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Epstein-Barr Virus (EBER) PNA Probe/Fluorescein
Nº de catálogo Y 5200
Indicaciones de uso
Para uso diagnóstico in vitro.
Fluorescein-Conjugated Epstein-Barr Virus (EBER) PNA Probe (sonda de PNA para virus de Epstein-Barr
(EBER) conjugada con fluoresceína) está indicado para la detección de la infección latente por el EBV
mediante hibridación in situ en secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con formol. Se ha observado
que, con esta sonda, las secciones de tejido linfoide de pacientes aquejados, por ejemplo, de linfoma de
Burkitt, linfoma de Hodgkin y mononucleosis infecciosa dan positivo. Asimismo, se ha observado que los
tejidos epiteliales de la leucoplasia oral y el carcinoma nasofaríngeo dan positivo. La sonda también es
adecuada para su uso en citometría de flujo. Dako le proporciona un procedimiento si lo solicita.
Reactivos suministrados
Fluorescein-Conjugated Epstein-Barr Virus (EBER) PNA Probe es una mezcla, lista para usar, de cuatro 15meros. Cada una de las sondas de ácido nucleico peptídico (PNA) se ha sintetizado en un sintetizador
PerSeptive Biosystem Expedite utilizando técnicas Fmoc-PNA estándar. Las sondas de PNA se han marcado
con el hapteno 5-carboxifluoresceína para su visualización posterior con Dako PNA ISH Detection Kit, número
de catálogo K 5201. El reactivo se suministra en forma líquida en una solución de hibridación que contiene
formamida al 30%, dextransulfato al 10%, pirofosfato sódico al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,2%, Ficoll al 0,2%,
Na2EDTA 5 mmol/L, Tris/HCl 50 mmol/L, pH 7,5, NaCl 10 mmol/L. Cada vial contiene 1 mL, correspondiente a
40 tests (25 µL por cada test).
Diana
La sonda EBER PNA es complementaria de los dos ARN EBER nucleares codificados por el virus de EpsteinBarr (EBV) (1-3).
Especificidad
Se ha determinado la especificidad probando la sonda en tejido o células que contienen EBV, CMV, HHV-6,
VHS, VZV o VHB. Sólo se ha obtenido una señal positiva en tejido infectado por el EBV.
Precauciones
1. Para uso por profesionales.
2. Como la sonda de PNA detecta ARN, es importante evitar la contaminación de las soluciones tampón, del
material de vidrio y de otros equipos con RNasa. Esto es de especial importancia hasta que se haya
completado el paso de hibridación incluido en el procedimiento descrito a continuación. La RNasa no digiere
los dúplex PNA-ARN, y la sonda de PNA no es degradada por las nucleasas, las proteasas o las peptidasas
(4). Se recomienda conservar el material de vidrio, los lotes de material de plástico y otros elementos que
vayan a utilizarse en los experimentos con ARN en un lugar designado y etiquetarlos con claridad. Los
métodos para la inactivación de RNasa en solución se describen en (5). La RNasa presente en el material de
vidrio puede inactivarse mediante una incubación de un día para otro a 200 ºC. Si se utilizan recipientes
limpios (sin RNasa), normalmente basta con utilizar agua esterilizada, agua Mili-Q o equivalente para la
dilución de las soluciones madre y los lavados.
3. Esta sonda contiene ≥25-<50% formamida y ≥1-<3% cloruro de sodio. Etiquetado del producto:
Peligro
H360D
P201
P280
P308 + P313
P405
P501
Puede dañar al feto.
Procurarse las instrucciones antes del uso.
Llevar guantes de protección. Llevar gafas o máscara de protección. Llevar prendas de
protección.
EN CASO DE exposición manifiesta o presunta: Consultar a un médico.
Guardar bajo llave.
Eliminar el contenido y el recipiente de acuerdo con las normativas locales, regionales,
nacionales e internacionales.
Almacenamiento
Almacénelo en la oscuridad a una temperatura de 2 a 8 °C. No lo utilice después de la fecha de caducidad
impresa en el vial. Si los reactivos se almacenan bajo condiciones distintas de las especificadas, éstas deben
ser verificadas por el usuario. No existen signos obvios que indiquen que este producto sea inestable. Por lo
tanto, debe llevarse a cabo un control positivo en simultaneidad con el ensayo de las muestras de los
pacientes. Si observa tinciones inesperadas que no puedan atribuirse a las variaciones en los procedimientos
de laboratorio y sospecha de que exista un problema con el producto, contacte con nuestro servicio de
asistencia técnica.
Productos acompañantes
Puede obtener un kit de detección de sondas de PNA conjugadas con fluoresceína mediante pedido a Dako.
Dako PNA ISH Detection Kit, número de catálogo K 5201, contiene todos los reactivos necesarios para realizar
la hibridación in situ. El procedimiento para el kit es sencillo y la mayoría de los reactivos están listos para
usar. Asimismo, puede solicitar a Dako una sonda Fluorescein-Conjugated Epstein-Barr Virus (Lytic) PNA
Probe, número de catálogo Y 5203, para la detección del EBV en fase lítica.
Referencias
1. Kieff E. Epstein-Barr virus and its replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, editors. Fields Virology.
3rd ed. Philadelphia. New York: Lippincott-Raven; 1996. p. 2343-96.
2. Glickman JN, Howe JG, Steitz JA. Structural analyses of EBER1 and EBER2 ribonucleoprotein particles
present in Epstein-Barr virus-infected cells. J Virol 1988;62:902-11.
3. Wu T-C, Mann RB, Epstein JI, MacMahon E, Lee WA, Charache P, et al. Abundant expression of EBER1
small nuclear RNA in nasopharyngeal carcinoma. A morphologically distinctive target for detection of
(128772-002)
P04166ES_01_Y520001-2/2015.09 p. 1/3
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Epstein-Barr virus
1991;138:1461-9.
in
formalin-fixed
paraffin-embedded
carcinoma
specimens.
Am
J
Pathol
4. Demidov VV, Potaman VN, Frank-Kamenetskii MD, Egholm M, Buchard O, Sönnichsen SH, et al. Stability
of peptide nucleic acids in human serum and cellular extracts. Biochem Pharmacol 1994;48:1310-3.
5. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold
Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
Procedimiento de hibridación in situ de un día para la detección de ARN con el empleo de sondas de PNA
El procedimiento se ha desarrollado para secciones incluidas en parafina fijadas con formol, y es aplicable a Dako PNA ISH Detection Kit, número
de catálogo K 5201. Los reactivos incluidos en este kit, así como las condiciones de hibridación y lavado, se han ajustado para obtener resultados
óptimos con las sondas de PNA conjugadas con fluoresceína de Dako. Debe llevarse a cabo un control de tejido positivo en simultaneidad con el
ensayo de las muestras.
NOTA:
Todas las incubaciones deben realizarse a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.
Rehidratación
Sumergir los portaobjetos con las secciones de tejido en xileno.
2 x 5 min
Sumergir en etanol al 99%.
2 x 3 min
Sumergir en etanol al 95%.
2 x 3 min
Sumergir en agua pura. El recipiente debe estar libre de RNasa.1
3 min
Rodear la muestra con un círculo con Dako Pen, número de catálogo S 2002.
Sumergir en agua pura.
Pretratamiento
2 x 3 min
Colocar los portaobjetos en una cámara de humedad (usar guantes limpios).
Justo antes de usar, diluir la cantidad necesaria de proteinasa K (vial número 1) a
1:10 en TBS, p. ej., con 11 gotas del vial número 1 (ó 500 µL) en 4,5 mL de TBS.2
Añadir a cada sección 150 µL de proteinasa K diluida.3
Hibridación
Incubar.
20 - 30 min
Sumergir los portaobjetos en agua pura.
2 x 3 min
Sumergir los portaobjetos en etanol al 95%.
~ 10 s
Secar los portaobjetos con aire en una cámara de humedad.
~ 5 min
Añadir a la sección de tejido 1 a 2 gotas de sonda de PNA conjugada con
fluoresceína. En secciones separadas, añadir las sondas de control, viales
número 2 y 3.
Cubrir las secciones con cubreobjetos.
Introducir agua en la cámara de humedad antes de colocarla en el incubador
(para evitar que las secciones se sequen).
Introducir la cámara de humedad en el incubador.4
1½ h a 55 °C
Retirar los cubreobjetos.
Precalentar la solución de trabajo Stringent Wash Solution, vial número 4, diluido
a 1:60, a 55 ºC en baño maría.
Detección
Sumergir los portaobjetos en la solución de trabajo de solución de lavado
astringente precalentada.
25 min a 55 ºC con
agitación
Ajustar los portaobjetos a la temperatura ambiente mediante una breve inmersión
en TBS.
10 s
Introducir los portaobjetos en una cámara de humedad.
Añadir 2 a 5 gotas de Anti-FITC/AP, vial número 5, a cada sección.
Incubar.
30 min
Golpear ligeramente para eliminar el anticuerpo.
Sumergir los portaobjetos en TBS.
2 x 3 min
Sumergir los portaobjetos en agua pura.
2 x 1 min
Introducir los portaobjetos en una cámara de humedad.
Añadir 2 a 3 gotas de sustrato, vial número 6, a cada sección.5
Incubar.
30 - 60 min
Golpear ligeramente para eliminar el sustrato.
Contratinción y montaje
Sumergir los portaobjetos en agua de grifo.
5 min
Contrateñir con hematoxilina si es pertinente.
5-10 s
Montar en Faramount, número de catálogo S 3025, o en Glycergel, número de
catálogo C 0563.
Notas sobre el procedimiento:
1.
A partir de este punto del procedimiento y hasta la realización de la hibridación, es importante evitar la contaminación de las secciones
con RNasas, y los portaobjetos sólo deben tocarse con guantes limpios y desechables (consulte también “Precauciones”).
2.
Disuelva el contenido de un envase de papel de aluminio de TBS en un litro de agua pura (libre de RNasa).
(128772-002)
P04166ES_01_Y520001-2/2015.09 p. 2/3
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3.
La digestión proteolítica óptima puede variar de un bloque de tejido a otro. En el caso de secciones congeladas y citocentrifugados, se
requiere una menor cantidad de proteinasa K (en general, de 100 a 1000 veces menos), dependiendo de la fijación.
4.
Hemos observado que un tiempo de incubación de 1½ hora confiere una sensibilidad óptima. Sin embargo, pueden obtenerse resultados
satisfactorios reduciendo el tiempo de incubación a 15 - 30 minutos, dependiendo de la cantidad de diana presente en la muestra.
5.
Hemos observado que el sustrato (BCIP/NBT/levamisol) incluido en Dako PNA ISH Detection Kit proporciona la sensibilidad más alta. No
obstante, New Fuchsin (número de catálogo K0625) y Fast Red con naftol fosfato (número de catálogo K0597) proporcionan también
resultados muy satisfactorios.
Explica ción de los símbolos
(128772-002)
Nú mero de ca tálog o
L ímite d e te mp era tu ra
Fe cha de ca du cidad
Prod ucto sanita rio p ara
di agn óstico in vitro
Ma ntene r a lej ado d e fu entes
d e calo r (co nsul te l a secció n
Almacen amie nto)
Fab ri cante
Co nsulte l as in strucci one s d e
uso
C ódigo de l ote
Picto grama de p eli gro SGA
(con sul te la se cción so bre
pre cau cione s)
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