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DETECCIÓN DEL Potato yellow vein virus (PYVV) EN DIFERENTES ÓRGANOS DE
Solanum tuberosum Grupo Phureja POR PCR EN TIEMPO REAL
Hernández1, Anngie K. y Guzmán2, Mónica M.
1 y 2
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia. Cra 30 45-03 Edificio
Manuel Ancizar, Bogotá D.C. (Colombia).
1
[email protected], 2 [email protected].
Introducción: PYVV es un virus reemergente (Closteroviridae/Crinivirus). Tiene genoma tripartita
ssRNA(+) (Livieratos et al., 2004) y es transmitido por Trialeurodes vaporariorum (Buriticá, 1971).
El primer reporte de la enfermedad causada por el virus lo hizo Alba (1950) en Antioquia
(Colombia) y en la actualidad se ha dispersado hasta Venezuela, Ecuador y Perú (Salazar et al.,
2000). La sintomatología es amarillamiento foliar y pérdidas en la producción desde 30% hasta
50% dependiendo de la especie (Salazar et al., 2000 y Guzmán et al., 2011), por tal razón es
cuarentenario en Europa y Estados Unidos (OEPP/EPPO, 1979; USDA – APHIS, 2000). El
diagnostico se ha basado en RT-PCR (Offei et al., 2004; Guzmán et al., 2006, Guzmán et al.,
2010), NASH (Salazar et al., 2000) y qPCR (López et al., 2006, Hernández et al., 2010) pero
ninguno evalúa la presencia y la acumulación del PYVV en diferentes órganos, aspecto aún no
reportado para PYVV. Siendo limitado al floema el interés de este trabajo fue detectarlo en
diferentes órganos de S. tuberosum Grupo Phureja (papa criolla) infectada con el virus. Se utilizó
RT-PCR y PCR en tiempo real (qPCR) para hacer la detección en foliolo, tallo, pétalo, pedúnculo
floral, anteras y raíz; amplificando el gen de la proteína mayor de la cápside (CP-PYVV) (López et
al., 2006). Este un trabajo preliminar que aporta información sobre la acumulación de PYVV en
diferentes órganos utilizando qPCR, y puede contribuir con futuros trabajos realizados en este
campo. Los resultados son interesantes para el conocimiento biológico de la distribución del virus
en la planta y debe ser de interés para agricultores y fitomejoradores.
Objetivos: Detectar PYVV por RT-PCR. y qPCR en diferentes órganos de Solanum tuberosum
Grupo Phureja (papa criolla) y evaluar la acumulación de PYVV en los diferentes órganos.
Materiales y métodos: Se utilizaron tres plantas de papa criolla infectadas con PYVV por
transmisión con el vector natural RT-PCR (+): (NS: no sintomática, S: sintomatología severa y M:
moderada). En total se evaluaron 265 muestras: foliolos (87), tallo primario (20), tallo secundario
(90), raíz primaria (17), raíz secundaria (29), pétalos (7), pedúnculo floral (7), y anteras (8). De
cada muestra se obtuvo el extracto de RNA total (Trizol®, invitrogen) y se realizó la síntesis de
cDNA (molde para las reacciones de amplificación) que fue repartido en dos fracciones: una para
RT-PCR convencional y la otra para qPCR con sondas TaqMan® amplificando el gen CP-PYVV.
Las muestras que resultaron negativas por RT-PCR se repitieron para descartar los falsos
negativos. Las reacciones se realizaron en dos tubos y como control interno en qPCR se amplificó
el gen cox. Para determinar la carga viral se construyó una curva estándar del gen CP-PYVV. Se
hizo análisis estadístico utilizando prueba ANOVA seguida de una prueba de t con ajuste de
Tukey manejando el Software R.
Resultados: Todas las muestras fueron positivas por qPCR con rangos de número de copias de
CP-PYVV entre 2.62X105 y 4.89X109. Por RT-PCR el 27.5% de las muestras fueron negativas
tanto en muestras sintomáticas (46/73) como en NS (27/73). Hubo órganos en las que todas las
muestras fueron detectadas por RT-PCR (raíz primaria, pedúnculo floral, pétalos y anteras), y
X X V C o n gr e s o de l a A s o c i a c i ón La ti n oa m e r i c a na d e l a P a pa - AL A P , 1 7 / 2 0 de s e p ti e m br e de 2 0 1 2 , U be r l â n di a , M G , Br a z i l
algunos en donde no fue detectado en todas las muestras (ex. sólo el 3.7% de tallo S fueron
positivas). La acumulación viral fue mayor en la zona aérea, principalmente en el foliolo (=
7.38X108 ± 7.80X107) y menor en la zona radical (= 2.3X108 ± 8.66X107). En S se presentaron
diferencias significativas entre cuatro grupos de órganos: el de mayor carga viral compuesto por
foliolo (= 5.49X108 ± 1.11X108), el siguiente grupo constituido por pedúnculo floral y pétalos (=
2.67X108 ± 5.86X107), después anteras, tallo secundario y raíz primaria y secundaria (= 3.79X107
±1.79X107) y el de menor acumulación tallo primario (: 2.07X107 ± 5.76X106). En la planta M se
encontraron diferencias significativas entre tres grupos: el de mayor carga formado por foliolo y
pedúnculo floral (= 8.98X108 ± 9.23X107); el siguiente grupo constituido por tallo primario,
secundario y pétalos (= 4.40X108 ± 7.04X107) y con menor carga viral anteras, y raíz primaria y
secundaria (= 8.97X107 ± 1.96X107). En la planta NS no hubo diferencias significativas en las
cargas virales de tallo, foliolo y raíz primaria (= 8.31X108 ± 1.01X108), pero si entre estos órganos
y raíz secundaria que presentó la menor carga viral (= 1.56X108 ± 3.45X107).
Discusión: qPCR es más sensible para la detección de PYVV que RT-PCR permitiendo detectar
el virus en todos los órganos y también en muestras que habían sido negativas por RT-PCR.
PYVV es limitado al floema razón por la que se pudo detectar en todos los órganos evaluados ya
que está presente en toda la planta y también está involucrado en el transporte a larga distancia
de virus (Leisner y Howell, 1993). En las tres plantas se observó una mayor carga viral en el foliolo
que es un tejido altamente vascularizado, aunque también era de esperarse una alta acumulación
en tejidos que presentan mayor vascularización como tallo y raíz primaria; pero esto no se
presentó. Es posible que la acumulación en cada tejido dependa de otros factores.
Conclusiones: (1) qPCR es más sensible que RT-PCR para la detección de PYVV. (2) Por
primera vez PYVV fue detectado molecularmente en diferentes órganos (Foliolo, tallo, raíz,
pedúnculo floral, pétalos y anteras) de plantas sintomáticas y no sintomáticas que tienen el virus.
(3) No se presentó alguna tendencia en la acumulación del virus entre las tres plantas, aunque en
los tres casos la carga viral fue mayor en el foliolo. (4) Las menores cargas virales de PYVV se
encontraron en tejido radical. (5) Los resultados son interesantes desde el punto de vista biológico
de la distribución del virus en la planta y debe ser de interés para agricultores y fitomejoradores.
Agradecimientos: Al laboratorio de biología molecular de plantas del IBUN por préstamo del
equipo de qPCR. A Colciencias y MADR por el financiamiento.
Referencias bibliográficas:
- Alba, V. 1950. Memorias de la Conferencia Latinoamericana de Especialistas en Papa (Bogotá,
Colombia) pp. 52 – 58.
- Buriticá, P. 1971. Informe Anual Programa de Fitopatología ICA (Bogotá-Colombia) 111 - 113.
- Guzman, M., Ruiz, E., Arciniegas, N. and Coutts, R. 2006. Journal of Phytopathology 154, 748–
750.
- Guzmán, M., Franco, L., Rodríguez, D., Vargas, L, y Fierro, J. 2011. Memorias del XXX
Congreso Colombiano y XIV Latinoamericano de Fitopatología.
- Guzmán, M., Franco, L. and Rodríguez, P. 2010. Phytopathology 99.S189.ISBN:0031-949X
- Hernández, A., Franco, L. y Guzmán, M. 2010. XXIV Congreso de la asociación latinoamericana
de la papa. Cusco, Perú
- Leisner, S. and Howell, S. 1993.. Trend Microbiology 8, 314 – 317
- Livieratos, I., Eliasco, E., Müller, G., Olsthoorn, R., Salazar, L., Pleij, C. and Coutts, R. 2004.
Journal of General Virology 85, 2065 – 2075.
- López, R., Asencio, C., Guzmán, M. and Boonham, N. 2006. Journal of Virological Methods 136,
24 – 29.
- OEPP/EPPO. 1979. Potato vein yellowing virus. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 9 (2).
[http://www.eppo.org/QUARANTINE/virus/Potato_yellow_vein_virus/PYVV00_ds.pdf
- Offei, S., Arciniegas, N., Müller, G., Guzmán, M., Salazar, L. and Cout ts, H. 2004. Archives of
Virology 149: 821 – 827.
- Salazar, L., Müller, G., Querci, M., Zapata, J. and Owens, R. 2000. Annals of Applied Biology
137, 007 – 019.
- USDA
–
APHIS.
2000.
Regulated
plant
pest
list.
[http://www.aphis.usda.gov/import_export/plants/plant_imports/downloads/RegulatedPestList.pdf]