En los estudios con concentraciones mayores (20 ppm, datos no mostrados) se encontró una alta toxicidad para ambas cepas, registrándose la muerte celular y la ausencia de actividad metabólica. Los valores de tolerancia (15 ppm) son mucho menores que los obtenidos por Hao y col.(1994), que presentaron un cultivo mixto de bacterias sulfato-reductoras que tolera 60 ppm de Cr(III). Sin embargo, Viera y col. (2003) encontraron el mismo nivel de tolerancia para ambos cultivos a 20 ppm de Cr(III). 3.1.2 Estudio con Cr(VI) Habitualmente, los medios contaminados por cromo presentan cromo hexavalente junto con el cromo trivalente. Aunque un objetivo de nuestro estudio es la reducción del Cr (VI) a Cr (III) mediante el trabajo de las bacterias azufre-oxidantes, puede ocurrir que el lixiviado arrastre cromo hexavalente si no se ha producido una reducción total. Por ello, parece interesante estudiar la tolerancia de estas bacterias al ion Cr (VI). Dado que la cepa mixta en el estudio de precipitación del Cr(III), y de otros iones, mostró mayor actividad se decidió realizar la experiencia con 191 RESULTADOS este cultivo. Para ello, se procedió de forma similar a los experimentos anteriores. Se prepararon 50 ml de medio Postgate C con concentraciones de 1, 5 y 10 ppm de Cr(VI) y se inóculo al 10% con Desulfovibrio sp. En este caso, tan sólo se llevó a cabo el estudio de la tolerancia del cultivo mixto a este ión metálico, por tanto, no se realizó el seguimiento de la concentración de metal en el sobrenadante. A partir de los resultados obtenidos de la población celular (figura 43) y el consumo de sulfato (figura 44), se deduce claramente la tolerancia de Desulfovibrio sp. a concentraciones de 1 y 5 ppm de Cr(VI) aunque se observa una ligera inhibición si comparamos la evolución de estos dos parámetros para cultivos suplementados con metal y el cultivo control. Sin embargo, una concentración de 10 ppm de Cr(VI) resultó tóxica para la célula. Los datos de tolerancia obtenidos permitieron realizar un estudio posterior con Desulfovibrio sp. en presencia Cr(VI) y Cr(III) en solución. 1000 900 800 Mcel/ml 700 600 500 control Dsp 400 1 ppm 300 5 ppm 200 10 ppm 100 C 10ppm 0 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) Figura 43: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(VI). 192 RESULTADOS 4000 3500 sulfato (ppm) 3000 2500 control Dsp 2000 1 ppm 5 ppm 1500 10 ppm C 10ppm 1000 500 0 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) Figura 44: Consumo de sulfato de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(VI.) 3.1.3 Estudio con Cr(III) y Cr(VI) Estudiada la tolerancia al Cr(III) y Cr(VI) de forma independiente, se procedió a realizar el estudio de ambos iones en combinación. A partir de los datos obtenidos, se seleccionaron las concentraciones adecuadas para llevar a cabo este estudio. En esta experiencia, al igual que en las anteriores, se dispusieron botes de vidrio de 50 ml, medio Postgate C suplementado con 15 ppm de Cr(III) y 1, 2,5 y 5 ppm de Cr(VI). Para ello, se emplearon disoluciones de Cr2(SO4)3 y K2Cr2O7. Se inoculó al 10% con Desulfovibrio sp. crecido en Postgate C. Se preparó también un control estéril de 15 ppm de Cr(III) y 5 ppm de Cr(VI) (C15/5) para determinar si se produce precipitación debido a factores no biológicos. Los ensayos se realizaron por duplicado y el seguimiento del crecimiento fue muy similar al caso anterior (Figura 45). 193 RESULTADOS 600 Mcel/ml 500 400 300 control Dsp 200 15/1 100 15/2,5 15/5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Tiempo (días) Figura 45: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(III) y Cr(VI). La presencia de ambos iones afecta al crecimiento de la bacteria y al séptimo día se produce el máximo crecimiento celular. El consumo de sulfato se corresponde de forma directa con el crecimiento de la población y la precipitación del metal. En la figura 46 se muestran los porcentajes de precipitación de cada uno de los ensayos realizados. En esta experiencia, el cultivo mixto se mostró tolerante a las mayores concentraciones probadas. La respuesta tuvo una tendencia similar al caso anterior, de tal forma que a mayor concentración de metal presente en el medio mayor porcentaje de él precipita, este hecho puede deberse a la posible reducción del Cr(VI) a Cr(III) por parte de las bacterias sulfato-reductoras, lo cual hace que la cantidad de Cr(III) en solución aumente y, por ello, se observe una mayor precipitación. De cualquier modo el porcentaje de precipitación se situa en un valor cercano al obtenido para 15 ppm de Cr(III). 194 RESULTADOS 30 % bioprecipitación 25 20 15 10 5 0 15 15/1 15/2,5 15/5 C15/5 Figura 46. Porcentaje de bioprecipitación para Desulfovibrio sp. En presencia de Cr(III) y Cr(VI). 3.1.4 Estudio con Ni(II) El estudio del efecto del ion Ni(II) sobre las bacterias sulfatoreductoras se realizó añadiendo al medio de crecimiento 1, 4, 8,5, 17 y 30 ppm de Ni(II) a partir de una disolución de sulfato de niquel (NiSO4 · H2O). La evolución del crecimiento bacteriano se muestra en la figura 47. La población aumentó de forma significativa hasta los siete días de cultivo y, a partir de ahí, se produjo una ligera estabilización. Resulta evidente que la concentración de metal afecta al metabolismo celular de tal modo que, para ensayos con 17 ppm, el crecimiento fue muy bajo y para 25 ppm no se observó crecimiento significativo. Se puede decir que la concentración de 25 ppm de Ni(II) resulta tóxica para el cultivo puro (Dv) y el mixto (Dsp) ya que, además del descenso celular, no se observó consumo alguno de sulfato. 195 RESULTADOS (a) Desulfovibrio vulgaris 1200 Mcel/ml 1000 1 ppm 800 4 ppm 8,5 ppm 600 17 ppm 400 25 ppm Control Dv 200 0 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) (b) Desulfovibrio sp . 1200 Mcel/ml 1000 1 ppm 4 ppm 8,5 ppm 17 ppm 25 ppm Control Dsp 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) Figura 47. Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de níquel(II) Al igual que ocurre en ausencia de metal, el cultivo mixto en presencia de las concentraciones más bajas de metal (1, 4 y 8,5 ppm) alcanzó una mayor concentración celular que Desulfovibrio vulgaris a las mismas concentraciones de metal. 196 RESULTADOS Solo se produjo un consumo de sulfato significativo (Figura 48) en los casos donde se observó crecimiento celular notable, siendo claramente mayor el descenso de la concentración de sulfato para el cultivo mixto. (a) Desulfovibrio vulgaris 4500 1 ppm 4 ppm 8,5 ppm 17 ppm 25 ppm C 25 ppm Control Dv sulfato (ppm) 4000 3500 3000 2500 2000 1500 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) (b) Desulfovibrio sp . 4500 1 ppm 4 ppm 8,5 ppm 17 ppm 25 ppm C 25 ppm Control Dsp sulfato (ppm) 4000 3500 3000 2500 2000 1500 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) Figura 48. Consumo de sulfato de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de níquel(II) 197 RESULTADOS En cuanto a la precipitación de Ni(II) (Figura 49), se observó para ambos cultivos una precipitación en torno al 65% para los ensayos de 1 ppm, de un 92% para los ensayos de 4 ppm y un 96% para los de 8,5 ppm. Para el experimento con 17 ppm de Ni(II), se registró una leve precipitación con el cultivo mixto(<20%), siendo nula para el cultivo puro. (a) Desulfovibrio vulgaris % bioprecipitación 120 100 80 60 40 20 0 4 7 11 Tiempo (dias) 1 ppm 4 ppm 8,5 ppm 17 ppm C 25 ppm (b) Desulfovibrio sp. % bioprecipitación 120 100 80 60 40 20 0 4 1 ppm 4 ppm 7 Tiempo (dias) 8,5 ppm 17 ppm 11 C 25 ppm Figura 49: Precipitación de níquel(II) para Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de níquel(II) 198 RESULTADOS En el cultivo puro se puede observar que la precipitación máxima que se alcanza para el caso con 1 ppm ocurre en tan sólo cuatro días, pero los ensayos de 4 y 8,5 ppm mejoraron su precipitación al cabo de los siete días y este valor se mantiene constante en el siguiente muestreo. Para el cultivo mixto los resultados de precipitación obtenidos a los cuatro días alcanzaron un máximo, ya que un mayor tiempo de cultivo no conlleva un aumento de esta cantidad. Se puede decir que en tan solo cuatro días, con este cultivo se pueden precipitar 8,5 ppm de Ni(II) casi en su totalidad. Ambos cultivos toleran hasta 8,5 ppm, y concentraciones mayores ralentizan el crecimiento y reducen la capacidad reductora del sulfato de estas bacterias. El cultivo mixto de bacterias sulfato-reductoras empleado por Hao y col. (1994) resultó más tolerante a la presencia de ion níquel (1020 ppm) 3.1.5 Estudio con Zn (II) La experiencia fue realizada suplementando el medio de cultivo Postgate C con sulfato de zinc (ZnSO4· 7H2O) para obtener unas concentraciones iniciales de Zn(II) de 5, 7, 10, 15 y 20 ppm. El crecimiento bacteriano (Figura 50) se ve afectado de una forma gradual en función de la concentración de metal en el medio, siendo la fase de latencia mayor a medida que aumenta la cantidad de zinc en solución. Se puede observar que el cultivo puro (Dv) presenta un crecimiento similar a los 14 días de incubación para los experimentos con concentraciones menores de 10 ppm. De igual modo, el cultivo mixto (Dsp) puede llegar a valores considerables de biomasa para concentraciones por debajo de 15 ppm, encontrándose una importante inhibición para el caso de 20 ppm. Este comportamiento vuelve a poner de manifiesto que el 199 RESULTADOS cultivo mixto tolera mayores concentraciones del metal en solución, como bien se ha observado con los metales ensayados anteriormente. (a) Desulfovibrio vulgaris 1000 5 ppm 7 ppm 10 ppm 15 ppm 20 ppm control Dv Mcel/ml 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Tiempo (días) (b) Desulfovibrio sp . 1200 Mcel/ml 1000 5 ppm 7 ppm 10 ppm 15 ppm 20 ppm control Dsp 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Tiempo (días) Figura 50: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de zinc(II) 200 RESULTADOS Como se observa en la figura 51, el consumo de sulfato se muestra parejo al aumento de la población. Cabe resaltar que en presencia de Zn(II) se obtiene mayor población celular y, por tanto, mayor consumo de sulfato que en presencia de otros iones. (a) Desulfovibrio vulgaris 5000 5 ppm 7 ppm 10 ppm 15 ppm 20 ppm C 20 ppm control Dv sulfato (ppm) 4000 3000 2000 1000 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Tiempo (días) (b) Desulfovibrio sp . sulfato (ppm) 5000 5 ppm 4000 7 ppm 10 ppm 3000 15 ppm 2000 20 ppm C 20 ppm 1000 control Dsp 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Tiempo (días) Figura 51: Consumo de sulfato de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia de zinc(II) 201 RESULTADOS Si observamos los porcentajes de bioprecipitación, se puede ver que el comportamiento de los dos cultivos de bacterias sulfato-reductoras fue bastante distinto en este caso (Figura 52). (a) Desulfovibrio vulgaris % bioprecipitación 120 100 80 60 40 20 0 4 7 11 14 Tiempo (dias) 5 ppm 7 ppm 10 ppm 15 ppm 20 ppm C 20 ppm (b) Desulfovibrio sp . 120 % bioprecipitación 100 80 60 40 20 0 4 7 11 14 Tiempo (dias) 5 ppm 7 ppm 10 ppm 15 ppm 20 ppm C 20 ppm Figura 52:. Precipitación de zinc(II) para Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) 202 RESULTADOS Para el cultivo Desulfovibrio vulgaris con 5 ppm de Zn(II) se alcanzó una precipitación cercana al 100% tras siete días de incubación y fueron necesarios 11 días para alcanzar niveles similares en el experimento con 7 y 10 ppm. Para el resto de las concentraciones, tras 14 días de incubación, sólo el caso de 15 ppm alcanzó una precipitación notable (20%), siendo tan sólo de un 9% para el cultivo de 20 ppm. Estos resultados indican que existe una correspondencia entre el crecimiento del cultivo y la concentración de metal precipitado. De tal modo que, la cantidad de metal precipitado aumenta en el tiempo hasta alcanzar un máximo que coincide con el momento en que se supera la fase exponencial de crecimiento en cada cultivo. Este hecho se corrobora también para el cultivo mixto, donde a los 7 días se observa el máximo de precipitación para el cultivo con 5 ppm, a los 11 días, coincidiendo con el aumento de la población celular, se precipitó el 99-95% del metal de los cultivos con 7-15 ppm y a los 14 días se obtuvo una precipitación del 93% para el caso de 20 ppm. La concentración máxima tolerada de zinc (20 ppm) coincide con la obtenida por Utgikar y col. (2001) aunque algo menor que la presentada por Hao y col. (1994) cuyo cultivo mixto toleró entre 25 y 40 ppm de este ion. 3.1.6 Estudio con Cr(III), Ni(II) y Zn(II) Una vez estudiada la tolerancia de Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp. a los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) se llevó a cabo un estudio similar combinando estos metales, por pares y todos juntos. El objetivo de este estudio es determinar el comportamiento de las bacterias sulfatoreductoras en presencia de una mezcla de iones metálicos, de forma similar a como ocurriría en un medio natural. 203 RESULTADOS Las concentraciones seleccionadas de cada metal fueron aquellas toleradas por ambos cultivos y que presentaron una precipitación significativa. Con el fin de poder establecer comparaciones, dado que el estudio con Cr(III) y Ni(II) se realizó hasta los 11 días de incubación se consideraron los valores correspondientes a este mismo tiempo para los cultivos con Zn(II) y se establecieron iguales tiempos de muestreo en la experiencia con combinación de metales. Se expuso a ambos cultivos a 15 ppm de Cr(III), 8,5 ppm de Ni(II) y 10 ppm de Zn(II). Las combinaciones se denominaron: CrNi, CrZn, NiZn y CrNiZn. Figura 53: Experiencia de precipitación de los iones cromo, níquel y zinc combinados en un cultivo de Desulfovibrio vulgaris (11 días). La evolución de la concentración celular de Desulfovibrio vulgaris (Figura 54) en presencia de los metales fue similar, el crecimiento fue mayor cuando los metales se encuentran combinados en parejas que para el cultivo con cada uno de ellos por separado. La prolongada fase de latencia del cultivo puro con 10 ppm de Zn(II) no se detecta cuando el metal se encuentra combinado con alguno más. Los datos de sulfato (Figura 55) se muestran coherentes con el aumento de la población celular. 204 RESULTADOS Desulfovibrio vulgaris Mcel/ml 800 700 Cr 600 Ni Zn 500 CrNi 400 CrZn 300 NiZn 200 CrNiZn 100 0 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) Figura 54: Crecimiento bacteriano para Desulfovibrio vulgaris en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II). Desulfovibrio vulgaris 4000 Cr Ni Zn CrNi CrZn NiZn CrNiZn sulfato (ppm) 3500 3000 2500 2000 1500 1000 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) Figura 55: Consumo de sulfato para Desulfovibrio vulgaris en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) En el caso del cultivo mixto (figura 56), el comportamiento es similar, el crecimiento es mayor cuando se combinan dos metales, que cuando se 205 RESULTADOS suplementan cada uno de ellos por separado. Se puede observar también correspondencia entre crecimiento y consumo de sulfato (figura 57). Desulfovibrio sp. 800 Cr 700 Ni Mcel/ml 600 Zn 500 CrNi 400 CrZn 300 NiZn 200 CrNiZn 100 0 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) Figura 56: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II). sulfato (ppm) Desulfovibrio sp. 4500 Cr 4000 Ni Zn 3500 CrNi 3000 CrZn 2500 NiZn 2000 CrNiZn 1500 1000 0 2 4 6 8 10 12 Tiempo (días) Figura 57: Consumo de sulfato de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II). 206 RESULTADOS Podría pensarse en un efecto de co-precipitación de los metales cuando se dan condiciones reductoras en el medio, ya que en ausencia de bacterias, el propio medio no produce precipitación alguna, de tal forma que los controles realizados con cada una de las combinaciones de metal posibles no presentaron porcentaje de precipitación mayor del 5%. En la tabla 26 se muestran los porcentajes de bioprecipitación de cada metal individual y en combinación para los dos cultivos de bacterias sulfato-reductoras. Cepa Metales sólo CrNi CrZn Cr(III) 24,7 28,0 29,2 Ni(II) 96,0 94,7 Zn(II) 92,9 Cr(III) 25,5 28,8 Ni(II) 96,1 95,4 Zn(II) 94,7 NiZn CrNiZn 33,3 Desulfovibrio 100,0 95,1 100,0 100,0 vulgaris Desulfovibrio sp. 100,0 32,0 100,0 33,0 100,0 91,4 100,0 100,0 Tabla 26: Porcentajes de precipitación de los iones metálicos solos y en combinación para Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp. La cantidad de cromo precipitado aumenta en los ensayos en que se encuentra combinado, aunque no se alcanzan los valores de precipitación tan elevados obtenidos para otros metales. Esta mejora puede atribuirse a una co-precipitación formando compuestos más complejos, aunque esta presunción tendría que confirmarse mediante la determinación analítica del precipitado obtenido. 207 RESULTADOS Las cantidades de níquel y zinc precipitados son bastante similares cuando se encuentran solos o en combinación, aproximadamente, se alcanza el 100% de eliminación del metal en solución. Para llegar a determinar las causas reales de este tipo de comportamiento, sería necesario programar una nueva batería de experimentos y profundizar en las técnicas analíticas para llegar a determinar la naturaleza química de los precipitados obtenidos. Sin embargo, estos experimentos no se han fijado como objetivos básicos del trabajo realizado y pueden constituir nuevos trabajos de investigación dentro de la línea iniciada con este estudio. Otro de los factores que puede influir significativamente en la precipitación de los metales en combinación es la respuesta de las bacterias ante los distintos metales. En este sentido, Utgikar y col. (2001) presentaron un mecanismo de inhibición de la reducción de sulfato de las bacterias sulfato-reductoras por la deposición de las partículas del sulfuro metálico formado sobre la membrana celular, lo que cual impide el acceso de la materia orgánica y del ion sulfato a las inmediaciones de la célula, reduciendo así la posibilidad de generar sulfuro y precipitar los iones metálicos presentes en el medio. En la figura 17 se muestran fotografías realizadas por microscopía electrónica donde se presenta un cultivo Desulfovibrio sp. en presencia de una combinación de cromo, níquel y zinc al inicio de la experiencia y a los 14 días. Se observa claramente la deposición de precipitados sobre la superficie celular de las bacterias cuando el proceso está por finalizar. 208 RESULTADOS Figura 58: Fotografía de microscopía electrónica (x20000) de un cultivo Desulfovibrio sp. en presencia de cromo, níquel y zinc para tiempo cero(izqda.) y a los 14 días (dcha) Por tanto, la deposición del sulfuro metálico sobre la superficie celular puede explicar claramente el descenso de la actividad metabólica de las bacterias y de la bioprecipitación de los metales estudiados. 209 RESULTADOS 3.2 PRECIPITACIÓN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN CONTINUO Para el estudio de la precipitación en continuo de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) por la acción de las bacterias sulfato-reductoras se empleó un reactor de tanque agitado donde se creció un cultivo de Desulfovibrio sp.. Se utilizó el cultivo mixto por presentar una mayor velocidad de crecimiento y de reducción de sulfato que el cultivo puro, como ya se observó en el estudio de precipitación discontinua. Figura 59: Sistema empleado para la precipitación de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) presentes en un lixiviado artificial por el medio generado por un cultivo Desulfovibrio sp. El medio obtenido del reactor, rico en sulfuro de hidrógeno, se goteó sobre un depósito donde se encontraba la solución metálica que había de 210 RESULTADOS ser precipitada y a la disolución resultante se la denominó como precipitado. El equipo empleado se muestra en la figura 59. El reactor de bacterias sulfato-reductoras se mantuvo en régimen discontinuo durante 2 días (figura 60), a partir de ese momento se trabajó a caudales crecientes partiendo de 6 ml/h hasta 14 ml/h, caudal que se establece a los 9 días. El cultivo se mantuvo con una población celular entre 300-500 Mcel/ml y una concentración de sulfato entre 2-2,5 g/l de sulfato a 700 3.0 600 2.5 Mcel/ml 500 2.0 400 1.5 300 1.0 200 100 0.5 0 0.0 0 10 20 30 [SO4=] (ppm) lo largo de todo el período de experimentación. 40 Tiempo (días) Mcel/ml [SO4=] Figura 60: Evolución de la población celular y la concentración de sulfato en el reactor de Desulfovibrio sp. Una vez conseguido el estado estacionario, el efluente del reactor se introdujo en el reactor de precipitación. Inicialmente, para evaluar la capacidad de estas bacterias para precipitar iones metálicos se empleó una disolución a la que denominamos lixiviado artificial. La solución, de 100 ml, se preparó con sulfato de cromo, de níquel y de zinc, para obtener una composición final de: 766 ppm de Cr(III), 376 ppm de Ni(II) y 3521 ppm de Zn(II), cantidades similares a las 211 RESULTADOS tomadas como referencia en apartados anteriores del estudio. La figura 61 presenta un cuadro resumen de la cantidad de cada uno de los metales durante el proceso de bioprecipitación. Formato: Lixiviado artificial 76,6 37,6 352,1 Lixiviado residual 66,6 32,5 188,3 Fracción 23,1 14,7 0,9 l medio D. sp. 10 5,1 mg Ni(II) mg Zn(II) % de precipitación 163,8 13,1 13,6 46,5 Fracción sin tratar 43,5 5 etapas 51,1 Precipitación mg Cr(III) 4,51 l medio D. sp. 17,8 137,2 % de precipitación Precipitación 0,2 6,1 45 0,87 41,5 88,1 Datos globales Cantidad de lixiviado tratada 33,1 19,8 214,9 4,51 l medio D. sp. Precipitación 10,2 11,2 % de precipitación 208,8 30,8 56,6 97,2 Figura 61. Cuadro resumen del proceso de precipitación de iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) por Desulfovibrio sp. La adición de 900 ml de medio con sulfuro de hidrógeno, procedente del reactor de crecimiento de las bacterias sulfato-reductoras, alcanzó una reducción del 13,1% de Cr(III), 13,6% de Ni(II) y 46,5% de Zn(II). Dado que el precipitado obtenido contenía una gran cantidad de metales en solución, se tomaron distintas fracciones de esta disolución con el fin de poder llegar a establecer el límite de precipitación que se puede conseguir bajo esta metodología. De esta forma, del lixiviado residual que quedó de esta primera etapa se trataron 23,1 mg de Cr(III), 14,7 mg de Ni(II) y 51,1 mg de Zn(II) en total, y esta cantidad en solución fue procesada mediante cinco etapas de precipitación que permitieron llegar a precipitar el 0,87% de 212 RESULTADOS Cr(III), el 41,5% de Ni(II) y el 88,1% de Zn(II). Si consideramos que una fracción de la disolución inicial no fue tratada, se puede calcular el porcentaje total de precipitación respecto a la cantidad de metal procesada, y de esta forma, se obtuvo un 30,8% de Cr(III), 55,8% de Ni(II) y 97,16% de Zn(II). Se observa que la mayor precipitación ocurre para el ion Zn(II), como ocurre en el caso de las experiencias en discontinuo. Este hecho puede deberse a que la de solubilidad del sulfuro de zinc es menor a la solubilidad de los demás compuestos en las condiciones en que se encuentra el medio, con lo cual incluso para concentraciones muy bajas de sulfuro de hidrógeno se obtiene precipitación de zinc, preferentemente. De los resultados obtenidos se puede destacar que la mayor precipitación ocurre cuando las concentraciones de los iones metálicos a tratar son más elevadas, de modo que la mayor precipitación ocurre en la etapa inicial. Las últimas fracciones del lixiviado residual tratadas presentaron una precipitación nula o muy baja de cromo y níquel y la precipitación de zinc se fue haciendo menor a medida que el contenido de éste en las distintas fracciones iba disminuyendo. En general, se puede deducir que este proceso no resulta viable para concentraciones demasiado bajas, ya que implica un elevado consumo del medio generado por las bacterias sulfato-reductoras. Este hecho se observa claramente en la segunda parte del proceso, en la cual fueron necesarios más de 4,5 litros para precipitar tan sólo 0,2 mg de Cr(III), 6,1 mg de Ni(II) y 45 mg de Zn(II). Por tanto, resulta conveniente favorecer la precipitación manteniendo unas concentraciones lo suficientemente elevadas en los lixiviados a tratar como para que la precipitación sea notable con el menor consumo de medio reductor posible. 213 RESULTADOS 4 INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS 4.1 INMOVILIZACIÓN DE BACTERIAS AZUFREOXIDANTES SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO Con el fin de obtener una producción de medio ácido suficiente para realizar el proceso de solubilización de iones metálicos en continuo, se estudió la conveniencia de inmovilizar las bacterias azufre-oxidantes sobre un soporte inerte. En este sentido, dada la experiencia de la que se dispone con la espuma de poliuretano, se procedió al estudio del proceso de inmovilización de ambas especies bacterianas sobre este soporte. El procedimiento constó de una primera etapa de inmovilización al pH óptimo de crecimiento de cada bacteria de forma discontinua en matraces erlenmeyers con las bacterias en suspensión y un gramo de unidades cúbicas de espuma de poliuretano. Tras dos ciclos, se empleó medio 0K ajustado a pH 4, por ser este valor más adecuado para el incremento de la producción de ácido. Inicialmente, se observó que las partículas de azufre elemental suplementadas permanecieron en la superficie del líquido, debido a su carácter hidrófobo, de modo que se pensó en la incompatibilidad de este sustrato con el soporte elegido, ya que las bacterias retenidas en el interior de la espuma difícilmente podrían acceder a la fuente de energía. Sin embargo, la acción de las bacterias en suspensión hace que la oxidación del azufre produzca partículas de menor tamaño que difunden fácilmente en la matriz porosa o se adhieren a su superficie, teniendo lugar este proceso en las primeras 24 horas (figura 62). 214 RESULTADOS Figura 62: Cultivo discontinuo a de At. thiooxidans crecido sobre espuma de poliuretano. El seguimiento de la experiencia se realizó midiendo diariamente el pH, la concentración de sulfato y la concentración de protones que se produce. Se fijó como criterio para finalizar un ciclo de inmovilización que el pH estuviera próximo a un valor de 1; en este momento, se determinó la concentración de biomasa inmovilizada de acuerdo a la metodología descrita en el apartado de Material y Métodos de la presente memoria. En estas condiciones la concentración de protones se encuentra en torno a los 0,25 g/l y la concentración de sulfato en 15 g/l. En la figura 63 se muestra la evolución del pH a lo largo de los distintos ciclos de inmovilización para At. ferrooxidans. La etapa de inicial se compone de dos ciclos de menor extensión ya que al partir de un medio más ácido (pH 1,8) el valor de pH 1 se alcanza en menor tiempo. Una vez suplementado con medio 0K a pH 4, se pudo observar una tendencia muy similar a partir del cuarto ciclo, tanto en la medida de pH como en la 215 RESULTADOS concentración de los productos de reacción (figura 64), siendo la duración media de un ciclo de inmovilización de 165 horas. La constancia en los ciclos respecto del tiempo coincide con el estacionamiento de la cantidad de bacterias inmovilizadas en un valor de 15 Mcél/mg de soporte (figura 65). 1.9 1.7 pH 1.5 1.3 1.1 0.9 0.7 0.5 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 Tiempo (horas) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 [H+] g/l [SO4=] g/l Figura 63:.Evolución del pH en el proceso de inmovilización de At. ferrooxidans sobre espuma de poliuretano. 0,05 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 Tiempo (horas) [SO4] g/l [H+] g/l Figura 64: Evolución de la concentración de protones y de sulfato en el proceso de inmovilización de At. ferrooxidans sobre espuma de poliuretano 216 RESULTADOS Mcel/mg de soporte 30 25 20 15 10 At. thiooxidans 5 At. ferrooxidans 0 1 2 3 4 5 6 Ciclo Figura 65: Evolución de la población celular inmovilizada por mg de espuma de poliuretano en función de los ciclos realizados para At. ferrooxidans y At. thiooxidans. La tendencia seguida en el proceso de inmovilización de At. thiooxidans se muestra en las figuras 66 y 67, y cabe destacar que en este caso, se necesita un menor tiempo para la inmovilización de esta especie bacteriana. Los dos primeros ciclos fueron similares en extensión a los observados para At. ferrooxidans, a pesar de que At. thiooxidans parte de un pH inicial mayor (medio 0K pH 2,5). Una vez que el cultivo es suplementado con medio a pH 4, la biomasa inmovilizada se establece en torno a los 24 Mcél/mg de soporte (figura 65) en el cuarto ciclo y la extensión de los ciclos no supera las 140 horas. Por tanto, a la vista de los resultados se puede concluir que, tanto At. ferrooxidans como At. thiooxidans pueden inmovilizarse en espuma de poliuretano cuando se utiliza azufre elemental como fuente de energía, siendo dicha inmovilización más efectiva para el segundo de ellos. Teniendo en cuenta estos resultados y, persiguiendo el objetivo de su aplicación para la producción de medio ácido, parece más conveniente 217 RESULTADOS utilizar columnas de At. thiooxidans inmovilizado sobre espuma de poliuretano. 2.1 1.9 1.7 pH 1.5 1.3 1.1 0.9 0.7 0.5 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Tiempo (horas) Figura 66: Evolución del pH en el proceso de inmovilización de At. thiooxidans sobre espuma de poliuretano 18 0.35 16 0.30 0.25 12 10 0.20 8 0.15 6 [H+ ] g/l [SO4=] g/l 14 0.10 4 0.05 2 0 0.00 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Tiempo (horas) [SO4] g/l [H+] g/l Figura 67: Evolución de la concentración de protones y de sulfato en el proceso de inmovilización de At. thiooxidans sobre espuma de poliuretano. 218 RESULTADOS 4.2 INTEGRACIÓN DE LOS PROCESOS DE SOLUBILIZACIÓN Y PRECIPITACIÓN EN CONTINUO La integración de los procesos de solubilización y precipitación en régimen continuo estudiados se llevó a cabo en el sistema descrito en la figura 68. Figura 68: Sistema empleado para la integración de los procesos de solubilización y precipitación de iones metálicos en continuo. Para realizar el proceso de solubilización se llevó a cabo la inmovilización de At. thiooxidans sobre espuma de poliuretano en matraces erlenmeyers. Tras cuatro ciclos de inmovilización, la espuma colonizada se incorporó a una columna de lecho fijo a la que se suplementó medio 0K (pH 4) y azufre elemental. Inicialmente, el sistema operó en discontinuo (figura 69) hasta alcanzar un pH igual a 1, comenzando a trabajar en ese momento en régimen continuo con un caudal de alimentación de 14,5 ml/h. Bajo estas condiciones de operación, el estado estacionario se estableció para una población celular inmovilizada de 33 Mcél/mg de espuma. 219 RESULTADOS 14 2 10 1.5 8 pH [sulfato] (ppm) 12 6 1 4 2 0 0.5 0 4 8 12 16 20 Tiempo (días) [sulfato] pH Figura 69: Evolución de la concentración de sulfato y pH en la columna de At. thiooxidans El medio ácido generado en la columna de At. thiooxidans se utilizó como alimentación de otra columna que contenía 50 gramos de una arena contaminada artificialmente con 75 mg de Cr(III), 50 mg de Cr(VI), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II). El aporte de cromo hexavalente a la arena se realizó con el objetivo de determinar la reducción del cromo(VI) a cromo(III) mediante los compuestos reductores obtenidos por la oxidación de azufre elemental por parte de las bacterias azufre-oxidantes. El primer volumen de lixiviado obtenido presentó una elevada concentración de cromo (VI). Este hecho se debe a la elevada solubilidad del dicromato potásico que hace que este ión se disuelva rápidamente en el medio ácido circulante y abandone con facilidad la matriz sólida en la que se encuentra y, por otra parte, el tiempo de residencia del medio fue insuficiente para que se produjese el contacto adecuado entre los compuestos reductores y el cromo hexavalente. No obstante, se observó una reducción parcial del Cr(VI), ya que sólo se detectó la presencia de este ión en el primer lixiviado obtenido el cual contenía 39,7 mg de Cr(VI) de los 50 mg totales, lo que supone que en los primeros 210 ml de medio ácido se redujo el 20,6% de este ión. Un aumento 220 RESULTADOS del tiempo de residencia permitiría el incremento de este porcentaje; de cualquier modo la proporción de este ion en la arena es mucho mayor a la que se suele encontrar en los medios contaminados de forma natural. Después de esta primera etapa de solubilización, el contenido total de Cr(III) en la arena se vió aumentado por la reducción de Cr (VI) en un total de 10,3 mg de Cr (III) para pasar a un total de 85,3 mg de Cr(III) totales. Al igual que en el estudio independiente de solubilización en continuo, se produce una lixiviación inicial de cromo y níquel (figura 70) cuando el pH del lixiviado no es muy ácido debido a la alcalinidad del soporte sólido empleado. Alcanzadas las condiciones ácidas, se muestra una elevada solubilización del zinc contenido en la arena que se acompaña por una leve y lenta lixiviación de los otros metales. La figura 71 permite comprobar la evolución de la cantidad de metal lixiviada en 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 Volumen (litros) [Zn(II)] [Cr(III)] 4 [Ni(II)] [Cr(III)], [Ni(II)] y pH [Zn(II)] función del volumen de ácido empleado para este proceso. 5 pH Figura 70: Evolución de la concentración de metales en el lixiviado en función del volumen de ácido pasado a través de la columna. 221 200 20 150 15 100 10 50 5 0 0 0 1 2 3 4 5 mg Cr(III) y mg Ni(II) lixiviados mg Zn(II) lixiviados RESULTADOS 6 Volumen (litros) mg Zn(II) mg Cr(III) mg Ni(II) Figura 71: Evolución de la cantidad de cada metal solubilizado en función del volumen de ácido pasado a través de la columna. En la tabla 27 se presentan algunos valores representativos del proceso de solubilización y precipitación completo. En la etapa de solubilización se puede observar que, después de hacer circular por la columna de residuo 2,4 litros de medio ácido, las concentraciones de los distintos metales toman valores muy bajos y se ha completado un alto porcentaje de la solubilización total. En concreto, se solubilizó el 14,62% de Cr(III), el 26,65% de Ni(II) y el 90,53% de Zn(II). De esta forma, después de pasar 3 litros más de medio ácido tan sólo se consiguió un aumento del 2,07% del Cr(III), un 6,25% del Ni(II) y un 7,89% del Zn(II). Como se puede observar, el proceso es más efectivo cuando los metales se encuentran a mayores concentraciones, por lo que parece adecuado utilizar este proceso para tratar cantidades similares a las iniciales e ir incorporando posteriormente más fracciones de residuo con el fin de mantener concentraciones que permitan unos porcentajes de solubilización elevados. La baja solubilización del cromo se debe principalmente a dos motivos, la extrema insolubilidad del compuesto de cromo (III) empleado 222 RESULTADOS (Cr2O3), lo que hace pensar que la mayor parte del cromo (III) lixiviado proceda de la reducción del cromo (VI), y la baja densidad del óxido de cromo que provoca que gran parte de la cantidad aportada a la arena sea arrastrada por el lixiviado, retirándolo de la arena y eliminando, por tanto, la posibilidad de ser solubilizado. Cromo Níquel Zinc mg totales en la arena 85,30 20,00 200,00 mg lixiviados en 2,4 l de medio ácido 12,47 5,33 181,10 % lixiviado del total 14,62 26,65 90,53 medio reductor 0,27 2,88 50,73 % precipitado de 2,4 l de lixiviado 2,17 54,03 28,02 mg lixiviados en 5,5 l de medio ácido 14,24 6,58 196,84 % lixiviado del total 16,69 32,90 98,42 medio reductor 0,29 2,90 54,53 % precipitado de 5,5 l de lixiviado 2,05 44,12 27,70 mg precipitados de 2,4 l de lixiviado con 2,2 l de mg precipitados de 5,5 l de lixiviado con 4,8 l de Tabla I1. Datos generales obtenidos en el proceso de solubilización-precipitación. Los porcentajes de solubilización finales obtenidos por este proceso son menores a los mostrados para la solubilización con un cultivo At. thiooxidans en suspensión. No obstante, el volumen de ácido empleado mediante esa metodología fue mayor (11,4 litros). Para el mismo volumen consumido en este proceso (5,5 litros), en el caso del cultivo de At. thiooxidans en suspensión, se obtuvo una solubilización del 39,4% de Cr(III), 88,1% de Ni(II) y 97,7 % de Zn(II) frente al 17% de Cr(III), 34,3% de Ni(II) y 99,3% de Zn(II) para At. thiooxidans inmovilizado. Como se puede observar estas 223 RESULTADOS concentraciones fueron más altas para el caso del cromo y níquel pero el tiempo necesario para alcanzar estos niveles fue de 26 días frente a los 19 días empleados con At. thiooxidans inmovilizado en espuma de poliuretano. Por tanto, en función del parámetro que deseemos optimizar habría que decidir de que modo resulta más conveniente operar. De cualquier modo, si comparamos la cantidad de metal lixiviado en la primera etapa (2,4 litros), que fue la que resultó más efectiva, con los porcentajes de solubilización obtenidos para el proceso con At. thiooxidans en cultivo sumergido, dichos valores fueron menores para el cromo y el zinc y muy similares para el níquel (5,5% de Cr(III), 27,7% de Ni(II) y 69,9% de Zn(II)). Estos resultados justifican la inmovilización de las bacterias azufre-oxidantes de cara a obtener una mayor solubilización de los metales en un menor tiempo, siempre y cuando trabajemos dentro de un rango de concentraciones de metales que permita una solubilización significativa. La siguiente etapa, de precipitación, se realizó de forma similar al proceso descrito anteriormente en la presente memoria para la precipitación de un lixiviado artificial de cromo, níquel y zinc. Para ello, se creció un cultivo de Desulfovibrio sp., en un reactor de tanque agitado, en el cual, tras una primera etapa en cultivo discontinuo se comenzó a trabajar en régimen continuo con un caudal de alimentación de medio de 12,5 ml/h. Alcanzado el estado estacionario, se operó de forma que el volumen de medio lixiviado obtenido diariamente de la etapa de solubilización se empleó como medio para la precipitación, el tiempo de contacto entre el lixiviado y el efluente rico en sulfuro de hidrógeno procedentes del reactor de Desulfovibrio sp. fue de 24 horas. Durante toda la experimentación, el lixiviado obtenido se filtró a través de una membrana de 0,22 m para retener el óxido de cromo arrastrado en el proceso de solubilización, con el fin de no interferir en la 224 RESULTADOS medida de la concentración de metales presentes en el sobrenadante del precipitado. De acuerdo con los resultados obtenidos (tabla 27), se puede decir que el proceso de precipitación es posible para los distintos metales presentes en el lixiviado, pero al igual que en el proceso de solubilización, la eficacia del proceso fue mayor para aquellos lixiviados con concentraciones mayores de los metales. De este modo, las distintas fracciones de lixiviado tratadas en los primeros 2,4 litros obtenidos en el proceso de solubilización presentaron un porcentaje de precipitación más alto. En esta primera etapa se registra la mayor parte de la precipitación total, de tal forma que se puede llegar a precipitar el 2,2% de Cr(III), el 54% de Ni(II) y 28% de Zn(II) de la cantidad de lixiviado tratada, empleando para ello 2,2 l de medio reductor. Se observa que, tal como ocurrió en el estudio anterior, la precipitación de cromo es bastante baja mostrándose una cierta preferencia por la precipitación de los otros metales. El elevado porcentaje de precipitación del níquel frente al del zinc, se debe a que las primeras fracciones presentan una concentración significativa de níquel y, sin embargo, no se detectó aún la solubilización del zinc, lo cual hace que el sulfuro de hidrógeno se consuma en la precipitación del níquel en solución. La baja concentración de metales en las fracciones de lixiviado tratadas posteriormente, dieron lugar a una baja precipitación de cromo y níquel, observándose sólo precipitación del ion zinc. La etapa final no resulta tan efectiva como era de esperar, ya que, el tratamiento total del lixiviado obtenido en la etapa de solubilización dio lugar a la precipitación del 2,1% de Cr(III), 44,1% de Ni(II) y 27,7% de Zn(II) empleando un total de 4,8 litros de medio procedente del reactor de bacterias sulfato-reductoras. 225 RESULTADOS 4.3 COMPARACIÓN CON OTRO PROCESO Finalizado el proceso integrado resulta interesante la comparación de los resultados obtenidos con un proceso similar. Para ello, se recurrió al trabajo realizado por White y Gadd (1998), en el cual se propone un proceso de solubilización y precipitación de un suelo contaminado artificialmente, y se calcularon una serie de parámetros para hacer posible dicha comparación. Las tablas 12 y 13 presentan los datos referentes a la etapa de solubilización y precipitación del proceso integrado llevado a cabo por estos autores y el realizado en el presente trabajo Parámetros Unid. White y Gadd (1998) Proceso Integrado Volumen de trabajo l 9 0,85 Caudal volumétrico ml/h 100 15 Velocidad de dilución d-1 0,267 0,43 Tiempo empleado d 190 19 Cantidad de residuo tratada g 8000 50 Volumen de medio ácido l 456 5,5 Metales estudiados Cr(III) Ni(II) Zn(II) Cr(III) Ni(II) Zn(II) Concentración del residuo mg/l 132,0 108,8 141,8 1500 400 4000 Cantidad tratada de metales mg 1056 870,1 1134 85,3 20 200 Cantidad lixiviada mg 950,4 817,9 1032,0 14,24 6,58 196,84 % lixiviado - 90 94 91 16,7 32,9 98,4 Cant. lixiviada/vol. ácido mg/l 2,08 1,79 2,26 2,59 1,20 35,78 Tabla 12 : Parámetros pertenecientes al proceso de solubilización continua llevado a cabo por White y Gadd (1998) y en el proceso integrado propuesto en este trabajo. El proceso de solubilización de White y Gadd (1998) empleaba un reactor (9 l) suplementado con 8 kg de suelo e inoculado con un cultivo de bacterias azufre-oxidantes acidófilas y neutrófilas. Dicho proceso se mantuvo 190 días operando y, para ello, se emplearon 456 litros de medio. 226 RESULTADOS Como puede observarse, la concentración del residuo tratado fue mucho menor que en el proceso estudiado en este trabajo, aunque la cantidad de cada metal tratada fue mayor. Estos autores obtuvieron porcentajes de solubilización mayores del 90% para todos los metales, mientras que en el estudio detallado en la memoria, la mayor concentración de metales en el residuo y la utilización de una velocidad de dilución mayor condujeron a unos porcentajes muchos menores en el caso del cromo y el níquel. No obstante, cabe indicar que el proceso se detuvo cuando se observó una baja solubilización con respecto al volumen de ácido empleado pero la experiencia previa de solubilización continua con At. thiooxidans en cultivo sumergido, permitió asegurarnos que un mayor volumen de ácido empleado da lugar a la solubilización completa del níquel y el zinc y una solubilización notable, mayor del 55%, del cromo. Por otra parte, si comparamos la cantidad de metal solubilizado por volumen de ácido empleado, en el presente trabajo se obtienen mayores niveles de solubilización para el cromo y el zinc, destacando este último. Este hecho viene a coincidir con el efecto observado de mayores concentraciones en los lixiviados para aquellos casos en los que se parte de una concentración de metal mayor en el residuo. De cualquier modo, la menor capacidad de lixiviación en el sistema de White y Gadd (1998) se puede deber a la forma en que se encuentran integrados los iones metálicos en el suelo. La etapa de precipitación llevada a cabo por White y Gadd (1998) se realizó en un reactor de sedimentación interna con recirculación, alimentado con lixiviado a 100 ml/h e inoculado con un cultivo mixto formado por distintas cepas resistentes a los metales y procedentes de distintos ambientes. La selección del cultivo bacteriano y el diseño del 227 RESULTADOS reactor para favorecer la precipitación, dieron lugar a una elevada precipitación de todos los iones. Los bajos rendimientos obtenidos en el proceso de precipitación llevado a cabo en el trabajo aquí presentado se corroboran si lo comparamos con otros procesos como el de White y Gadd (1998), ya que sólo en el caso del zinc se obtuvo una precipitación significativa con respecto al volumen de medio procedente del reactor de bacterias sulfatoreductoras, debido a la alta concentración de este metal en el lixiviado. Este hecho experimental puede deberse a que en este trabajo no se ha realizado ningún tipo de selección de las bacterias y se ha trabajado con cepas de colección. Parámetros Unid. White y Gadd (1998) Proceso Integrado Volumen de trabajo l 1 0,8 Caudal volumétrico ml/h 100 12,5 Velocidad de dilución d-1 2,4 0,375 Tiempo empleado d 190 19 Cantidad de residuo tratada g 8000 50 Volumen de medio D.sp. l 456 4,8 Metales estudiados Cr(III) Ni(II) Zn(II) Cr(III) Ni(II) Zn(II) Concentración del lixiviado mg/l 1,31 1,81 2,49 2,59 1,20 35,78 Cantidad tratada de metales mg 597,0 828,4 1134 14,24 6,58 196,84 Cantidad precipitada mg 581,9 664,0 1092,7 0,29 2,90 54,53 % precipitado - 97,5 80,2 96,4 2,1 44,1 27,7 Cant. precipitada/vol. D. sp. mg/l 1,28 1,46 2,40 0,06 0,60 11,36 Tabla 13: Parámetros pertenecientes al proceso de precipitación continua llevado a cabo por White y Gadd (1998) y en el proceso integrado propuesto en este trabajo. 228 E.-CONCLUSIONES CONCLUSIONES • Las bacterias azufre-oxidantes tienen la capacidad de solubilizar los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) presentes en compuestos de carácter insoluble cuando éstos se encuentran solos y en combinación. En concreto, operando en régimen discontinuo At. ferrooxidans es capaz de solubilizar 1,5 % de Cr(III), 22,6 % de Ni(II) y 53,25% de Zn(II) y At. thiooxidans 1,35% de Cr(III), 24,25% de Ni(II) y 55% de Zn(II) de una disolución metálica compuesta por 75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II) en 100 ml de medio. • La presencia de una matriz sólida como la arena en el cultivo discontinuo de las bacterias azufre-oxidantes provoca alteraciones en el medio que inhiben la actividad celular y, por tanto, impiden el proceso de solubilización de compuestos metálicos. • El proceso de solubilización en continuo propuesto permite lixiviar los compuestos metálicos presentes en una arena contaminada artificialmente. El crecimiento en continuo de At. thiooxidans en cultivo sumergido produce un medio de elevada acidez que puede ser empleado de forma continua como agente lixiviante sobre el lecho de arena contenido en una columna. Los porcentajes de solubilización obtenidos haciendo pasar 11,4 l de medio ácido por 50 g de arena (75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II)) fueron de un 55,4% de Cr(III), 100% de Ni(II) y 100% de Zn(II) del total añadido. • Las bacterias azufre-oxidantes tienen la capacidad de reducir el cromo hexavalente a cromo trivalente mediante la producción de compuestos reductores obtenidos a partir de la oxidación de azufre elemental. En cultivo discontinuo, At. ferrooxidans es capaz de reducir totalmente un cultivo con 5 ppm de Cr(VI) en dos días y el 32,7% de 10 ppm, tras 11 días de incubación. Sin embargo, At. thiooxidans se muestra más sensible a la presencia de este ion, y sólo es capaz de 231 CONCLUSIONES alcanzar un reducción del 64,7% de 5 ppm de Cr(VI), tras 11 días de incubación, y el 16,5% de 10 ppm, encontrándose una elevada inhibición para esta concentración. • La capacidad de reducción del Cr(VI) y de solubilización del Cr(III) de las bacterias azufre-oxidantes se puede aplicar de forma simultánea en un proceso continuo con el fin de reducir la toxicidad de un residuo de cromo (30% de Cr(III) y 0,1% de Cr(VI)). El proceso diseñado permite la reducción de un 92,66% del Cr(VI) y la solubilización de un 12% del Cr(III) de un total de 157 g de este residuo cuando se hacen pasar 4 litros de medio ácido. • Las bacterias sulfato-reductoras, Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp., pueden tolerar la presencia de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) y precipitarlos a partir de compuestos solubles, como sulfatos, cuando se encuentran solos y en combinación. El cultivo puro (Desulfovibrio vulgaris) tolera la presencia de 15 ppm de Cr(III), 8,5 ppm de Ni(II) y 10 ppm de Zn(II) alcanzando para dichas concentraciones una precipitación del 24,7% del Cr(III), 96% del Ni(II) y 92,7% del Zn(II). El cultivo mixto (Desulfovibrio sp.) tolera la presencia de 15 ppm de Cr(III), 8,5 ppm de Ni(II) y 20 ppm de Zn(II) obteniéndose la precipitación en estos casos del 25,5% del Cr(III), 96,1% del Ni(II) y 93% del Zn(II). Los porcentajes de precipitación de dichos iones son bastante similares cuando éstos se encuentran en combinación para los dos cultivos estudiados. • El proceso propuesto para la precipitación continua de cromo, níquel y zinc en solución permite evitar el problema de inhibición y toxicidad de estos metales sobre la actividad celular de las bacterias sulfatoreductoras. El tratamiento de un total de 33,08 mg de Cr(III), 19,74 mg de Ni(II) y 214,84 mg de Zn(II) mediante este sistema permite la 232 CONCLUSIONES precipitación del 30,8% de Cr(III), 56,6% de Ni(II) y 97,2% de Zn(II). Este hecho hace que sea susceptible de ser empleado para la precipitación de los metales presentes en las disoluciones obtenidas en el proceso de solubilización en continuo llevado a cabo por las bacterias azufre-oxidantes • Tanto At. ferrooxidans como At. thiooxidans pueden inmovilizarse en espuma de poliuretano cuando se utiliza azufre elemental como fuente de energía, siendo dicha inmovilización más efectiva para el segundo de ellos. Por ello la producción de medio ácido puede ser favorecida por la aplicación de esta operación empleando columnas de At. thiooxidans inmovilizado sobre espuma de poliuretano. • El proceso de solubilización en régimen continuo resulta más efectivo cuando el crecimiento de At. thiooxidans se realiza inmovilizando las bacterias sobre espuma de poliuretano. Este hecho proporciona una mayor producción de ácido y, por tanto, una mayor solubilización de los metales si lo comparamos con la solubilización obtenida para un volumen igual obtenido por At. thiooxidans en cultivo sumergido. Con 5,5 litros de medio ácido se obtuvo la solubilización del 17% de Cr(III), 34,3% de Ni(II) y 99,3% de Zn(II). • La adaptación de una etapa de precipitación con las bacterias sulfato-reductoras al proceso de solubilización en continuo, proceso integrado, da lugar a la alcalinización de los lixiviados pero la precipitación de lixiviados de baja concentración metálica fue insignificante, por lo que esta etapa sólo resulta efectiva cuando se tratan concentraciones relativamente elevadas permitiendo la eliminación de los metales en la solución y la acidez típica de este tipo de medios. 233 CONCLUSIONES • El proceso propuesto resulta ventajoso para residuos contaminados por metales y de características ácidas que puedan ser retirados de su origen (lodos, aguas residuales) ya que permitiría la posterior deposición o la reutilización del residuo, pero no sería favorable para medios naturales contaminados que se deseen recuperar o devolver a su forma habitual, como suelos o sedimentos, dado que la transformación de estos medios mediante el proceso desarrollado daría lugar a características diferentes (pH, conductividad, materia orgánica, flora bacteriana…) a las originales de estos medios antes de ser contaminados. 234 F.-BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFIA • Ahmann D, Roberts AL, Krumholtz LR, Morel FMM (1994) Microbe grows by reducing arsenic. 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