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DETERMINACIÓN DE VARIANTES
DEL VIRUS DEL AMARILLAMIENTO
DE LAS NERVADURAS DE LA HOJA
DE PAPA (PYVV) POR ANÁLISIS
MOLECULAR DE TRES GENES EN
AISLADOS COLOMBIANOS DE
Solanum spp.
KAREN ANDREA CUBILLOS ABELLO
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
BOGOTÁ, COLOMBIA
2011
1 2 DETERMINACIÓN DE VARIANTES DEL
VIRUS DEL AMARILLAMIENTO DE LAS
NERVADURAS DE LA HOJA DE PAPA
(PYVV) POR ANÁLISIS MOLECULAR DE
TRES GENES EN AISLADOS
COLOMBIANOS DE Solanum spp.
KAREN ANDREA CUBILLOS ABELLO
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de
Magíster en Ciencias, Microbiología
Directora:
MSc., PhD. MÓNICA GUZMÁN BARNEY.
Profesora Asociada UNAL
Coordinadora del Laboratorio Virus Vegetales IBUN- UNAL
Línea de Investigación:
Biología Molecular y serológica de virus y otros patógenos ambientales
Grupo de Investigación:
Biología Molecular de Virus.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
MAESTRIA EN CIENCIAS, MICROBIOLOGÍA
BOGOTÁ, COLOMBIA
2011
3 4 Agradecimientos
A Dios.
A mi familia por su amor y apoyo incondicional que contribuyen a mi desarrollo
profesional y personal.
Sinceros agradecimientos a la Doctora Mónica Guzmán por su apoyo, por brindarme la
oportunidad de trabajar en su laboratorio y por todo el conocimiento que me transmitió
contribuyendo al desarrollo de este trabajo.
A la Universidad Nacional de Colombia, al Instituto de Biotecnología, al posgrado
Interfacultades de Microbiología y muy especialmente a la Doctora Martha Fontanilla
quien siguió paso a paso mi proceso de aprendizaje aportando grandes conocimientos
y calidad humana.
A mis amigas y compañeras de trabajo, Patricia Rodríguez, Anngie Hernández Angela
Villamil y Veronica Román por el conocimiento que me aportaron y por todo el apoyo
que me brindaron durante el proceso.
A jurados por la lectura del texto y sugerencias.
A Luis Fernando Moreno por ser de gran ayuda en la recolección de las muestras
analizadas en este estudio.
A Colciencias y al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural por la financiación de
este trabajo de grado. Proyectos 115-2007 – 2007S4654-69.
5 6 Resumen
Potato yellow vein virus (PYVV) es un virus cuarentenario de países andinos como
Colombia, Venezuela Perú y Ecuador, que puede llegar a ocasionar perdidas del 25%
al 50% de la producción de plantas de papa. PYVV es un virus RNA de cadena
sencilla, sentido positivo, genoma tripartita que pertenece a la familia Closteroviridae y
género Crinivirus. Existe información acerca de la variabilidad viral de esta familia, sin
embargo, poco se conoce acerca de la variabilidad del PYVV. Con el objetivo de
determinar la presencia de variantes del virus en 60 aislados de Solanum tuberosum
Grupo Phureja y Andígena provenientes de Nariño, se realizó análisis molecular de
tres genes: gen de la proteína mayor de la cápside (CP), de la proteína menor de la
cápside (CPm) y de la proteína de choque térmico (Hsp70), a través de la técnica de
SSCP y por secuenciación de un subgrupo de aislados que presentaron perfiles
diferentes de uno o varios genes.
En el Grupo Phureja se encontraron 8 perfiles SSCP para el gen Hsp70 (A-H), 2
perfiles para la CP (1-2) y 6 perfiles para el gen CPm (I-IV) mientras que para el Grupo
Andígena se encontraron 6 perfiles (A-F) para el gen Hsp70, 3 perfiles (1-3) para el
gen CP y 6 perfiles para el gen CPm (I-IV). Los análisis bioinformáticos sobre las
secuencias confirmaron lo encontrado por SSCP, sin embargo algunas de estas
variantes posiblemente no generan cambios a nivel de aminoácidos de la proteína. La
mayor variabilidad fue determinada en el gen CPm seguido del Hsp70 y por último el
gen CP, sin embargo, el análisis de selección natural permitió concluir que para los
tres genes el tipo de selección es negativa o purificadora.
Este trabajo es el primero que analiza la variabilidad del PYVV en base a tres genes y
en dos hospederos. Los resultados son importantes para el conocimiento genético viral
y deben ser de interés para los programas de fitomejoramiento de la papa y control del
virus.
Palabras claves: PYVV, SSCP, secuencias, variabilidad, CPm , Hsp70, CP.
7 Abstract
Potato yellow vein virus (PYVV) affects potato crops of countries such Colombia,
Venezuela, Peru and Ecuador, and potentially causes yield losses of 25% to 50% of
the tuber. PYVV is a single-stranded positive RNA virus with a tripartite genome that
belongs to the family Closteroviridae and genus Crinivirus. There is information about
viral variability of this family, however, little is known about the variability of PYVV. In
order to determine the presence of variants of the virus in 60 isolates from Solanum
tuberosum Phureja and Andigena from Nariño, molecular analysis was made of the
three genes: major capsid protein (CP), the minor capsid protein (CPm) and heat shock
protein (Hsp70), through the technique SSCP and sequencing of a subset of isolates
showed different profiles of one or more genes.
In Phureja there were 8 SSCP profiles for the Hsp70 gene (A-H), 2 profiles for the CP
(1-2) and 6 profiles for the CPm gene (I-IV) while in Andígena we found 6 profiles (F-A)
for the Hsp70 gene, 3 profiles (1-3) for the CP gene and 6 profiles for the CPm gene (IIV). The bioinformatic analysis of the sequences confirmed the findings of SSCP,
however some of these variants may not have impact on the protein. Greater variability
was determined for the CPm gene, followed by the Hsp70 and finally the CP gene,
however, natural selection analysis concluded negative or purifying selection for the
three genes.
This work is the first to analyze the variability PYVV on three genes and two hosts. The
results are important for viral genetic knowledge and should be of interest for breeding
programs and control of potato virus.
Keywords: PYVV, SSCP, sequences, variability, CPm, Hsp70, CP.
8 CONTENIDO
RESUMEN ......................................................................................................... 7 ABSTRACT........................................................................................................ 8 LISTA DE FIGURAS........................................................................................ 12 LISTA DE TABLAS ......................................................................................... 16 INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 18 1. JUSTIFICACIÓN.......................................................................................... 22 2. HIPÓTESIS ................................................................................................. 25 3. OBJETIVOS................................................................................................. 26 3.1 Objetivo general ..............................................................................................................................26 3.2 Objetivos específicos ....................................................................................................................26 4. MARCO TEÓRICO ...................................................................................... 27 4.1 Cultivo de papa en Colombia.......................................................................................................27 4.2 Patógenos de la papa ....................................................................................................................28 4.3 Potato yellow vein virus (PYVV)..................................................................................................29 4.3.1 Genoma viral..............................................................................................................................30 4.3.2 Síntomas ocasionados por PYVV...........................................................................................35 4.3.3 Transmisión de PYVV...............................................................................................................36 4.3.4 Distribución del PYVV en el mundo........................................................................................38 4.4 VARIABILIDAD VIRAL....................................................................................................................39 4.4.1 Metodologías para estimación de variabilidad viral .............................................................40 5. METODOLOGÍA .......................................................................................... 48 5.1 Material vegetal ...............................................................................................................................48 5.2 Aislado viral......................................................................................................................................49 5.3 Diseño de “primers”.......................................................................................................................50 5.4 RT-PCR ..............................................................................................................................................50 9 5.5 Análisis de variabilidad por SSCP..............................................................................................51 5.6 Secuenciación .................................................................................................................................52 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................... 54 6.1 Reacciones de RT-PCR para CP, CPm y Hsp70 ....................................................................54 6.2 RFLP de los genes CPm y Hsp70 ..............................................................................................55 6.3 Análisis de variabilidad por la técnica SSCP ..........................................................................56 6.3.1 Variabilidad por SSCP para el gen Hsp70 ............................................................................56 6.3.2. Variabilidad por SSCP del gen CPm.....................................................................................60 6.3.3. Variabilidad por SSCP para el gen CP mayor .....................................................................64 6.4 Análisis de secuencias..................................................................................................................72 6.4.1 Gen de la proteína de choque térmico (Hsp70)...................................................................72 6.4.2. Gen de la proteína menor de la cápside (CPm) ..................................................................90 6.4.3. Gen de la proteína de la cápside (CP)................................................................................100 7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................. 112 7.1 Conclusiones ...............................................................................................................................112 7.2 Recomendaciones.....................................................................................................................113 A. ANEXO: EXTRACCIÓN DE DSRNA POR COLUMNAS DE EXCLUSIÓN
DE SEPHADEX G-50..................................................................................... 116 B. ANEXO: CONDICIONES REACCIÓN RT-PCR ....................................... 117 C. ANEXO: DIGESTIÓN VIRTUAL CON LA ENZIMA BSTYI DEL GEN CPM Y
ECORI DEL GEN HSP70............................................................................... 118 D. ANEXO: PROTOCOLO DE PURIFICACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR 119 E. ANEXO: PROTOCOLO PARA CUANTIFICACIÓN CON QUBITTM .......... 120 F. ANEXO: TINCIÓN CON PLATA................................................................ 121 G. ANEXO: IDENTIFICACIÓN DE PERFILES DE SSCP POR PROGRAMA
QUANTITI ONE.............................................................................................. 122 H. ANEXO: ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS NUCLEOTÍDICAS DEL GEN
HSP70 EN S. TUBEROSUM GRUPO ANDÍGENA ....................................... 123 10 I. ANEXO: ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS
DEDUCIDAS DE NUCLEÓTIDOS DEL GEN HSP70 EN S. TUBEROSUM
GRUPO ANDÍGENA ...................................................................................... 126 J. ANEXO: ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS NUCLEOTÍDICAS DEL GEN
CPM EN S. TUBEROSUM GRUPO PHUREJA............................................. 127 K. ANEXO: ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS
DEDUCIDAS DE NUCLEÓTIDOS DEL GEN CPM DE S.TUBEROSUM
GRUPO PHUREJA ........................................................................................ 131 L. ANEXO: ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS NUCLEOTÍDICAS DEL GEN
CPM EN S. TUBEROSUM GRUPO ANDÍGENA........................................... 133 M. ANEXO: ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS
DEDUCIDAS DE NUCLEÓTIDOS DEL GEN CPM DE S.TUBEROSUM
GRUPO ANDÍGENA ...................................................................................... 137 N. ANEXO: ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS DEL GEN
CP EN S. TUBEROSUM GRUPO PHUREJA................................................ 139 O. ANEXO: ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS
DEDUCIDAS DE NUCLEÓTIDOS DEL GEN CP EN S. TUBEROSUM GRUPO
PHUREJA ...................................................................................................... 140 P. ANEXO: ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS DEL GEN
CP EN S. TUBEROSUM GRUPO ANDÍGENA.............................................. 141 Q. ANEXO: ALINEAMIENTOS DE SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS
DEDUCIDAS DE NUCLEÓTIDOS DEL GEN CP EN S. TUBEROSUM GRUPO
ANDÍGENA .................................................................................................... 142 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................. 143 11 Lista de figuras
Figura 1. Relación filogenética entre las especies y géneros de la familia Closteroviridae basada en la secuencia del gen Hsp70h (Tomado de Martelli et al., 2002) ........................................... 30 Figura 2. Viriones de PYVV. Escala de barra=200nm (Tomado de Salazar et al., 2000)............. 31 Figura 3. Representación esquemática de la organización genómica del PYVV (Tomado de Livieratos et al., 2004) ................................................................................................................. 32 Figura 4. Microscopía electrónica de transmisión de viriones LIYV. a) Anticuerpos anti CP b) Anticuerpos anti CPm. Barras representan 224nm (Tomado de Ng and Falk, 2006) ................. 32 Figura 5. Representación de la función de las proteínas Hsp70, CPm y CP en Beet yellow virus (BYV) (Tomado y modificado de Alzhanova et al., 2001).............................................................. 1 Figura 7. Representación esquemática de los RNA defectivos de PYVV (Tomado de Eliasco et al., 2006)...................................................................................................................................... 34 Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa para detección de cinco RNAs en PYVV. En la línea 2 amplificado de planta infectada con PYVV (Tomado de Livieratos et al., 2004) .......................... 1 Figura 8. Síntomas ocasionados por PYVV. A la izquierda clorosis de la hoja (Franco y Guzmán. 2008. Solanum tuberosum Grupo Andígena, Zipaquirá) A la derecha amarillamiento del follaje con disminución en la producción de tubérculos (Tomado de Salazar et al., 2000) .................... 1 Figura 9. Cuerpos de inclusión, depósitos de viriones (V) de Lettuce infectious yellows virus (LIYV) del genero Crinivirus en los plasmodesmos de células infectadas (PD) (Tomada de Medina et al., 1998) .................................................................................................................... 36 Figura 10. Comportamiento sintomático de plantas afectadas con PYVV (Tomado de Zapata et al., 2004)...................................................................................................................................... 37 Figura 11. Vector natural de PYVV. Trialeurodes vaporariorum. Fuente: www.ars.usda.gov ..... 1 Figura 12. Distribución de PYVV en el mundo (EEPO, 2007)........................................................ 1 Figura 13. RFLP con HinfI del gen CP de PYVV (Tomado de Guzman et al., 2006)..................... 41 Figura 14. Plantas indicadoras de izquierda a derecha Nicotiana tabacum, Chenopodium murale y Phaseolus vulgaris.......................................................................................................... 1 Figura 15. Representación de la técnica SSCP (Tomada de Estrada‐Cuzcano et al., 2005) ......... 1 Figura 16. Representación esquemática de posibles resultados de la técnica SSCP de aislados de campo..................................................................................................................................... 45 Figura 17. Perfiles de OLYaV para el gen Hsp70 (Tomado de Essakhi et al., 2006) ................... 46 12 Figura 18. Perfiles del gen CP del virus CYSDV (Tomado de Rubio et al., 2001b) ..................... 47 Figura 19. Tabla de flujo metodología........................................................................................ 48 Figura 20. Material vegetal recolectado en Nariño sintomático severo para PYVV (Guzmán, 2008). ............................................................................................................................................ 1 Figura 21. Síntomas de amarillamiento en campo (Guzman y Franco 2009) .............................. 1 Figura 22. Amplificación del gen CP por RT‐PCR con “primers” F2 y Coutts3’............................. 1 Figura 23. Amplificación del gen CPm por RT‐PCR con “primers” CPm1 y CPm2 ...................... 55 Figura 24. Amplificación del gen Hsp70 por RT‐PCR con “primers” HSP‐F517 y HSP‐R2323..... 55 Figura 25. Digestión de los genes Hsp70 (1664nt) con EcoRI (izquierda) y gen CPm (2025nt) con BstYI (derecha) ....................................................................................................................... 1 Figura 26. Perfiles de SSCP de muestras amplificadas para el gen Hsp70 (S. tuberosum Grupo P.) ................................................................................................................................................ 57 Figura 27. Perfiles de SSCP del gen Hsp70 de Solanum tuberosum Grupo Phureja................... 57 Figura 28. Perfiles de SSCP de muestras amplificadas para el gen Hsp70 (S.tuberosum Grupo A.) ................................................................................................................................................ 58 Figura 29. Perfiles de SSCP del gen Hsp70 de Solanum tuberosum Grupo Andígena................ 59 Figura 30. Perfiles de SSCP (A‐D) del gen Hsp70 en muestras de los dos grupos de S.tuberosum
..................................................................................................................................................... 60 Figura 31. Perfiles de SSCP (E‐H) del gen Hsp70 en muestras de los dos grupos de S.tuberosum
..................................................................................................................................................... 60 Figura 32. Perfiles de SSCP de muestras amplificadas para el gen CPm (S.tuberosum Grupo Phureja) ....................................................................................................................................... 61 Figura 33. Perfiles de SSCP del gen CPm de Solanum tuberosum Grupo Phureja ..................... 61 Figura 34. Perfiles de SSCP de muestras amplificadas del gen CPm de S.tuberosum Grupo Andígena ..................................................................................................................................... 62 Figura 35. Perfiles de SSCP del gen CPm de Solanum tuberosum Grupo Andígena................... 63 Figura 36. Perfiles de SSCP del gen CPm (I‐IV) en muestras de los dos grupos de S.tuberosum64 Figura 37. Perfiles de SSCP del gen CPm (V‐VI) en muestras de los dos grupos de S.tuberosum
..................................................................................................................................................... 64 Figura 38. Perfiles de SSCP del gen CP de S. tuberosum Grupo Phureja.................................... 65 13 Figura 39. Perfiles 1 y 2 de SSCP del gen CP en S. tuberosum Grupo Andígena. ....................... 65 Figura 40. Perfiles 1 y 3 de SSCP del CP en S. tuberosum Grupo Andígena. .............................. 66 Figura 41. Perfiles de SSCP del gen CP en muestras de los dos grupos de S.tuberosum ........... 66 Figura 42. Dendograma de secuencias nucleótidicas del gen Hsp70 en CTV, PYVV y S. tuberosum ..................................................................................................................................... 1 Figura 43. Alineamiento de secuencias nucleotidicas del gen Hsp70 en S. tuberosum Grupo Phureja (programa SeaView) ...................................................................................................... 76 Figura 44. Dendograma de secuencias de nucleótidos para el gen Hsp70 en muestras de S.tuberosum Grupo Phureja.......................................................................................................... 1 Figura 45. Alineamiento de secuencias de aminoácidos deducidas del gen Hsp70 de S.tuberosum Grupo Phureja........................................................................................................ 80 Figura 46. Dendograma de secuencias de aminoácidos del gen Hsp70 en muestras de S.tuberosum Grupo Phureja.......................................................................................................... 1 Figura 47. Dendograma de secuencias de nucleótidos para el gen Hsp70 en muestras de S.tuberosum Grupo Andígena ....................................................................................................... 1 Figura 48. Dendograma de secuencias de aminoácidos para el gen Hsp70 en muestras de S.tuberosum Grupo Andígena ....................................................................................................... 1 Figura 49. Dendograma de secuencias de aminoácidos deducidas del gen Hsp70 para S.tuberosum Grupos Phureja y Andígena ................................................................................... 89 Figura 50. Dendograma de secuencias de nucleótidos para el gen CPm en muestras de S.tuberosum Grupo Phureja.......................................................................................................... 1 Figura 51. Dendograma de secuencias de aminoácidos para el gen CPm en muestras de S.tuberosum Grupo Phureja.......................................................................................................... 1 Figura 52. Dendograma de secuencias de nucleótidos para el gen CPm en muestras de S.tuberosum Grupo Andígena ....................................................................................................... 1 Figura 53. Dendograma de secuencias de aminoácidos para el gen CPm en muestras de S.tuberosum Grupo Andígena ....................................................................................................... 1 Figura 54. Dendograma de secuencias de aminoácidos deducidas de nucleótidos del gen CPm para S.tuberosum Grupos Phureja y Andígena ........................................................................... 99 Figura 55. Dendograma de secuencias nucleotídicas para el gen CP en muestras de S.tuberosum Grupo Phureja.......................................................................................................... 1 Figura 56. Dendograma de secuencias de aminoácidos para el gen CP en muestras de S.tuberosum Grupo Phureja.......................................................................................................... 1 14 Figura 57. Dendograma de secuencias nucleotídicas para el gen CP en muestras de S.tuberosum Grupo Andígena ....................................................................................................... 1 Figura 58. Dendograma de secuencias de aminoácidos para el gen CP en muestras de S.tuberosum Grupo Andígena ....................................................................................................... 1 Figura 59. Dendograma de secuencias de aminoácidos deducidas de nucleótidos del gen CP para S.tuberosum Grupos Phureja y Andígena ......................................................................... 108 15 Lista de tablas
Tabla 1. Principales municipios colombianos productores de papa criolla ................................ 28 Tabla 2. Función putativa de las proteínas de PYVV ................................................................... 34 Tabla 3. Origen y listado de muestras......................................................................................... 49 Tabla 4. Secuencias de "primers" para PYVV .............................................................................. 50 Tabla 5. Perfiles SSCP en 30 aislados de S.tuberosum Grupos Phureja y Andígena ................... 67 Tabla 6. Perfiles de SSCP obtenidos para los genes Hsp70, CP y CPm en S. tuberosum Grupo Phureja ........................................................................................................................................ 68 Tabla 7. Perfiles de SSCP obtenidos para los genes Hsp70, CP y CPm en S. tuberosum Grupo Andígena ..................................................................................................................................... 69 Tabla 8. Sustitución en las secuencias del gen Hsp70 (1664nt) de S.tuberosum Grupo Phureja respecto a la secuencia peruana................................................................................................. 77 Tabla 9. Cambios en nucleótidos presentados en las ocho secuencias de Hsp70 de S. tuberosum Grupo Phureja ............................................................................................................................. 78 Tabla 10. Cambios en aminoácidos en el gen Hsp70 de Grupo Phureja..................................... 81 Tabla 11. Sustituciones de nucleótidos en el gen Hsp70 (1664nt) de S.tuberosum Grupo Andígena respecto a la secuencia peruana................................................................................. 84 Tabla 12. Cambios en nucleótidos presentados en las seis secuencias de Hsp70 de S. tuberosum Grupo Andígena .......................................................................................................................... 84 Tabla 13. Cambios en aminoácidos en el gen Hsp70 de Grupo Andígena.................................. 86 Tabla 14. Sustituciones de nucleótidos en el gen CPm (2025nt) de S.tuberosum Grupo Phureja respecto a la secuencia peruana................................................................................................. 91 Tabla 15. Cambios en nucleótidos presentados en las seis secuencias de CPm de S. tuberosum Grupo Phureja ............................................................................................................................. 92 Tabla 16. Cambios no sinónimos en el gen CPm del Grupo Phureja .......................................... 93 Tabla 17. Sustituciones en el gen CPm (2025nt) de S.tuberosum Grupo Andígena ................... 95 Tabla 18. Cambios en nucleótidos presentados en las seis secuencias de CPm de S. tuberosum Grupo Andígena .......................................................................................................................... 96 Tabla 19. Número de cambios en aminoácidos en el gen CPm de Grupo Andígena .................. 97 16 Tabla 20. Sustitucionesn en el gen CP (537nt) de S.tuberosum Grupo Phureja ....................... 101 Tabla 21. Cambios en aminoácidos en el gen CP de Grupo Phureja......................................... 102 Tabla 22. Sustituciones en el gen CP (537nt) de S.tuberosum Grupo Andígena....................... 104 Tabla 23. Cambios en aminoácidos en el gen CP de Grupo Andígena...................................... 106 Tabla 24. Cambios no sinónimos presentes en todas las secuencias de aislados colombianos por gen vs. el aislado peruano .................................................................................................. 109 Tabla 25. Resultados del análisis de selección por MEGA ........................................................ 110 17 Introducción
El cultivo de la papa (Solanun tuberosum) es el cuarto cultivo de importancia a nivel
mundial después del trigo, arroz y maíz (FAO-2008); en Colombia es el producto
agrícola de mayor consumo, presentando un área de cultivo de 190.719 Ha con
producción de 2.400.000 toneladas/año, además este cultivo es la fuente de ingresos
para más de 90.000 familias colombianas (Zapata et al., 2004; Espinal et al., 2005).
Son muchos los patógenos que pueden afectar este cultivo, entre estos se encuentran
los virus. Las consecuencias de las infecciones virales pueden ser variables, algunos
no causan perdidas significativas como el Potato virus S (Luque et al., 1991), mientras
que otros como el caso del Potato yellow vein virus-PYVV puede llegar a ocasionar
perdidas entre un 25-50% de la producción en Solanum tuberosum Grupo Andígena
(Salazar et al., 2000, Zapata et al., 2004). En S. tuberosum Grupo Phureja la
prevalencia sintomática de PYVV evaluada en tres departamentos estuvó entre 1 y
5.3% con perdidas de aproximadamente 22% estimadas a través de un modelo en
campo (Franco-Lara et al., 2009a; Franco-Lara et al., 2009b; Guzmán et al., 2009;
Vargas et al., 2010). PYVV es un virus reemergente, después que fue informado por
primera vez por Alba en 1943 (Alba, 1952). Actualmente es considerado como un virus
cuarentenario por Aphis y EPPO (2007).
PYVV puede ser transmitido de forma vegetativa por tubérculo semilla y a través del
vector natural (mosca blanca Trialeurodes vaporariorum) (Guzmán y Rodriguez, 2010).
El hecho de que no exista un anticuerpo contra PYVV ha imposibilitado la certificación
de semilla contra este virus, lo cual es de crucial importancia para evitar la dispersión
viral entre municipios colombianos y fuera del país como producto de exportación. El
grupo de Virus Vegetales del IBUN-UNAL está en vías de obtención de este
anticuerpo.
PYVV es un virus RNA de cadena sencilla, sentido positivo, con genoma tripartita que
codifica para 13 proteínas, pertenece al género Crinivirus de la familia Closteroviridae
(Dolja et al., 2006: Livieratos et al., 2004) y se limita al floema de la planta.
18 Existe información acerca de la variabilidad viral de diferentes especies de la familia
Closteroviridae. Por ejemplo en Olive leaf yellowing-associated virus (OLYaV), se
demostró amplia variabilidad en el gen Hsp70 por SSCP (Essakhi et al., 2006), en
Citrus tristeza virus (CTV) se encontraron una población de diversos aislados con
diferentes propiedades biológicas y epidemiológicas (Orita et al., 1989) a diferencia de
Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV) y Sweet potato chlorotic stunt virus
(SPCSV) ambos pertenecientes al género Crinivirus que mostraron baja diversidad
genética para los genes Hsp70 y CP (Rubio et al., 2001b). Por otro lado, hay
evidencias de recombinación génica en CTV para generación de nuevas poblaciones y
variantes (Rubio et al., 2001a) y existen evidencias de que los virus transmitidos por
mosca blanca presentan tasas de mutación y evolución más elevadas que otros
Closteroviridae transmitidos por áfidos o coccinelidos (Karasev, 2000; Vives et al.,
2005).
Aunque existe información acerca de otros miembros de la familia Closteroviridae,
poco se conoce acerca de la variabilidad del PYVV. Trabajos realizados por Offei et
al., (2004) mediante la técnica de SSCP (Polimorfismo Conformacional de Cadena
Sencilla) sobre el gen de la proteína mayor de la cápside de diez aislados de
Cundinamarca de Solanum spp, no mostró diferencias entre sí, ni con un aislado
peruano, sugiriendo que el asilado peruano podía tener origen colombiano. Sin
embargo, el tamaño muestral fue bajo y restringido a una pequeña zona de
Cundinamarca. De otra parte, los RFLPs (Análisis de Polimorfismos de Fragmentos
de Restricción) utilizando las enzimas de restricción Hinf 1, Ecor RI y Pst 1 realizados
en 200 muestras de papa criolla (Solanum tuberosum Grupo Phureja) recolectadas en
los departamentos de Cundinamarca, Antioquia y Nariño mostraron tres perfiles
diferentes indicando la presencia de algunas variantes a través del gen CP (Guzmán
et al., 2006). Esta metodología permite estimar la variabilidad pero tiene limitaciones
porque solo se concentra en la información correspondiente a los sitios diana de
restricción y a enzimas específicas de un solo gen, por lo cual se sospecha que puede
existir mayor variabilidad en la secuencia de nucleótidos de otros genes que lo
reportado por Guzmán et al. (2006). La comparación entre aislamientos de PYVV a
través del secuenciamiento de nucleótidos del gen de la proteína mayor de la cápside,
ha permitido ampliar la detección de variantes (Rodríguez et al., 2009).
Los estudios sobre la variabilidad viral son importantes no solamente para conocer la
biología y evolución
viral sino
también para implementar programas de
19 fitomejoramiento clásico o biotecnológico. El objetivo de este trabajo fue determinar la
presencia de variantes de PYVV en aislados de campo obtenidos de dos hospederos
importantes en el cultivo de papa en Colombia como son Solanum tuberosum Grupo
Andígena y Grupo Phureja del departamento de Nariño, debido a que estudios previos
mostraron una mayor prevalencia de PYVV en este departamento con respecto a
síntomas en campo y confirmación por pruebas moleculares (Franco-Lara et al.,
2009a).
Se espera que la detección de variantes virales para este patógeno en este cultivo sea
de utilidad a mediano y largo plazo en programas de resistencia derivada del patógeno
y para conocer con mayor precisión la variabilidad genómica del virus, además de
contribuir a su caracterización biológica lo que permitirá relacionar la presencia de una
variante viral con la expresión de síntomas en la planta.
20 21 1. Justificación
Después de los hongos y de las bacterias, los virus son los principales fipatógenos con
mayor repercusión en la pérdida de rendimiento en los cultivos de papa, causando
reducción en tamaño, malformación de los tubérculos-semillas y degeneración gradual
de las variedades de estos cultivos (Estrada, 2000).
En los últimos años, un número de virus emergentes y re-emergentes han afectado el
cultivo de la papa en países andinos como Colombia, Ecuador, Perú y Venezuela.
Dentro de estos virus re-emergentes se encuentra Potato yellow vein virus (PYVV)
(Muller et al., 2004; Salazar, 2006).
La enfermedad de amarillamiento de venas de las nervaduras de la hoja de papa
(PYVD) se observó por primera vez en Antioquia, Colombia en el año de 1943 (Alba,
1952). Sin embargo, solamente hasta 1980 el Potato vein yellow virus (PYVV) fue
reconocido por instituciones agrícolas colombianas como un limitante severo para la
producción de papa (Salazar et al., 2000). En la actualidad PYVV es considerado un
patógeno cuarentenario por varias agencias de inspección sanitaria como la EPPO
(European and Mediterranean Plant Protection Organization) y por APHIS (Animal and
Plant Health Inspection Service) (López et al., 2006; APHIS, 2007), así como por
países andinos (Centro Internacional de la Papa). El vector natural de este virus es la
mosca blanca Trialeurodes vaporariorum, la cual ha ampliado su nivel de acción a
varios pisos térmicos de manera que potencialmente puede transmitir el virus a nuevos
nichos y a diferentes hospederos acrecentando la posibilidad de dispersión de este
patógeno (Salazar, 1998; Salazar et al., 2000). Teniendo en cuenta estos factores e
incluyendo el uso de semillas –tubérculos infectados, las pérdidas de la producción de
papa debidas a este virus supera el 20%.
Las poblaciones de virus de plantas, entre ellos los miembros del género Crinivirus,
familia Closteroviridae, de la cual hace parte PYVV, son genéticamente heterogéneas
(Vives et al., 2005). Esta variabilidad dada entre variantes virales se evidencian por
diferencias en las secuencias de nucleótidos del genoma completo o de genes
específicos, debidas a mutaciones puntuales, deleciones y/o inserciones o como
productos de eventos de recombinación, que se detectan por diferencias en los
22 perfiles de migración de las cadenas de cDNA y en la secuencia de nucleótidos.
Entonces, es posible detectar variantes virales teniendo en cuenta un solo gen o
ampliar las posibilidades de detección de variantes al analizar varios genes al mismo
tiempo o los genomas completos.
Se han realizado estudios sobre la variabilidad del gen de la proteína mayor de la
cápside de PYVV con aislamientos de Colombia y uno peruano a través de la técnica
de RFLP y de SSCP o de secuenciamiento de nucleótidos , en los que se ha reportado
baja variabilidad (Offei et al., 2004, Guzmán et al., 2006, Guzmán et al., 2008,
Rodríguez et al., 2009, Cubillos et al., 2010). Sin embargo, no se ha realizado un
análisis de la variabilidad de PYVV a través de diferentes genes, ni existen estudios
sobre la comparación de variantes virales entre hospederos como papa criolla y papa
de año (Solanum tuberosum Grupo Phureja y Grupo Andígena), respectivamente.
Aunque el genoma completo de PYVV codifica para al menos 13 proteínas, los genes
estructurales CP y CPm que codifican para la proteína de la cápside mayor y menor,
respectivamente y, el gen Hsp70 que codifica para la proteína de choque térmico, son
un buen blanco de estudio pues putativamente intervienen en el proceso de
ensamblaje del virión, estabilidad de la partícula viral, en el paso del virus célula a
célula, en la transmisión por vector y en la protección del genoma (Alzhanova et al.,
2001).
Estos genes amplificados permitirán ampliar el análisis de la variabilidad de cada uno
de ellos, dentro y entre hospederos, por SSCP, secuenciamiento y análisis
bioinformáticos. No se ha informado en la literatura trabajos similares al que se
propone en esta investigación de tal forma que los resultados que se obtengan
permitirán una reflexión biológica y molecular en cuanto al significado del aporte de
cada gen en la variabilidad viral y en cuanto a sí dos hospederos diferentes son
igualmente susceptibles a las mismas variantes o por el contrario si se puede
sospechar algún filtro de variantes particulares del virus a través del hospedero.
El cultivo de papa ocupa el cuarto lugar en la producción mundial de alimentos y en
Colombia es de alta importancia para la economía nacional y de interés para la
exportación. Por lo tanto, es importante conocer más sobre uno de los virus que afecta
la producción y rendimiento de este cultivo en Colombia y los países andinos. De tal
manera se espera que este trabajo amplie el conocimiento sobre la caracterización
23 molecular del PYVV, provea herramientas para su caracterización biológica y sea de
utilidad a mediano y largo plazo en las estrategias de control de los programas de
resistencia de la papa a este virus.
24 2. Hipótesis
La variabilidad de PYVV se puede analizar a través de genes diferentes al de la
proteína mayor de la cápside.
Es posible detectar algunas variantes de Potato Yellow Vein Virus a través del análisis
de tres genes (CP, CPm y Hsp70), en aislados de campo de Solanum spp de Nariño,
Colombia.
25 3. Objetivos
3.1 Objetivo general
Determinar variantes de PYVV a partir del análisis de tres genes en aislados virales
provenientes de muestras foliares sintomáticas de plantas de Solanum tuberosum
Grupos Andígena y Phureja cultivadas en el departamento de Nariño.
3.2 Objetivos específicos
1. Seleccionar y amplificar tres genes de un grupo de aislados de PYVV provenientes
de Solanum tuberosum Grupo Andígena y Phureja del departamento de Nariño.
2. Evaluar la variabilidad molecular de tres genes intra e inter aislados.
3. Analizar secuencias de un subgrupo de aislados de Solanum tuberosum Grupo
Andígena y Phureja que presenten patrones diferentes en uno o varios genes por la
técnica de SSCP.
26 4. Marco teórico
4.1 Cultivo de papa en Colombia
El cultivo de papa es el cuarto cultivo de importancia a nivel mundial después del trigo,
arroz y maíz (FAO-2008). En el país se cultivan principalmente dos especies de papa:
Solanum tuberosum Grupo Andígena (papa de año) y Solanum tuberosum Grupo
Phureja (papa criolla) (Tabla 1). Cerca del 90% de la producción nacional de papa
corresponde a S. tuberosum Grupo Andígena con variedades que incluyen Pastusa
suprema, DIACOL Capiro, Tocarreña, ICA Nariño, Sabanera e ICAR12 entre otras,
mientras que de papa criolla, Solanum tuberosum Grupo Phureja corresponde
aproximadamente el 8% del área total de papa cultivada (Agronet, 2007).
Según FEDEPAPA, en el país en 2005 existían más de 30 variedades de papas
cultivadas pero sólo 10 de ellas con importancia comercial. La variedad denominada
Parda Pastusa es la más cultivada y la que en mayor cantidad se consume en estado
fresco, le siguen en importancia, la Diacol Capiro ó R12 negra, utilizada como materia
prima por la industria, para la exportación y para el consumo en fresco. La ICA- Puracé
es utilizada preferentemente en algunas regiones del país (climas templado y cálido)
para consumo en fresco; la Tuquerreña o Sabanera es consumida principalmente en
Bogotá, la criolla o yema de huevo ubicada principalmente en los departamentos de
Cundinamarca y Nariño. En los últimos años han entrado nuevas variedades
desarrolladas en el marco de convenios entre entidades del sector público (ICA,
Universidad Nacional) y el sector privado (FEDEPAPA). Las variedades ICA Única e
ICA Morita son ejemplos de los nuevos desarrollos que tienen grandes posibilidades
comerciales (Espinal et al., 2005).
27 Tabla 1. Principales municipios colombianos productores de papa criolla DEPARTAMENTOS
MUNICIPIOS
Subachoque*, Une, Cáqueza, Usme, Zipacón,
Bojacá,Chocontá, Cajicá, La Calera, Cota, Guasca, Zipaquirá,
Suesca, Carmen de Carupa y Mosquera
Toca, Siachoque, Motovita, Ventaquemada, Umbita, La Capilla,
Boyacá
Turmequé y Buenavista
Pasto, Puerres, Potosí, Córdoba, Ipiales, Pupiales, Guachucal,
Nariño
Cumbal
Antioquia
Sonsón, La Unión, Abejorral, Carmen de Vivoral, Santuario
Cauca
Silvia, Puracé, Sotorá, Jambaló, Totoró
Norte de Santander Mutiscua, Silos, Opitaga, Pamplona, Cácota
Santander
Sutará, Tona, Cerrito, Málaga
*Mayor municipio productor en Colombia (Mosquera, 1992).
Cundinamarca
En la actualidad, la mayor parte de la producción nacional de papa es para consumo
interno, y menos del 0.1% se destina a exportación. Según datos de Agronet (2007),
26.000 toneladas fueron exportadas desde Colombia en el año 2005 para semilla de
papa, como papas frescas o refrigeradas, papas cocidas o preparadas. Parte de lo que
se exporta se vende para semilla de papa en países como Panamá y Venezuela, lo
que supone una responsabilidad en la venta de semilla libre de patógenos.
4.2 Patógenos de la papa
Según la Guía para el cultivo de papa (Fedepapa, 2004), los principales patógenos de
papa son hongos y oomicetos como Phytophthora infestans, Alternaria solani,
Spongospora subterranea y Thanatephorus cucumeris, bacterias como Erwinia
carotovora, Ralstonia solanacearum y nemátodos de los géneros Meloidogyne,
Oitylenchus y Pratylenchus. Dentro de las plagas se resaltan Tecia solanivora y
Premnotrypes vorax entre otros. Sin embargo, según Estrada (2000), los principales
responsables de los bajos rendimientos cuando los cultivadores no emplean semillas
certificadas libres de patógenos, son los virus.
Se conocen al menos 35 virus diferentes que causan síntomas en hojas, tallos y
tubérculos de variedades de papa en todo el mundo: PLRV (Potato leafroll virus), PVY
(Potato virus Y), PVA (Potato virus A), PVX (Potato virus X), PVM (Potato virus M) y
PVS (Potato virus S) son considerados los más importantes en cuanto a su
distribución y efectos sobre el rendimiento (Burrows and Zitter, 2005; Salazar, 1982;
Guzmán et al., 2008).
28 Potato leafroll virus o PLRV ocasiona enrollamiento de las hojas, enanismo de la
planta y ha mostrado una reducción del redimiento de producción entre 46‐80% y
puede aumentar si esta con otros virus como PVX. Este último, causa mosaicos leves
latentes o necrosis y disminución en la producción entre 10‐50% con diferentes
variantes del virus. PVY puede ocasionar perdidas hasta del 80% con PLRV o PVX,
siendo uno de los virus más severos que atacan el cultivo de papa. PVS ocasiona
ligeras hendiduras de las nervaduras algunas veces indetectables puede generar
perdidas entre el 10‐15% (Luque et al.,1991).
Además de los virus ya mencionados, en los últimos años, un número de virus
emergentes, es decir nunca antes mencionados en un lugar determinado y virus
reemergentes, es decir aquellos supuestamente controlados, en descenso o
prácticamente desaparecidos, que vuelven a constituir una amenaza y que en algunos
casos reaparecen causando mayor severidad de síntomas (Formento A.N, 2010),
están afectando el cultivo de la papa en la región de la cordillera de los Andes. Dentro
de estos virus reemergentes se encuentran PVYNTN (Potato virus Y variante necrótica)
que es uno de los más frecuentes y problemáticos debido a que causa mosaicos
severos en la planta, flacidez en las hojas y grandes lesiones necróticas en las
nervaduras, disminuyendo el rendimiento de la producción por encima de un 50%
(Hamm, 2003). Adicionalmente, PYVV (Potato yellow vein virus) y PMTV (Potato moptop virus) no causa pérdidas significativas en la producción pero ocasiona
deformaciones en los tubérculos (Salazar, 1996). Los efectos causados por los virus
dependen de factores ambientales y biológicos como, la variedad de papa, cepa viral,
combinaciones sinergísticas de virus o la presencia de insectos vectores en los
cultivos afectados (Muller et al., 2004; Salazar et al., 2000; Guzmán et al., 2008).
Estudios realizados en Colombia determinaron que la interacción de PVX, PVY y
PLRV redujo rendimientos hasta un 61% mientras que PVX solo en 0.2% (Luque et al.,
1991).
4.3 Potato yellow vein virus (PYVV)
La enfermedad del amarillamiento de las nervaduras de la hoja de la papa (PVYD) es
causada por el Potato yellow vein virus (PYVV) (Salazar et al., 2000), Crinivirus de la
familia Closteroviridae (Livieratos et al., 2004). Los virus de esta familia son limitados
al floema y son considerados los más largos y complejos dentro de los fitovirus
29 (German-Retana et al., 1999). El tamaño de los genomas de los Closterovirus varía de
~15.5 a ~19.5 kb, con capacidad de codificar para 10-14 proteínas (Dolja et al., 2006).
Basados en el número de RNAs genómicos y en el modo de transmisión, los
Closteroviridae se dividen en tres géneros. El género Closterovirus es transmitido por
áfidos, el género Ampelovirus por chinches y el género Crinivirus por mosca blanca.
Los dos primeros están constituídos por genomas monopartitas mientras que los
Crinivirus son bipartitas con excepción del PYVV que es tripartita (Karasev, 2000;
Martelli et al., 2002; Livieratos et al., 2004). En la figura 1 se muestra la relación
filogenética entre las especies y géneros de la familia Closteroviridae basada en la
secuencia del gen Hsp70.
Figura 1. Relación filogenética entre las especies y géneros de la familia Closteroviridae basada en la secuencia del gen Hsp70h (Tomado de Martelli et al., 2002) 4.3.1 Genoma viral
Potato yellow yein virus es un virus RNA de cadena sencilla y sentido positivo, que
actúa como RNA mensajero en la célula infectada. Los viriones presentan forma
filamentosa flexuosa altamente inestable. La partícula viral fue observada al
microscopio electrónico por primera vez por Salazar et al. (2000) (Figura 2).
30 Figura 2. Viriones de PYVV. Escala de barra=200nm (Tomado de Salazar et al., 2000) PYVV consta de tres RNA genómicos y dos RNA defectivos (Livieratos et al., 2004).
Su genoma posee 10 marcos abiertos de lectura (ORF), repartidos en los tres RNAs
genómicos que codifican aproximadamente 12 proteínas (tabla 2) (Livieratos et al.,
2004).
PYVV RNA1 (8035nt) presenta tres ORFs: el módulo de replicación, que consta de
ORF 1a y b que contiene dominios conservados L-Pro (dominio similar a la papaína),
MTR (metiltransferasa), HEL (helicasa) y RdRp (RNA polimersa dependiente de RNA)
y ORF 2 que codifica para p7 (proteína hidrofóbica corta) (Livieratos et al., 2004).
PYVV RNA 2 (5339nt) presenta el arreglo genómico de virus de la familia
Closteroviridae que consta de cinco ORF: Hsp70h “heat shock protein” homóloga 70
(chaperonas moleculares) única de los virus de la familia Closteroviridae. El ORF 2
codifica la p7 similar a proteínas encontradas en otros Crinivirus. El ORF 3 codifica la
p60 que podría tener implicaciones en el ciclo de replicación. El ORF 4 la p10 y el ORF
5 la proteína de la cápside (CP) de 28.2 kDa (Livieratos et al., 2004).
PYVV RNA3 (3892nt) presenta tres ORF: p4, CPm (proteína menor de la cápside) y
p26, los cuales representan el remanente de genes de la familia Closteroviridae
(Livieratos et al., 2004). El gen que codifica la proteína CPm de PYVV fue
caracterizada por Livieratos (2002) y contiene 2022 nucleótidos. En la figura 3 se
ilustra la organización genómica del PYVV.
31 Figura 3. Representación esquemática de la organización genómica del PYVV (Tomado de Livieratos et al., 2004) Los viriones filamentosos de los closterovirus poseen un cuerpo largo formado por la
proteína de la cápside mayor (CP) y una cola corta formada por la proteína menor de
la cápside (CPm). La proteína de la cápside (CP) cubre el 95% del virión, protegiendo
su genoma y dándole estabilidad al cuerpo del virión. La proteína menor de la cápside
(CPm) cubre el 5% restante formando la cola del virión (figura 4). La Hsp70 participa
junto con la CPm en la estabilidad de la cola del virión, aumentando la eficiencia de la
encapsidación
en
la
familia
Closteroviridae
(Satyanarayana
et
al.,
2004,
Satyanarayana et al., 2010) y juega un papel importante en el paso del virus célula a
célula. Gracias a las proteínas Hsp70 y Cpm se lleva a cabo la unión del virión a los
canales de los plasmodesmos, ocasionando la pérdida de la integridad de la cola del
virión y el posterior paso del genoma viral a la otra célula (Peremyslov et al., 1999,
Satyanarayana et al., 2000, Alzhanova et al., 2001).
Figura 4. Microscopía electrónica de transmisión de viriones LIYV. a) Anticuerpos anti CP b) Anticuerpos anti CPm. Barras representan 224nm (Tomado de Ng and Falk, 2006) Estudios realizados en viriones de la familia Closteroviridae evidencian la interacción
física de la Hsp70 con los viriones, lo que sugiere que esta proteína Hsp70 también
hace parte de las proteínas estructurales del virus (Napuli et al., 2000). Además Tian
et al. (1999) mostraron que en adición a las proteínas CP y CPm otras dos proteínas
32 se presentaban en viriones de LIYV purificados, la proteína Hsp70 y la proteína p59.
La figura 5 esquematiza la representación de la función de las proteínas Hsp70, CPm
y CP en Beet yellow virus.
Figura 5. Representación de la función de las proteínas Hsp70, CPm y CP en Beet yellow virus (BYV) (Tomado y modificado de Alzhanova et al., 2001) En adición a los tres RNA genómicos, PYVV cuenta con dos RNAs de bajo peso
molecular x, y de 2.0 y 1.8 kbp respectivamente que corresponden a RNAs defectivos
(dRNA) que parecen ser mosaico de los tres RNAs genómicos por presentar
secuencias derivadas de los extremos 5’ y 3’ de PYVV RNA3 con deleciones internas
(Livieratos et al., 2004) (figura 6).
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa para detección de cinco RNAs en PYVV. En la línea 2 amplificado de planta infectada con PYVV (Tomado de Livieratos et al., 2004)
Los RNA defectivos fueron renombrados como dRNA A y B, y contienen
respectivamente 2082 y 1802 nucleótidos aparte de una región duplicada de 228
33 nucleótidos presente en dos RNAs genómicos (figura 7). La importancia biológica de
estos RNA defectivos es desconocida sin embargo, no interfieren con la acumulación
de los RNA genómicos, por lo que pueden ser un producto de recombinación genética
(Eliasco et al., 2006), lo que confirmaría la variabilidad de los miembros de esta
familia.
Figura 7. Representación esquemática de los RNA defectivos de PYVV (Tomado de Eliasco et al., 2006) Tabla 2. Función putativa de las proteínas de PYVV Gen
Proteína
Función Putativa
L-Pro
Proteinasa. Similar a papaína
Procesamiento poliproteínas. Transporte viral.
Replicación del RNA.
Mtr
Hel
p7
Metiltransferasa
Helicasa
RNA polimerasa dependiente
de RNA
Proteína corta hidrofóbica P7
Hsp70
Proteína de choque térmico
Movimiento célula-célula por unión a plasmodesmos.
Ensamblaje de la cola del virión.
Estabilidad del virión.
p60
Proteína P60
Ensamblaje de la cola del virión.
Movilidad célula-célula.
p10
Proteína P10. Única en el
género Crinivirus
No se conoce su función.
CP
Proteína mayor de la cápside
Protección del genoma.
Prevenir degradación del RNA durante la traducción.
Ensamblaje del virión- encapsidación
p4
Proteína P4
CPm
Proteína menor de la cápside
p26
Proteína P26
RdRp
Replicación RNA viral
Movimiento célula-célula.
No se conoce su función.
Transmisión planta- planta por mosca blanca
Ensamblaje del virión-encapsidación
Interviene en el movimiento local pero también es
requerida para el transporte por el floema.
(Peremyslov et al., 1999; Tongyan et al., 1999; Satyanarayana et al., 2000; Alzhanova
et al., 2001; Peng et al., 2001; Callaway et al., 2001; Satyanarayana et al., 2004;
Mandahar, 2006, Ng and Falk, 2006).
34 4.3.2 Síntomas ocasionados por PYVV
Los síntomas que produce PYVV son variables, y se han reportado casos de plantas
infectadas no sintomáticas (Salazar, 2000; Guzmán y Rodríguez, 2010). PYVV se
localiza en el floema de la planta y cuando causa síntomas de amarillamiento de las
nervaduras (figura 8), produce diferentes grados de clorosis asociados con reducción
de la capacidad fotosintética, dificultad para la translocación de nutrientes y pérdida
del vigor general de la planta (Alba, 1952; Salazar et al., 2000; Guzmán et al., 2008).
El primer síntoma en aparecer en la planta es el amarillamiento en la porción apical de
las nervaduras de las hojas, posteriormente las nervaduras secundarias también son
afectadas, las hojas se vuelven completamente amarillas y las nervaduras pueden
recuperar su color verde (Salazar et al., 2000).
Alteraciones en la cantidad y calidad de los tubérculos se han documentado en
trabajos anteriores realizados en condiciones de invernadero con plantas de Solanum
tuberosum Grupo Phureja infectadas con PYVV (Arciniegas, 2003) y en campo
(Vargas et al., 2010).
Figura 8. Síntomas ocasionados por PYVV. A la izquierda clorosis de la hoja (Franco y Guzmán. 2008. Solanum tuberosum Grupo Andígena, Zipaquirá) A la derecha amarillamiento del follaje con disminución en la producción de tubérculos (Tomado de Salazar et al., 2000)
Estudios previos han mostrado que la infección por miembros de la familia
Closteroviridae induce cuerpos citoplasmáticos de inclusión característicos de las
células asociadas a los plasmodesmos, incluyendo el parénquima del floema y células
acompañantes (figura 9) (Medina et al., 1998; Roistacher, 1991). Esto obstaculiza las
haces vasculares, alterando la fotosíntesis y el metabolismo de la planta, lo cual se
35 evidencia por clorosis de las hojas, reducción del vigor y enanismo de la planta y en el
caso del PYVV ocasionando disminución en la producción de tubérculos de un 25% a
un 50% en países andinos (Salazar et al., 2000, Zapata et al., 2004).
Figura 9. Cuerpos de inclusión, depósitos de viriones (V) de Lettuce infectious yellows virus (LIYV) del genero Crinivirus en los plasmodesmos de células infectadas (PD) (Tomada de Medina et al., 1998) 4.3.3 Transmisión de PYVV
a) Transmisión vegetativa. El PYVV es un virus limitado al floema, lo que permite que
la enfermedad perpetúe en el campo mediante tubérculos-semilla que provienen de
plantas infectadas. Según Salazar (2000) plantas derivadas de tubérculos de plantas
infectadas pueden no presentar sintomas y la progenie de estos pueden incluir tanto
plantas sintomáticas como no sintomáticas (Vargas et al., 2010). Estudios
relacionados con la expresión de síntomas mostraron que de una planta madre
infectada se puede obtener plantas hijas con o sin síntomas y esto se puede mantener
por generaciones, como se ilustra en la figura 10 (Zapata et al., 2004).
36 Figura 10. Comportamiento sintomático de plantas afectadas con PYVV (Tomado de Zapata et al., 2004) b) Transmisión por vector. La transmisión del virus de amarillamiento de nervaduras de
la hoja de la papa a través de mosca blanca (Trialeurodes vaporariorum) fue
demostrada por primera vez por Vega (1970) y Buriticá (1971) y fueron después
confirmados por Tamyo y Navarro (1984) aunque aun no se afirmaba que la
enfermedad tenía origen viral (Salazar et al., 2000). Utilizando mosca blanca como
vector se pudo observar la expresión de síntomas de PYVD en plantas inoculadas.
La mosca blanca pertenece al orden Homoptera, familia Aleyrodidae, género
Trialeurodes, especie T. vaporariorum (figura 11), se encuentra en todos los
departamentos del país que cultivan papa y transmiten el PYVV de manera
semipersistente y se ha demostrado que un periodo de inanición de 1 a 3 horas
favorece su transmisión (German-Retana et al., 1999).
La importancia de este insecto se debe a su amplia distribución geográfica en el
trópico, subtrópico y zonas templadas del mundo, del gran número de especies
vegetales cultivadas que afecta y su amplio rango de hospederos cultivados y
silvestres. Los adultos y ninfas de este insecto succionan la savia del floema y causan
daños directos por la reducción del rendimiento de los cultivos.
37 Figura 11. Vector natural de PYVV. Trialeurodes vaporariorum. Fuente: www.ars.usda.gov
El periodo de adquisición corresponde al tiempo necesario en la exploración y
alimentación del insecto y el tiempo para adquirir las partículas virales de una planta
enferma, el cual para la mosca blanca es un periodo mínimo de 30 minutos. El periodo
de latencia es el tiempo que se necesita para que el insecto se convierta en virulífero;
aparentemente la mosca blanca no requiere un período de latencia (Saldarriaga et al.,
1988). Las moscas blancas viruliferas pierden su infectividad, es decir su periodo de
retención es hasta 6 horas si no tienen acceso a plantas nuevamente infectadas (Ng
and Falk, 2006; Zapata et al., 2004).
4.3.4 Distribución del PYVV en el mundo
Potato yellow vein virus o PYVV es un virus cuarentenario afectando países andinos
como Colombia, Perú, Venezuela y Ecuador (figura 12). Los productores de papa de
Antioquia, Colombia, habían observado la presencia de la enfermedad del
amarillamiento de las venas de la papa hacia 1943 (Alba, 1952), aunque su existencia
ya era conocida en 1939 (Smith, 1972). Silberschmidt (1954) encontró que la
enfermedad estaba ampliamente difundida en los campos de papa del sur de
Colombia, desde donde se cree que se diseminó a Ecuador. Sin embargo, otros
investigadores como Fernow, 1949 sugirieron que la enfermedad en realidad se
originó en Ecuador y de allí se diseminó a Colombia (Salazar, 1997).
Un estudio realizado sobre la prevalencia de PYVV en Colombia demostró, que Nariño
presentó mayor prevalencia en comparación a Cundinamarca y Antioquia tanto por
síntomas característicos de PYVV (estudio visual) como por análisis molecular de
muestras sin síntomas y con síntomas de amarillamiento (Franco-Lara et al., 2009a).
38 Figura 12. Distribución de PYVV en el mundo (EEPO, 2007)
4.4 VARIABILIDAD VIRAL
Los virus RNA se caracterizan por una alta variabilidad genética (Domingo and
Holland, 1997) lo cual ha sido atribuido, principalmente a la ausencia de actividad
correctora de la RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp) (Drake and Holland,
1999). Además, gracias a su variabilidad, presentan una gran capacidad de
adaptación, siendo la mutación y la recombinación los primeros recursos de variación
genética para proveer esta capacidad (García-Arenal et al., 2001, 2003).
La alta tasa de mutación de los virus RNA no necesariamente resulta en alta
variabilidad genética pues factores como la selección natural, episodios de cuello de
botella, etc., pueden reducir la diversidad genética viral. La facilidad de los virus para
mutar y dar variantes del virus original puede dar lugar a que en un mismo aislado o
individuo aparezcan variantes virales circulantes relacionadas que se han denominado
"Cuasiespecies" (Rubio et al., 2001a). En CTV se han evidenciado cuasiespecies
dentro de la población, halladas por diferencias en la expresión síntomas
(caracterización biológica), por el uso de anticuerpos específicos y por métodos
moleculares y en aislamientos virales colombianos fueron encontradas cepas suaves y
severas de este virus (Peñaranda et al., 1996).
Entre los cambios que se pueden generar por mutaciones o recombinaciones están los
cambios de nucleótidos sinónimos (silenciosos) y no sinónimos. Si los cambios
mantienen el aminoácido original se dirá que son cambios sinónimos que no afectarán
39 la proteína, mientras que los no sinónimos cambian un aminoácido por otro y esto
puede afectar la proteína producida según las características bioquímicas del
aminoácido reemplazado (Nei and Gojobori, 1986).
4.4.1 Metodologías para estimación de variabilidad viral
Algunos de los métodos empleados para analizar la variabilidad genética de los virus
de plantas son análisis de polimorfismo de fragmentos de restricción (RFLPs),
indexación
o
caracterización
biológica
en
plantas
indicadoras,
análisis
de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP) y por secuenciación
(Broadbent et al., 1996, Rubio et al., 1996, Zemzami et al., 2002, García-Arenal et al.,
2003, Essakhi et al., 2006, Oliveros et al., 2009).
a) Análisis de polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP).
Se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y
cortadas por las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de
restricción) y que varían entre individuos.
Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y
disposición diferentes en el ADN de diferentes individuos de una población, por lo que
se dice que la población es polimórfica para estos fragmentos de restricción (RFLP).
Gracias a los sitios de corte de las enzimas de restricción es posible determinar
variantes de un mismo fragmento de ADN.
Con esta técnica se han podido determinar variantes virales para Potato yellow vein
virus del gen CP por restricción con la enzima HinfI en aislados de tres departamentos
de Colombia, en donde se encontraron tres variantes diferentes A, B y C, como se
ilustra en la figura 13 (Guzmán et al., 2006).
40 Figura 13. RFLP con HinfI del gen CP de PYVV (Tomado de Guzman et al., 2006) b) Caracterización biológica-Indexación. Gracias al uso de la transmisión de virus a
plantas indicadoras, es posible detectar un virus causal de síntomas específicos (De la
Torre et al., 2006) e identificar diferentes variantes virales por la sintomatología que
causan (Broadbent, P. et al., 1996). Muchas especies han sido buenas indicadoras
para virus de papa, como Nicotiana, Chenopodium, Cucumus, Phaseolus, Vicia y
Brassica (figura 14); sin embargo para PYVV se evidenció buena transmisión en
Lycopersicon esculentum (Salazar et al., 2000).
Figura 14. Plantas indicadoras de izquierda a derecha Nicotiana tabacum, Chenopodium murale y Phaseolus vulgaris d) Análisis de secuencias. La amplificación de genes específicos por medio de retro
trasnscripción – PCR, ha posibilitado la secuenciación de genes, partes de genes, o
incluso de regiones no codificantes. Es muy utilizada hoy en día para el estudio de
variabilidad puesto que se puede determinar el orden preciso de los nucleótidos
(Adenina, Timina, Citosina o Guanina) en un fragmento de ADN dado. La enzima Taq
polimerasa utilizada para una PCR convencional puede introducir errores en la
secuencia, por no tener actividad proofreading, lo que puede afectar la estimación de
la variabilidad, particularmente si las secuencias a comparar son muy similares. Al
41 secuenciar las dos cadenas de ADN usando enzimas con actividad proofreading o
actividad exonucleasa 3-5’ que corrige sus propios errores durante la replicación
asegura que las diferencias en las secuencias son debidas a la variabilidad del gen y
no a errores en la PCR (Malet et al., 2003).
El estudio de secuencias permite no solo evaluar los cambios en nucleótidos, sino que
además por medios bioinformáticos es posible derivar la secuencia de aminoácidos y
como una simple sustitución en un nucleótido puede alterar o no la secuencia de la
proteína, representado en cambios sinónimos y no sinónimos y en cambios
bioquímicos que alteren o no la función. Para evaluar los tipos de sustitución entre
nucleótidos y aminoácidos existen diversos modelos, algunos que tienen en cuenta si
los cambios fueron transiciones (cambio entre purinas A-G o pirimidinas T-C) o
transversiones (cambio de una purina por una pirimidina o viceversa) (Yu, 2005).
Entre estos modelos existe el GTR (General time reversible) (Lanave et al., 1984), el
cual es un modelo neutral para la evaluación de sustituciones de nucleótidos, porque
considera las frecuencias de nucleótidos como parámetros libres y las diferencias
entre todas las posibles sustituciones se tienen en cuenta, esto debido a que se
reconoce que no hay sesgo en la frecuencia de nucleótidos en las secuencias de ADN
y no es necesario forzarlas a ser iguales en los modelos evolutivos (Yu, 2005).
Con respecto a los modelos de sustitución de aminoácidos Jones et al., (1992)
construyó un modelo (JTT) con una matriz de posibles sustituciones, sin deducir las
secuencias ancestrales sino que sólo se utilizan comparaciones por parejas entre las
secuencias para estimar el número de aminoácidos reemplazados (Yu, 2005).
A través de análisis bioinformaticos también es posible estudiar mecanismos de
evolución dentro de una población los cuales también se pueden ver reflejados por el
número de sustituciones de aminoácidos y la posición de estas sustituciones; el
principal mecanismo de evolución es la selección natural, la cual genera un cambio en
las frecuencias relativas de fenotipos/genotipos de acuerdo a su adaptación relativa
dentro de la población. A nivel molecular, se conocen dos tipos de selección natural:
selección positiva o diversificadora y la selección negativa o purificadora (Li, 1997).
En la selección positiva, los nuevos mutantes poseen adecuaciones mayores que el
promedio de la población y las frecuencias de dichos mutantes se incrementan en la
42 siguiente generación, es decir que este tipo se selección promueve la diversidad
genética (Li, 1997, Boulila, 2010). En virus de plantas la posible ventaja de cambios en
aminoácidos en la selección positiva puede estar asociado a la adaptación al
hospedero o al vector (Marco and Aranda, 2005).
En la selección negativa, los nuevos mutantes poseen adecuaciones menores que el
promedio de la población y la frecuencia de estos mutantes disminuye en las
siguientes generaciones, es decir que este tipo de selección disminuye la diversidad
eliminando las variantes de la población (Li, 1997, Boulila, 2010).
Para poder detectar la participación de la selección en una región del genoma o en un
gen en particular lo primero que se tiene que probar es el rechazo de la hipótesis nula,
que indicaría que la selección ha actuado en las secuencias estudiadas. Estimando el
número de sustituciones sinónimas (dS) y el número de sustituciones no sinónimas (dN)
se realiza el test de hipótesis nula: H0: dN=dS; el nivel de significancia por la cual la
hipótesis nula es rechazada depende de la hipótesis alternativa (HA), dN > dS es
considerado selección positiva, mientras que dN < dS selección negativa y si se evalúa
la relación entre los cambios presentados, dN/dS < 1 indicaría selección negativa,
mientras que dN/dS > 1 selección positiva
(Boulila, 2010, Tamura et al., 2011),
infiriendo que entre más cambios no sinónimos se presenten en el genoma mayor será
la variabilidad, y se dirá que existe selección positiva en la población.
Entre los métodos para detectar la selección basados en las sutituciones nucleotidicas
y en la determinación de sustituciones sinónimas y no sinónimas en secuencias
codificantes de ADN, como se mencionó anteriormente se encuentra el método de
Nei-Gojobori (1986), en el cual los sitios potencialmente sinónimos y no-sinónimos son
descritos a partir de cada codón asumiendo que existe igual probabilidad de cambio
para todos los nucleótidos.
e) Análisis de Polimorfismo Conformacional de Cadena Sencilla (SSCP). Se basa en la
movilidad electroforética diferencial de moléculas de DNA de cadena simple,
permitiendo la detección de mutaciones puntuales de DNA sin necesidad de conocer
su secuencia (Berta et al., 1990; Estrada-Cuzcano et al., 2005. Figura 15) y son
capaces de identificar entre el 30 y 70% de todos los polimorfismos debidos a una
mutación simple (Larsen and Nielsen, 1992). La movilidad, el número y la intensidad
de las bandas de cada patrón de SSCP encontrado puede ser usado como una
43 primera estimación de la estructura poblacional dentro de un grupo de aislados
(Enomoto et al., 1994).
Figura 15. Representación de la técnica SSCP (Tomada de Estrada‐Cuzcano et al., 2005)
El análisis por SSCP fue originalmente desarrollado para analizar diversidad de
genomas virales porque el procedimiento combina simplicidad, bajo costo y el
potencial para usar con muchas muestras (Orita et al., 1989; Sambade et al., 2002).
Adicionalmente, este tiene la suficiente sensibilidad para detectar diferencias en un
simple nucleótido en fragmentos relativamente largos de DNA (encima de 700
nucleótidos) (Rubio et al., 1996; Gago-Zachert et al., 1999; Kim et al., 2006).
Cuando se realiza la técnica SSCP de aislados de campo es posible detectar cambios
conformacionales de una sóla variante en el aislado (perfil simple) ó en más de una
variante viral dentro del mismo aislado (perfil complejo), es decir es frecuente
encontrar mezcla de variantes (Essakhi et al., 2006) (figura 16), mientras que al partir
de clones se individualiza la variante y se puede observar los cambios
conformacionales de esa variante específica.
44 Figura 16. Representación esquemática de posibles resultados de la técnica SSCP de aislados de campo. La variabilidad y las estructuras poblacionales de miembros de la familia
Closteroviridae se han estudiado por SSCP para CTV, los cuales se encuentran como
una población de diversos aislados con diferentes propiedades biológicas y
epidemiológicas (Orita et al., 1989; Rubio et al., 1999; Ayllon et al., 1999; Kong et al.,
2000; Turturo et al., 2005; Cerni et al., 2008). A través SSCP se pudieron detectar
variaciones dentro de esas poblaciones después de la transmisión por áfidos (D'urso
et al., 2000) o luego del paso por el hospedero (Rubio et al., 2001a). Se analizó la
variabilidad del CTV con respecto a diferentes genes; el gen de la proteína menor de
la cápside (CPm) tiene baja variabilidad, sin embargo es más variable que otros genes
como el de la metiltransferasa, CP o el gen de la proteína 20 (Rubio et al., 2001b;
Oliveros-Garay, et al., 2009).
Dentro de la familia Closteroviridae existen diferencias en las tasas de variabilidad; la
baja variabilidad de virus pertenecientes al género Crinivirus en relación al CTV
perteneciente al género Closterovirus puede ser debido a diferencias en factores como
sus hospederos y/o modos de transmisión. El CTV, afecta cultivos perennes por lo
tanto el virus tiene mayor tiempo de exposición para realizar procesos de
recombinanción en el vector (áfido), mientras que para otros Closteroviridae que
afectan cultivos de corto tiempo les conviene mantener su estabilidad genética (Rubio
et al., 2001b) como es el caso de PYVV que afecta cultivos de papa con tiempo de
desarrollo de 3 a 6 meses.
45 Estudios realizados en Olive leaf yellowing-associated virus (OLYaV), Closteroviridae
no asignado a género (Martelli et al., 2002), demostró amplia variabilidad en el gen
Hsp70 que como se conoce esta involucrado en el movimiento célula-célula. Estos
resultados fueron inesperados, debido a que se ha demostrado que este gen es muy
conservado dentro de algunos miembros de la familia Closteroviridae posiblemente
debido a su importancia biológica. Como muestra la figura 17 los aislados 5, 9, 11, 14,
16 y X16 muestran infección simple de OLYaV, mientras que los aislados P5 (clon C y
E), 15 (clon D y F) y 17 (clon G y H) tienen mas de un patrón de SSCP observado por
las diferencias entre los dos clones respectivamente; revelando la infección con mas
de una variante de OLYaV (Essakhi et al., 2006).
Figura 17. Perfiles de OLYaV para el gen Hsp70 (Tomado de Essakhi et al., 2006) Al igual que el gen Hsp70, el gen de la proteína de la cápside mayor (CP) se ha
mostrado como un gen conservado dentro de la familia Closteroviridae (Rubio et al.,
1999). Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV) y Sweet potato chlorotic stunt
virus (SPCSV) dos Crinivirus mostraron baja diversidad genética para los genes Hsp70
y CP a diferencia de lo encontrado para CTV. La figura 18 muestra tres perfiles
diferentes encontrados en 68 aislados del virus CYSDV, confirmando la baja
variabilidad genética del gen de la proteína de la cápside para los crinivirus (Rubio et
al., 2001b).
Tomato clorosis virus (ToCV) otro miembro del género Crinivirus, mostró una mayor
variabilidad para el gen de la RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp) en
comparación a los genes Hsp70, CP y CPm; sin embargo al extrapolar la información
de la cadena nucleotidica a aminoácidos la mayoría de sustituciones encontradas en la
secuencia de este gen fueron sinónimas; el gen CP fue el mas conservado de los
genes evaluados esto explicado por la importancia para el virión de mantener la
46 estructura y estabilidad de la cápside viral (Lozano et al., 2009). Para CTV, el gen
CPm se comporta como un gen conservado según sus secuencias, pero pocas
diferencias en aminoácidos entre los aislados es de crucial importancia en la
configuración estructural de esta proteína para dar inicio a la encapsidación
(Satyanarayana et al., 2010). Estos estudios sugieren que las diferencias en
variabilidad están relacionadas con la función especifica de cada segmento genómico
(Lozano et al., 2009).
Figura 18. Perfiles del gen CP del virus CYSDV (Tomado de Rubio et al., 2001b) En el laboratorio de Virus Vegetales del Instituto de Biotecnología de la Universidad
Nacional de Colombia se llevó a cabo un estudio de la variabilidad viral de Potato
yellow vein virus (PYVV) con respecto al gen de la proteína de la cápside mayor (CP)
en 501 aislados de muestras foliares sintomáticas de Solanum tuberosum Grupo
Andígena y Phureja de diferentes departamentos productores de papa colombianos
por la técnica de SSCP (Guzmán et al., 2008, Rodríguez et al., 2009; Cubillos et al.,
2010). Como resultado se obtuvieron 7 perfiles distribuidos en 501 muestras de toda
Colombia, sugiriendo que en estas muestras habia baja variabilidad del gen CP en
PYVV al igual que en otros miembros de la misma familia. Una explicación de esta
baja variabilidad genética en PYVV podría ser que este virus es un virus reemergente
y de poco peso evolutivo en la fijación de variantes. Sin embargo, faltaría realizar
análisis sobre clones, secuencias y de otros genes para confirmar el número de
variantes (Cubillos et al., 2010).
47 5. Metodología
Figura 19. Tabla de flujo metodología 5.1 Material vegetal
El material vegetal fresco fue recolectado de cultivos de S. tuberosum Grupo Andígena
y Grupo Phureja del departamento de Nariño. Los muestreos se concentraron en
plantas con síntomas severos de PYVV (figura 19): 30 de S. tuberosum Grupo Phureja
(papa criolla) y 30 S. tuberosum Grupo Andígena de dos variedades (tabla 3). Las
muestras de material foliar se trasladaron en fresco al laboratorio de Virus Vegetales
del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN). En el
laboratorio, las muestras de hojas sintomáticas se maceraron con nitrógeno líquido y
se almacenaron a -20ºC hasta su utilización.
48 Figura 20. Material vegetal recolectado en Nariño sintomático severo para PYVV (Guzmán, 2008).
5.2 Aislado viral
La extracción de RNA doble banda (dsRNA) viral, se realizó a partir de las muestras
de hoja previamente pulverizadas, con fenol cloroformo (1:1) y posterior separación y
purificación del RNA por columnas de sephadex G50 (Guzmán et al., 2006) ver anexo
A. La numeración de los aislados virales fue consecutiva al trabajo del laboratorio de
Virus vegetales de la Universidad Nacional. En la tabla 3 se muestran la numeración y
el origen de los aislados.
Los extractos de RNA se emplearon para RT-PCR (reacción en cadena de la
polimerasa mediada por transcriptasa reversa) en dos tubos.
Tabla 3. Origen y listado de muestras Especie de
S. tuberosum
Municipio
Variedad
Puerres
Grupo Phureja
Ipiales
Pupiales
Grupo
Andígena
Pastusa suprema
Ipiales
Capiro
Aislado viral
484, 489, 498, 517, 560, 596,
597, 600
672, 674, 676, 711, 712, 715,
716
742, 751, 752, 753, 754, 756,
757, 789, 793, 797, 831, 832,
835, 836, 837
609, 610, 611, 612, 613, 614,
615, 616, 617, 618, 619, 620
621, 622, 623, 624, 625, 626,
627, 628, 629, 630, 631, 632,
633, 634, 635, 636, 637, 638
49 5.3 Diseño de “primers”
Se diseñaron “primers” específicos para amplificar los genes completos de las
proteínas de la cápside menor y Hsp70 y el 70% del gen de la cápside mayor de
PYVV, empleando secuencias reportadas en GenBank (accesiones NC_006061.1 y
NC_006063). De estas secuencias se seleccionaron las regiones que codifican para
estas proteínas y se diseñaron “primers” a través del programa PRIMER3. Con los
“primers” del gen de la CP se espera obtener un fragmento de 768 nucleótidos, para el
CPm 2025 nucleótidos y el gen Hsp70 de 1664 nucleótidos.
5.4 RT-PCR
Con los “primers” diseñados se realizaron las amplificaciones por RT-PCR usando
como molde el dsRNA según el protocolo establecido en el Laboratorio de Virus
Vegetales del IBUN (Guzmán et al., 1994; Guzmán et al., 2006, Guzmán, 2008), con
35 ciclos de amplificación. Posteriormente se hizo una separación electroforética en
gel de agarosa 1% en TBE 1X y se tiño con SYBR® Safe (Invitrogen). El corrido
electroforético se realizó a 70 voltios durante 45 minutos.
El cDNA se obtuvo por retrotranscripción del dsRNA viral, usando 20U/µl de
retrotranscriptasa reversa (MMLV Epicentre®) y 4U/µl de la proteína inhibidora de
RNAsas (RNAsin Fermentas®). Se utilizaron “primers” específicos para cada gen
(tabla 4).
Tabla 4. Secuencias de "primers" para PYVV Gen
Secuencias de los “primers”
CP
F2: 5’-3’ CTCGAGGATCCTCATGGAAATCCGATC
Coutts 3’: 5’-3’CTACTCAATAGATCCTGCTA
CPm CPm1: 5-3’ ATGGATAAGTCTG TTTTAGATG
CPm2: 5-3’ TCAAAAGTTTTGATTCACATTC
Fi 5’-3’ TCTCTCCAGATCAGGCCAAT
Hsp70 HSP-F517: 5-3’ TGCCCTCTATCTTCAATACCAG
HSP-R2323: 5-3’ CACTTCAAAAATTATCCTACAAAGTGA
En la reacción de retrotranscripción se usaron los “primers reverse” para cada gen.
Las condiciones de la reacción se muestran en el anexo B.
50 Las condiciones de la PCR para los tres pares de “primers” fueron optimizadas con 2.5
U/µl de la enzima Biolasa (Taq Polimerasa Bioline®), teniendo en cuenta:
temperaturas de alineamiento y tiempos de extensión según la longitud de los
amplicones. La reacción de PCR de las 60 muestras para los tres genes fue llevada a
cabo con mezcla de enzimas: 3.75U/µl de Accuzyme con actividad proofreading
(Bioline®) y 1.875 U/µl de Biolasa (Taq Polimerasa Bioline®). La amplificación de cada
gen se realizó en reacciones separadas para cada aislamiento. Las condiciones de
amplificación y perfiles térmicos se muestran en el anexo B.
Los amplicones obtenidos de los genes CPm (2024nt) y Hsp70 (1664nt) fueron
digeridos con enzimas de restricción para la obtención de fragmentos cortos que
permiten mayor resolución en la técnica SSCP. Las enzimas de restricción fueron
elegidas según el análisis con el programa NebCutter (New England Biolabs Inc)
Anexo C. El gen Hsp70 se digirió con EcoRI con un sitio de restricción en 924nt. El
gen de la CPm fue digerido con la enzima BstYI con tres sitios de corte (636nt, 1164nt
y 1786nt) (anexo C). La digestión se llevó a cabo durante 4 horas a 37ºC. Los
productos digeridos fueron observados en geles de agarosa 4% TBE 1X y teñidos con
SYBR® safe (Invitrogen) para confirmar los fragmentos producidos. El corrido
electroforético se realizó a 70 voltios durante 45 minutos.
5.5 Análisis de variabilidad por SSCP
Los productos de PCR fueron purificados con el kit Wizard® SV Gel and PCR CleanUp System de Promega (Anexo D) y cuantificados por QubitTM dsDNA HS de
Invitrogen (Anexo E). Del producto de PCR se tomaron 3 µl (aproximadamente 6 ng/µl)
y se mezclaron con 7µl de buffer denaturante (formamida al 95%, EDTA 20mM,
xilencianol y azul de bromofenol al 0.05%), y se denaturaron por ebullición (92°C por
10 min y 10 minutos en hielo). Las muestras fueron separadas por electroforesis en
poliacrilamida (acrilamida-bisacrilamida al 8%) (29:1) en condiciones no denaturantes,
por 4 horas (gen CP), 4 horas y media (gen Hsp70) y tres horas (gen CPm) a 200
voltios constantes a 4ºC (Rubio et al., 1996; Guzmán et al., 2006 b). La tinción se
realizó con nitrato de plata siguiendo el protocolo de Beidler et al., 1982, con
modificaciones (anexo F). Se utilizaron marcadores de peso de DNA que permitieron
tener un parámetro de migración más no de peso en cada corrida electroforética.
51 Se analizaron los perfiles de SSCP para cada gen por presencia-ausencia y número
de bandas indicadoras de la variabilidad intra e inter aislados, a través del programa
Quantiti one 4.1 (Anexo G). Se nombraron los perfiles para el gen CP con números
(1,2,3, etc..), Hsp70 con letras (A,B,C, etc…) y CPm con números romano (I, II, III,
etc…).
Los criterios para definir perfiles simples y complejos para cada gen, dependió del
número posible de fragmentos que se puedan presentar en el corrido electroforético,
es decir para el gen CP la presencia de 2 bandas o menos, referidas al gen
denaturado indicaría un perfil simple. Para Hsp70 un perfil simple correspondería a 4
bandas o menos por los 2 fragmentos denaturados obtenidos de la digestión y para el
gen CPm un perfil simple se detectó por la presencia de 8 bandas o menos dadas por
los 4 fragmentos obtenidos denaturados después de la digestión con BstY. Aquellos
aislados con perfiles diferentes fueron seleccionados para secuenciación.
5.6 Secuenciación
Se realizó secuenciación directa (MACROGEN-USA) de los productos de PCR
purificados de los genes amplificados (CP, CPm, Hsp70) provenientes de cada
hospedero y seleccionados por tener diferentes perfiles de SSCP. El número de
muestras secuenciadas por gen dependió del número de perfiles encontrados por
SSCP. Para la secuenciación se utilizaron los mismos pares de “primers” de la
amplificación, sin embargo para obtener secuencias completas del gen CPm se añadió
una tercera reacción con un “primer” interno: Fi 5’-3’ TCTCTCCAGATCAGGCCAAT.
En total se obtuvieron 34 secuencias: 18 del Grupo Phureja y 16 del Grupo Andígena.
Las secuencias fueron analizadas por BLAST (Gertz, 2005) para confirmar su similitud
con PYVV. El ensamblaje de las secuencias consenso se realizó mediante el
programa Lasergene (DNAStar) y los alineamientos múltiples y los dendogramas de
las secuencias nucleótidicas y de aminoácidos con Muscle y SeaView (Gouy et al.,
2010). Posteriormente se utilizó el programa Mega 5 (Tamura et al., 2011) que
permitió obtener la relación entre cambios sinónimos y no sinónimos de nucleótidos y
evaluar el tipo se selección para cada gen (Nei and Gojobori, 1986).
Para la construcción de dendogramas se usaron modelos recomendados por los
programas FindModel (Posada and Crandall, 2001) para nucleótidos y ProtTest
52 (Abascal et al., 2005) para aminoácidos. Los modelos usados fueron GTR
(Generalised time-reversible) y JTT para la evaluación de las sustituciones en las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos respectivamente.
53