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Detección y cuantificación del
Potato yellow vein virus (PYVV) en
aislamientos de diferentes órganos
de Solanum tuberosum Grupo
Phureja
Anngie Katherine Hernández Guzmán
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Departamento de Ciencias Fisiológicas
Maestría en Bioquímica
Bogotá, Colombia
2012
Detección y cuantificación del
Potato yellow vein virus (PYVV) en
aislamientos de diferentes órganos
de Solanum tuberosum Grupo
Phureja
Anngie Katherine Hernández Guzmán
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de: Magister en Bioquímica
Directora:
M. Sc., Ph.D. María Mónica Guzmán Barney
Docente Asociado
Coordinadora del Laboratorio de Virus Vegetales
Instituto de Biotecnología
Universidad Nacional de Colombia
Línea de Investigación
Virus Vegetales
Grupo de Investigación:
Biología Molecular de Virus
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Departamento de Ciencias Fisiológicas
Maestría en Bioquímica
Bogotá, Colombia
2012
A Dios por haberme permitido llegar hasta
este punto.
A
mi
querida
madre,
a
quien
amo
profundamente, por haberme brindado su
comprensión y apoyo incondicional sin el cual
no habría sido posible alcanzar esta meta,
por sus consejos que me orientaron a tomar
las mejores decisiones y por creer en mí.
Agradecimientos
A mi familia por su afecto y consejos.
A la Universidad Nacional de Colombia, al programa de Bioquímica de la Facultad de
Medicina y a los docentes de la Maestría: Dr. Carlos Guerrero, Dr. Alberto Gómez y al Dr.
Orlando Acosta por el proceso de formación durante esta etapa académica.
Debo agradecer de manera especial a la Doctora Mónica Guzmán por todas sus
enseñanzas, la dirección de este trabajo y por todo el apoyo brindado durante este
proceso.
A la doctora Liliana Franco por su amplia colaboración y aportes que fueron muy valiosos
para este trabajo.
Al doctor Jorge Evelio Angel y al Profesor Carlos Ñustez por la evaluación de este
trabajo, y los aportes realizados.
A Carlos Fabián Gordillo, por haberme acompañado durante este proceso, por ser mi
motivación e inspiración para alcanzar esta meta.
A Angela Villamil, por la gran amistad que me brindó, por sus aportes, enseñanzas y
acompañamiento durante este proceso.
A Karen Cubillos, por estar a mi lado apoyándome, por los consejos recibidos y por
brindarme una bonita amistad.
A Rafael Guerrero, por su colaboración y solidaridad.
VIII
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de
diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
A Lorena Vargas y Juan Esteban Cruz por su colaboración.
A Carlos Barragán por su colaboración en los ensayos de transmisión.
A Patricia Rodríguez, por su amistad y enseñanzas.
A Patricia Liévano por su valiosa colaboración y generosidad.
Al Instituto de Biotecnología, a Rocio Oliveros, Germán Bautista, Alejandra Cuellar,
Miriam Beltrán, Yurleidy Güaldrón, Andrés Castillo y Germán Orjuela por toda la
contribución en el desarrollo de este proyecto.
A cada una de las personas que de una u otra manera contribuyeron y estuvieron
pendientes de mi trabajo de grado.
Al Laboratorio de Biología Molecular de Plantas del Instituto de biotecnología por el
préstamo del equipo de PCR en tiempo real.
Al Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Biotecnología por la producción de
las plántulas in vitro
A la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia, por permitirme
realizar algunos ensayos en el invernadero.
A Colciencias y a la División de Investigaciones de Bogotá por la financiación de este
trabajo (Proyectos: 202010016358 y 201010018595-302010103).
Resumen y Abstract
IX
Resumen
Potato vein yellow virus (PYVV) es un virus reemergente que infecta a la especie
Solanum tuberosum en algunos países andinos causando pérdidas importantes en la
producción. El virus ha sido detectado por RT-PCR convencional y en sólo dos
ocasiones se ha reportado el uso de PCR en tiempo real para el diagnóstico del virus. No
existen estudios sobre la distribución y acumulación de PYVV en diferentes órganos de
una planta infectada, por lo tanto no se sabe si la distribución del virus en plantas
infectadas es homogénea ó heterogénea. Teniendo en cuenta lo anterior el objetivo del
presente trabajo fue evaluar la distribución y acumulación viral del PYVV en muestras de
tubérculos y otros órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja variedad
Criolla Colombia infectadas con el virus.
Se hizo cuantificación absoluta utilizando la técnica de RT-PCR en tiempo real (qRTPCR) con Sondas TaqMan® la cual requiere tener un RNA de buena calidad y cantidad,
por lo tanto inicialmente se hizo una evaluación de tres métodos de extracción para el
aislamiento de RNA a partir de diferentes órganos de plantas de S. tuberosum Grupo
Phureja Variedad Criolla Colombia infectadas con el virus (foliolo, peciolo, tallo,
pedúnculo floral, antera, pétalo, raíz y brote de tubérculo). La evaluación se hizo en
términos del rendimiento, radio de las absorbancias 260/280nm, radio de la intensidad de
las bandas de las subunidades ribosomales 28S/18S, y la amplificación del gen de la
proteína mayor de la cápside (CP) de PYVV; los métodos evaluados fueron: Trizol®
(Invitrogen), fenol:cloroformo seguido de purificación con Sephadex y un método basado
en CTAB. Aunque con los tres métodos se logró la detección del virus en los diferentes
órganos evaluados, los resultados sugirieron que Trizol® (Invitrogen) era el mejor método
para la extracción de RNA a partir de diferentes órganos, debido a que este presentó la
mayor probabilidad de obtener un mayor rendimiento y relación 260/280nm, y se logró la
detección del virus por RT-PCR en un mayor número de muestras que con los otros dos
métodos de extracción.
X
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de
diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Posteriormente se analizó la acumulación del virus en diferentes órganos de plantas de
S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas por transmisión con el
vector natural, en donde PYVV presentó una distribución homogénea en plantas que no
expresaban síntomas de amarillamiento, mientras que las plantas que expresaron
síntomas de amarillamiento presentaron una distribución diferencial (heterogénea) entre
la zona aérea y la zona radical (con mayor acumulación en la zona aérea). En tubérculos
el virus también se distribuye heterogéneamente cuando las muestras provienen de
plantas que no expresan síntomas.
Es la primera vez que se detecta PYVV en muestras de diferentes órganos de plantas
infectadas. La información presentada en este trabajo puede resultar interesante para el
conocimiento del virus (distribución del virus en el hospedero) y puede ser importante en
programas de fitomejoramiento, indexado de plantas contra PYVV, programas de
cuarentena y certificación de semillas libres de virus.
Palabras clave: PYVD, distribución, RT-PCR en tiempo real, RT-PCR, Sondas
TaqMan®, Cuantificación absoluta, diferentes órganos.
Resumen y Abstract
XI
Abstract
Detection and quantification of Potato yellow
vein virus (PYVV) in isolates of different organs
of Solanum tuberosum Grupo Phureja
Potato yellow vein virus (PYVV) is a re-emerging virus that infects the specie Solanum
tuberosum in some Andean countries causing significant losses in production. The virus
has been detected by conventional RT-PCR and in only two cases have been reported
using real-time RT-PCR for the diagnosis of the virus. There is not studies on the
distribution and accumulation of PYVV in different organs of a plant infected, therefore, it
is not known if the distribution of the virus in infected plants is homogeneous or
heterogeneous. Considering the above, the aim of this study was to evaluate the
distribution and accumulation of PYVV in tubers and other plant organs of Solanum
tuberosum Group Phureja variety Criolla Colombia infected with the virus.
Absolute quantification was made using real time RT-PCR technique (qRT-PCR) with
TaqMan® probes which requires having a good RNA quality and quantity, Initially was
made an evaluation of three methods for RNA extraction from various organs of plants S.
tuberosum Group Phureja cultivar Colombia Criolla infected with the virus (leaflet, petiole,
stem, peduncle, anther, petal, root and tuber shoot). Evaluations were made in terms of
yield, ratio of 260/280nm absorbance, radio of intensity bands of ribosomal subunits
28S/18S, and the amplification of gene major capsid protein (CP) of PYVV. The
evaluated methods were: Trizol ® (Invitrogen), phenol: chloroform followed by purification
with Sephadex and a CTAB-based method. Although all three methods are able to detect
the virus in different organs evaluated, the results suggested that Trizol ® (Invitrogen)
was the best method for extracting RNA from different organs, because this had the
highest probability of obtain a higher yield and 260/280nm ratio, and detection was
achieved by RT-PCR virus in a greater number of samples than the other two methods of
extraction.
Subsequently, the virus accumulation was analyzed in different organs of plants S.
tuberosum Group Phureja cultivar Criolla Colombia infected by transmission using the
natural vector. A homogeneous distribution of PYVV was presented in plants not
expressing symptoms of yellowing, while plants pexressin yellowing symptoms showed
XII
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de
diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
differential distribution (heterogeneous) between the aerial zone and the radical zone
(with higher accumulation in the aerial zone). In tubers the virus was also distributed
heterogeneously in samples from plants that do not express symptoms.
It is the first report of detection of PYVV in samples from different organs of infected
plants. The information presented in this paper could be interesting for increase the
knowledge of the virus (virus distribution in the host) and could be important in breeding
programs, indexed plants against PYVV, quarantine programs, and certification of virusfree seed.
Keywords: PYVD, distribution, Real time RT-PCR, RT-PCR, TaqMan® proof, Absolute
quantification, different organs.
Contenido
XIII
Contenido
Resumen ....................................................................................................................... IX
Lista de Figuras ......................................................................................................... XVIII
Lista de tablas .............................................................................................................. XX
Lista de abreviaturas................................................................................................... XXI
Introducción .................................................................................................................... 1
1.
Justificación ............................................................................................................. 3
2.
Hipótesis ................................................................................................................... 5
3.
Objetivos ................................................................................................................... 7
3.1
Objetivo general............................................................................................... 7
3.2
Objetivos específicos ....................................................................................... 7
4.
Marco teórico ............................................................................................................ 9
4.1
El cultivo de la papa ......................................................................................... 9
4.1.1
Plagas y enfermedades de la papa criolla ........................................... 10
4.2
PYVV (Potato yellow vein virus)..................................................................... 12
4.2.1
Clasificación Taxonómica .................................................................... 12
4.2.2
Síntomas causados por PYVV ............................................................ 13
4.2.3
Transmisión de PYVV ......................................................................... 15
Transmisión por tubérculo ............................................................................. 15
Transmisión mecánica y por injerto................................................................ 16
Transmisión por vector natural, mosca blanca (T. vaporariorum)................... 16
4.2.4
Genoma .............................................................................................. 18
D-RNAs (RNAs Defectivos) ...................................................................................... 20
4.2.5
Antecedentes: Estudios moleculares en PYVV ................................... 22
4.3
Extracción de RNA vegetal ............................................................................ 23
4.3.1
Ruptura del tejido y extracción ............................................................ 24
4.3.2
Precipitación diferencial del RNA ........................................................ 25
4.4
RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR) ............................................................... 25
4.4.1
Cuantificación ..................................................................................... 26
Umbral ........................................................................................................... 26
Cuantificación Absoluta y relativa .................................................................. 27
Químicas utilizadas en qPCR ........................................................................ 30
4.4.2
RT-PCR en tiempo real para el estudio de virus en el cultivo de la papa.37
XIV
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de
diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
5.
Metodología, Resultados y Discusión ...................................................................41
5.1
Resumen de la metodología del objetivo 1. ....................................................42
5.2
Resúmen de la metodología del objetivo 2 .....................................................43
5.3
Resúmen de la metodología del objetivo 3 .....................................................44
6.
Artículo 1. ................................................................................................................45
Resumen ..................................................................................................................45
6.1
Introducción....................................................................................................46
6.2
Materiales y Métodos .....................................................................................48
6.2.1
Material vegetal y aislados virales........................................................48
6.2.2
Evaluación de los protocolos de extracción de RNA ............................48
Métodos de extracción de RNA ......................................................................49
Determinación de la concentración y evaluación de la calidad de los extractos
|
de RNA ..........................................................................................................50
Determinación de la integridad de los extractos de RNA ................................50
Síntesis de cDNA ...........................................................................................50
PCR ...............................................................................................................51
6.2.3
Análisis Estadísticos ............................................................................51
6.3
Resultados y Discusión ..................................................................................52
6.3.1
Rendimiento de la extracción de RNA, radio de la absorbancia
260/280nm y radio de la intensidad de las subunidades ribosomales 28S/18S. .52
6.3.2
Diferencias entre los tres métodos de extracción .................................57
Fase de extracción de ácidos nucleicos .........................................................58
Fase de precipitación de RNA ........................................................................58
6.3.3
Relación entre calidad, integridad y rendimiento ..................................60
6.3.4
. RT-PCR del gen CP de PYVV ...........................................................62
Agradecimientos .......................................................................................................66
Referencias...............................................................................................................66
7.
Artículo 2 .................................................................................................................69
Resúmen ..................................................................................................................69
7.1
Introducción....................................................................................................70
7.2
Materiales y Métodos .....................................................................................71
7.2.1
Material vegetal y aislados virales........................................................71
Plantas de S. tuberosum Grupo Phureja (papa criolla) infectadas con PYVV .71
Plantas de S. tuberosum Grupo Phureja libres de virus..................................72
7.2.2
Transmisión de PYVV por vector natural T. vaporariorum (Westwood) 72
Cria de mosca blanca .....................................................................................72
Obtención del vector virulífero ........................................................................72
Ensayos de transmisión .................................................................................72
7.2.3
Extracción de RNA ..............................................................................73
Extracción de RNA del vector natural .............................................................73
Extracción de RNA vegetal .............................................................................73
7.2.4
Detección de PYVV por RT-PCR y qPCR ............................................74
Síntesis de cDNA ...........................................................................................74
PCR ...............................................................................................................74
PCR en tiempo real ........................................................................................75
Curva estándar para la cuantificación absoluta ..............................................76
7.2.5
Análisis Estadísticos ............................................................................77
7.3
Resultados .....................................................................................................78
7.3.1
Transmisión de PYVV utilizando el vector natural ................................78
Contenido
XV
7.3.2
Detección del gen CP de PYVV por RT – PCR convencional en
muestras de diferentes órganos de plantas transmitidas con PYVV por vector
natural 79
7.3.3
PCR en tiempo real en diferentes órganos de plantas transmitidas con
PYVV por vector natural .................................................................................... 81
7.3.4
Estimación del número de copias del gen CP de PYVV ...................... 82
7.3.5
Acumulación de PYVV en diferentes órganos de plantas con diferente
grado de intensidad de la expresión de síntomas .............................................. 84
7.4
Discusión ....................................................................................................... 87
Agradecimientos ...................................................................................................... 92
Referencias .............................................................................................................. 92
8.
Artículo 3................................................................................................................. 97
Resúmen .................................................................................................................. 97
8.1
Introducción ................................................................................................... 98
8.2
Materiales y Métodos ................................................................................... 100
8.2.1
Muestras de brotes de tubérculo y controles ..................................... 100
8.2.2
Extracción de RNA ............................................................................ 100
8.2.3
Pruebas basadas en PCR ................................................................. 100
Síntesis de cDNA......................................................................................... 100
PCR ............................................................................................................. 101
PCR en tiempo real ..................................................................................... 101
Curva estándar para la cuantificación absoluta ............................................ 103
8.2.4
Análisis Estadísticos ......................................................................... 104
8.3
Resultados................................................................................................... 104
8.3.1
RT – PCR y qPCR en muestras de brotes de tubérculo .................... 104
8.3.2
Estimación del número de copias del gen CP de PYVV en muestras de
brote de tubérculo ........................................................................................... 105
8.3.3
Acumulación de PYVV en brotes de tubérculo provenientes de plantas
sintomáticas y no sintomáticas ........................................................................ 107
8.4
Discusión ..................................................................................................... 109
Agradecimientos .................................................................................................... 112
Referencias ............................................................................................................ 112
9.
Conclusiones y recomendaciones ...................................................................... 115
9.1
Conclusiones ............................................................................................... 115
9.2
Recomendaciones ....................................................................................... 117
Anexo A: Métodos de extracción de RNA ................................................................. 119
Anexo A.1: Extracción de RNA total con Trizol® (Invitrogen) .................................. 119
Anexo A.1.1 Extracción: .................................................................................. 119
Anexo A.1.2 Precipitación de RNA: ................................................................. 119
Anexo A.2: Extracción de RNA total con CTAB (López et al., 2006) ....................... 120
Anexo A.2.1 Composición de buffers:.............................................................. 120
Anexo A.2.2 Extracción: .................................................................................. 120
Anexo A.2.3 Precipitación: .............................................................................. 121
Anexo A.3: Extracción de dsRNA con fenol:cloroformo/Sephadex (Guzmán et al.,
2006) 121
Anexo A.3.1 Composición de buffers:.............................................................. 121
Anexo A.3.2 Extracción: .................................................................................. 122
Anexo A.3.3 Purificación con columnas de Sephadex: .................................... 122
XVI
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de
diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Anexo A.4: SV Total RNA Isolation System (Promega) ...........................................123
Anexo B: Cuantificación de RNA ................................................................................125
Anexo B.1: Cuantificación de RNA utilizando el kit Quant-iTTM RiboGreen Assay
(Invitrogen)..............................................................................................................125
Anexo B.2: Cuantificación de RNA por espectrofotometría a 260nm.......................125
Anexo C: Estimación de la integridad de RNA ..........................................................127
Anexo C.1 Gel de agarosa denaturante ..................................................................127
Anexo C.1.1: Composición de buffers ..............................................................127
Anexo C.1.2: Preparación del gel de agarosa denaturante ..............................127
Anexo C.1.3: Denaturación de RNA .................................................................127
Anexo C.1.4: Cargar las muestras y correr la electroforesis .............................128
Anexo C.2: Determinación de la intensidad de las bandas para la estimación de la
integridad del RNA ..................................................................................................128
Anexo D. Reacciones de Amplificación .....................................................................129
Anexo D.1: Primers y sondas ..................................................................................129
Anexo D.2: Retrotranscripción ................................................................................129
Anexo D.3: PCR .....................................................................................................130
Anexo D.4: qPCR....................................................................................................130
Anexo E. Transcripción in vitro ..................................................................................133
Anexo E.1: Linearización del plásmido....................................................................133
Anexo E.2: Purificación del plásmido linearizado ....................................................134
Anexo E.3: Transcripción in vitro.............................................................................135
Anexo E.4: Purificación de los transcritos ...............................................................135
Anexo E.5: Tratamiento de los transcritos con DNasa I ..........................................135
Anexo F. Resultados artículo 1. ..................................................................................137
Anexo F.1: Determinación del rendimiento de los extractos de RNA.......................137
Anexo F.2: Determinación de la calidad de los extractos de RNA y Resultados de
RT-PCR ..................................................................................................................141
Anexo F.3: Determinación de la integridad de los extractos de RNA.......................146
Anexo F.5: Resúmen de resultados ........................................................................151
Anexo F.6: Resultados análisis estadísticos ...........................................................151
Anexo F.6.1: Comparaciones entre métodos de extracción de RNA por órgano151
Anexo F.6.2: Efecto del órgano, el método de extracción y la interacción del
órgano con el método de extracción en el rendimiento, calidad e integridad ....153
Anexo G. Resultados artículo 2. .................................................................................155
Anexo G.1: Determinación del número de copias del gen CP de PYVV ..................155
Anexo G.2: Resumen de resultados........................................................................159
Anexo G.3: Resultados análisis estadísticos ...........................................................160
Anexo G.3.1: Comparación para evaluar el efecto del número de copias en RTPCR
160
Anexo G.3.2: Comparación para evaluar la acumulación de PYVV en plantas
con diferente grado de intensidad de la expresión de síntomas .......................160
Anexo G.3.3: Comparación para evaluar diferencias en el número de copias
entre plantas con diferente grado de intensidad de expresión de síntomas .....161
Anexo G.3.4: Comparaciones entre órganos por planta ...................................161
Contenido
XVII
Anexo H. Resultados artículo 3. ................................................................................. 163
Anexo H.1: Determinación del número de copias del gen CP de PYVV en muestras
de brote de tubérculo. ............................................................................................ 163
Anexo H.2: Resumen de resultados ....................................................................... 170
Anexo I. Presentaciones en congresos ..................................................................... 171
Anexo I.1: Resúmen presentación en el IV Simposio Nacional de Virología. Red
Colombiana de Virología. Medellín, Colombia. 2011. ............................................. 171
Anexo I.2: Resumenes de presentaciónes en el XXV Congreso de la Asociación
Latinoamericana de la Papa ALAP, Uberlandia, Brasil, 2012 ................................. 173
Bibliografía .................................................................................................................. 177
Lista de Figuras
XVIII
Lista de Figuras
Pág.
Figura 4-1. S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia. ................................ 9
Figura 4-2. Micrografía electrónica de partículas virales de PYVV. ................................. 12
Figura 4-3. Clasificación de la familia Closteroviridae. .................................................... 12
Figura 4-4. Sintomatología causada por PYVV ............................................................... 14
Figura 4-5. Formación de cuerpos de inclusión ............................................................... 15
Figura 4-6. Transmisión de PYVV a través de tubérculo ................................................. 15
Figura 4-7. Representación esquemática de los modos de transmisión por los vectores.16
Figura 4-8. T. vaporariorum (Mosca Blanca). .................................................................. 17
Figura 4-9. Distribución geográfica de PYVV, ................................................................. 18
Figura 4-10. Esquema representativo de la estructura genómica de PYVV .................... 19
Figura 4-11. Esquema representativo de la estructura de los D-RNAs de PYVV ............ 21
Figura 4-12. Modelo de la estructura secundaria para el UTR 3’ de los RNAs genómicos
de PYVV. ........................................................................................................................ 22
Figura 4-13 Cinética de la reacción de PCR en tiempo real. ........................................... 27
Figura 4-14. Curva estándar para la hacer cuantificación absoluta. ................................ 28
Figura 4-15. Cuantificación relativa ................................................................................. 29
Figura 4-16: Química de detección de SYBR® Green I.................................................... 30
Figura 4-17. Química de detección con Sondas TaqMan® ............................................. 31
Figura 4-18. Estructura de un molecular beacon.. ........................................................... 32
Figura 4-19. Hybridization probes ................................................................................... 33
Figura 4-20. Eclipse Probes ............................................................................................ 33
Figura 4-21. Amplifluor assay.......................................................................................... 34
Figura 4-22. Scorpions primers. ...................................................................................... 35
Figura 4-23. LUX primers. ............................................................................................... 36
Figura 4-24. QZyme primers. .......................................................................................... 37
Figura 5-1. Esquema representativo primer objetivo. ...................................................... 42
Figura 5-2. Esquema representativo segundo objetivo.................................................... 43
Figura 5-3. Esquema representativo tercer objetivo. ....................................................... 44
Figura 6-1. A. Distribución del rendimiento de RNA ........................................................ 54
Figura 6-2. Gel denaturante de agarosa 1%. .................................................................. 55
Figura 6-3. Gráficos del análisis de componentes principales. ........................................ 61
Figura 6-4. RT-PCR del gen de la proteína mayor de la cápside .................................... 62
Figura 6-5. Porcentaje de muestras RT-PCR positivas y RT-PCR negativas. ................. 63
Figura 7-1. Detección del gen de la proteína mayor de la cápside de PYVV por RT-PCR.
....................................................................................................................................... 79
Contenido
XIX
Figura 7-2. Porcentaje de muestras RT-PCR positivas y RT-PCR negativas ................. 80
Figura 7-3. Curvas de amplificación obtenidas con la pareja de primers para COX. ....... 82
Figura 7-4. Curva estándar construida para la determinación del número de copias del
gen CP.. ......................................................................................................................... 83
Figura 7-5. Curvas de amplificación obtenidas con la pareja de primers para el gen de la
proteína mayor de la cápside de PYVV. ......................................................................... 84
Figura 7-6. Resultados de PCR en tiempo real para evaluar la acumulación del virus ... 85
Figura 7-7. Distribución de la carga viral en tres plantas con diferente grado de intensidad
de síntomas (No sintomático, Moderado y Severo). ....................................................... 86
Figura 8-1 .RT-PCR con la pareja de primers para la detección de la proteína mayor de la
cápside de PYVV ..........................................................................................................105
Figura 8-2. Estimación de la carga viral de PYVV en muestras de brotes de tubérculo. 106
Figura 8-3. Curvas de amplificación de brotes de tubérculo derivados de plantas
sintomáticas y no sintomáticas. .....................................................................................107
Lista de Tablas
XX
Lista de tablas
Pág.
Tabla 4-1: Genes codificados por PYVV y su posible función ......................................... 20
Tabla 5-1. Artículos planteados para la presentación de metodología, resultados y
discusión. ........................................................................................................................ 41
Tabla 6-1 Muestras utilizadas para hacer la evaluación de los métodos de extracción por
órgano ............................................................................................................................ 49
Tabla 6-2. Primers para la amplificación del gen completo de la proteína mayor de la
cápside de PYVV. ........................................................................................................... 51
Tabla 6-3. Resúmen de resultados de los parámetros evaluados para cada método de
extracción ....................................................................................................................... 53
Tabla 6-4. Efecto del órgano, método de extracción de RNA y su interacción en el
rendimiento, calidad e integridad .................................................................................... 57
Tabla 6-5. Diferencias entre los tres métodos de extracción ........................................... 57
Tabla 7-1. Muestras analizadas para evaluar la acumulación del virus en diferentes
órganos de plantas infectadas ........................................................................................ 74
Tabla 7-2. Primers para la amplificación del gen completo de la proteína de la cápside de
PYVV. ............................................................................................................................. 75
Tabla 7-3. Secuencias de los primers y sondas que se utilizaron en los ensayos de qPCR
....................................................................................................................................... 76
Tabla 7-4. Valores de p del contraste entre los órganos de la planta con sintomatología
moderada. Las celdas en negrilla corresponden a las parejas que presentaron diferencias
estadísticamente significativas (p<0.05). ......................................................................... 86
Tabla 7-5. Valores de p del contraste entre los órganos de la planta con sintomatología
severa. Las celdas en negrilla corresponden a las parejas que presentaron diferencias
estadísticamente significativas (p<0.05). ......................................................................... 86
Tabla 8-1. Muestras analizadas por RT-PCR y qPCR ................................................... 100
Tabla 8-2. Primers para la amplificación del gen completo de la proteína mayor de la
cápside de PYVV. ......................................................................................................... 101
Tabla 8-3. Secuencias de los primers y sondas que se utilizaron en los ensayos de qPCR
..................................................................................................................................... 102
Tabla 8-4. Comparaciones para evaluar la acumulación de PYVV en las muestras de
tubérculo. ...................................................................................................................... 108
Lista de Abreviaturas
XXI
Lista de abreviaturas
Abreviatura
APMoV
cDNA
CERV
CEVIPAPA
CIP
COX
CP
CPm
Ct
CTAB
CTV
CVMV
CV%
dpt
D-RNAs
DI-RNAs
EDTA
ES
Fedepapa
FRET
GLaV
gRNA
GTC
HEL
Hsp70h
IBUN
IMI
IVMV
LCV
LIYV
L-Pro
M
MADR
MMLV
MTR
MVBaV
NASH
NS
NS+
NS-
Término
Andean potato mottle virus
DNA complementaria
Carnation etched ring virus
Centro de Desarrollo Tecnológico de la Cadena Agroalimentaria de la
Papa
Centro Internacional de la Papa
Citocromo oxidasa
Proteína mayor de la cápside
Proteína menor de la cápside o divergente
Cycle threshold
Bromuro de hexadecil trimetil amonio
Citrus tristeza virus
Carnation vein mottle virus
Porcentaje del coeficiente de variación
Días post-transmisión
RNAs Defectivos
RNAs Defectivos Interferentes
Ácido etilendiaminotetraacético
Error estándar
Federación Colombiana de Productores de Papa
Fluorescence Resonance Energy Transference
Grapevine leafroll associated virus
RNA genómico
Isotiocinato de guanidina
Helicasa
Proteína homóloga a la proteina de choque térmico 70
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia
Inmunoimpresión de tejido
Ipomoea vein mosaic virus
Lettuce clorosis virus
Lettuce infectious yellows virus
Dominio Proteasa
Sintomatología Moderada
Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural
Moloney murine leukemia virus
Metiltransferasa
Mint vein banding associated virus
Nucleic acid spot hybridization
No sintomática
Planta no sintomática RT - PCR positivo
Planta no sintomática RT - PCR negativo
XXII
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de
diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Abreviatura
OD
OEPP-EPPO
ORF
PCR
PLRV
PMTV
PPIS
PPO
PVA
PVM
PVS
PVX
PVY
PYVD
PYVV
qPCR
RdRp
RFLPs
RT-PCR
S
S+
SSarkosyl
SDS
SPCSV
SPFMV
SPLCV
SSCPs
TICV
TRV
UMNG
Unal
USDA-APHIS
UTR
Término
Densidad óptica
European and Mediterranean Plant Protection Organization
Open reading frame
Reacción en cadena de la polimerasa
Potato leafroll virus
Potato mop top virus
Plant Protection and Inspection Services
Polifenol oxidasa
Potato virus A
Potato virus M
Potato virus S
Potato virus X
Potato virus Y
Potato yellow vein disease
Potato yellow vein virus
PCR en tiempo real
RNA polimerasa dependiente de RNA
Restriction Fragment Length Polymorphisms
Retrotranscripción seguida de la reacción en cadena de la polimerasa
Sintomatología Severa
Planta sintomática RT - PCR positivo
Planta sintomática RT - PCR negativo
Lauryl Sarcosyl de Sodio
Dodecil sulfato sódico
Sweet potato chlorotic stunt virus
Sweet potato feathery mottle virus
Sweet potato leaf curl virus
Single Strand Conformational Polymorphisms
Tomato infectious chlorosis virus
Tobacco rattle virus
Universidad Militar Nueva Granada
Universidad Nacional de Colombia
United States Department of Agriculture – Animal and Plant Health
Inspection Service
Región notraducible ó untranslated region
Introducción
PYVV o virus del amarillamiento de las nervaduras de la hoja de la papa, hace parte de la
familia Closteroviridae y es una especie del género Crinivirus (Martelli et al., 2011;
Livieratos et al., 2004). La enfermedad causada por este virus (PYVD, Potato yellow vein
disease) fue observada hacia los años 50 en Antioquia (Colombia) (Alba, 1950), pero con
el incremento de las poblaciones de su vector (Trialeurodes vaporariorum, Westwood)
(Buriticá, 1971) y del transporte indiscriminado de germoplasma, el virus se ha
dispersado en diferentes regiones de Colombia y en países vecinos como Venezuela,
Ecuador y Perú (Salazar et al., 2000). Este virus es re-emergente (Müller et al., 2004) y
puede ocasionar pérdidas en la producción que pueden ir desde 25% en Solanum
tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia (Guzmán et al., 2011) hasta un 50%
o más en el Grupo Andígena variedad Diacol Capiro (Salazar et al., 2000), por dicha
razón ha sido considerado un patógeno cuarentenario en Europa y Estados Unidos por
algunas agencias fitosanitarias como OEPP-EPPO (European and Mediterranean Plant
Protection Organization) y USDA - APHIS (United States Department of Agriculture Animal and Plant Health Inspection Service) (OEPP/EPPO, 1979; USDA – APHIS, 2000).
Salazar et al. (2000) reportaron los primeros estudios sobre la morfología de PYVV en
donde se encontró que el virus es filamentoso y limitado al floema y también realizaron
algunos análisis moleculares basados en NASH (Nucleic acid spot hybridization) y RTPCR (retrotranscripción – reacción en cadena de la polimerasa). La detección de este
virus por RT-PCR también ha sido reportada por Offei et al. (2004) y Guzmán et al.
(2012). La primera secuencia completa del virus fue obtenida por Livieratos et al. (2004)
indicando que PYVV tiene un genoma tripartita con RNA de cadena sencilla de sentido
positivo y más tarde Eliasco et al. (2006) encontró que el genoma también cuenta con
dos RNAs defectivos (D-RNAs).
Algunos estudios han informado la presencia de algunas plantas que no expresan
síntomas en las que por medio de técnicas moleculares se ha detectado la presencia del
2
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
virus en material foliar (Salazar et al., 2000; Arciniegas, 2003; CIP, 2003; Guzmán et al.,
2006; Vargas et al., 2010a; Guzmán y Rodríguez, 2010).
Hasta el momento no se ha estudiado si PYVV está presente en todos los órganos de la
planta, ni cómo es la distribución en plantas infectadas, siendo de especial interés
analizar cómo se distribuye PYVV en los tubérculos (semilla) de plantas infectadas,
debido a que este virus puede trasmitirse vegetativamente a partir de semilla, siendo este
uno de los factores que podría favorecer la dispersión de PYVV. Además se ha
observado que a partir de tubérculos (semilla) provenientes de plantas que expresan
síntomas se pueden obtener plantas que no expresan síntomas y viceversa (Salazar et
al., 2000; Guzmán y Rodríguez, 2010); aún es desconocida la razón por la que se puede
presentar este fenómeno, puede deberse a varios factores, se ha planteado que esto
puede ser debido a latencia viral o por resistencia, por lo tanto, a pesar de que estas
están infectadas por el virus no expresan síntomas (Salazar et al., 2000; Arciniegas,
2003; Vargas et al., 2010a); esto también podría ser explicado por una distribución
heterogénea del virus en los tubérculos lo que podría ser causa de que algunas plantas
provenientes de plantas sintomáticas puedan expresar síntomas mientras que otras no y
viceversa (Guzmán y Rodríguez, 2010). En el cultivo de papa esta situación es
impredecible y aumenta los riesgos de utilizar tubérculos-semilla infectados y sus
posteriores efectos para la producción.
Hasta el momento no existen estudios sobre la distribución de PYVV en diferentes
órganos por lo que la propuesta del presente proyecto es analizar foliolos, flores, raíz,
tallo, pedúnculo floral, pétalos, peciolo, antera y brotes de tubérculo provenientes de
plantas de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas con el virus
para lo cual se utilizó la técnica de qRT-PCR.
La técnica de qRT-PCR para la detección de PYVV fue reportada inicialmente por López
et al. (2006) para la detección del virus en muestras de foliolo y Hernández et al. (2010)
la adaptaron preliminarmente para la detección de PYVV en muestras de brotes de
tubérculo. Por lo tanto, con este trabajo además de determinar cómo es la distribución del
virus en diferentes órganos de las plantas infectadas, se busca proporcionar información
sobre el uso de qRT-PCR para estudios de detección de PYVV, información que resulta
útil en programas de fitomejoramiento, certificación de semillas y en programas de
indexación.
1. Justificación
El cultivo de la papa es un alimento muy popular no sólo en este país si no en todo el
mundo formando parte fundamental de la alimentación a nivel mundial. En el 2011 el
cultivo se ubicó en el sexto lugar a nivel de producción nacional, y a pesar de que solo
una pequeña parte de la producción de papa entra en el comercio internacional y el
consumo interno se ha reducido durante los últimos años, es una actividad agropecuaria
que genera ingresos y empleos en varias regiones de este país, incluyendo
aproximadamente 90.000 familias que se benefician de las labores del cultivo (MADR,
2011).
Este cultivo se ha visto afectado por varios patógenos, dentro de los que se encuentran
algunos virus re-emergentes como PYVV (Müller et al., 2004) el cual es endémico de
Colombia (Salazar et al., 2000). Debido a la gran importancia de este cultivo en este país
y en la región Andina, además del efecto sobre la reducción de la productividad que tiene
PYVV en plantas infectadas (Salazar et al., 2000), es importante continuar con estudios
sobre este virus para aportar al conocimiento en algunos aspectos hasta el momento no
informados en la literatura científica, como es la distribución del virus en la planta.
Salazar et al. (2000) y Guzmán et al. (2011) han reportado la presencia de plantas no
sintomáticas derivadas de tubérculos de plantas sintomáticas. Por otro lado, López et al.
(2006) han sugerido que es posible que la distribución del virus en los tubérculos pueda
ser heterogénea, lo cual también podría presentarse en los demás órganos de plantas
infectadas.
Teniendo en cuenta que el virus está limitado al floema, se transmite vegetativamente de
manera masiva a través de tubérculo (semilla) y por vector natural (T. vaporariorum)
(Salazar et al., 2000), además de que se ha informado la presencia del virus en algunas
plantas que no expresan síntomas (Salazar et al., 2000; Franco-Lara et al,. 2009;
Guzmán et al., 2011; 2012), surge la pregunta de cómo es la distribución (homogénea o
heterogénea) del PYVV en muestras de semilla y en los diferentes órganos de una planta
4
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
infectada. Por tal razón, la propuesta del presente proyecto es analizar la acumulación de
PYVV utilizando la técnica qRT-PCR en aislamientos virales de muestras de foliolo,
peciolo, pedúnculo floral, antera, pétalo, tallo, flor, y tubérculo (diferentes brotes de un
tubérculo) provenientes de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla
Colombia infectadas con PYVV.
Para cumplir con el objetivo se utilizó la técnica de qRT-PCR la cual permite hacer una
estimación precisa de la acumulación del virus en diferentes órganos de las plantas
infectadas, lo que no se logra con otras técnicas que son cualitativas (RT - PCR,
hibridaciones, secuenciación). Estudios que reporten el uso de esta técnica en PYVV son
escasos, (López et al., 2006; Hernández et al., 2010) y se ha utilizado con fines de
detección. En este trabajo se propone usar qRT-PCR como una herramienta útil en la
detección y en estudios sobre aspectos biológicos del virus, como por ejemplo, la
acumulación del virus dentro de plantas infectadas, la dispersión viral a partir de semillatubérculo (transmisión vegetativa) y a través del vector natural. Además permite hacer la
detección de cargas virales bajas en diferentes órganos de plantas infectadas con el
virus, y en plantas que no expresan síntomas.
La información resultante es de interés para seleccionar órganos en procesos de
diagnóstico viral, para apoyar programas de cuarentena, programas de certificación de
semillas, de fitomejoramiento y para estudios de la biología y dinámica viral y de la
interrelación del virus con el hospedero y el vector.
2. Hipótesis
1. Es posible detectar PYVV en diferentes órganos de plantas de S. tuberosum
Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas con PYVV debido a que este
es limitado al floema (Salazar et al., 2000).
2. Algunos autores como Salazar et al. (2000) y Guzmán et al. (2011) han reportado
que a partir de plantas sintomáticas es posible obtener una progenie conformada
por plantas sintomáticas y no sintomáticas lo que sugiere que la distribución del
virus en tuberculos es heterogénea.
3. Las plantas de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas
con PYVV presentan una acumulación y distribución heterogénea del virus en
diferentes órganos de plantas infectadas.
3. Objetivos
3.1 Objetivo general
Evaluar la distribución y acumulación (carga viral) del PYVV en tubérculos y otros
órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas
con el virus.
3.2 Objetivos específicos
1. Comparar métodos de extracción de RNA viral en diferentes órganos de plantas
de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas con PYVV.
2. Determinar la carga viral de PYVV en un grupo de muestras de brotes de
tubérculos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia
infectadas con el virus.
3. Evaluar la distribución-carga viral de PYVV en diferentes órganos de plantas de S.
tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas con el virus.
4. Marco teórico
4.1 El cultivo de la papa
La papa (Solanum spp, Figura 4-1B) (Reino: Plantae¸ División: Magnoliópsida, Órden:
Solanales, Familia: Solanaceae, Género: Solanum), es originaria de América del Sur y
cultivada en todo el mundo por sus tubérculos comestibles (Estrada, 2000); este es uno
de los cultivos alimenticios que se ha venido expandiendo, en el año 2010 se ubicó como
el quinto alimento con mayor producción a nivel mundial después de la caña de azúcar,
maíz, arroz, y trigo (FAOSTAT, 2012).
Hacia 1990 la papa era producida y consumida en Europa, América del Norte y en los
países de la antigua Unión Soviética; desde entonces se ha incrementado la producción
y demanda de papa en otras regiones como Asia, África y América Latina. En 1991 la
producción mundial de papa era de 267.99 millones de toneladas y para el 2009 se
incremento a 317.25 millones de toneladas (FAOSTAT, 2012); en Colombia se ha
reportado que para el año 2010 se cultivaron 138.631 hectáreas con una producción de
2.652.449 toneladas (Villarreal, 2011, tomado de Ñustez, 2011).
Figura 4-1. S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia (papa criolla). A. Cultivo. B.
Planta.
10
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Dentro de las variedades de papa que se producen en Colombia, la papa criolla (S.
tuberosum Grupo Phureja) (Figura 4-1A). Anteriormente clasificada como Solanum
phureja, pero recientemente ubicada como el Grupo Phureja dentro de la especie
Solanum tuberosum (Huamán y Spooner, 2002). El cultivo de la papa criolla en Colombia
se desarrolla a pequeña escala, para el 2009 del área total de papa sembrada en
Colombia (134.640 hectáreas), solamente el 5.9% corresponde a papa criolla (Villarreal,
2011; tomado de Ñustez, 2011); esto es debido a que este cultivo es más susceptible a
las heladas, a los problemas fitosanitarios y además presenta una alta perecebilidad
post-cosecha debido a que sus tubérculos no presentan dormancia (Ardila y Luis, 2009).
A pesar de lo anterior, Colombia es le primer productor mundial de papa criolla, se
siembra en promedio unas 8.500 hectáreas y se cosecha cerca de 100.000 toneladas por
año, especialmente en los departamentos de Cundinamarca, Nariño y Boyacá (Consejo
Nacional de la Papa, 2010) y se realizan exportaciones cercanas a 1000 toneladas por
año (Fedepapa, 2010).
4.1.1 Plagas y enfermedades de la papa criolla
Debido a que se produce vegetativamente a través de tubérculo, todos los grupos de
patógenos tienen una alta importancia económica. Las pérdidas estimadas para
patógenos, virus, pestes, y malezas entre 1996 – 1998 fue del 22%, 8%, 18% y 23%
respectivamente (Oerke y Dehne, 2004).
El cultivo de la papa criolla es más susceptible al ataque de plagas y enfermedades que
el de la papa común, por lo tanto es necesario tomar medidas preventivas a tiempo, una
de estas es la rotación de cultivos con otras especies agrícolas (otras variedades de
papa, trigo, zanahoria, arveja, cebada, calabaza, haba, maíz, fríjol, ajo, brócoli, caléndula,
coliflor, repollo y pastos); de la misma manera la presencia de cultivos asociados e
intercalados es fundamental para reducir la cantidad de inoculo de las enfermedades en
el campo (Estrada, 2000; Agronet, 2005).
La enfermedad de mayor incidencia en la papa es causada por la gota o tizón tardío cuyo
agente causal es el oomycete Phytophthora infestans el cual genera destrucción de hojas
y tubérculo durante la última fase de la infección manifestándose en necrosis de las
hojas, manchas y destrucción de tejido en los tubérculos (Estrada, 2000).
Marco Teórico
11
El cultivo de la papa criolla también es afectado por algunos hongos como:
Alternaria solani - tizón temprano ó mancha negra: Se manifiesta con manchas
necróticas en las hojas de color marrón a negro de diferentes tamaños y con anillos
concéntricos característicos que pueden juntarse. En los tubérculos las lesiones son
oscuras, hundidas, de forma circular e irregular (Estrada, 2000).
Rhizoctonia solani - sarna negra ó rhizoctoniasis: Frecuente en suelos fértiles, ácidos y
muy húmedos o con falta de drenaje. En la superficie de los tubérculos maduros se
forman esclerotos de color negro a castaño oscuro. Otros síntomas en los tubérculos
incluyen grietas, malformaciones, concavidades y necrosis en el extremo de unión con el
estolón (Estrada, 2000).
Los hongos y oomycetes no son los únicos agentes causales de enfermedades en papa
criolla algunas bacterias también pueden generar enfermedades en el cultivo dentro de
las que se encuentran:
Streptomyces scabies - sarna común: Afecta principalmente la calidad de los tubérculos
pero no su producción (Estrada, 2000).
Erwinia carotovora - podredumbre blanda: Enfermedad frecuente en ambientes húmedos.
Se manifiesta por la presencia de lesiones negras y secreciones muscilaginosas en el
tallo que van ascendiendo desde el tubérculo con pudrición blanda. Los tubérculos
nuevos se pudren a veces en el extremo del estolón (Estrada, 2000).
Por otro lado debido a su color claro, textura blanda y contenido alto de azúcares, la papa
criolla es muy susceptible al ataque de insectos (especialmente la polilla guatemalteca,
Tecia solanivora, y el gusano blanco, Premnotrypes vorax) (Estrada, 2000).
Las enfermedades causadas por virus constituyen uno de los factores que más afectan la
producción en el cultivo de la papa. Las virosis son las responsables primarias de la
degeneración gradual de las variedades, la cual se traduce principalmente en la pérdida
de rendimiento. En algunos casos los virus causan pérdidas cualitativas debido a la
reducción del valor de mercadeo y conservación de tubérculos. A nivel viral, los que
representan la principal amenaza para este cultivo son PVY, PVX, PLRV y PYVV
(Estrada, 2000; CIP, 2003; Müller et al., 2004).
12
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
4.2 PYVV (Potato yellow vein virus)
4.2.1 Clasificación Taxonómica
PYVV pertenece al género Crinivirus, familia Closteroviridae (Martelli et al., 2011), el virus
presenta genoma tripartita es de RNA de cadena sencilla sentido positivo, con morfología
filamentosa (Figura 4-2), se localiza en el floema de la planta infectada. (Salazar et al.,
2000), y sus partículas son polares (tienen cabeza y cola) (Livieratos et al., 2002).
Figura 4-2. Micrografía electrónica de partículas virales de PYVV. La barra corresponde a 200nm
(Tomada de Salazar et al., 2000).
Dependiendo del insecto vector, esta familia está dividida en tres géneros: Closterovirus
(Áfidos), Ampelovirus (Chinches) y Crinivirus (Mosca blanca) (Martelli et al., 2002) (Figura
4-3); además de algunos miembros sin género asignado como la especie MVBaV (Mint
vein banding associated virus) (Tzanetakis et al., 2005).
Figura 4-3. Clasificación de la familia Closteroviridae. Árbol filogenético construido con secuencias
de las proteína homologa de choque térmico 70 (Hsp70h) con miembros de los tres géneros de la
Marco Teórico
13
familia. PYVV se encuentra dentro del género Crinivirus y es el miembro que está encerrado en el
cuadro rojo (Modificado de Martelli et al., 2002).
Los miembros del género Closterovirus y Ampelovirus son monopartitas y los del género
Crinivirus son multipartitas. Los miembros del género Crinivirus son bipartitas, pero hasta
el momento PYVV ha sido reportado como el único tripartita de este género (Martelli et
al., 2010), este virus ha conservado un bloque marcador de genes característicos de la
familia Closteroviridae (Karasev, 2000; Martelli et al., 2002).
4.2.2 Síntomas causados por PYVV
Las plantas infectadas con el virus expresan inicialmente síntomas de amarillamiento en
la porción apical de las nervaduras terciarias de las hojas; generalmente solo se
observan unos pequeños puntos amarillos brillantes, pero a medida que avanza la
infección las nervaduras secundarias también se ven afectadas y al final de la
enfermedad la lámina foliar entre las venas también se vuelve amarilla; generalmente no
afecta las nervaduras primarias las cuales pueden permanecer verdes hasta que la
planta muere (Salazar et al., 2000) (Figura 4-4A, B y C). Los síntomas en hojas afectadas
secundariamente (producto del movimiento del virus a larga distancia) tienen el mismo
patrón de síntomas que los descritos anteriormente (Salazar et al., 2000).
Cuando la sintomatología aparece tempranamente, la planta entera puede llegar a verse
afectada. En algunos casos la remoción de las primeras hojas sintomáticas puede ser
suficiente para evitar la dispersión del virus a otras hojas, aunque hay que tener en
cuenta que hojas que no expresan síntomas pueden tener el virus (Salazar et al., 2000).
Otro de los síntomas que produce la infección por PYVV es la reducción en la producción
de tubérculos (Figura 4-4D), generalmente las plantas infectadas producen menos
tubérculos que las plantas sanas, en algunos casos puede darse una disminución de
hasta un 50% en S. tuberosum Grupo Tuberosum variedad Diacol Capiro (Salazar et al.,
2000); y en S. tuberosum Grupo Phureja hasta un 25% (Guzmán et al., 2011).
14
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Figura 4-4. A. Síntoma de amarillamiento foliar por la infección por PYVV. B. Planta de S.
tubersoum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia con síntomas de amarillamiento C. Cultivo de
S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia ubicado en el municipio de Une
(Cundinamarca) infectado con PYVV. D. En el panel izquierdo se observan los tubérculos
producidos por una planta de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia sana, en el
panel derecho una planta infectada con PYVV (Figura Tomada de Vargas et al., 2010B).
Una de las características de la familia Closteroviridae es que son parásitos del floema
en donde inducen la formación de cuerpos de inclusión dentro de las células
acompañantes, estos cuerpos de inclusión incluyen membranas citoplasmáticas
vesiculadas dentro de las células del floema (Figura 4-5) (Medina et al., 2003; Rodríguez
et al., 2008). La presencia de estos depósitos se han relacionado con la obstaculización
de los haces vasculares lo que conduce a una alteración del metabolismo de la planta
(puede verse reflejado en algunos síntomas como enanismo) y de los cloroplastos (hojas
cloróticas) (Salazar et al., 2000).
Marco Teórico
15
Figura 4-5. Micrografía electrónica de tejido de Nicotiana benthamiana infectada con LIYV
(Lettuce infectious yellows virus), miembro del género Crinivirus en donde se observan algunos
cuerpos de inclusión. N: núcleo, IB: cuerpos de Inclusión. La barra corresponde a un tamaño de
0.73µm (Tomada Medina et al., 1998).
4.2.3 Transmisión de PYVV
Transmisión por tubérculo
Uno de los aspectos a tener en cuenta para el control y manejo de la enfermedad
producida por PYVV es la transmisión vegetativa del virus a través de tubérculo-semilla,
debido a que este puede perpetuarse en el campo por el uso de semilla proveniente de
plantas infectadas. Según Salazar et al. (2000) y Guzmán et al. (2011) es posible tener
progenies sintomáticas cuando se utilizan tubérculos provenientes de plantas
sintomáticas, aunque dentro de esta progenie pueden encontrarse plantas no
sintomáticas. No se ha podido demostrar si la transmisión del virus puede darse a través
de la semilla sexual (Figura 4-6).
Figura 4-6. Transmisión de PYVV a través de tubérculo (Tomada de Salazar et al., 2000)
16
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Transmisión mecánica y por injerto
PYVV es transmitido fácilmente por injerto de tallo aéreo y subterráneo; Salazar et al.
(2000) tuvieron éxito en ensayos de transmisión del virus por injerto, después de un mes
el virus pudo ser recuperado por back grafting en plantas de papa y además resultaron
positivas por NASH, pero los ensayos de transmisión mecánica no fueron positivos.
Transmisión por vector natural, mosca blanca (T. vaporariorum)
La transmisión de los virus de la familia Closteroviridae se da por insectos homópteros
cuya transmisión es semipersistente (Karasev, 2000), lo que implica una asociación
temporal entre el virus y el vector, el virus puede ser adquirido en un determinado periodo
de tiempo que puede ser corto (10 minutos para algunos virus como LCV, Lettuce
clorosis virus; SPCSV, Sweet potato chlorotic spot virus; TICV, Tomato infectious
chlorotic virus), pueden ser retenidos en las moscas durante algunas horas como en el
caso de PYVV hasta algunos días (el periodo de tiempo depende del virus), existiendo
una correlación entre el periodo de adquisición, el de inoculación y el de transmisión
(Figura 4-7). A pesar de esta correlación, el virus solo es retenido en el aparato digestivo
del vector sin atravesar las barreras hematoencefálicas y sin replicarse dentro del vector
(Hull, 2002). En la actualidad no está bien descrito cuales son los determinantes
moleculares (proteínas virales) que están relacionados con la transmisión por vector
natural de miembros del género Crinivirus, pero se sabe que la adquisición e inoculación
están asociados con la alimentación por parte del vector en tejido floemático (Johnson et
al., 2002) y no parece haber implicación de proteínas no estructurales de origen viral
(Tian et al., 1999)
Figura 4-7. Representación esquemática de los modos de transmisión por los vectores. NC: Virus
transmitidos de una manera no circulativa (no persistente), estos se restringen al aparato bucal
Marco Teórico
17
(negro); C: virus transmitidos de una manera circulativa (semi-persistente, verde) entran al
hemoceloma (amarillo), no se replican dentro del vector y generalmente entran a las glándulas
salivares desde la hemolinfa; P: virus transmitidos de manera propagativa (persistente, rojo), estos
se replican dentro del vector (Tomada de Froissart et al., 2010).
Vega (1970), fue el primero en demostrar que la transmisión del agente causal de la
enfermedad del amarillamiento de las nervaduras de la hoja de la papa era T.
vaporariorum (Figura 4-8), lo cual fue confirmado posteriormente por varios autores
(Buriticá, 1971; Tamayo y Navarro, 1984; Chuquillanqui y Müller, 2002; Gamarra, 2002;
Arciniegas, 2003). Tanto en el trabajo de Alba (1952) como en el de Vega (1970) se
confirmó que el virus no podía ser transmitido por áfidos como algunos miembros de la
familia Closteroviridae.
Figura 4-8. T. vaporariorum (Mosca Blanca). En las tres primeras fotografías se pueden observar
algunos estadios del ciclo de vida de la mosca blanca, y en la última el envés de una hoja con
mosca blanca (Tomada de PPIS, Plant Protection and Inspection Services, 2009)
Recientemente la incidencia de PYVD ha incrementado debido a varios factores dentro
de los que se encuentra la falta de uso de semilla certificada, el transporte indiscriminado
de material vegetal y también a que las poblaciones de mosca blanca han incrementado
contribuyendo con la dispersión de la enfermedad (Zapata et al., 2004). En la figura 4-9
se muestra los países en los que se ha reportado PYVV (Colombia, Perú, Ecuador y
Venezuela) (Salazar et al., 2000).
18
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Figura 4-9. Distribución geográfica de PYVV, los círculos rojos vacios indican que en esos países
el virus solo está presente en algunas áreas. (Tomado de OEPP-EPPO, 2006).
4.2.4 Genoma
PYVV se caracteriza por presentar un genoma tripartita (Figura 4-10) de RNA de cadena
sencilla de sentido positivo, de aproximadamente 17kb en donde se encuentran
codificados 10ORFs (Livieratos et al., 2004).
El RNA1 (8035pb) contiene el modulo de replicación que codifica para: un dominio
proteasa similar a Papaina (L – Pro), un dominio metiltransferasa (MTR) y un dominio
helicasa (HEL) que conformarían el marco de lectura abierto 1a (ORF 1a); una RNA
polimerasa dependiente de RNA (RdRp) que corresponde al ORF 1b y el ORF2 que
corresponde a un marco de lectura abierto adicional (p7) que corresponde a una
pequeña proteína hidrofóbica.
En los RNAs 2 y 3 se encuentran repartidos un arreglo de genes altamente conservados
que son característicos de la familia Closteroviridae que está conformado por: los ORFs
Hsp70h, p60, p10, CP, CPm y p26. El RNA 2 (5339pb) contiene 5 ORFs , el primer ORF
corresponde a la proteína homóloga a la proteína de choque térmico (Hsp70h), la familia
Closteroviridae es la única familia de virus que tiene la proteína Hsp70h y se cree que es
Marco Teórico
19
producto de la incorporación de secuencias del hospedero (Martelli et al., 2002); una
proteína pequeña de 6.8KDa (p7, ORF 2), el ORF 3 que corresponde a la proteína p60
que es homóloga a la de otros miembros de los géneros Clostero - y Crinivirus, la cual ha
mostrado dominios similares a CP en otros miembros de la familia Closteroviridae, el
ORF 4 que es la proteína p10 la cual no tiene similaridad con ninguna secuencia
reportada, es única del género Crinivirus, y ORF 5 que codifica para la proteína de la
cápside de 28.2KDa.
Figura 4-10. Esquema representativo de la estructura genómica de PYVV (Tomado de Livieratos
et al., 2004).
El RNA 3 (3892pb) tiene tres ORFs, el ORF 1 corresponde a la proteína p4 la cual no
tiene homología con ninguna secuencia ni contraparte con otra proteína de la familia
Closteroviridae, el ORF 2 a la proteína de cápside menor ó divergente (CPm), proteína
que le da una forma similar a un cascabel de serpiente a las partículas virales y el ORF 3
codifica una proteína única del género Crinivirus (Tabla 4-1) (Livieratos et al., 2004).
20
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Tabla 4-1: Genes codificados por PYVV y su posible función
Tamaño
RNA
ORF
Gen
Proteína
(KDa)
L-Pro
1ª
226
MTR
HEL
1
2
3
Proteína similar
a papaína
Metiltransferasa
Helicasa
RNA polimerasa
dependiente de RNA
Proteína p7
1b
59
RdRp
2
7
p7
1
62.3
Hsp70h
2
6.8
p7
Proteína p7
3
60
p60
Proteína p60
4
9.8
p10
Proteína p10
5
28.2
CP
Proteína de la cápside
1
4
p4
Proteína p4
2
77.5
CPm
Proteína de la cápside
menor ó divergente
3
26.4
p26
Proteína p26
Proteína homóloga a la
de choque térmico
Función putativa
Procesamiento de poliproteínas
Transporte de virus a larga distancia
Replicación del RNA
Replicación del RNA
Replicación del RNA
Replicación del RNA
Movimiento de virus célula a célula
Ensamblaje de las partículas virales
Movimiento de virus
Estabilidad del virión
Movimiento del virus célula a célula
Ensamblaje de la cola del virión
Movimiento del virus
Función desconocida (única del
género Crinivirus)
Ensamblaje de las partículas virales
Protección del genoma
Función desconocida
Ensamblaje de las partículas virales
Movimiento célula a células
Transmisión del virus por el vector
Única del género Crinivirus
Movimiento del virus
D-RNAs (RNAs Defectivos)
D-RNAs son formas delecionadas de los RNAs genómicos que retienen las señales de
replicación (UTR 5’ y 3’) y son generados por un mecanismo de recombinación (Rubio et
al., 2000 y 2002).
Aún no se conoce cuál es la importancia biológica de los D-RNAs, no se sabe si ellos son
útiles para los virus, si afectan el proceso infeccioso, o simplemente son productos de
errores durante la recombinación genética (Simon y Bujarski, 1994; Roossinck, 1997), lo
único que se sabe es que son el producto de eventos de recombinación, mecanismo que
le confiere mejor adaptabilidad al virus y una mayor diversidad genética, esta debe ser
una estrategia muy importante para la familia Closteroviridae debido a que presentan un
genoma grande, por recombinación se reduciría el riesgo de acumulación de mutaciones
deletéreas (Rubio et al,. 2000 y 2002).
Los D-RNAs son incapaces de replicarse en la ausencia del tipo silvestre o de un virus
helper que proveerá las funciones perdidas debidas al evento de recombinación, pero los
Marco Teórico
21
defectivos deben tener por lo menos las señales necesarias para que la polimerasa
pueda reconocerlo y se pueda llevar a cabo su replicación, la replicación del virus helper
o del virus de tipo silvestre a veces es menos eficiente debido a que los D-RNAs
compiten por las funciones de las que este carece, estos RNAs son conocidos como
RNAs defectivos interferentes (DI-RNA) (Roossinck, 1997). Dentro de la familia
Closteroviridae se ha observado que aparentemente los D-RNAs no interfieren con la
acumulación de los RNAs genómicos (Rubio et al., 2000 y 2002).
En PYVV, además de los tres RNAs genómicos (gRNA), su genoma cuenta con dos
RNAs adicionales de menor peso y cumplen con las características de RNAs defectivos
nombrados como DRNA A ó DRNA x (2082nt) y DRNA B ó DRNA y (1802nt) (Livieratos
et al., 2004) (Figura 4-11B). Estos se caracterizan por estar conformados por mezcla de
secuencias de los RNAs genómicos (principalmente de los extremos 3’ y 5’, Figura 411A) y son conocidos como RNAs defectivos (Eliasco et al., 2006).
Ambos defectivos se caracterizan por presentar una composición rica en A/U (D-RNA x
67 % y D-RNA y 65%), el extremo 5’ de ambos proviene del extremo 5’ del RNA 1 (85%
de identidad) y el extremo 3’ de los dos proviene del UTR 3’ del RNA 3 (92% de
identidad) (Figura 4-11A). Predicciones de estructuras secundarias mostraron que las
estructuras putativas y las señales, tales como las involucradas en replicación y
posiblemente en encapsidación (Figura 4-12) fueron retenidas con menores variaciones
de secuencia al compararlas con las de RNA genómico (Eliasco et al., 2006).
A
B
Genómicos
Defectivos
Figura 4-11. A. Esquema representativo de la estructura de los D-RNAs de PYVV (Tomado de
Eliasco et al, 2006) B. Gel de agarosa de una preparación de dsRNA de una planta infectada con
PYVV, la línea 1 es el marcador de peso molecular y la línea 2 es la planta infectada (Modificado
de Livieratos et al., 2004).
22
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Con respecto a los sitios de unión de los extremos 3’ y 5’ de ambos D-RNAs no se
encontró alguna repetición o secuencia de origen no viral como se observa en otros virus
como el Citrus tristeza virus (CTV). Las intersecciones de ambos RNAs parecen ser
mezclas de todos los RNAs genómicos (Figura 4-11A) (Eliasco et al, 2006).
Figura 4-12. Modelo de la estructura secundaria para el UTR 3’ de los RNAs genómicos de
PYVV. La estructura está formada por cuatro stem loops (hpI –hpIV) (estructura típica en
miembros del género Crinivirus), este tipo de estructura puede estar involucrada en procesos de
replicación, empaquetamiento y traducción (Tomado de Livieratos et al., 2004).
4.2.5 Antecedentes: Estudios moleculares en PYVV
Hasta el momento hay poca información para este virus, los trabajos más relevantes en
los que se ha estudiado PYVV inician con Alba hacia 1950 los cuales se basan en la
expresión de síntomas en campo, y solamente hasta el año 2000 Salazar et al. hicieron
los primeros análisis moleculares de PYVV, en este trabajo se obtuvieron las primeras
microfotografías electrónicas de partículas virales y se dilucidaron algunos aspectos
básicos del virus como por ejemplo su distribución geográfica, transmisión y efectos
sobre la producción, parte de estos estudios fueron retomados en el 2003 por Arciniegas.
Salazar et al. (2000); Arciniegas (2003) y Guzmán et al. (2011) reportaron la presencia de
plantas que no expresaban síntomas en las que se pudo detectar el virus por pruebas
moleculares (RT - PCR y NASH).
En el año 2002, Livieratos et al. identificaron que el virus presentaba una proteína menor
de la cápside (CPm) razón por la cual PYVV tiene una estructura similar a la de una
serpiente de cascabel, presentando partículas con cabeza y cola. Hasta el año 2004,
Livieratos et al. obtuvieron la primera secuencia completa del genoma tripartita de PYVV,
año en el cual también se hicieron estudios de variabilidad del virus utilizando la técnica
de SSCPs (Single Strand Conformational Polymorphism) (Offei et al., 2004), en este
estudio se evaluaron los genes de la proteína mayor de la cápside (CP), la proteína
Marco Teórico
23
homóloga de choque térmico 70 (Hsp70h) y la región N-terminal del ORF p60, los
resultados de este estudio indicaron que había poca diversidad genética entre los
aislados de PYVV de Perú y Colombia (Offei et al., 2004), dos años más adelante
Guzmán et al. (2006) también reportaron un estudio de variabilidad basado en RFLPs
(Restriction Fragment Lenght Polymorphism) en el cual detectaron mayor variabilidad del
gen CP. Eliasco et al. (2006) informaron de la presencia de RNAs defectivos asociados
con este virus que parecerían ser el producto de eventos de recombinación genética
errónea. Además de los estudios mencionados anteriormente se han realizado otros
trabajos en este virus que se han basado en la detección de PYVV utilizando técnicas
como RT – PCR (Rodríguez et al., 2008 Guzmán et al., 2008 y 2009A; Wei et al., 2009).
Otros trabajos han reportado la susceptibilidad o tolerancia en accesiones colombianas
de S. tuberosum Grupo Phureja (Arciniegas, 2003; Guzmán et al., 2003 y 2009b; Vargas
et al., 2010b; Guzmán y Rodríguez, 2010). También se ha evaluado los efectos de PYVV
en los cultivos afectados en donde se ha observado una relación entre la infección del
virus con una reducción en la producción de los cultivos infectados (Salazar et al., 2000;
Vargas et al. 2010b); prevalencia de la enfermedad (Franco – Lara et al., 2009; Guzmán
y Rodríguez, 2010); transmisión (Chuquillanqui y Müller, 2002; Gamarra; 2002;
Arciniegas et al., 2003) y variabilidad (Rodríguez et al., 2009; Cubillos et al., 2010).
4.3 Extracción de RNA vegetal
Para la obtención de RNA de virus de plantas es necesario hacer una extracción del
material vegetal, en donde se encontrará una mezcla de RNA de la planta y del virus (ó
virus) que infectan la planta.
La obtención de RNA de alta calidad y en cantidades adecuadas es un paso crítico en
experimentos basados en reacciones de amplificación. Pero este procedimiento no es
muy fácil en tejidos vegetales debido a la presencia de paredes celulares y de algunos
compuestos polifenólicos, proteínas, carbohidratos de alto peso molecular, pigmentos,
metabolitos secundarios, entre otros que son inhibidores de las reacciones de
amplificación (Claros y Canovas, 1998; Kim y Hamada, 2005). En la actualidad hay una
gran cantidad de métodos de extracción que van desde protocolos de extracción hasta
kits comerciales que permiten la extracción de RNA vegetal.
24
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Los protocolos de extracción de RNA esta divido en dos fases: la inicial que implica la
ruptura de tejidos y extracción de ácidos nucleicos , y la última fase de precipitación
diferencial de RNA.
4.3.1 Ruptura del tejido y extracción
Es el primer paso en el proceso y posiblemente uno de los más críticos para la obtención
de RNA de alta calidad y con un buen rendimiento. En plantas este proceso es difícil
debido a la composición de la pared celular, esta debe ser rota por acción mecánica para
lo cual se pulveriza el material vegetal utilizando nitrógeno líquido, para la extracción de
todo el contenido intracelular.
Posteriormente, se deben destruir las membranas celulares de manera que los ácidos
nucleicos acompañados de otras sustancias quedan expuestos para su posterior
extracción (Velazco, 2005), En esta fase se utilizan soluciones que pueden estar
compuestas por:
-
Sales caotrópicas que destruyen rápidamente las membranas celulares, esto
también se puede lograr con la utilización de detergentes, (ex. CTAB que es un
detergente catiónico). La actividad de estas moléculas también contribuye con la
denaturación de proteínas (Sambrook et al., 1989).
-
Un agente quelante para la inactivación de las RNasas (John, 1992; Kiefer et al.,
2000), muchas nucleasas tienen como cofactor Mg2+, aunque hay que tener en
cuenta que también hay RNasas que no tienen cofactor; por lo tanto se ha utilizado
sustancias como el isotiocianato de guanidina (Trizol®) (Chomczynski, 1993), el cual
a ser un agente caotrópico también afecta la actividad de estas enzimas (Sambrook
et al., 1989).
-
NaCl para evitar la contaminación de las muestras con polisacáridos, debido a que
estos presentan una solubilidad diferencial en altas concentraciones de NaCl
precipitándolos por centrifugación (Chang et al., 1993; Meisel et al., 2005). Esta sal
se utiliza en esta fase cuando se utilizan detergentes catiónicos para el rompimiento
de las membranas, con el objetivo de competir en las interacciones formadas entre
los grupos PO4- del RNA y el detergente.
Marco Teórico
-
25
SDS para solubilizar las proteínas y membranas evitando que los ácidos nucleicos
se mezclen (Sambrook et al., 1989).
-
Polivinil pirrolidona (PVP) ó polivinil polipirrolidona (PVPP) el cual evita la
contaminación con polifenoles porque se une a estos y posteriormente pueden ser
eliminados por precipitación con etanol (Sambrook et al., 1989).
-
El cloroformo y el fenol a un pH específico desnaturaliza las proteínas, y debido a
que estos dos son solventes orgánicos las proteína migran a esta fase mientras que
los ácidos nucleicos se mantienen en la fase acuosa, además a bajo pH el fenol
hace que el DNA sea un poco soluble en la fase orgánica. El cloroformo también
contribuye con la eliminación de lípidos (Sambrook et al., 1989).
4.3.2 Precipitación diferencial del RNA
Generalmente para la precipitación de RNA se utiliza algún etanol o isopropanol, los
cuales en presencia de cationes monovalentes como el Na+ y el Li+, neutralizan las
cargas reduciendo la hidrofilicidad del RNA y promoviendo su precipitación (Sambrook et
al., 1989). Dentro de las sales más utilizadas esta el LiCl debido a que este es soluble
con proteínas, carbohidratos y DNA permitiendo la precipitación del RNA. Dependiendo
de la concentración este es muy eficiente porque permite la precipitación del RNA y es
ineficiente para la precipitación de DNA proteína y carbohidratos (Barlow et al., 1963).
4.4 RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR)
Las técnicas basadas en PCR (Mullis y Faloona, 1987) han sido utilizadas como una
prueba gold standard para la detección de una gran variedad de moldes en diferentes
áreas del conocimiento, incluyendo virología (Heid et al., 1996; Makkouk y Kumari, 2006;
Feng et al., 2008). Para la observación de los amplificados se requiere de electroforesis,
un procesamiento post-PCR lo cual puede conllevar a problemas de contaminación, una
manera de sobrellevar este inconveniente, fue buscar una forma de poder visualizar los
productos a medida que se lleva a cabo la reacción, para lo cual se implemenntó la
técnica de qPCR (Lomeli et al., 1989), en la cual se hace un marcaje de los primers,
sondas o amplicones con moléculas fluorogénicas (Matthews y Kricka, 1988).
26
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
qRT-PCR está basada en PCR y se usa para amplificar y al mismo tiempo cuantificar
moléculas de cDNA (DNA complementario) específicas y así acceder a datos fiables y
precisos del número de copias de un gen (cuantificación absoluta) ó de la expresión
génica relativa (cuantificación relativa). En esta técnica el producto de la PCR se mide al
final de cada ciclo, mientras que en las reacciones de RT-PCR convencional el producto
solo puede ser visualizado cuando la reacción ha terminado (Heid et al., 1996; Makkouk y
Kumari, 2006; Feng et al., 2008).
Se han utilizado diferentes métodos para el diagnostico viral como anticuerpos mono y
policlonales, hibridaciones con sondas de DNA y RNA, RT – PCR, pero ninguno de estos
métodos permite una estimación precisa de la acumulación de virus en los tejidos
infectados (Ruiz – Ruiz et al., 2007), lo cual si puede llevarse a cabo con qPCR. qPCR se
ha convertido en una técnica ampliamente utilizada en estudios de expresión y regulación
génica y también en el diagnóstico y cuantificación de virus. Es una técnica que presenta
una alta sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, además no requiere procesamiento
post PCR de la muestra, lo que reduce el riesgo de contaminación (Ruiz – Ruiz et al.,
2007; Feng et al., 2008).
4.4.1 Cuantificación
Se han utilizado varios métodos para la estimación de RNA, entre los que se encuentran:
nothern blot, ensayo de protección de la ribonucleasa, hibridación in situ, entre otros. Los
ensayos de northern blot y los ensayos de protección de la ribonucleasa requieren de
grandes cantidades de RNA, y por otro lado hibridación in situ es más cualitativa que
cuantitativa, mientras que qRT-PCR es fácil de realizar y no requiere grandes cantidades
de molde lo que la hace más conveniente para cuantificaciones en comparación con las
demás técnicas de cuantificación (Heid et al., 1996; Feng et al., 2008).
Umbral
Los resultados de qRT-PCR se basan en la detección y cuantificación de los marcadores
fluorescentes a lo largo de la reacción. Esto permite conocer la cantidad de fluorescencia
emitida durante la fase exponencial de la reacción, donde un aumento significativo del
producto de PCR se correlaciona con la cantidad inicial de DNA o cDNA en estudio (Feng
et al., 2008). Para poder hacer las cuantificaciones, se debe obtener el valor Ct (cycle
Marco Teórico
27
treshhold); para su determinación se debe establecer un umbral adecuado que debe ser
fijado por el investigador, en el que el valor Ct se determina por la identificación del ciclo
en el cual la emisión de la intensidad del marcador fluorescente se eleva por encima del
ruido de fondo en la fase exponencial de la reacción de PCR. Quiere decir que este valor
está representado por el ciclo en el cual la producción de fluorescencia cruza el umbral
establecido (Figura 4-13) (Bustin, 2002; Dorak, 2006).
Figura 4-13 Cinética de la reacción de PCR en tiempo real. En la gráfica puede observarse la
línea base y el umbral a partir del cual se determinan los valores Ct (Tomada de Heid et al., 1996).
Cuantificación Absoluta y relativa
Con el uso de PCR en tiempo real la cantidad de molde puede ser cuantificado de
manera absoluta o relativa (Bustin, 2002):
Cuantificación Absoluta: El número de moléculas blanco presentes en la muestra es
determinada usando una curva estándar, construida por la amplificación de cantidades
conocidas del molde bajo condiciones idénticas a las de la muestra. Sin embargo, la
curva estándar tiene que ser rigurosamente validada con gran exactitud pues la
cuantificación depende exclusivamente de la precisión de los estándares empleados
(Figura 4-14) (Pfaffl, 2008).
28
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Figura 4-14. Curva estándar para la hacer cuantificación absoluta. (Tomada de Heid et al., 1996).
A. Curva estándar. B. Curvas de amplificación de los estándares utilizados para la construcción
de la curva estándar.
Cuantificación Relativa: Describe los cambios en la cantidad de una secuencia blanco en
comparación con un normalizador (corresponden a genes cuya expresión es constante
en las células estudiadas razón por la que habitualmente se utilizan genes
housekeeping), pero no se sabe el número de copias de molde presentes en cada
muestra. Los cálculos en cuantificación relativa de expresión genética se basan en la
comparación de los valores Ct utilizando la eficiencia de la reacción de la PCR como
factor de corrección (Pfaffl, 2008). La eficiencia se calcula a partir de la pendiente de la
curva teniendo en cuenta la siguiente ecuación:
En donde se espera que cuando la eficiencia es igual a 2 el porcentaje de eficiencia es
igual a 100%, lo que quiere decir que en cada ciclo de amplificación se duplica la
Marco Teórico
29
cantidad de producto con respecto al ciclo anterior, aunque hay que tener en cuenta que
la eficiencia nunca será igual a 2.
A
B
Figura 4-15. Cuantificación relativa (Figura tomada de Heid et al., 1996). A. Comparación de las
diferencias entre la expresión de un gen de interés con uno de expresión constitutiva, el valor
∆∆Ct representa el número de veces en el cambio de la expresión génica. B. Resultados de un
análisis de expresión relativa.
Generalmente la cuantificación relativa ofrece suficiente información y es más simple de
desarrollar, sin embargo cuando se requiere monitorear el progreso de una infección, la
cuantificación absoluta es muy útil para demostrar los cambios en el nivel de virus
(Mackay et al., 2002).
30
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Químicas utilizadas en qPCR
En la actualidad hay dos formas para la detección de los productos de qPCR se basa en
la utilización de fluorocromos: los que se unen al DNA, y los que vienen unidos a los
primers ó sondas.
Fluorocromos que se unen al DNA: Esta es la química más usada para la detección de
productos de PCR en tiempo real, en donde generalmente se utiliza la molécula SYBR®
Green I. Esta molécula presenta baja fluorescencia cuando se encuentra libre, pero esta
incrementa hasta 1000 veces cuando se une al DNA de doble cadena, además la señal
de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de dsDNA presente en la muestra. Debe
tenerse en cuenta que durante la reacción pueden formarse productos inespecíficos y
dímeros de primers, lo cual puede hacer que la interpretación de los resultados sea
confusa, para evitar esto es útil hacer curvas de fusión después de la amplificación para
determinar la temperatura de fusión a la que el amplicón es denaturado y de esta manera
poder discriminar la presencia de dímeros de primers debido a que estos presentan una
reducida temperatura de fusión comparada con la temperatura de los amplicones (Figura
4-16) (Mackay et al., 2002; Dorak, 2006).
Figura 4-16: Química de detección de SYBR® Green I. (Figura Tomada de BIO-RAD,
2012).
Marco Teórico
31
Primers ó sondas unidas a un fluorocromo: Dentro de esta categoría hay varias químicas:
-
Sondas TaqMan®: Son una clase de sondas fluorogénicas basadas en FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transference) entre un fluorocromo y un quencher
el cual dispersa la energía generada por el fluorocromo como calor más que como
fluorescencia, evitando la fluorescencia de la sonda. Con el quencher en algunos de
los extremos de la sonda, la fluorescencia es apagada debido a la proximidad del
fluorocromo y del quencher, pero esta es detectada después de que la DNA
polimerasa hidroliza la sonda permitiendo de esta manera que se pueda emitir la
fluorescencia generada por el fluorocromo (Figura 4-17) (Mackay, et al., 2002;
Bustin, 2002). Cuando se emplean este tipo de sondas se incrementa la
especificidad en comparación con los fluorocromos que se unen de manera
inespecífica al DNA, debido a que estos se unen a amplicones específicos por lo
tanto son muy precisos y se evita la cuantificación de dímeros de primers o
productos de amplificación inespecíficos (Dorak, 2006). A pesar de las ventajas
descritas anteriormente, las sondas TaqMan® no son útiles cuando se está
trabajando con muestras que presentan una alta variabilidad debido a que estas
requieren de que haya una alta complementariedad, para poder hacer la detección
en este tipo de muestras sería más eficiente la utilización de SYBR® Green I con
primers degenerados (Papin et al., 2004).
Figura 4-17. Química de detección con Sondas TaqMan® (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).
32
-
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Molecular beacons: Es un oligonucleótido entre 25 a 40 nt que tiene forma de hairpin
con un stem y un loop. Los extremos 3´y 5´tienen complementariedad entre 5 a 6
nucleotidos en el stem, y en el loop hay de 15 a 30 nucleotidos que se diseñan de
manera que hibridicen con la secuencia blanco. En uno de los extremos la sonda
esta marcado con un fluorocromo y en el otro extremo hay un quencher evitando que
se emita fluorescencia. (Figura 4-18). Durante el alineamiento en la reacción de
amplificación, la porción del loop del molecular beacon se une a la secuencia blanco,
haciendo que el stem se denature. En este tipo de química la cantidad de
fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de moléculas blanco. Estas
sondas resultan muy útiles debido a que tienen una especificidad muy alta; la
principal desventaja es que son difíciles de diseñar (BIO-RAD, 2012).
Figura 4-18. Estructura de un molecular beacon. (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).
-
Hybridization probes: Utiliza dos sondas secuencia-específica, las dos son diseñadas
para unirse a secuencias adyacentes en el blanco (Figura 4-19). Las sondas son
marcadas con un par de fluorocromos que pueden emplear FRET. El fluorocromo
donador se une al extremo 3´de la primera sonda, mientras que el fluorocromo
aceptor se une al extremo 5´de la segunda sonda. Durante la reacción de tiempo
real, la excitación se hace a la longitud de onda del donador, y la reacción es
monitoreada a la longitud de onda del aceptor. Durante el alineamiento, las sondas
hibridizan en el blanco en un arreglo de cabeza y cola, dejando juntos a los dos
fluorocromos para que se lleve a cabo FRET (BIO-RAD, 2012).
Marco Teórico
33
Figura 4-19. Hybridization probes (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).
-
Eclipse probes: Se utiliza dos primers y una sonda secuencia-específica. La sonda
eclipse es complementaria con una secuencia dentro del blanco y tiene un
fluorocromo en el extremo 3´ y un quencher en el extremo 5’. Cuando la sonda no
esta hibridizada esta adopta una forma de random coil uniendo al fluorocromo y al
quencher evitando la emisión de fluorescencia. Durante el alineamiento la sonda se
hibrida al blanco linearizandose, separando el quencher del fluorocromo permitiendo
la emisión de fluorescencia (BIO-RAD, 2012).
Figura 4-20. Eclipse Probes (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).
-
Amplifluor assays: En este tipo de reacciones se utiliza una pareja de primers secuenciaespecífica y un primer universal llamado UniPrimer. Una secuencia de 18nt (llamada la
secuencia Z) se extiende desde el extremo 5´de uno de los primers secuencia-
34
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
específica; esta misma secuencia forma el extremo 3´del Uniprimer. El Uniprimer forma
una estructura hairpin con un fluorocromo y un quencher en los extremos 5´y 3´del stem¸
respectivamente. En la conformación del hairpin, el fluorocromo y el quencher se
encuentran a corta distancia, por lo tanto no se emite fluorescencia. Durante el primer
ciclo de amplificación, el primer Z se hibrida con el molde y es extendido (Figura 4-21).
Durante el segundo ciclo de amplificación, el otro primer secuencia-específica, hibrida
con el producto del primero, y es usado para sintetizar un nuevo molde que contiene una
secuencia complementaria con la secuencia Z. El producto del segundo ciclo de
amplificación puede servir como el molde para el Uniprimer. En el tercer ciclo de
amplificación, el Uniprimer extendido sirve como molde para la amplificación del ciclo
siguiente ciclo de amplificación. En el cuarto ciclo, al extensión del molde a través el
Uniprimer hace que el hairpin se abra y adopte una configuración lineal, permitiendo que
se emita la fluorescencia. La amplificación exponencial usando el segundo primer
secuencia-específicay el Uniprimer ocurre en los siguientes ciclos (BIO-RAD, 2012).
Figura 4-21. Amplifluor assay. (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).
-
Scorpions primers: Se utilizan dos primers, uno que sirve como sonda y contiene una
estructura stem-loop, con un fluorocromo en el extremo 5´y el quencher en el
Marco Teórico
35
extremo 3´. Durante el primer ciclo de amplificación el primer Scorpions, es
extendido, y la secuencia complementaria a la secuencia del loop se genera en la
misma hebra (Figura 4-22). La subsecuente denaturación y alineamiento permite que
el loop de la sonda Scorpion hibride a la secuencia blanco, separando el fluorocromo
del quencher. La sonda Scorpion contiene un bloqueador de PCR en el extremo
3´del quencher para prevenir lectura corrida durante la extensión de la cadena
opuesta (BIO-RAD, 2012).
Figura 4-22. Scorpions primers. (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).
-
LUX primers: Utiliza dos primers, uno de los cuales tiene forma de hairpin con un
fluorocromo en el extremo 3´ (Figura 4-23). El reportero es apagado por la estructura
secundaria del hairpin. Durante la amplificación, el primer LUX es incluido en el
producto, permitiendo que se emita la fluorescencia del fluorocromo (BIO-RAD,
2012).
36
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Figura 4-23. LUX primers. (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).
-
QZyme primers: Se utiliza un primer secuencia-específica que contiene un
antisentido (inactivo), secuencia para un DNA catalítico, un sustrato para el DNA
catalítico (oligonucleótido), y un primer reverse secuencia-específico (Figura 4-24). El
sustrato ttiene un fluorocromo en el extremo 5´ y un quencher en el extremo 3´,
cuando el sustrato está intacto la fluorescencia es apagada. Durante el primer ciclo
de amplificación, el primer que tiene la secuencia catalítica antisentido es extendido.
En el segundo ciclo, el producto del primer ciclo sirve como molde para el primer
reverse secuencia-específico, el cual es extendido para crear un nuevo producto que
contiene la región de DNA catalítica en sentido (activo). En el siguiente paso de
alineamiento, el sustrato (oligonucleótido) marcado con un fluorocromo, hibrida con
la secuencia de DNA catalítica y es clivado. El rompimiento separa el fluorocromo del
quencher (BIO-RAD, 2012).
Marco Teórico
37
Figura 4-24. QZyme primers. (Figura Tomada de BIO-RAD, 2012).
4.4.2 RT-PCR en tiempo real para el estudio de virus en el cultivo
de la papa.
Técnicas basadas en qPCR han sido utilizadas para la detección de varios virus en el
cultivo de la papa (Boonham et al., 2000; Klerk et al., 2001; Kokkinos y Clark, 2006;
Pompe-Novak et al., 2006, Agindotan et al., 2007; Ruíz-Ruíz et al., 2007 y 2009; Osman
et al., 2008; Kogovšek et al., 2008 y 2011; Mortimer-Jones et al., 2009) incluyendo a
PYVV (López et al., 2006; Hernández et al., 2010).
A pesar del amplio uso de esta técnica para la detección de otros virus, no ha sido muy
utilizada para el estudio de PYVV, solamente López et al. (2006) hicieron uso de esta
técnica (utilizando sondas TaqMan® amplificando el gen CP) para la detección de PYVV,
en este trabajo los autores evaluaron la sensibilidad de RT – PCR y de qRT – PCR, en
donde se observó que RT – PCR era 1000 veces menos sensible que qRT – PCR,
también se realizaron reacciones multiplex (reacción en la que se incluyen varias parejas
de primers permitiendo la detección de varios blancos) en la que se incluyó una pareja de
primers con la respectiva sonda para la amplificación del gen citocromo oxidasa (control
38
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
interno de amplificación de planta) observándose que en este tipo de reacción no se
afectó la sensibilidad de la reacción.
Muchos autores también han reportado el uso de esta técnica con fines de detección en
otros virus que infectan el cultivo de la papa. Algunos han hecho uso de reacciones
múltiplex para la detección simultánea de diferentes virus, aunque no es muy común,
debido a que el proceso de estandarización y de optimización no es muy fácil. Boonham
et al. (2000) realizaron reacciones múltiplex utilizando sondas TaqMan® para la detección
de TRV and Andean potato mottle top virus (APMoV) en muestras de tubérculo. Klerk et
al. (2001) también hicieron reacciones múltiplex para la detección de PLRV y PVY a partir
de material foliar. Agindotan et al. (2007) reportaron la detección de PLRV, PVA, PVX y
PVY a partir de tubérculo. En algunos casos se ha querido implementar técnicas de alto
rendimiento para la detección de varios virus simultáneamente como la planteó MortimerJones et al. (2009) quien propuso el uso de esta técnica para la detección de PLRV,
PVX, PVS y TSWV en material foliar y tubérculo
Esta técnica no sólo se ha utilizado con fines de detección, algunos autores han
reportado su uso para estudiar diferentes aspectos de la biología de virus que infectan el
cultivo de la papa, como en los siguientes casos:
-
Kokkinos y Clark (2006) evaluaron la interacción entre virus, en donde haciendo uso
de reacciones simplex (con una sola pareja de primers) pudieron detectar miembros
del género Potyvirus: Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV), e Ipomoea vein
mosaic virus (IVMV); el miembro del género Crinivirus SPCSV; y el miembro del
género Begomovirus Sweet potato leaf curl virus (SPLCV) de plantas de S.
tuberosum infectadas. En este trabajo se pudo encontrar que las cargas virales de
SPFMV, IVMV,y SPCSV eran mayores cuando las plantas presentaban infecciones
múltiples, y al igual que lo reportado en anteriores estudios se confirmó que la
técnica de qPCR fue más sensible que la técnica de PCR.
-
Pompe Novak et al., (2006) evaluó los cambios de la expresión génica en plantas de
papa infectadas con PVYNTN, ellos encontraron que plantas infectadas inducen las
expresión de genes relacionados con respuestas a estrés como la proteína de
choque térmico, catalasa 1, β-1,3- glucanasa y genes involucrados en la fotosíntesis
Marco Teórico
-
39
Kogovšek et al. (2008) reportaron el uso de la técnica para hacer la discriminación de
razas de PVY.
-
Kogovšek et al. (2011) evaluaron la acumulación del virus PVY en diferentes órganos
de plantas de papa infectadas con PVY, el estudio indicó que el virus se encuentra
distribuido heterogéneamente, con una mayor acumulación en la zona aérea.
Esta técnica ha sido utilizada más ampliamente con otros virus miembros de la familia
Closteroviridae en particular en CTV. Ruíz-Ruíz et al. (2007) hicieron uso de esta técnica
para determinar la distribución del virus CTV en plantas infectadas, observándose que la
distribución del virus en toda la planta no es homogénea y que se concentra
principalmente en la corteza y frutos que en las hojas y raíces, posiblemente en el caso
de PYVV, la distribución del virus también sea diferencial, aunque aún no se sabe si
exista un tropismo en particular por determinados órganos de la planta infectada, como
ya está documentado para CTV. Un par de años más tarde Ruíz-Ruíz et al. (2009)
también le dio otra aplicación a esta técnica, utilizándola para la discriminación de
aislados de CTV (moderados y severos), para lograrlo se diseñó una pareja de primers
(diseñados a partir de regiones altamente conservadas), que permitieran la amplificación
de cualquier aislado de CTV y tres sondas específicas conservadas para que permitieran
reconocer cada uno de los aislados.
Dentro de familia Closteroviridae también se han hecho varios estudios de detección por
qPCR del virus Grapevine leafroll associated virus (GLaV) debido a la gran importancia
que este virus representa para la industria del vino. Osman et al. (2008) utilizaron
arreglos de baja densidad basados en qPCR con fines de diagnóstico.
5. Metodología, Resultados y Discusión
El análisis de la acumulación de PYVV utilizando qPCR en aislamientos de foliolo, tallo,
flor, raíz y principalmente tubérculo (diferentes brotes de un tubérculo) de plantas de S.
tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas con PYVV, se explica en
tres artículos científicos, detallando en cada uno de ellos la metodología, los resultados
obtenidos y la discusión, los cuales corresponden a los objetivos propuestos en la
presente investigación (Tabla 5-1).
Tabla 5-1. Artículos planteados para la presentación de metodología, resultados y discusión.
Objetivo
Artículo
Evaluación de tres métodos de extracción de
1. Comparar métodos de extracción de RNA
RNA para la detección por RT-PCR del Potato
en diferentes órganos de plantas de S.
yellow vein virus (PYVV) en diferentes órganos
tuberosum Grupo Phureja variedad
de plantas de Solanum. tuberosum Grupo
Colombia Criolla infectadas con PYVV
Phureja variedad Colombia Criolla.
PCR en tiempo real para la detección y
2. Evaluar la distribución-carga viral de PYVV
cuantificación de Potato yellow vein virus
en diferentes órganos de plantas de S.
(PYVV) en diferentes órganos de plantas de
tuberosum Grupo Phureja infectadas con el
Solanum. tuberosum Grupo Phureja variedad
virus
Criolla Colombia infectadas con el virus
Evaluación de la distribución del Potato yellow
3. Determinar la carga viral de PYVV en un
vein virus (PYVV) en brotes de tubérculos de
grupo de muestras de brotes de tubérculos
Solanum tuberosum Grupo Phureja utilizando
de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja
cuantificación absoluta por la técnica de PCR
infectadas con el virus
en tiempo real (qPCR) con Sondas TaqMan®.
Los resultados del primer artículo están plasmados en el artículo: “Comparación de
métodos de extracción 1 de RNA para la detección por RT-PCR del Potato yellow vein
virus (PYVV) en diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja” que ya fue
sometido a la Revista Colombiana de Biotecnología.
Los resultados del tercer objetivo hacen parte del artículo: “Tracking foliar symptoms
caused by tuber-borne Potato yellow vein virus (PYVV) in Solanum phureja (Juz et Buk)
cultivar “Criolla Colombia” ya sometido a la revista American Journal of Potato Research
(#AJPR-D-12-00392).
42
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
5.1 Resumen de la metodología del objetivo 1.
Figura 5-1. Esquema representativo de la metodología para comparar tres métodos de extracción
de RNA en diferentes órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja infectadas con PYVV.
Los valores en el paréntesis corresponden al número de muestras evaluadas por cada órgano.
Resumen de la metodología
43
5.2 Resúmen de la metodología del objetivo 2
Figura 5-2. Esquema representativo de la metodología para evaluar la distribución-carga viral de
PYVV en diferentes órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja infectadas con el virus.
44
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
5.3 Resúmen de la metodología del objetivo 3
Figura 5-3. Esquema representativo de la metodología para determinar la carga viral de PYVV en
un grupo de muestras de brotes de tubérculos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja
infectadas con el virus.
6. Artículo 1.
Evaluación de tres métodos de extracción de RNA
para la detección del Potato yellow vein virus
(PYVV) por RT-PCR a partir de muestras de
diferentes órganos de plantas de Solanum
tuberosum Grupo Phureja
Resumen
Potato yellow vein virus (PYVV) género Crinivirus, contiene genoma tripartita de RNA
positivo, se limita al floema de la planta y causa pérdidas en la producción entre 25% y
más del 50%. PYVV es un virus re-emergente, clasificado como cuarentenario por
agencias fitosanitarias en Europa y Estados Unidos. La detección se ha reportado en
muestras de brotes de tubérculo y foliolo utilizando RT-PCR, NASH y PCR en tiempo
real. No se sabe si PYVV se distribuye homogéneamente en toda la planta y si todos los
métodos de extracción de RNA son igualmente eficientes. Por lo tanto, el objetivo de este
trabajo fue detectar al virus en diferentes órganos (foliolo, peciolo, pedúnculo floral,
pétalos, tallo, raíz, antera y brotes de tubérculo) amplificando el gen de la proteina mayor
de la cápside por RT-PCR, para lo cual se evaluaron tres métodos de extracción: uno
basado en Trizol® (Invitrogen), uno basado en bromuro de hexadecil trimetil amonio
(CTAB) y fenol – cloroformo seguido por purificación con columnas de Sephadex G-50. A
cada método se le estimó la integridad (relación de las subunidades ribosomales
28S/18S), calidad (relación de las lecturas espectrofométricas 260/280nm) y rendimiento
de los extractos obtenidos. Con los tres métodos se detectó PYVV en todos los órganos
analizados. No se presentaron diferencias estadísticamente significativas entre los tres
métodos de extracción; sin embargo, por Trizol® (Invitrogen) se obtuvo extractos con
mayores valores de rendimiento, calidad e integridad, además se logró la detección del
46
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
virus por RT-PCR en todos los órganos evaluados (raíz, brote de tubérculo, tallo, foliolo,
pedúnculo floral, antera y pétalos).
Palabras claves: Solanum tuberosum, papa criolla, virus, extracción de RNA, detección.
6.1 Introducción
Potato yellow vein virus (PYVV) es un virus re-emergente, limitado al floema, miembro de
la familia Closteroviridae y del género Crinivirus (Salazar et al., 2000; Martelli et al.,
2002); sus partículas son filamentosas (Salazar et al., 2000) y su genoma es tripartita
ssRNA(+) (Livieratos et al., 2004). La enfermedad del amarillamiento de las nervaduras
de la hoja de papa (PYVD) fue observada por primera vez por Alba (1950) en Antioquia
(Colombia) y debido al incremento en las poblaciones del vector (Trialeurodes
vaporariorum, Westwood; Buriticá, 1971). y al transporte indiscriminado de tubérculossemilla, el virus se ha dispersado en Colombia y países vecinos como Venezuela, Perú y
Ecuador (Salazar et al., 2000). Los síntomas de PYVD son un amarillamiento apical de
nervaduras primarias y secundarias que puede extenderse a todo el folíolo conllevando a
reducción de la producción hasta un 50% en Solanum tuberosum Grupo Tuberosum cv
Diacol Capiro (Salazar et al., 2000) y aproximadamente 30 % en S. tuberosum Grupo
Phureja (Guzmán et al., 2011). Por esta razón es considerado un patógeno cuarentenario
por varias agencias fitosanitarias como OEPP-EPPO (European and Mediterranean Plant
Protection Organization) y USDA - APHIS (United States Department of Agriculture Animal and Plant Health Inspection Service) (OEPP/EPPO, 1979; USDA – APHIS, 2000).
PYVV se ha detectado molecularmente por medio de sondas utilizando NASH (Salazar et
al., 2000), amplificación de genes por RT-PCR (Offei et al., 2004; Guzmán et al., 2006;
2010; Wei et al., 2009) y por PCR en tiempo real (qPCR) (López et al., 2006; Hernández
et al., 2010). Esta última técnica es muy sensible, sin embargo, RT-PCR es de uso
rutinario para su diagnóstico (Guzmán et al., 2006; Guzmán y Rodríguez, 2010; FrancoLara et al., 2009). Para que esta técnica sea exitosa es necesario contar con buenos
extractos de RNA, en particular en plantas de papa debido a que algunos órganos
presentan una alta oxidación además de la presencia de paredes celulares, pigmentos,
polisacáridos, polifenoles y otros metabolitos secundarios que coprecipitan con el RNA
afectando el rendimiento y calidad de los mismos (Claros y Canovas, 1998; Kim y
Hamada, 2005).
Artículo 1. Evaluación de tres métodos de extracción de RNA para la
detección del Potato yellow vein virus (PYVV) por RT-PCR a partir de
muestras de diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo
Phureja.
47
Se han reportado métodos de extracción de ácidos nucléicos, algunos podrían estar
clasificados en algunas de las siguientes categorías: basados en tioisocianato de
guanidina (Trizol®, Invitrogen; Chomczynski, 1993), basados en CTAB (Chang et al.,
1993) y basados en fenol:cloroformo.
Uno de los principales problemas durante la extracción de RNA es la actividad de las
nucleasas; el tioisocianato de guanidina inhibe la actividad de estas enzimas mejorando
la calidad del RNA (Chomczynski, 1993); en esta categoría se encuentra el producto
comercial Trizol® (Invitrogen) compuesto por una mezcla de tioisocianato de guanidina
(GTC), fenol, acetato de sodio, lauryl sarcosyl de sodio (Sarkosyl) y otros agentes
desnaturalizantes fuertes que permiten la extracción del RNA total (Liu et al., 1998).
En el método basado en CTAB se utiliza este detergente catiónico que solubiliza las
membranas celulares liberando los ácidos nucleídos y cuando se trabaja con soluciones
de alta concentración iónica forma complejos con los ácidos nucleicos permitiendo su
precipitación (Chang et al., 1993). A pesar de que hay muchas modificaciones de este
protocolo, durante el procedimiento se debe utilizar iones Na+ a una alta concentración
para crear un ambiente molecular de alta fuerza iónica favoreciendo la eliminación de
compuestos contaminantes (Chang et al., 1993; Meisel et al., 2005). Como agente
inhibidor de ribonucleasas se utiliza ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (John, 1992;
Kiefer et al., 2000).
La extracción de RNA utilizando fenol:cloroformo hace uso de un buffer que contiene
SDS (Docecil sulfato sódico), que es un detergente iónico que permite el rompimiento de
las membranas celulares liberando el contenido intracelular y posteriormente por la
utilización de fenol saturado en un buffer ácido se permite la extracción diferencial de
RNA, posteriormente se adiciona cloroformo que se encarga de denaturar las proteínas
haciéndolas solubles en la fase orgánica o interfase (Sambrook, et al., 1989). En este
trabajo se empleó el protocolo utilizado por Guzmán et al. (2006) en donde en la fase
final no se hace precipitación del RNA sino que este es purificado a través de una
columna de sephadex G-50 permitiendo la desalinización y eliminación de compuestos
fenólicos presentes en los extractos de RNA impuros (Sambrook et al., 1989)
48
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
PYVV se limita al floema (Salazar et al., 2000) y solamente se ha informado la detección
molecular a partir de muestras de foliolo y brotes de tubérculos (Salazar et al., 2000;
López et al., 2006; Guzmán et al., 2006; Wei et al., 2009; Guzmán et al., 2010;
Hernández et al., 2010). Aunque los virus se mueven dentro de la planta vía floema
(Serón y Haenni; 1996) no se sabe todavía si PYVV se puede detectar exitosamente en
todos los órganos. Por tal motivo, el objetivo de este trabajo fue evaluar tres métodos de
extracción para la obtención de RNA a partir de diferentes órganos (tallo, foliolo, peciolo,
raíz, pedúnculo floral, pétalos y anteras) de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja
infectadas con PYVV para determinar cuál es el más apropiado para la detección de
PYVV en diferentes órganos de plantas infectadas por RT-PCR. La extracción de RNA de
alta calidad es útil en diferentes estudios virales para monitorear la presencia y dispersión
del virus en diferentes órganos, en programas de fitomejoramiento, de certificación de
semillas e indexación de material vegetal.
6.2 Materiales y Métodos
6.2.1 Material vegetal y aislados virales
Se hizo una visita a cultivos de papa en el municipio de Chipaque (Cundinamarca) donde
se tomaron tres plantas completas de papa criolla con sintomatología de PYVD que
tenían una edad de aproximadamente dos meses. Estas fueron sembradas en materas
utilizando como sustrato una mezcla de tierra:cascarilla de arroz (3:1) y se mantuvieron
en el patio del IBUN durante dos meses. Las plantas fueron regadas con agua dos veces
por semana y fueron fertilizadas con 15:15:15 (Nitrógeno: Fósforo: Potasio) el día de la
siembra en matera y un mes después. Adicionalmente se hizo control para hongos
fumigando una vez a la semana con Benlate 0.1% y para el control de mosca blanca
fumigando dos veces a la semana con Karate® 1.5cc/L.
6.2.2 Evaluación de los protocolos de extracción de RNA
Para determinar cuál es el mejor método de extracción para la obtención de RNA a partir
de diferentes órganos se evaluaron las tres metodologías de extracción de RNA
previamente reportadas en estudios de PYVV: uno basado en CTAB (López et al., 2006),
Trizol® (Invitrogen) y fenol:cloroformo con purificación por Sephadex G-50 (Guzmán et
Artículo 1. Evaluación de tres métodos de extracción de RNA para la
detección del Potato yellow vein virus (PYVV) por RT-PCR a partir de
muestras de diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo
Phureja.
49
al., 2006). Para esto se tomaron muestras de raíz, brotes de tubérculo, tallo, foliolo,
pétalo, antera y pedúnculo floral de S. tuberosum Grupo Phureja infectadas con PYVV
(Tabla 6-1), estas fueron recolectadas y pulverizadas de inmediato con nitrógeno líquido
para procesarlas por las tres metodologías. Se evaluaron 84 muestras por cada método
de extracción (4 de antera y 10 por cada uno de los órganos restantes).
Tabla 6-1 Muestras utilizadas para hacer la evaluación de los métodos de extracción por órgano
Número de muestras/
método de extracción
Zona
Órgano
Fenol/Cloroformo
Trizol
CTAB
Sephadex
Primaria
10
10
10
Radical Raíz
Secundaria
10
10
10
Brote de tubérculo
10
10
10
Foliolo
10
10
10
Pedúnculo
10
10
10
Flor
Pétalos
10
10
10
Aérea
Anteras
4
4
4
Primario
10
10
10
Tallo
Secundario (Peciolo)
10
10
10
Métodos de extracción de RNA
Extracción de RNA total con Trizol® (Invitrogen): Se partió de 100mg de tejido vegetal el
cual fue procesado de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Anexo A.1).
Extracción de RNA total con CTAB: Se partió de 150mg de tejido vegetal que fue
procesado utilizando el protocolo propuesto por López et al. (2006) (Anexo A.2).
Extracción de dsRNA con fenol:cloroformo/Sephadex: Se partió de 100mg de material
vegetal y se procesó teniendo en cuenta el protocolo propuesto por Guzmán et al. (2006)
.(Anexo A.3). En este protocolo se hizo una extracción inicial de RNA con
fenol:cloroformo el cual fue purificado a través de columnas de Sephadex G-50, Esta es
una columna de exclusión que permite la separación de moléculas entre 1.5 y 30KDa.
Todos los extractos de RNA fueron resuspendidos en 30µl de agua tratada con DEPC y
almacenados a -20°C hasta su procesamiento.
50
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Determinación de la concentración y evaluación de la calidad de los
extractos de RNA
Para la determinación de la concentración de RNA se utilizó fluorimetría con el kit QuantiTTM RiboGreen Assay (Invitrogen) teniendo en cuenta las instrucciones del fabricante
(Anexo B.1), la concentración de todos los extractos se ajustó a 20ng/µl.
Se calculó el rendimiento del proceso de extracción de RNA teniendo en cuenta la
siguiente ecuación:
La calidad de los extractos de RNA fue evaluada por espectrofotometría; para esto se
diluyó 10µl del extracto de RNA con 990µl de agua tratada con DEPC y utilizando una
celda de cuarzo de 1ml se hicieron lecturas a 260 y 280nm en un espectrofotómetro
SmartSpecTM Plus (BIO-RAD). Para la evaluación de la calidad se hizo la relación
260nm/280nm la cual debe tener un valor superior a 1.8, asumiendo que cuando el valor
es igual a 2 el extracto es puro (Sambrook et al., 1989).
Determinación de la integridad de los extractos de RNA
Los extractos fueron corridos en geles de agarosa denaturantes (Anexo C.1) y
posteriormente se estimó la intensidad de las bandas correspondientes a las
subunidades 28S y 18S utilizando el software ImageJ 1.37 (Anexo C.2) (Rasband, 1997).
Finalmente se estimó el radio de las intensidades 28S/18S.
Síntesis de cDNA
Los extractos obtenidos por las tres metodologías de extracción fueron evaluados por
RT-PCR utilizando una pareja de primers para la detección del gen completo de la
proteína mayor de la cápside de PYVV (769pb) (Rodríguez et al., 2009) (Tabla 6-2). La
síntesis de cDNA se llevo a cabo en un volumen final de 10µl adicionando una mezcla de
1X buffer de reacción (Epicentre), 1mM de dNTPs (Bioline), 10mM de DTT (Epicentre),
0.4µM de primer 3´ (Tabla 7-2), 1.6U de RNAse inhibitor (Fermentas), 8U de MMLV HP
(Epicentre) y 100ng de RNA, se incubó durante una hora a 42°C seguida de una
denaturación a 70°C por 10min.
Artículo 1. Evaluación de tres métodos de extracción de RNA para la
detección del Potato yellow vein virus (PYVV) por RT-PCR a partir de
muestras de diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo
Phureja.
51
PCR
Las reacciones de amplificación contenían 1.6µl de cDNA, 1X de buffer NH4 (Bioline),
2.5mM de MgCl2 (Bioline), 0.4µM de dNTPs (Bioline), 0.4µM de cada primer (F2/3´)
(Tabla 6-2) y 1U de Biolasa (Bioline) en un volumen final de 10µl. El programa de
amplificación consistió de una denaturación inicial a 94ºC durante 3min, 35 ciclos de
denaturación a 94ºC durante 1min, alineamiento a 55ºC durante 1min y extensión a 72ºC
durante 1min, y una extensión final a 72ºC durante 10min, condiciones que fueron
previamente establecidas en la Laboratorio de Virus vegetales del IBUN (Guzmán et al.,
2006).
Tabla 6-2. Primers para la amplificación del gen completo de la proteína mayor de la cápside de
PYVV.
Secuencia
Referencia
Primer Dirección
3´
Reverse
5’ AAG CTT CTA CTC AAT AGA TCC TGC TA 3’
Rodríguez et al., 2009
F2
Forward
5’ CTC GAG GAT CCT CAT GGA AAT CCG AT 3’
Como control positivo se utilizó una muestra de planta que expresaba síntomas para
PYVV y que había sido positiva por RT-PCR y como controles negativos una muestra de
Calamondino (Citrofortunella madurensis, Lour) infectada con CTV y una muestra de S.
tuberosum Grupo Phureja libre de virus (obtenida por cultivo in vitro de meristemos
donada por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del IBUN). Los productos de PCR fueron
visualizados en geles de agarosa 1% preparados en TAE 1X (0.04M Tris-Acetato,
0.001M EDTA) y teñidos con SYBR®Safe (Invitrogen), corridos a 70V constantes durante
una hora y visualizados en digitalizador Gel Doc® (BIO-RAD).
6.2.3 Análisis Estadísticos
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el Software R (R Development Core
Team, 2008). La distribución de todos los datos fue evaluada utilizando el test de
normalidad Shapiro Wilk. Debido a que los resultados no presentaron una distribución
normal las comparaciones entre los órganos por método de extracción y entre métodos
de extracción por órgano se determinaron mediante la aplicación de una prueba MannWhitney acompañada de la corrección de Bonferroni a nivel de significancia (p<0.05)
para controlar la tasa de error (Yuan et al., 2006). Adicionalmente, se realizó un análisis
de componentes principales para evaluar las relaciones entre los parámetros
52
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
cuantitativos. Adicionalmente, se realizó un análisis factorial no paramétrico utilizando la
prueba de Kruskall-Wallis para analizar si el
6.3 Resultados y Discusión
En este trabajo se evaluaron tres métodos de extracción de RNA en términos de la
calidad, integridad, rendimiento, y amplificación por RT-PCR del gen CP de PYVV a partir
de diferentes órganos de plantas de papa criolla infectadas, para la selección del mejor
método de extracción que permita la detección del virus en varios órganos de plantas
infectadas mediante RT-PCR.
6.3.1 Rendimiento de la extracción de RNA, radio de la
absorbancia 260/280nm y radio de la intensidad de las
subunidades ribosomales 28S/18S.
En la tabla 7-3 se muestra el rendimiento (ng RNA/mg material vegetal) obtenido con
cada una de las tres metodologías de extracción empleadas, indicando también la
calidad o pureza del RNA con base en la presencia o no de contaminantes proteicos a
través de la relación de absorbancia (260/280nm), la integridad con relación a las
subunidades ribosomales (28S/18S), y la eficiencia de amplificación con relación a todas
las muestras analizadas por amplificación por RT-PCR (número de muestras
amplificadas sobre el total de muestras extraídas ) a partir de cada uno de los extractos
de RNA obtenidos.
Como se puede observar el rendimiento de RNA obtenido con Trizol® (Invitrogen) fue
casi el doble y significativamente mayor (414.25 24 ngRNA/mg de material vegetal) que
el obtenido con los otros dos métodos de extracción (Sephadex: 283.17 14.43 y CTAB:
248.99 16) (p<0.05). El resultado de rango de calidad del RNA, en el que se estima si
hay o no contaminación con proteínas indicó mejor calidad obtenida por el método Trizol®
(Invitrogen), debido a que este presentó valores más cercanos a dos en comparación con
los otros métodos de extracción. Con relación a la integridad esta fue similar en los tres
métodos de extracción, en donde el rango fue amplio para los tres casos, en algunos
extractos se presentó degradación de RNA (los que presentan valores lejanos de dos).
Artículo 1. Evaluación de tres métodos de extracción de RNA para la
detección del Potato yellow vein virus (PYVV) por RT-PCR a partir de
muestras de diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo
Phureja.
53
Finalmente con los tres métodos de extracción se pudo amplificar el gen de la proteína
mayor de la cápside en un número similar de muestras, aunque por Trizol® (Invitrogen)
se logró detectar el virus en un mayor número de muestras.
Tabla 6-3. Resúmen de resultados de los parámetros evaluados para cada método de extracción
Trizol
CTAB
Sephadex
Promedio del rendimiento
414.25 24
248.99 16
283.17 14.43
(ng RNA/mg material vegetal)
Rango de la calidad
1.65 – 2.05
1.34 – 1.93
1.39 – 1.98
(260/280nm)
Rango de la integridad
1 – 1.98
1.17 – 2.13
0.87 – 1.97
(28S/18S)
Muestras amplificadas
75/84
71/84
72/84
por RT-PCR
En la Figura 6-1A se presenta el rendimiento promedio obtenido en cada órgano por
método de extracción. En todos los órganos el mayor rendimiento se presentó en los
extractos obtenidos por Trizol® (Invitrogen) (Figura 6-1A, cajas de color verde), (p<0.05) y
el menor en los extractos obtenidos por CTAB (excepto en brotes de tubérculo en donde
el menor rendimiento se presentó en los extractos obtenidos con Sephadex) (Figura 6-1ª,
cajas de color azul).
Para la determinación de la calidad de los extractos de RNA se calculó la relación de las
lecturas espectrofométricas a 260nm y 280nm, el cual se debe encontrar entre 1.8 y 2.0
para ser considerado de buena calidad asumiendo que un valor de dos corresponde a un
RNA puro (Sambrook et al., 1989; Staub et al., 1995). Este valor presentó un rango entre
1.65 a 2.05 en los extractos obtenidos por Trizol® (Invitrogen) (Tabla 6-3) lo que indica
que en algunas muestras no hubo contaminación con proteínas y en otras la
contaminación fue baja, los valores de la relación fueron similares entre los otros
métodos de extracción: con el método basado en CTAB la relación se encontró entre
1.34 y 1.93 y en el método fenol:cloroformo seguido de purificación con Sephadex los
valores se encontraron entre 1.39 y 1.98 (Tabla 6-3); lo que indica que en algunos casos
se presentó contaminación por proteínas.
En la Figura 6-1B se presenta la distribución del radio de la absorbancia 260/280nm en
cada órgano por método de extracción. En todos los órganos evaluados la mayor relación
260/280 se encontró en los extractos obtenidos por Trizol® (Invitrogen) (Figura 6-1B,
54
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Figura 6-1. A. Distribución del rendimiento de RNA (ng RNA/mg de tejido vegetal). B. Distribución
de la relación de la absorbancia 260/280nm. C. Distribución de la relación 28S/18S de los
extractos de RNA por órgano en las tres metodologías de extracción. Las cajas de color azul
corresponden a los extractos obtenidos por CTAB, las de color rojo a los extractos obtenidos por
®
Sephadex y las de color verde a los extractos obtenidos por Trizol (Invitrogen).
Artículo 1. Evaluación de tres métodos de extracción de RNA para la
detección del Potato yellow vein virus (PYVV) por RT-PCR a partir de
muestras de diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo
Phureja.
55
cajas de color verde) en algunos órganos la menor relación 260/280nm se presentó en
extractos obtenidos por CTAB (antera, foliolo, pétalo y raíz primaria), y en otros órganos
(peciolo, pedúnculo floral, tallo y raíz secundaria) la menor relación se presentó en los
extractos obtenidos por fenol:cloroformo seguido por purificación con Sephadex. (Figura
6-1B, cajas de color azul y rojo); lo que sugiere que Trizol® (Invitrogen) es más eficiente
en la eliminación de proteínas que los otros dos métodos de extracción, esto puede
deberse a que en este método se utilizan cuatro agentes denaturantes para cumplir con
esta función (sarkosyl, tioisocianato de guanidina, clorofomo y fenol) además se adiciona
acetato de sodio que contribuye con la precipitación de las proteínas denaturadas,
mientras que en los otros dos métodos de extracción sólo se utilizan dos agentes
denaturantes (fenol y cloroformo) (Tabla 6-5).
Adicionalmente se determinó la integridad de los extractos de RNA a partir de geles
denaturantes de agarosa en donde todas las muestras evaluadas (excepto las muestras
de raíz) mostraron dos bandas claras que representan las subunidades ribosomales 18S
y 28S (Figura 6-2), a partir de estos geles se estimó la densidad de las subunidades
ribosomales 28S y 18S, en donde se considera que un RNA que se encuentra casi
intacto debe presentar una relación 28S/18S igual o superior a dos (Conde et al., 2012).
Figura 6-2. Gel denaturante de agarosa 1% para la determinación de la densidad de las bandas
28S y 18S. En los tres carriles se encuentran extractos de RNA de muestras de tallo obtenidos por
®
Trizol (Invitrogen). Los carriles 1 y 3 corresponden a extractos con buena integridad de RNA
debido a que la relación 28S/18S fue cercana a 2. En el carril 2 hay un extracto en donde se
evidencia que hay un cierto grado de degradación debido a que la intensidad de las dos bandas
es similar.
56
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
En la Figura 6-1C se encuentra la distribución de la relación de intensidad de las
subunidades ribosomales 28S/18S en cada órgano por método de extracción. Los
extractos obtenidos por Trizol® (Invitrogen) presentaron un radio de intensidad 28S/18S
entre 1 y 1.98, los extractos obtenidos por el método basado en CTAB entre 1.17 y 2.13 y
los extractos obtenidos por fenol cloroformo seguido por purificación con Sephadex entre
0.87 y 1.97 (Tabla 6-3), lo que indica que en los tres métodos de extracción algunas
muestras presentaron degradación de los extractos de RNA. Particularmente en las
muestras de raíz primaria y secundaria, en raíz secundaria no se logró la estimación del
radio en la mayoría de las muestras debido a que los geles presentaron un barrido que
no permitió la distinción de las dos bandas; esto pudo deberse a que la integridad puede
ser influenciada fuertemente por el proceso de maceración del material vegetal, en el que
se liberan nucleasas que conducen a la degradación de los ácidos nucleicos. La raíz fue
el tejido de mayor dificultad en la maceración por lo tanto es posible que durante este
proceso el RNA se haya visto afectado por estas enzimas.
Se encontró que en la mayoría de los órganos de la planta de papa criolla, excepto la raíz
y pedúnculo floral los mayores valores de la relación 28S/18S se presentaron cuando la
extracción se realizó con Trizol® (Invitrogen) lo que sugiere que en este método el
tioisocianato de guanidina es más eficiente para la inactivación de RNasas, debido a que
su espectro es mayor por su función de agente caotrópico que también contribuye con la
denaturación de otras proteínas, lo que no sucede con el EDTA que es la sustancia que
se utiliza para la inhibición de RNasas por los otros dos métodos de extracción (Tabla 65), su espectro no es tan alto como el de tioisocianato de guanidina porque este sólo
actúa sobre las nucleasas que tiene como cofactor Mg2+, este agente quelante no puede
actuar sobre nucleasas que funcionen sin cofactor (Sambrook et al., 1989).
La calidad y cantidad de RNA obtenida en un proceso de extracción puede afectarse por
la presencia de sustancias fenólicas en los extractos de RNA (Kansal et al., 2008).
Aunque en este trabajo no se evaluó la presencia de estas sustancias, es posible que la
menor calidad y cantidad en los extractos obtenidos por el método basado en CTAB y el
método de fenol:cloroformo seguido por purificación con Sephadex podría ser el
resultado de la coprecipitación de polisacáridos y oxidación de compuestos fenólicos que
interactúan irreversiblemente con los ácidos nucleicos (Chan et al., 2004).
Artículo 1. Evaluación de tres métodos de extracción de RNA para la
detección del Potato yellow vein virus (PYVV) por RT-PCR a partir de
muestras de diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo
Phureja.
57
Finalmente se evaluó si el método de extracción de RNA, el órgano y la interacción entre
estos dos factores afecta el rendimiento, el radio de absorbancia 260/280nm y el radio de
intensidad de las subunidades ribosomales 28S/18S. Se determinó que los dos factores
independientes y, la interacción de los dos, afecta los tres parámetros evaluados
(p<0.05) (Tabla 6-4). Este aspecto debería ser tenido en cuenta en procesos de
muestreo de material vegetal y de selección de métodos de extracción, debido a que de
acuerdo al órgano o al método de extracción se puede obtener RNA de muy buena ó
mala calidad y cantidad.
Tabla 6-4. Efecto del órgano, método de extracción de RNA y su interacción en el rendimiento,
calidad e integridad
Valores de p de prueba de Kruskall-Wallis
Parámetro
Órgano
Método
Interacción Órgano – Método
-16
-16
-15
Rendimiento
< 2.6 10
< 2.6 10
1.65 10
-16
-5
Calidad
0.0408
< 2.6 10
1.35 10
-16
-10
-12
Integridad
< 2.6 10
2.82 10
2.42 10
6.3.2 Diferencias entre los tres métodos de extracción
Algunas sustancias utilizadas en las fases de extracción y de precipitación son distintas
en los tres métodos. En la tabla 6-5 se observan las diferencias entre los tres métodos de
extracción de RNA las cuales podrían afectar el rendimiento, la integridad y calidad del
RNA.
Tabla 6-5. Diferencias entre los tres métodos de extracción
Agente para el
rompimiento de las células
Agente denaturante
de proteínas
Agente inhibidor de RNasas
Eliminación de carbohidratos
Trizol
Sarkosyl
Tioisocianato de Guanidina
Sarkosyl
Tioisocianato de Guanidina
Cloroformo
Fenol
Tioisocianato de Guanidina
Fenol
Cloroformo
Eliminación de compuestos
Fenólicos
Cloroformo
Precipitación de RNA
Tiempo
Isopropanol
1h 30min
CTAB
Sephadex
CTAB
SDS
CTAB
Cloroformo: isoamil-alcohol
Fenol
Cloroformo
EDTA
EDTA
Fenol
Cloroformo
Cloroformo
Cloroformo: isoamil-alcohol
PVP-40
Na2SO3
LiCl
2h
Cloroformo
Sephadex
45min
58
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Fase de extracción de ácidos nucleicos
En la fase de extracción la diferencia radica principalmente en el buffer, en donde el
agente utilizado para el rompimiento de las células (detergente o surfactante) tiene un
gran efecto sobre la integridad y rendimiento del RNA.
En el método CTAB el agente que se utiliza para el rompimiento de las células es CTAB
que es un detergente catiónico, mientras que el detergente aniónico SDS se utiliza en el
método fenol:cloroformo seguido de purificación con Sephadex. Por otro lado, en el
método Trizol® (Invitrogen) el agente es sarkosyl en compañía de tioisocianato de
guanidina que además de ayudar al rompimiento de las células actúa como un inhibidor
de RNasas (Tabla 6-5). Por lo tanto, la fase de extracción podría ser más eficiente en el
método de Trizol® (Invitrogen) en donde se utilizan dos agentes que ayudan a romper las
células además contribuyen con la denaturación de proteínas, asimismo este reactivo
tiene otros agentes denaturantes fuertes (no revelados) (Liu et al., 1998) que pueden
contribuir con la extracción reflejándose en un mayor rendimiento y una mejor calidad
(radio de la absorbancia 260/280nm) en los extractos obtenidos por este método de
extracción; mientras que en los otros dos métodos de extracción esta función sólo es
llevada a cabo por un detergente. Sin embargo, CTAB y SDS son detergentes iónicos
que tienen una fuerte capacidad de rompimiento de membranas.
Otro de los aspectos a tener en cuenta en la composición del buffer es la presencia de
sales sobre todo cuando el detergente utilizado es catiónico como el caso de CTAB, las
sales permiten la solubilización del RNA evitando que el detergente catiónico forme
complejos con el RNA, en algunos casos no sólo se solubiliza el RNA, sino también otras
sustancias como proteínas y polisacáridos afectando la calidad del RNA. Por esta razón,
es posible que en los extractos obtenidos por CTAB se presentaron valores más bajos
del radio 260/280nm.
Fase de precipitación de RNA
Los ácidos nucleicos son solubles en agua debido a que son polares por lo tanto pueden
interactuar electrostáticamente con las moléculas de agua (Sambrook et al., 1989). En
los métodos de extracción generalmente se utilizan sales con el objetivo de neutralizar
las cargas en las moléculas de RNA debido a que en solución las sales forman iones, por
lo tanto, los cationes producidos reaccionarían con los grupos fosfatos de las moléculas
Artículo 1. Evaluación de tres métodos de extracción de RNA para la
detección del Potato yellow vein virus (PYVV) por RT-PCR a partir de
muestras de diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo
Phureja.
59
de RNA, disminuyendo su solubilidad. Posteriormente, con la adición de etanol se
disminuye la hidrofilicidad de las moléculas de RNA conllevando a su precipitación
(Sambrook et al., 1989).
Una de las diferencias en los tres métodos de extracción de RNA utilizados fue el
proceso de precipitación: en el método basado en fenol:cloroformo seguido de
purificación por Sephadex no hay un proceso de precipitación como tal, en el método
basado en CTAB la precipitación se basa en LiCl, mientras que por Trizol® (invitrogen) la
precipitación se hizo con Isopropanol (Tabla 6-5).
Con el método basado en CTAB se obtuvo el menor rendimiento en la mayoría de los
órganos evaluados (excepto en brotes de tubérculo). La precipitación del RNA se realizó
con LiCl debido a que este permite la deshidratación del RNA haciendo que las
moléculas se agreguen contribuyendo con su precipitación, su gran utilidad en la
precipitación de RNA se ha atribuido a que este no es eficiente para precipitar sustancias
como DNA, proteínas y carbohidratos, permitiendo una precipitación eficiente del RNA
(Barlow et al., 1993). A pesar de esto, Chan et al. (2004) y Rubio y Zapata (2011) han
reportado que en algunas ocasiones las altas concentraciones de LiCl pueden contribuir
con un incremento en las cantidad de impurezas (polifenoles y carbohidratos) cuando se
realizan extracciones de RNA, lo cual afecta la concentración y calidad del RNA; que
posiblemente fue lo que pudo haber afectado el rendimiento en los extractos obtenidos
por este método.
A pesar de que por el método basado en CTAB se obtuvo el menor rendimiento, las
diferencias no fueron significativas (p<0.05) con respecto a los extractos obtenidos por
fenol cloroformo seguido por purificación con Sephadex en donde no se realizó un
proceso de precipitación. En este método el extracto impuro es purificado por medio de la
utilización de columnas de exclusión con Sephadex G-50 en donde se permite que
moléculas grandes como RNA (en particular de doble cadena) pasen rápidamente a
través de la columna y en la resina se quedan atrapadas moléculas de pequeño tamaño
como sales y fenoles (Amershan Biosciences, 2002). Probablemente durante el proceso
de purificación se disminuye el rendimiento debido a que través de la columna pueden
pasar algunas sustancias de alto peso molecular como polisacáridos y polifenoles,
60
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
proteínas de alto peso molecular, entre otras que afectan el rendimiento y calidad de los
extractos obtenidos por este método de extracción.
6.3.3 Relación entre calidad, integridad y rendimiento
En la Figura 6-3 se muestran los resultados del análisis de componentes principales, en
donde en la Figura 6-3ª se muestra el circulo de correlaciones de la integridad,
rendimiento y calidad, observándose, que integridad y rendimiento se encuentran
correlacionados debido a que el ángulo que se formó entre los dos vectores es pequeño,
esto puede ser debido a que una de las etapas más importantes durante la extracción es
la fase inicial (maceración del material vegetal y extracción) porque se da la liberación de
nucleasas que afectan el proceso de extracción, por lo tanto si no se tiene especial
atención en este aspecto se presentará una degradación del RNA (integridad) que a su
vez afectará el rendimiento de la extracción. A partir del círculo de correlaciones se
puede observar que los extractos de mayor calidad, rendimiento e integridad se
encuentran ubicados en los cuadrantes izquierdos.
En la Figura 6-3B se observan los resultados del análisis de componentes principales
agrupados por método de extracción en donde ser observa que no hay diferencias
estadísticamente significativas entre los tres métodos de extracción, a pesar de las
diferencias encontradas en los tres métodos de extracción y de que los parámetros
revisados hasta el momento parecen indicar que Trizol® (Invitrogen) reúne un mayor
número de atributos en términos de calidad, cantidad e integridad del RNA porque
presentó los mayores valores en estos tres parámetros. El grupo formado por los
extractos obtenidos por fenol cloroformo seguido por purificación con Sephadex es casi
idéntico al grupo constituido por los extractos obtenidos por CTAB, lo cual es debido a
que no se presentaron diferencias estadísticamente significativas entre los dos métodos
de extracción cuando se evaluaron los tres parámetros cuantitativos (p>0.05) y el grupo
formado por los extractos obtenidos por Trizol® (Invitrogen) no difiere mucho de los
grupos formados por los otros dos métodos de extracción; sin embargo, se encuentra
ubicado hacia los dos cuadrantes izquierdos (Figura 6-3B) en donde se encontrarían
localizados los extractos con mejor rendimiento, calidad e integridad de acuerdo a las
coordenadas del círculo de correlaciones (Figura 6-3ª).
Artículo 1. Evaluación de tres métodos de extracción de RNA para la
detección del Potato yellow vein virus (PYVV) por RT-PCR a partir de
muestras de diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo
Phureja.
61
Al evaluar los grupos formados en el análisis de componentes principales según órgano
(Figura 6-3C) se encontró que entre foliolo, peciolo, pétalos, tallo, raíz primaria y brotes
de tubérculo no se presentaron diferencias estadísticamente significativas, pedúnculo
floral que fue el órgano que presentó mayor rendimiento e integridad presentó diferencias
con los demás órganos excepto con antera que también fue un órgano con el que se
obtuvieron altos valores en estas dos variables, mientras que raíz secundaria que fue el
órgano con el que se presentaron los menores valores en los tres parámetros evaluados
A
B
C
D
Figura 6-3. Gráficos del análisis de componentes principales. A. Círculo de correlaciones. B.
Agrupación de los resultados de análisis de componentes principales según método de extracción.
En color azul los extractos obtenidos por Sephadex, en color rojo los obtenidos por CTAB y en
®
verde los obtenidos por Trizol (Invitrogen). C. Agrupación de los resultados de análisis de
componentes principales según órgano. En color rojo las muestras de antera, en color azul brote
de tubérculo, en azul claro las muestras de foliolo, en rosado las muestras de peciolo, en verde
pedúnculo floral, en amarillo pétalo, en azul oscuro raíz primaria, en púrpura las muestras de raíz
secundaria y en color café las muestras de tallo. D. Agrupación de los resultados del análisis de
componentes principales por resultado de RT-PCR.
62
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
se ubicó hacia los cuadrantes del lado derecho que de acuerdo al círculo de
correlaciones (Figura 6-3ª) correspondería a las muestras con menores valores de las
tres variables analizadas. Estos resultados sugerirían que muestras de antera y
pedúnculo floral podrían ser útiles a la hora de seleccionar órganos de plantas de papa
para procesos de extracción de RNA debido a que con estos dos órganos se presentaron
los mayores valores de rendimiento, integridad y calidad.
6.3.4 . RT-PCR del gen CP de PYVV
Para una síntesis de cDNA viral adecuada y el subsecuente uso para amplificación de
genes es necesario partir de una extracción de RNA que permita obtener un material de
alta cantidad y cantidad. Para evaluar los extractos obtenidos por los tres métodos de
extracción de RNA en los órganos evaluados se amplificó del gen completo de la
proteína mayor de la cápside de PYVV. Con los tres métodos de extracción se obtuvo
amplificados del tamaño esperado (769pb) en todos los órganos evaluados (Figura 6-4),
aunque en algunos órganos el porcentaje de detección no fue del 100% (Figura 6-5).
Figura 6-4. Gel de agarosa 1% de los productos de RT-PCR del gen de la proteína mayor de la
cápside con extractos de todos los órganos evaluados extraídos con las tres metodologías de
extracción (Tamaño esperado 759pb). Para los tres geles M corresponde al marcador de peso
molecular GeneRuler 100pb (Fermentas), carril 1: antera, carril 2: foliolo, carril 3: peciolo, carril 4:
pedúnculo floral, carril 5: pétalo, carril 6: brote de tubérculo, carril 7: tallo, carril 8: raíz primaria,
carril 9: raíz secundaria, carriles 10 y 11: controles positivos, carril 12: muestra de S. tuberosum
Grupo Phueja obtenida a partir de cultivo de meristemos y carril 13: muestra de C. madurensis,
Lour infectada con CTV.
Se evaluaron 84 muestras por cada método de extracción (4 de antera y 10 por cada uno
de los órganos restantes) y se encontró que por Sephadex se pudo amplificar el gen de
la proteína mayor de la cápside de PYVV en el 83.3% de las muestras analizadas, por
CTAB en el 85.7% y por Trizol® (Invitrogen) en el 89.3%. En la Figura 6-5 se puede
observar el porcentaje de muestras positivas y negativas por RT-PCR para el gen CP de
Artículo 1. Evaluación de tres métodos de extracción de RNA para la
detección del Potato yellow vein virus (PYVV) por RT-PCR a partir de
muestras de diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo
Phureja.
63
Figura 6-5. Porcentaje de muestras RT-PCR positivas y RT-PCR negativas obtenidos en todos
los órganos evaluados en los tres métodos de extracción. La fracción de la barra de color azul
claro corresponde a las muestras RT-PCR positivas y la fracción de color azul oscuro a las
muestras RT-PCR negativas. En la tabla debajo de las gráficas se encuentra el número de
muestras positivas y negativas en cada órgano.
PYVV, se encontró que en algunos órganos (foliolo, brote de tubérculo, raíz primaria y
raíz secundaria) no se logró detectar el virus en todas las muestras evaluadas por los
tres métodos de extracción, aunque hay que tener en cuenta que a pesar de esto se
64
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
logró detectar entre el 70% y el 90% de las muestras evaluadas, en antera se logró la
detección en todas las muestras obtenidas por los tres métodos de extracción, en
pedúnculo floral sólo se logró detectar el virus en todos los extractos obtenidos por CTAB
y Trizol® (Invitrogen), en peciolo y pétalo sólo se detectó el virus en la totalidad de las
muestras extraídas por Trizol® (Invitrogen).
El hecho de que en raíz se haya obtenido los extractos de menor rendimiento, calidad e
integridad (Figura 6-3C), además de un menor porcentaje de detección de PYVV por RTPCR que en los demás órganos (Figura 6-5) podría ser debido a la acumulación
diferencial de algunas sustancias en este órgano que afectan los procesos de extracción.
Por ejemplo los polisacáridos, estos presentan un mayor contenido en la zona radical de
plantas de papa (St-Pierre et al., 1996), es posible que en los tres métodos utilizados no
se haya eliminado completamente estas sustancias lo cual interfirió con los extractos
obtenidos a partir de este tejido.
Otras sustancias como los polifenoles también afectan el proceso de extracción, l-a
polifenol oxidasa (PPO) que es la enzima relacionada con el pardeamiento enzimático se
distribuye principalmente en tejidos en desarrollo como por ejemplo flores y en la zona
radical (Thygesen et al., 1995). Por lo tanto se esperaría que en estos órganos se
afectara la extracción de RNA, esto se evidenció en las muestras de la zona radical en
donde se obtuvieron los menores valores de los tres parámetros evaluados (Figura 6-3C)
y un menor porcentaje de detección de PYVV por RT-PCR que en los demás órganos,
pero no se relacionó con flor (pedúnculo, antera y pétalos), a pesar de que hay una alta
acumulación de esta enzima en este órgano, en los extractos obtenidos los valores de los
tres parámetros fueron aceptables, además al hacer RT-PCR para amplificar el gen CP
de PYVV en estas muestras se logró la detección del virus (Figura 6-5) (confirmando que
los extractos obtenidos eran adecuados en procesos de síntesis de cDNA y
amplificación), lo que sugiere que los procesos de extracción permitieron la eliminación
de estas sustancias en los extractos obtenidos a partir de órganos florales, es posible
que el procesamiento del material vegetal sea más fácil en muestras de órganos florales
que en la zona radical de la planta en donde en el proceso de maceración se da
oxidación del material (probablemente por la actividad de la enzima PPO).
Con respecto al tiempo el método de fenol:cloroformo seguido de Sephadex resulta ser el
método más rápido para el procesamiento de las muestras (Tabla 6-5), aunque en este
Artículo 1. Evaluación de tres métodos de extracción de RNA para la
detección del Potato yellow vein virus (PYVV) por RT-PCR a partir de
muestras de diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo
Phureja.
65
método hay que ser muy cuidadoso en la preparación de las columnas para poder
obtener resultados exitosos. El siguiente método en términos de duración de tiempo fue
Trizol® (Invitrogen) con una hora y media y el de mayor duración fue CTAB con dos horas
de procesamiento. A pesar de que Trizol® (Invitrogen) no presentó el menor tiempo de
procesamiento, los resultados obtenidos en los ensayos de amplificación de RNA,
determinación del rendimiento, integridad y calidad el método con el que se obtuvieron
los mejores resultados fue Trizol® (Invitrogen) además permitió la extracción y detección
del virus en todos los órganos evaluados, sin embargo no quiere decir que los otros dos
métodos no sean eficientes, estos fueron seleccionados debido a su gran utilidad en la
extracción de RNA vegetal en otros estudios realizados en el Laboratorio de Virus
Vegetales relacionados con la papa criolla.
Hay que tener en cuenta que PYVV se encuentra limitado al floema, por lo tanto
esperaría detectarse en casi toda la planta, a pesar de esto la extracción de RNA a partir
de algunos tejidos podría dificultarse como lo han propuesto López et al. (2006) quienes
han sugerido que por lo menos para tubérculo parecería que la distribución de PYVV
fuera irregular y con bajas cargas virales, lo que también podría ocurrir con el resto de la
planta; esto podría conllevar a obtener falsos negativos. A pesar de esto el virus logró ser
detectado por RT-PCR en todos los órganos evaluados: pétalo, tallo, peciolo, foliolo, raíz,
brotes de tubérculo, pedúnculo floral y antera; en donde los dos últimos presentaron
diferencias con los demás órganos con respecto a los tres parámetros evaluados
presentando los valores más altos (Figura 6-3C), lo que sugiere que estos dos órganos
serían un buen material de partida en procesos rutinarios de detección que impliquen la
extracción de RNA.
En este trabajo se analizó por primera vez diferentes órganos de papa como fuente para
la extracción del RNA de PYVV, un virus limitado al floema de la planta, el cual pudo ser
detectado en todos los órganos evaluados. Se concluye que Trizol® (Invitrogen) es un
método eficiente en cuanto a rendimiento, no presenta una alta contaminación con
proteínas y presentó una buena integridad, además es un método rápido que permitió la
amplificación de genes a partir de cualquier órgano. Los resultados obtenidos en este
trabajo resultan útiles para monitorear la presencia y dispersión del virus en diferentes
66
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
órganos, en programas de fitomejoramiento, de certificación de semillas e indexación de
material vegetal.
Agradecimientos
Esta investigación se realizó gracias al apoyo económico y técnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia y a Colciencias (201010016538). Al
Laboratorio de Microbiología del IBUN por el préstamo del espectrofotómetro para
realizar el ensayo de la estimación de la relación 260/280nm. Al Laboratorio de
Investigaciones de la Facultad de Medicina de la Universidad Militar Nueva Granada por
el préstamo de la celda de cuarzo.
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7. Artículo 2
PCR en tiempo real para la detección y
cuantificación del gen de la proteína mayor de la
cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en
diferentes órganos de plantas de Solanum
tuberosum Grupo Phureja infectadas con el virus
Resúmen
Potato yellow vein virus (PYVV) se ha detectado en extractos de foliolos y en brotes de
tubérculos de papa por medio de NASH, RT-PCR y PCR en tiempo real (qPCR). En este
trabajo el gen de la proteína mayor de cápside (CP) se detectó por RT-PCR convencional
y PCR en tiempo real con Sondas TaqMan® a partir de muestras de diferentes órganos
de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja (papa criolla) que expresaban
diferentes niveles de sintomatología o no sintomáticas (NS) pero RT-PCR positivas. Se
extrajo RNA de diferentes órganos de la zona aérea (foliolo, peciolo, tallo, pedúnculo
floral, pétalo y antera) y de la zona radical (raíz primaria y secundaria). PYVV se detectó
en todos los órganos evaluados utilizando ambas metodologías, aunque con una mayor
sensibilidad por qPCR (100 veces más sensible). Los resultados indican que en plantas
(NS RT-PCR +) no se hay diferencias en la acumulación de PYVV en los diferentes
órganos evaluados mientras que cuando la planta expresa síntomas la acumulación de
PYVV es diferencial (distribución heterogénea), con mayor acumulación en pedúnculo
floral y foliolo, y menor acumulación en zona radical y antera. Es la primera vez que se
hace un seguimiento de PYVV en diferentes órganos de papa criolla utilizando qPCR.
Los resultados proveen información sobre la distribución del virus tanto en plantas
infectadas que expresan síntomas como no sintomáticas y esta información podría ser de
interés para agricultores y fitomejoradores. Para la detección de PYVV en programas de
70
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
cuarentena así como en procesos de indexación de PYVV para la producción de semilla
libre de virus la técnica de qPCR podría ser muy útil.
Palabras claves: Papa, virus, qPCR, órganos, proteína de cápside.
7.1 Introducción
Potato yellow vein virus (PYVV) es miembro de la familia Closteroviridae considerado una
especie tentativa del género Crinivirus conformado por un genoma tripartita de ssRNA(+)
(Livieratos et al., 2004). Las partículas virales son filamentosas, están limitadas al floema,
es transmitido de manera vegetativa por los tubérculos (semilla) (Salazar et al., 2000) y
semipersistentemente por mosca blanca (Trialeurodes vaporariorum, Westwood)
(Buriticá, 1971, Gamarra et al., 2006).
PYVV es el agente causal de la enfermedad de amarillamiento de venas (PYVD)
reportada por Alba (1950) en Antioquia (Colombia). La enfermedad afecta la producción
de papa reduciéndola hasta en un 50% en Solanum tuberosum Grupo Tuberosum cv
Diacol Capiro (Salazar et al., 2000) y más de 25% en S. tuberosum Grupo Phureja
(Guzmán et al., 2011). PYVV es un virus reemergente declarado cuarentenario en
Europa y en Estados Unidos (OEPP/EPPO, 1979; USDA – APHIS, 2000). La dispersión
por tubérculos y vector natural es alta y los reportes indican que PYVV está presente en
algunos países andinos como Venezuela, Colombia, Ecuador y Perú (Salazar et al.,
2000).
El uso de técnicas moleculares como NASH (Salazar et al., 2000), RT-PCR (Offei et al.,
2004; Guzmán et al., 2006 y 2010; Wei et al., 2009) y qPCR (López et al., 2006;
Hernández et al., 2010) han permitido la detección de PYVV en extractos de muestras de
foliolo y en muestras de brotes de tubérculo (Guzmán et al. 2006 y 2010; Hernández et
al. 2010). Estudios basados en qPCR han informado sobre expresión de genes,
detección de secuencias específicas en diferentes tipos de muestras, diagnóstico
específico y cuantificación de virus (Bustin, 2002; Heid et al., 1996; Mackay et al., 2002).
La alta sensibilidad, alta especificidad, alta reproducibilidad, no requiere de un
procesamiento post-PCR, y permite hacer una estimación precisa del número de copias
de un gen blanco, hacen que qPCR sea una herramienta muy útil en estudios de
Artículo 2. PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del gen de la
proteína mayor de la cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en
diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja
infectadas con el virus
71
diferentes aspectos de la biología de virus (Bustin, 2002; Heid et al., 1996; Mackay et al.,
2002).
Como miembro de la familia Closteroviridae, PYVV se limita al floema y las células
adyacentes. Sin embargo, hasta el momento no se ha estudiado si PYVV se distribuye de
manera similar en todos los órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja o si la
acumulación viral es o no diferencial en estos órganos tanto en muestras de plantas
sintomáticas como no sintomáticas RT-PCR positivas para PYVV. El objetivo del
presente trabajo es analizar estos supuestos utilizando las técnicas de RT-PCR y qPCR
en muestras de diferentes órganos. De manera general, los resultados indican que PYVV
se distribuye en todos los órganos de la planta de papa criolla con acumulación viral
diferencial entre órganos aéreos y radicales de plantas sintomáticas pero con cargas
virales similares en los órganos de las plantas no sintomáticas.
7.2 Materiales y Métodos
7.2.1 Material vegetal y aislados virales
Plantas de S. tuberosum Grupo Phureja (papa criolla) infectadas con PYVV
Se recolectaron plantas de S. tuberosum Grupo Phureja en cultivos de papa criolla en el
municipio de Chipaque (Cundinamarca). Se tomaron diez plantas completas (parte aérea
y radical) con una edad aproximada de dos meses y que expresaban diferentes niveles
de sintomatología de PYVD: cinco con sintomatología severa (S) y cinco con
sintomatología moderada (M). Las plantas se transportaron al patio del Instituto de
Biotecnología de la Universidad Nacional (IBUN) donde fueron mantenidas durante dos
meses más. Estas fueron sembradas en materas utilizando como sustrato una mezcla de
tierra: cascarilla de arroz (3:1), se regaron con agua dos veces por semana y se
fertilizaron con Nitrógeno: Fósforo: Potasio (15:15:15) el día de la siembra en matera y un
mes después. Adicionalmente se hizo control para hongos fumigando una vez a la
semana con Benlate 0.1% y para el control de mosca blanca se fumigó dos veces a la
semana con Karate® 1.5cc/L. Estas plantas se denominaron plantas donadoras de
PYVV.
72
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Plantas de S. tuberosum Grupo Phureja libres de virus
Como controles negativos se utilizaron plantas de papa criolla Clon 1 obtenidas a partir
de cultivo de meristemos in vitro adquiridas en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos y de
Biología Molecular de Plantas del IBUN. Las plántulas se propagaron por esquejes y se
trasplantaron a materas con turba para hacer el proceso de adaptación. Después de
ocho días se pasaron a materas con tierra: cascarilla de arroz (3:1), fueron mantenidas
en jaulas entomológicas en el patio del IBUN. Antes de la utilización de las plantas en los
ensayos de transmisión estas fueron analizadas por RT-PCR (reacción y condiciones
descritas más adelante) para el gen CP de PYVV utilizando material foliar para confirmar
que las plantas estaban libres de PYVV. Estas plantas se denominaron plantas
receptoras de PYVV.
7.2.2 Transmisión de PYVV por vector natural T. vaporariorum
(Westwood)
Cria de mosca blanca
Inicialmente se estableció una cria de mosca blanca donadas por la Universidad Militar
Nueva Granada (UMNG) en plantas de calabacín (Cucurbita pepo), mantenidas en jaulas
entomológicas selladas con velo suizo en el invernadero de la Facultad de Agronomía de
la Unal.
Obtención del vector virulífero
Aproximadamente 700 adultos de T. vaporariorum avirulíferos se liberaron en una jaula
entomológica que contenía las plantas donadoras de PYVV (plantas de papa criolla que
habían sido confirmadas por RT-PCR como positivas para PYVV y con una edad
aproximada de tres meses) para su alimentación durante un periodo de 48h tiempo en el
cual se aseguraría la adquisición del virus (moscas virulíferas). La transmisión se realizó
en el invernadero en cajas entomológicas.
Ensayos de transmisión
Las moscas virulíferas se utilizaron para hacer un ensayo de transmisión para evaluar la
acumulación del virus en diferentes órganos de plantas infectadas, en el cual se liberaron
Artículo 2. PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del gen de la
proteína mayor de la cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en
diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja
infectadas con el virus
73
entre 20 a 50 moscas virulíferas por plántula receptora (12 plántulas) durante un periodo
de 48 horas sin limitación del sitio de inoculación y después de este periodo se fumigaron
con Karate® 1.5cc/L para eliminar la mosca blanca. Las plantas receptoras se
mantuvieron en jaulas entomológica y se fumigaron contra mosca blanca dos veces a la
semana. A estas plantas se les realizó un seguimiento de sintomatología y confirmación
de la presencia de PYVV por RT-PCR para el gen de la proteína mayor de la cápside.
7.2.3 Extracción de RNA
Extracción de RNA del vector natural
Para confirmar que las moscas eran portadoras del virus (moscas virulíferas) se utilizó el
protocolo previamente establecido por el grupo de Virus vegetales del IBUN (Barragán y
Guzmán. 2012), en donde se obtuvieron extractos de RNA a partir de T. vaporariorum
(Westwood) utilizando el kit SV Total RNA isolation (Promega) teniendo en cuenta las
instrucción del fabricante (Anexo A.4).
Extracción de RNA vegetal
Todos los extractos de RNA fueron obtenidos utilizando Trizol® (Invitrogen) de acuerdo a
las instrucción del fabricante (Anexo A.1). Se obtuvieron extractos de RNA de muestras
de foliolo de plantas receptoras y donadoras para confirmar la presencia de PYVV por
RT-PCR (reacción y condiciones descritas más adelante). De las plantas resultantes en
el ensayo de transmisión se seleccionaron tres RT-PCR positivas: una NS, una M y una
S para evaluar la acumulación del virus en varios órganos de plantas infectadas. De
manera aleatoria se tomaron muestras de diferentes órganos en estas plantas (Tabla 81) y se hizo extracción de RNA.
Con el fin de tener la certeza de detectar el exclusivamente RNA viral, todos los extractos
fueron tratados con DNasa I para lo cual se adicionó 20U de enzima y se dejó incubar
durante 15min a 37°C.
74
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Tabla 7-1. Muestras analizadas para evaluar la acumulación del virus en diferentes órganos de
plantas infectadas
Planta
Zona
Órgano
Sintomática
*No
Sintomática Moderado Severo
Raíz Primaria
2
6
9
Radical
Raíz Secundaria
7
4
18
Foliolo
24
27
36
Peciolo
24
27
39
Tallo
3
7
10
Aérea
Pétalo
0
6
2
Pedúnculo floral
0
6
2
Antera
0
6
2
No se pudo evaluar muestras de tubérculo debido a que ninguna de las plantas tuberizó.
* No se tomaron muestras de pétalos, anteras y pedúnculo floral debido a que esta planta no
floreció.
7.2.4 Detección de PYVV por RT-PCR y qPCR
Extractos de RNA de muestras de foliolo de las plantas donadoras y receptoras en el
procesos de transmisión y las muestras utilizadas para la evaluación de la acumulación
del virus en diferentes órganos de plantas infectadas (Tabla 7–1) fueron evaluadas por
amplificación para el gen de la proteína mayor de la cápside de PYVV utilizando RT-PCR
convencional con los primers descritos en la Tabla 7-2 y por qPCR con los primers y
sondas descritos en la Tabla 7-3.
Síntesis de cDNA
A partir de los extractos de RNA se obtuvo cDNA el cual fue repartido en dos fracciones:
una para evaluación por PCR y la otra para evaluación por qPCR. La síntesis de cDNA
se llevo a cabo en un volumen final de 10µl adicionando una mezcla de 1X buffer de
reacción (Epicentre), 1mM de dNTPs (Bioline), 10mM de DTT (Epicentre), 0.4µM de
primer 3´ (Tabla 7-2), 1.6U de RNAse inhibitor (Fermentas), 8U de MMLV HP (Epicentre)
y 100ng de RNA, se incubó durante una hora a 42°C seguida de una denaturación a
70°C por 10min. El producto de esta reacción se repartió en dos: una fracción para
evaluación por PCR y la otra para evaluación por qPCR.
PCR
Las reacciones de amplificación contenían 1.6µl de cDNA, 1X de buffer NH4 (Bioline),
2.5mM de MgCl2 (Bioline), 0.4µM de dNTPs (Bioline), 0.4µM de cada primer (F2/3´)
Artículo 2. PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del gen de la
proteína mayor de la cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en
diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja
infectadas con el virus
75
(Tabla 7-2) y 1U de Biolasa (Bioline) en un volumen final de 10µl. El programa de
amplificación consiste de una denaturación inicial a 94ºC durante 3min, 35 ciclos de
denaturación a 94ºC durante 1min, alineamiento a 55ºC durante 1min y extensión a 72ºC
durante 1min, y una extensión final a 72ºC durante 10min, condiciones que fueron
previamente establecidas en la Laboratorio de Virus vegetales del IBUN (Guzmán et al.,
2006).
Tabla 7-2. Primers para la amplificación del gen completo de la proteína de la cápside de PYVV.
Primer Dirección
Secuencia
Referencia
Reverse
3
5’ AAG CTT CTA CTC AAT AGA TCC TGC TA 3’
Rodríguez et al., 2009
Forward
F2
5’ CTC GAG GAT CCT CAT GGA AAT CCG AT 3’
Como control positivo se utilizó una muestra foliar de una planta que expresaba síntomas
para PYVV y que había sido positiva por RT-PCR y como controles negativos una
muestra foliar de una planta de Calamondino (Citrofortunella madurensis, Lour). infectada
con el virus Citrus tristeza virus (CTV) de la familia Closteroviridae y una muestra foliar de
S. tuberosum Grupo Phureja libre de virus (obtenida por cultivo in vitro de meristemos).
Los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa 1% preparados en TAE
1X (0.04M Tris-Acetato, 0.001M EDTA) y teñidos con SYBR®Safe (Invitrogen), corridos a
70V constantes durante una hora y visualizados en digitalizador Gel Doc® (BIO-RAD).
PCR en tiempo real
Las reacciones de qPCR se realizaron en el Laboratorio de Biología Molecular de Plantas
del IBUN con el equipo LightCycler 480 (Roche), usando la química de sondas TaqMan®
para amplificar un fragmento de 79pb de la proteína mayor de la cápside de PYVV y
como control interno se amplificó un fragmento de 79pb del gen Citocromo oxidasa
(COX) de expresión constitutiva en la planta (López et al., 2006). Se utilizaron las sondas
y primers reportados por López et al. (2006) con algunas modificaciones en el marcaje de
las sondas. En el trabajo de López et al. (2006) la sonda para detectar a COX estaba
marcada con JOE, en este caso el marcaje se hizo con HEX (Tabla 7-3)
76
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Tabla 7-3. Secuencias de los primers y sondas que se utilizaron en los ensayos de qPCR
Primer
Sonda
PYVV-591-F
PYVV-670-R
Sonda CP
(465:510)
COX – F
COX – R
Sonda COX
(533:580)
Dirección
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Secuencia
5’ CGG AGA TTA TGT CAA TGG TTC GA 3’
5’ TTG CTG CAT TCT TGA ACA GGT AA 3’
5’ 6-FAM AAC CAA CAT TTC TGA TGA TGA TTT GAC
TGC AA 3’ BHQ1
5’ CGT CGC ATT CCA GAT TAT CCA 3’
5’ CAA CTA CGG ATA TAT AAG AGC CAA AAC TG 3’
Gen
Tamaño
esperado (pb)
Proteína mayor
de la cápside
79
*Citocromo
Oxidasa
79
5’ HEX TGC TTA CGC TGG ATG GAA TGC CCT 3’ BHQ2
Los valores entre paréntesis corresponden a las longitudes de onda en nanómetros de excitación:
emisión de los fluorocromos.
* Control interno de la reacción
Las reacciones de amplificación se realizaron en placas opacas (Roche) de 98 pozos y
se utilizó 1X de buffer NH4 (Bioline), 5.5mM de MgCl2 (Bioline), 0.5mM de dNTPs
(Bioline), 0.3µM de cada primer, 0.24µM de la sonda (Tabla 7-3), 1U de biolasa, 2µl de
cDNA en un volumen final de 10µl. El programa de amplificación consiste de una
denaturación inicial durante 10min a 95ºC, 45 ciclos de amplificación con una
denaturación a 95ºC por 10s y alineamiento a 55ºC por 30s.
En las reacciones de qPCR se incluyeron los siguientes controles: (1) control positivo:
muestra de papa criolla infectada con PYVV RT-PCR positivo para el gen de la proteína
mayor de la cápside de PYVV, (2) control positivo: uno de los puntos utilizados para la
construcción de la curva estándar (3) control para evaluación de contaminación de
reactivos: reacción en la que el molde es agua, (4) control para la evaluación de
reacciones cruzadas con genes de otros virus: muestra de C. madurensis, Lour infectada
con CTV (5) control para la evaluación de reacciones cruzadas con genes de la planta:
muestra de planta de papa criolla libre de virus obtenida a partir de cultivo de meristemos
in vitro.(6) control para evaluar si los extractos están contaminados con DNA: muestra en
la cual el molde es el control positivo pero en este no se adiciona retrotranscriptasa
durante la síntesis de cDNA.
Adicionalmente cada una de las muestras fue amplificada con una pareja de primers para
el gen citocromo oxidasa (COX) con el objetivo de confirmar que las extracciones de
RNA fueron realizadas apropiadamente y para descartar falsos negativos.
Curva estándar para la cuantificación absoluta
Para poder determinar el número de copias del gen de la proteína mayor de la cápside
en cada una de las muestras, se construyó una curva estándar utilizando diluciones
Artículo 2. PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del gen de la
proteína mayor de la cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en
diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja
infectadas con el virus
77
seriadas de transcritos de RNA de concentración conocida obtenidos a partir de un
plásmido pGEM-T® (Promega) cuyo inserto era el gen completo de la proteína mayor de
la cápside de PYVV y que presentaba un promotor T7 para que pudiera ser utilizado para
hacer transcripción in vitro del gen (Anexo E) (aportado por la estudiante de doctorado
Patricia Rodríguez del Laboratorio de Virus Vegetales del IBUN).
Los transcritos fueron cuantificados utilizando el kit Quant-iTTM RiboGreen Assay
(Invitrogen) teniendo en cuenta las instrucciones del fabricante (Anexo B) y se utilizaron
para construir la curva estándar graficando el valor Ct (threshold cycle) de cada una de
las diluciones versus el logaritmo del número de copias del gen de la proteína mayor de
la cápside de PYVV. Cada punto de la curva estándar se corrió por duplicado y para
validar la cuantificación absoluta se corrió en tres ensayos independientes. Se pudo
determinar la carga viral en cada una de las muestras por la interpolación del valor Ct en
la curva estándar. La estimación del número de copias del gen CP de los estándares
utilizados para la construcción de la curva estándar se hizo de acuerdo a la siguiente
ecuación:
En donde la cantidad de transcrito de RNA debe ser expresada en mg, el número de
avogadro corresponde a
, # pb a número de pares de bases del transcrito,
340 es el peso molecular de una hebra de RNA.
La eficiencia de amplificación fue calculada a partir de la pendiente de la curva estándar
usando la fórmula:
7.2.5 Análisis Estadísticos
Se calculó el promedio del número de copias para cada órgano evaluado, la desviación
estándar y coeficiente de variación (CV%) inter-ensayo (porcentaje de la desviación
estándar en comparación con el promedio del número de copias). Los análisis
78
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
estadísticos se realizaron utilizando el Software R (R Development Core Team, 2008). La
distribución de todos los datos fue evaluada utilizando el test de normalidad Shapiro Wilk.
Debido a que los resultados no presentaron una distribución normal se realizaron
comparaciones para evaluar si se presentaban diferencias en la carga viral entre los
órganos mediante la aplicación de una prueba Mann-Whitney acompañada de la
corrección de Bonferroni a nivel de significancia (p<0.05) para controlar la tasa de error
(Yuan et al., 2006).
7.3 Resultados
7.3.1 Transmisión de PYVV utilizando el vector natural
En la Figura 7-1A se muestran los productos de RT-PCR para la detección del gen CP de
PYVV (fragmento de 769 pb) obtenidos en muestras de plantas donadoras con diferentes
niveles de intensidad de síntomas: síntoma S: carriles 1-5 y síntoma M: carriles 1-10. En
la Figura 7-1B se incluyen las muestras de plantas receptoras antes de la transmisión
(carriles 1-5) y muestras positivas del vector virulífero (carriles 6 y 7). En la Figura 7-1C
se muestra la detección de PYVV por RT-PCR en plantas receptoras después de un mes
de la transmisión en donde cinco plantas no expresaron síntomas (carriles 1-5) y siete si
expresaron síntomas (carriles 6-12).
El porcentaje de transmisión fue del 75%, de doce plantas transmitidas en nueve se pudo
detectar el virus por RT-PCR (Figura 7-1, carriles 2, 4, 6-12), de las cuales dos no
expresaron síntomas (Figura 7-1, carriles 2 y 4) durante el ciclo de vida de la planta.
Las plantas sintomáticas no tuvieron el mismo nivel de intensidad en la expresión d-e
síntomas; cuatro presentaron sintomatología S y tres sintomatología M. De las plantas
receptoras obtenidas en el proceso de transmisión, se seleccionaron tres plantas RTPCR positivas para evaluar la acumulación del virus en diferentes órganos: una NS, una
M y una S, las cuales fueron analizadas a los cuatro meses de edad evaluando diferentes
órganos (foliolo, peciolo, tallo, pedúnculo floral, pétalo, antera, raíz primaria y
secundaria).
Artículo 2. PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del gen de la
proteína mayor de la cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en
diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja
infectadas con el virus
79
Figura 7-1. Detección del gen de la proteína mayor de la cápside de PYVV por RT-PCR. En los
tres geles M corresponde a marcador de peso molecular GeneRuler 100pb (Fermentas), el control
positivo corresponde a una muestra de planta que expresaba síntomas para PYVV positiva por
RT-PCR. Como controles negativos: Muestra de calamondino infectada con CTV y S. tuberosum
Grupo Phureja libre de virus. A. RT-PCR de las plantas donadoras del virus; los carriles 1-10
corresponde a plantas de papa criolla sintomáticas para PYVV, del carril 1 al 5 muestras de
plantas M, y del carril 6 al 10 muestras de plantas S, el carril 11 al control positivo y los carriles 12
y 13 a controles negativos B. RT-PCR de plantas receptoras antes de la transmisión (carriles 1-5),
vector natural virulífero alimentado con plantas S, (carril 6) vector virulífero alimentado con plantas
M, (carril 7), vector avirulífero (carril 8), el carril 9 corresponde al control positivo, y los carriles 10 y
11 a controles negativos. C. RT-PCR de plantas receptoras después de cuatro semanas de la
transmisión; carriles 1-5 plantas que no expresaron síntomas, carriles 6-12 plantas que
expresaron síntomas, carril 13 control positivo, carriles 14-15 controles negativos.
7.3.2 Detección del gen CP de PYVV por RT – PCR convencional
en muestras de diferentes órganos de plantas transmitidas
con PYVV por vector natural
En la Figura 7-2 se muestra el porcentaje de muestras RT-PCR positivas (color azul
claro) y RT-PCR negativas (color azul oscuro) obtenidos en los órganos evaluados en las
tres plantas escogidas con diferentes grados de sintomatología (M, S y NS), a partir de
estos resultados se observa que en las plantas sintomáticas (tanto M, como S) se detectó
el mayor porcentaje de muestras positivas (en plantas M del 95.5% y en plantas S del
92.3%), mientras que en la planta que no expresó síntomas sólo se detecto el virus en el
46.6% de las muestras, sin embargo en esta planta se detectó PYVV en muestras de
foliolo, raíz primaria y secundaria. Como las plantas no tuberizaron seguramente por las
80
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Figura 7-2. Porcentaje de muestras RT-PCR positivas y RT-PCR negativas obtenidos en todos
los órganos evaluados en las tres plantas con diferentes grados de sintomatología (Severa,
Moderada, No Sintomática). La fracción de la barra de color azul claro corresponde a las muestras
RT-PCR positivas y la fracción de color azul oscuro a las muestras RT-PCR negativas. En la tabla
debajo de las gráficas se encuentra el número de muestras positivas y negativas en cada órgano.
condiciones de cultivo (ex. temperatura), no se pudo evaluar la presencia de PYVV en
muestras de tubérculo de estas plantas.
Artículo 2. PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del gen de la
proteína mayor de la cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en
diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja
infectadas con el virus
81
En las plantas que expresaron síntomas pudo lograrse la detección por RT-PCR en todos
los órganos evaluados lo cual no ocurrió en la planta no sintomática en donde no se
detecto el virus en muestras de tallo y sólo se detectó el virus en un bajo porcentaje de
las muestras de peciolo (4.1%). En pedúnculo floral, pétalo, antera y raíz primaria se
logró la detección del virus en todas las muestras evaluadas en las tres plantas (hay que
tener en cuenta que en la planta no sintomática no se evaluó pedúnculo floral, pétalo y
antera debido a que no se desarrollaron flores en la planta); en foliolo se detectó el virus
en más del 90% de las muestras analizadas en las plantas sintomáticas y en el 83.3% de
muestras provenientes de la planta no sintomática; en raíz secundaria se detectó el virus
en el 15% de las muestras provenientes de la plantas con sintomatología severa, 75% de
muestras de la planta con sintomatología moderada y en muestras de planta no
sintomática se detectó en un 71.4%; y en las muestras de peciolo y tallo el virus se
detectó en un alto porcentaje de las muestras provenientes de plantas que expresan
síntomas (mayor al 80%) pero en la planta no sintomática la detección se hizo en un muy
bajo porcentaje de las muestras (< al 5% para peciolo y del 0% en tallo) (Figura 7-2).
7.3.3 PCR en tiempo real en diferentes órganos de plantas
transmitidas con PYVV por vector natural
Cada una de las muestras evaluadas por RT-PCR convencional fue evaluada por qPCR
amplificando un fragmento del gen de la proteína mayor de la cápside de PYVV y como
control interno el gen COX de expresión constitutiva en la planta, el cual fue amplificado
para descartar falsos negativos. En todas las muestras evaluadas se logró la
amplificación del control interno y los valores del Ct fueron muy similares en todas las
muestras con un promedio de 15.9 0.46 así como se muestra en la Figura 7-3. Además
el porcentaje del coeficiente de variación inter-ensayo no fue mayor al 7% indicando una
buena reproducibilidad.
82
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Figura 7-3. Curvas de amplificación obtenidas con la pareja de primers para COX.
Una vez se descartaron problemas de inhibición en el proceso de amplificación por qPCR
teniendo como referencia la amplificación del gen COX, cada muestra se evaluó por
qPCR para la cuantificación absoluta del gen de la proteína mayor de la cápside de
PYVV para lo cual se utilizó una curva estándar construida con transcritos de diferentes
concentraciones del gen CP de PYVV. El virus logró ser detectado en la totalidad de la
muestras de plantas S, M y NS utilizando qPCR.
7.3.4 Estimación del número de copias del gen CP de PYVV
En la figura 7-4, se presenta la curva estándar construida con diluciones de transcritos de
concentración conocida (a partir de la concentración se calculó el número de copias)
cuyos valores del número de copias iban desde 106 hasta 1010. Cada una de las
diluciones se corrió por duplicado y se repitió tres veces en corridas independientes
teniendo en cuenta que los resultados de cuantificación absoluta deben ser muy
reproducibles para su validación. En los tres casos se obtuvo un resultado similar en
donde el valor de la eficiencia cercano a dos y la pendiente de la curva fue de -3.27.
Con la curva estándar y a partir del valor Ct para cada una de las muestras se estimó el
número de copias del gen CP y a pesar de que por RT-PCR no se detectó el virus en
todas las muestras (Figura 7-2), por qPCR con sondas TaqMan® se logró la detección del
virus en todas las muestras evaluadas, los controles positivos amplificaron y en cada
corrida el valor Ct no presentó variaciones en estas reacciones. No se amplificó ninguno
de los controles negativos (planta libre de virus, planta de calamondino infectada con
CTV) indicando que los reactivos no estaban contaminados y que no había reacción
Artículo 2. PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del gen de la
proteína mayor de la cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en
diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja
infectadas con el virus
83
cruzada con genes de la planta o de virus de la familia Closteroviridae; ni tampoco
amplificó el control en el cual no se hizo retranscripción del control positivo mostrando
que los extractos no estaban contaminados con DNA.
Figura 7-4. Curva estándar construida para la determinación del número de copias del gen CP.
(Cada punto de la curva estándar se corrió por duplicado).
Al comparar los resultados de qPCR con los de RT-PCR convencional se encontró que
por esta última técnica se presentaron falsos negativos: el 6.2% de las muestras
provenientes de plantas sintomáticas (13/207) y el 53.3% (32/60) de las plantas
provenientes de plantas no sintomáticas fueron negativas por RT-PCR convencional,
pero estas pudieron ser detectadas por qPCR. Es posible que la concentración del virus
en la muestra analizada afecte la detección por RT-PCR convencional debido a que las
muestras que resultaron negativas por esta técnica presentaron una menor carga viral
que las que resultaron positivas (p=0.0123, Figura 7-6ª), lo cual se correlacionó con la
expresión de síntomas debido a que las plantas sintomáticas presentaron una mayor
carga viral que las plantas que no expresaron síntomas (p<0.05), encontrándose que
generalmente las plantas que no expresan síntomas presentan una menor carga viral y
por ende un menor porcentaje de detección (Figura 7-6).
El valor Ct para el gen CP estuvo entre 14.57 y 24.47 con un valor promedio de
18.89 2.22 (Figura 7-5) y los valores %CV inter-ensayo fueron menores al 10%
84
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
indicando una buena reproducibilidad de los ensayos. Por el lado del número de copias
del gen CP los valores se encontraron entre 9.17 106 hasta 4.86 109 con un promedio
de 5.22 108 7.05 107.
Figura 7-5. Curvas de amplificación obtenidas con la pareja de primers para el gen de la proteína
mayor de la cápside de PYVV.
7.3.5 Acumulación de PYVV en diferentes órganos de plantas con
diferente grado de intensidad de la expresión de síntomas
Por qPCR se encontró que la planta que no expresaba síntomas presentó una
acumulación del virus significativamente menor que las plantas que expresaban síntomas
(p<0.05) (casi un grado de magnitud) (Figura 7-6B) y esto también se presentó en todos
los órganos (Figura 7-7). Entre la planta que presentó sintomatología moderada y la que
presentó sintomatología severa se evidenció que esta última tiene una mayor
acumulación del virus, pero la diferencia entre estas dos plantas no fue significativa
(p>0.05, Figura 7-6B).
La evaluación estadística de la acumulación de PYVV en diferentes órganos de las tres
plantas S, M y NS se presenta en Figura 7-7 y en las Tablas 7-4 y 7-5. Los análisis
permiten realizar las siguientes consideraciones:
(1) El órgano, el grado de intensidad de expresión de síntomas y la combinación de estos
dos factores afecta la acumulación del virus (p<0.005). Se pudo observar que el virus
tiende a acumularse principalmente en órganos de la zona aérea (Figura 7-7) y además
las plantas que presentan un mayor grado de intensidad de síntomas presentan una
mayor acumulación del virus (Figura 7-6B).
Artículo 2. PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del gen de la
proteína mayor de la cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en
diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja
infectadas con el virus
85
Figura 7-6. Resultados de PCR en tiempo real para evaluar la acumulación del virus A. Carga
viral en muestras RT-PCR positivas y RT-PCR negativas. B. Carga viral en muestras con
diferentes grados de intensidad de expresión de síntomas. Las barras de error corresponden a la
desviación estándar.
(2) Hay heterogeneidad en la acumulación de PYVV en las plantas que expresan
síntomas (moderada y severa) encontrándose diferencias significativas (p<0.05) en la
carga viral entre los diferentes órganos evaluados por planta.(Figura 7-7 y Tabla 7-44 y
Tabla 7-55).
(3) Antera, que incluye las células sexuales masculinas, presentó una carga viral
significativamente menor que la mayoría de los órganos en las dos plantas sintomáticas
(S y M) y no presentó diferencias significativas con los dos tipos de raíces en la planta de
sintomatología moderada. En la planta con sintomatología severa, antera no presentó
diferencias en la acumulación de PYVV con raíz secundaria (Figura 7-7 y Tabla 7-4 y
Tabla 7-5).
(4) En la planta S se puede encontrar dos grupos con cargas virales similares
(exceptuando antera). El de mayor carga conformado por tallo, peciolo, foliolo y
pedúnculo floral y el de menor carga formado por las dos clases de raíces y pétalo. En
esta planta la mayor carga viral se presentó en foliolo la cual fue significativamente mayor
que en antera. Con el resto de los órganos las diferencias no fueron significativas (Figura
7-7 y Tabla 7-5).
(5) En la planta M, la acumulación del virus en los órganos evaluados fue errática (Figura
7-7 y Tabla 7-4 y Tabla 7-5). La mayor acumulación de PYVV se presentó en pedúnculo
86
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
floral el cual fue significativamente mayor con respecto a los dos tipos de raíces, tallo y
antera. Con el resto de los órganos las diferencias no fueron significativas en esta planta
(Figura 7-7 y Tabla 7-4).
Tabla 7-4. Valores de p del contraste entre los órganos de la planta con sintomatología moderada.
Las celdas en negrilla corresponden a las parejas que presentaron diferencias estadísticamente
significativas (p<0.05).
Foliolo
Peciolo
Pedúnculo floral
Pétalo
Raíz Primaria
Raíz Secundaria
Tallo
Antera
7.4 10-5
5.6 10-6
0.00013
0.00885
0.78000
0.65000
0.00312
Foliolo
Peciolo
Pedúnculo floral
Pétalo
Raíz Primaria
Raíz Secundaria
0.90321
1.00000
0.75350
0.00045
0.00369
0.05235
0.00081
1.00000
1.00000
0.04231
1.00000
0.22517
0.00053
0.00200
0.00070
1.00000
0.00063
0.00501
1.00000
1.00000
1.00000
Tabla 7-5. Valores de p del contraste entre los órganos de la planta con sintomatología severa.
Las celdas en negrilla corresponden a las parejas que presentaron diferencias estadísticamente
significativas (p<0.05).
Foliolo
Peciolo
Pedúnculo floral
Pétalo
Raíz Primaria
Raíz Secundaria
Tallo
Antera
0.0038896
0.0048073
0.0099978
0.0099998
0.0099998
0.8110348
0.0099999
Foliolo
Peciolo
Pedúnculo floral
Pétalo
Raíz Primaria
Raíz Secundaria
0.9997866
0.7980644
0.6690065
0.1378152
0.2158231
0.9453644
0.8686979
0.7586575
0.3047982
0.0733825
0.9894701
0.0099999
0.0029999
0.0003999
0.9861907
1.0000000
1.0000000
0.9570846
1.0000000
0.5062931
0.2572929
Figura 7-7. Distribución de la carga viral en tres plantas con diferente grado de intensidad de
síntomas (No sintomático, Moderado y Severo). Las barras de error corresponden a la desviación
estándar.
Artículo 2. PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del gen de la
proteína mayor de la cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en
diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja
infectadas con el virus
87
(6) En la planta NS la acumulación del virus en los órganos fue menor que en las otras
dos plantas y presentó homogeneidad, no se presentaron diferencias estadísticamente
significativas entre los órganos evaluados (p>0.05) (Figura 7-7).
7.4 Discusión
El virus PYVV es reemergente en Colombia y se ha diseminado a los países andinos
como Venezuela, Colombia, Ecuador y Perú afectando la producción en estos países con
pérdidas importantes en diferentes grupos de Solanum tuberosum (Salazar et al., 2000;
Guzmán et al., 2011). Aspectos moleculares de PYVV se han determinado solamente
desde la década pasada, en 2004 con la publicación del genoma (Livieratos et al, .2004)
y algunos pocos estudios sobre la variabilidad (Offei et al., 2004; Rodríguez et al., 2010).
Salazar et al. (2000) plantean que hay dificultad en los procesos de extracción y
diagnóstico de PYVV debido a que es un virus que está limitado al floema, es de difícil
extracción, algunas plantas pueden presentar cargas virales extremadamente bajas para
ser detectadas, o el virus es latente, además hay plantas que no expresan síntomas a
pesar de que estén infectadas con el virus. Al no existir trabajos que abordaran la
detección y cuantificación de PYVV en diferentes órganos de plantas de papa, en el
presente trabajo se evaluó la acumulación del virus en diferentes órganos de plantas de
S. tuberosum Grupo Phureja (papa criolla) infectadas con PYVV utilizando la técnica
qPCR con sondas TaqMan® para la cuantificación del virus en diferentes órganos (folíolo,
peciolo, tallo, antera, pedúnculo floral, pétalo y raíz) de plantas que expresan síntomas
severos, moderados y no sintomáticas pero positivas para el virus por RT-PCR.
Previamente la técnica de qPCR había sido utilizada para la detección de PYVV en
muestras foliares (López et al., 2006) pero en este trabajo es la primera vez que se utiliza
para cuantificar la acumulación de PYVV en diferentes órganos de papa criolla.
Inicialmente se obtuvieron plantas infectadas con PYVV a través de transmisión por
vector para lo cual se tuvo en cuenta que en algunas especies de plantas se ha
reportado coinfección con diferentes virus lo que puede resultar en una reducción de
síntomas ó en una exacerbación de los mismos afectando otros aspectos como rango de
88
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
hospederos (García-Cano et al., 2006), y diferencias de tropismo y de la carga viral
acumulada en diferentes órganos (Wege y Siegmund, 2007). Estudios serológicos
realizados en muestras de accesiones de bancos de germoplasma del Grupo Phureja,
han demostrado que una accesión de papa mantenida en campo puede estar infectada
con uno o varios grupos virales, como PVS, PLRV, PVY y PVX (Guzmán et al., 2010) y
por deep sequencing se ha detectado que muestras infectadas con PYVV pueden estar
infectadas con PVY (Silvestre et al., 2012). Hay que tener en cuenta que PVY es un
potivirus transmitido por otro vector (Myzus persicae) (Van Hoof, 1980). En este trabajo
se transmitió PYVV por medio de su vector natural (mosca blanca, T. vaporariorum), el
cual es específico para la transmisión de PYVV; por lo tanto las plantas receptoras se
infectaron exclusivamente con PYVV.
Los ensayos de transmisión fueron exitosos al utilizar como planta donadora una planta
con síntoma severa. Se logró la detección del virus por RT-PCR a los 21dpi (días postinfección) y la expresión de síntomas entre 28 y 35dpi, estos resultados fueron similares
a los reportados por Arciniegas et al. (2003) en donde la expresión de síntomas se dio
entre 28 a 32 dpi en S. tuberosum Grupo Phureja.
Cuando la fuente de inoculo fue una planta de sintomatología moderada, en las plantas
receptoras no se dio expresión de síntomas, a pesar de esto el virus fue detectado por
RT-PCR (Figura 7-1C) y presentaron una menor carga viral que las plantas receptoras de
PYVV provenientes de la trasmisión con plantas de sintomatología severa (Figura 7-6B);
esto podría ser debido a problemas en la carga viral transmitida por el insecto vector la
cual depende de varios aspectos como: (1) el tiempo de adquisición del virus por el
vector (en este caso se permitió que las moscas tuvieran un tiempo de 48 horas para su
alimentación en las plantas infectadas), (2) el tiempo de retención (que para PYVV puede
ser de horas, tiempo suficiente para manipular las moscas mientras se hace la
transmisión) (3) el tiempo de inoculación (para que el proceso de transmisión sea exitoso
debe hacerse dentro del periodo de retención) (Froissart et al., 2010). Sin embargo, estos
aspectos no explican la falta de expresión de síntomas cuando se utilizó como fuente de
inoculo una planta con sintomatología moderada, es posible que la carga viral afecte la
transmisión y en las plantas de sintomatología moderada la carga viral es menor que en
las plantas de sintomatología severa (Figura 7-6B), lo cual afecta en casos en donde la
transmisión no es persistente o es semipersistente como PYVV (Salazar et al., 2000;
Artículo 2. PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del gen de la
proteína mayor de la cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en
diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja
infectadas con el virus
89
Díaz et al., 1990; Tamayo y Navarro 1984) debido a que no hay replicación del virus
dentro del insecto y por lo tanto, durante el periodo de adquisición la carga viral
alcanzada por el virus debería ser proporcional a la carga viral de la planta fuente de
inoculo.
En el presente trabajo se utilizó la metodología de qPCR con sondas TaqMan® propuesta
por López et al. (2006) para la detección de PYVV con algunas modificaciones, pues en
lugar de utilizar un solo paso para las reacciones de retrotranscripción y amplificación, se
utilizaron dos pasos independientes debido a que no se presentaron problemas de
contaminación, además esta modalidad de qPCR es más sensible para la detección
(Wacker and Godard, 2005). Se realizó la cuantificación absoluta a cada una de las
muestras utilizando una curva estándar externa (Fronhoffs et al., 2002; Rutledge y Coté,
2003) la cual permitió hacer la estimación precisa del número de copias del gen CP en
muestras de diferentes órganos de plantas infectadas con PYVV. Se pudo detectar PYVV
en muestras de diferentes órganos antes de la expresión de síntomas y además en
plantas que no expresaban síntomas o que habían sido negativas por RT-PCR.
PYVV pudo ser detectado en todos los órganos evaluados tanto por RT-PCR como por
qPCR con sondas TaqMan®, en todas las muestras evaluadas se pudo hacer la
detección del virus cuando se utilizó la técnica de qPCR, mientras que por RT-PCR sólo
se detecto el virus en el 90% de las muestras provenientes de plantas sintomáticas y en
el 46.6% de las muestras provenientes de plantas no sintomáticas. En muestras que
habían sido negativas por RT-PCR para PYVV se pudo hacer la detección del virus
utilizando qPCR, con una sensibilidad 100 veces mayor que RT-PCR convencional. Esto
puede ser debido al bajo número de copias del blanco el cual fue significativamente
menor en plantas que fueron negativas por RT-PCR lo que sugiere que la carga viral
puede afectar la detección por la técnica convencional (Figura 7-6A).
A partir de los resultados en la estimación de la carga viral se pudo establecer que en las
plantas que expresan síntomas de amarillamiento (M y S) hay heterogeneidad en la
acumulación de PYVV en los diferentes órganos evaluados, presentándose una
acumulación diferencial del virus entre los órganos de la zona radical y los de la zona
aérea, se obtuvo una mayor acumulación en foliolo cuando la planta es S y en pedúnculo
90
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
floral cuando la planta es M, a pesar de eso en ambas plantas no se presentaron
diferencias estadísticamente significativas entre estos órganos y los demás de la zona
aérea; en ambas plantas la menor acumulación se presentó en raíz, es posible que la
menor acumulación en este órgano sea debida a la presencia de polifenoles
y
carbohidratos que interfieren con la extracción viral y la detección (Thygensen et al.,
1995; Hoover, 2001) debido a que son inhibidores de reacciones de amplificación. La
planta no sintomática (RT-PCR positiva para PYVV), presentó menor acumulación del
virus en todos los órganos analizados con respecto a las plantas que expresaron
síntomas lo que sugiere que podría existir una correlación entre la expresión de síntomas
y la carga viral, y además la distribución fue homógenea en plantas NS (Figura 7-7),
El hecho de que el virus esté acumulado principalmente en la zona aérea, puede ser una
estrategia de dispersión del virus porque al mantenerlo en esta zona el virus quedaría
más accesible a la mosca blanca contribuyendo de esta manera con la dispersión del
mismo, este aspecto no había sido estudiado previamente en PYVV pero si en otros virus
como por ejemplo Carnation etched ring virus (CERV) y Carnation vein mottle virus
(CVMV) que son transmitidos por miembros de la familia Aphididae, estos presentaron
una menor acumulación viral en la zona radical (Sánchez-Navarro et al., 2007), en casos
de virus que son transmitidos por hongos que habitan en el suelo o nemátodos se ha
descrito que estos se concentran principalmente en la zona radical como es el caso de
Carmovirus que son transmitidos por hongos del suelo (Gosalvez et al., 2003) y
Tobravirus que son transmitidos por nematodos (Schmitt et al., 1998; MacFarlane y
Popovich, 2000).
El folíolo fue uno de los órganos que presentó mayor carga viral y este es el órgano del
que prefiere alimentarse la mosca blanca, sumado a esto PYVV es un patógeno limitado
al floema y la mosca blanca solo puede alimentarse del floema (Cohen et al., 1996),
estos aspectos podrían resultar en un mayor éxito de transmisión. Los hábitos
alimenticios de la mosca blanca reforzarían la idea de que el virus se acumula en las
plantas de manera que sea muy accesible al vector, sugiriendo un proceso de
coevolución entre el vector y el virus (Lovisolo et al., 2003).
Hay que tener en cuenta que este virus también puede ser transmitido vegetativamente a
través de tubérculo, pero en este trabajo no se evaluó la acumulación del virus en
muestras de tubérculo debido a que las plantas no tuberizaron (este aspecto se evalúa
Artículo 2. PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del gen de la
proteína mayor de la cápside del Potato yellow vein virus (PYVV) en
diferentes órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja
infectadas con el virus
91
en el último artículo de esta tesis), podría esperarse que aunque el virus presentó una
baja carga viral en muestras de raíz, este pueda acumularse de una manera diferencial
en la zona radical con altas cargas virales en tubérculo, y de no ser así esto podría
indicar que la transmisión vegetativa no se afecta por la carga viral acumulada en el
tubérculo, de todas maneras esto estaría por demostrarse.
Este estudio es el primer reporte para la detección de PYVV en diferentes órganos de
plantas infectadas pero aún queda pendiente evaluar si estos patrones de acumulación
son generalizados o fueron el producto de las condiciones de ensayo utilizadas en este
trabajo. Además sería interesante evaluar cómo se da la acumulación del PYVV en
cultivares susceptibles y resistentes, y como es la cinética de la acumulación del virus en
los órganos en diferentes estadios fenológicos de plantas infectadas, es posible que
dependiendo de la etapa de desarrollo el virus pueda irse redistribuyendo de una manera
diferencial, en este trabajo sólo se evaluó como era la acumulación después de la
cosecha.
Es interesante que se detectara PYVV por primera vez en diferentes órganos, entre ellos
las anteras que tienen interés reproductivo. Sin embargo, no fue posible obtener semilla
sexual en las plantas analizadas, ni en recorridos de los cultivos, por lo que falta
establecer si es posible que PYVV sea detectado en semilla a pesar de que este virus no
se transmite por semilla sexual. En este trabajo también se logró la detección en
muestras de flor, Maruthi et al. (2005) reportaron que no se logró detectar Cassava brown
streak virus (CBSV) en muestras de semilla aunque el virus fue detectado en muestras
de flores y frutos, según estos autores posiblemente existe un mecanismo que excluye el
virus del embrión y por esta razón este virus no es transmisible sexualmente, quizás esto
sea lo que ocurre con PYVV pero es un aspecto por confirmar.
No se sabe si la acumulación de RNA en los diferentes tejidos se relaciona con la
acumulación de partículas virales, es posible que haya un alto número de copias de RNA
viral pero no de partículas virales, lo que se ha reportado en algunos virus como PVY en
donde no hay una relación entre partículas virales y RNA viral debido a que las partículas
virales son más lábiles a degradación, mientras que el RNA tiende a ser estable (Mehle
et al., 2004; Kogovšek et al., 2011).
92
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
La detección de plantas infectadas por virus y su eliminación es un paso importante en
los programas de manejo y control para poder evitar la dispersión viral; por lo tanto la
incorporación de técnicas de detección con un alto grado de sensibilidad (que permitan la
detección del virus tanto en plantas que expresen síntomas como en plantas que no
expresan síntomas a pesar de que presentan el virus) como es el caso de PCR en
tiempo real son una herramienta importante a tener en cuenta en procesos de
diagnóstico para la detección de plantas infectadas en bancos de germoplasma y en
programas cuarentenarios. Esta técnica permite evaluar la distribución del virus en
plantas infectadas lo que además de aportar información del virus, es una base para la
selección de órganos en los procesos de detección; además esta técnica también resulta
muy útil en estudios de expresión de genes y en diversos aspectos de la biología de
virus.
Agradecimientos
Esta investigación se realizó gracias al apoyo económico y técnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia y a Colciencias (201010016538). A Patricia
Rodríguez por la donación del plásmido con el inserto de la proteína mayor de la cápside
que sirvió de material de partida para el proceso de transcripción y por los aportes
hechos a este trabajo. Al Laboratorio de Biología Molecular de Plantas del IBUN por el
préstamo del equipo de PCR en tiempo real. A Carlos Barragán por su apoyo en la
realización de los ensayos de transmisión. A la Facultad de Ciencias de la Universidad
Militar Nueva Granada por la donación del inóculo de mosca blanca. A la Facultad de
Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia por el espacio en el invernadero.
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8. Artículo 3.
Evaluación de la distribución del Potato yellow
vein virus (PYVV) en brotes tubérculos de
Solanum tuberosum Grupo Phureja utilizando
cuantificación absoluta por la técnica de PCR en
tiempo real (qPCR) con Sondas TaqMan®
Resúmen
Potato yellow vein virus (PYVV) es un virus re-emergente que hace parte de la familia
Closteroviridae y al género Crinivirus y se caracteriza porque genera pérdidas en la
producción de hasta el 50% (dependiendo de la especie) razón por la que ha sido
clasificado como un patógeno cuarentenario en Europa y Estados Unidos. Teniendo en
cuenta que el virus está limitado al floema, que se ha detectado el virus en plantas no
sintomáticas a partir de semillas provenientes de plantas sintomáticas y que puede ser
transmitido vegetativamente a través de semilla, en este trabajo se evaluó la acumulación
de PYVV en muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas sintomáticas y no
sintomáticas utilizando la técnica de cuantificación absoluta por PCR en tiempo real
(qPCR) con la química de sondas TaqMan®, para determinar como es la distribución del
virus en la semilla. Se encontró que en las muestras sintomáticas el virus pudo ser
detectado por RT-PCR y por qPCR en todos los brotes analizados con una carga viral
promedio de 1.43 107 1.18 107 que fue significativamente mayor que en muestras no
sintomáticas con una carga viral promedio de 1.29 106 8.44 105 en donde se detectó el
virus en un 9.6% de las muestras evaluadas. Con respecto a la distribución del virus en
las muestras de brotes de tubérculo se pudo observar que no se presentaron diferencias
significativas en la carga viral acumulada en tubérculos de una misma planta (p=0.549),
ni tampoco entre brotes de un mismo tubérculo (p=0.118). A pesar de estos resultados,
se pudo encontrar que la distribución del virus en muestras provenientes de plantas no
98
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
sintomáticas presentó cierto grado de heterogeneidad debido a que en algunos casos el
virus fue detectado en uno de los brotes del tubérculo, o en varios brotes de un tubérculo
(más no en todos los brotes del tubérculo), o en varios tubérculos de una planta (más no
en todos tubérculos provenientes de una planta); lo que no se presentó en las muestras
provenientes de plantas sintomáticas en donde el virus fue detectado en todos los brotes
analizados.
Palabras claves: Solanum tuberosum Grupo Phureja, cuantificación absoluta, PCR en
tiempo real, tubérculo, RT-PCR, Sondas TaqMan®.
8.1 Introducción
La papa criolla (Solanum tuberosum Grupo Phureja) se ha expandido en los recientes
años encontrándose entre los cinco cultivos alimenticios más importantes a nivel mundial
(Oerke y Dehne, 2004; FAOSTAT, 2010). Esta especie es susceptible a muchos virus
dentro de los que se encuentran algunos re-emergentes como el Potato yellow vein virus
(PYVV) (Müller et al., 2004; Salazar, 2006).
Los síntomas causados por este virus son un amarillamiento que comienza en las
nervaduras secundarias y se va extendiendo hasta que cubre la lámina foliar, (Salazar et
al., 2000; Arciniegas et al, 2003) y una reducción en la producción que puede ser de
hasta un 50% dependiendo de la especie (Salazar et al., 2000; Guzmán et al., 2011).
PYVV se encuentra distribuido en países andinos: Colombia donde se hizo el primer
reporte de este virus (Alba, 1950), Perú, Ecuador, y Venezuela (Salazar et al., 2000).
Parece que la dispersión de este virus se ha debido al transporte indiscriminado de
germoplasma (Salazar et al., 2000) y al incremento de las población de su vector natural
(Trialeurodes vaporariorum) (Buriticá, 1971).
En previos estudios se ha hecho la detección de este virus utilizando NASH (Salazar et
al., 2000) RT – PCR (Salazar et al., 2000; Guzmán et al., 2006; Guzmán y Rodríguez,
2010; Wei et al., 2009) y qPCR (López et al., 2006; Hernández et al., 2010). Se ha
encontrado que en algunas plantas que no expresan síntomas se logró hacer la
detección molecular del virus; adicionalmente Salazar et al. (2000) y Guzmán et al.
(2011) reportaron que a partir de semillas provenientes de plantas sintomáticas se
pueden obtener plantas que expresan síntomas o viceversa; teniendo en cuenta esto, el
hecho de que este virus es limitado al floema y que puede ser transmitido
Artículo 3. Evaluación de la distribución del Potato yellow vein virus (PYVV)
en brotes tubérculos de Solanum tuberosum Grupo Phureja utilizando
cuantificación absoluta por la técnica de PCR en tiempo real (qPCR) con
Sondas TaqMan®
99
vegetativamente a través de semilla; el objetivo del presente trabajo fue evaluar como era
la acumulación del virus en tubérculos de plantas infectadas (tanto tubérculos
provenientes de plantas sintomáticas como los provenientes de plantas no sintomáticas)
para determinar si la distribución del virus es homogénea o heterogénea dentro de los
tubérculos, aspecto aún no reportado para PYVV debido a que la detección de este virus
se ha realizado primordialmente en muestras de foliolo (Salazar et al., 2000; Guzmán et
al., 2006; Guzmán y Rodríguez, 2010; López et al., 2006) y en un par de ocasiones en
muestras de brotes de tubérculo (Guzmán y Rodríguez, 2010; Hernández et al., 2010),
pero aún no se ha informado como es la distribución del virus dentro de los tubérculos
infectados, esto podría ayudar a explicar el porque no toda la progenie obtenida a partir
de tubérculos provenientes de plantas sintomáticas no es sintomática (Salazar et al.,
2000; Guzmán et al., 2012).
Para lograr este objetivo se utilizó la técnica de PCR en tiempo real por su alta
sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, además permite hacer una estimación del
número de copias de un blanco presente en una muestra haciéndola una técnica muy
poderosa para el estudio de muchos aspectos de la biología de muchos virus (Bustin,
2002; Mackay et al., 2002). Como se indicó anteriormente está técnica no ha sido muy
utilizada para estudios de este virus (solo ha sido reportada por López et al. (2006) y por
Hernández et al. (2010)), y las veces que se ha utilizado en estudios para PYVV ha sido
con fines de detección; con este trabajo se propone esta técnica como una herramienta
útil en el estudio de diferentes aspectos de la biología del virus.
Por otra parte, estos resultados podrían apoyar programas de fitomejoramiento, procesos
de indexación de plantas de papa, programas de cuarentena y en programas de
certificación de semillas de papa debido a que esta permite hacer la detección de cargas
virales bajas en diferentes órganos de plantas infectadas aunque no expresen síntomas,
lo que no se puede lograr con otras técnicas de detección.
100
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
8.2 Materiales y Métodos
8.2.1 Muestras de brotes de tubérculo y controles
Se tomaron muestras de brotes de tubérculos provenientes de plantas de papa criolla de
un cultivo establecido en el municipio de Mosquera (Cundinamarca). Estos fueron
almacenados en la oscuridad durante un periodo de 20 días esperando que germinaran,
debido a que el material analizado sería brote de tubérculo (Tabla 8-1)
Tabla 8-1. Muestras analizadas por RT-PCR y qPCR
Número de
Número de
Sintomatología
Plantas
Tubérculos
Sintomático
8
56
No sintomático
30
174
Número de
brotes
114
301
Se evaluaron de uno a siete brotes de tubérculo por tubérculo (en promedio cuatro brotes
de tubérculo/tubérculo). Como controles negativos se utilizaron plantas de papa criolla
Clon 1 obtenidas a partir de cultivo de meristemos in vitro las cuales fueron adquiridas en
el Laboratorio de Cultivo de Tejidos y de Biología Molecular de Plantas del IBUN. y una
planta de C. madurensis, Lour infectada con CTV.
8.2.2 Extracción de RNA
Se obtuvieron extractos de RNA a partir de las muestras de brotes de tubérculo para lo
cual se partió de 100mg de material pulverizado en nitrógeno líquido utilizando el
protocolo descrito por Guzmán et al. (2006) (Anexo A).
8.2.3 Pruebas basadas en PCR
Síntesis de cDNA
Se obtuvo cDNA a partir de cada uno de los extractos de RNA. La síntesis de cDNA se
llevo a cabo en un volumen final de 10µl adicionando una mezcla de 1X buffer de
reacción (Epicentre), 1mM de dNTPs (Bioline), 10mM de DTT (Epicentre), 0.4µM de
primer 3´ (Tabla 7-2), 1.6U de RNAse inhibitor (Fermentas), 8U de MMLV HP (Epicentre)
y 100ng de RNA, se incubó durante una hora a 42°C seguida de una denaturación a
70°C por 10min.
Artículo 3. Evaluación de la distribución del Potato yellow vein virus (PYVV)
en brotes tubérculos de Solanum tuberosum Grupo Phureja utilizando
cuantificación absoluta por la técnica de PCR en tiempo real (qPCR) con
Sondas TaqMan®
101
PCR
Las reacciones de amplificación contenían 1.6µl de cDNA, 1X de buffer NH4 (Bioline),
2.5mM de MgCl2 (Bioline), 0.4µM de dNTPs (Bioline), 0.4µM de cada primer (F2/3´)
(Tabla 8-2) y 1U de Biolasa (Bioline) en un volumen final de 10µl. El programa de
amplificación consiste de una denaturación inicial a 94ºC durante 3min, 35 ciclos de
denaturación a 94ºC durante 1min, alineamiento a 55ºC durante 1min y extensión a 72ºC
durante 1min, y una extensión final a 72ºC durante 10min, condiciones que fueron
previamente establecidas en la Laboratorio de Virus vegetales del IBUN (Guzmán et al.,
2006).
Tabla 8-2. Primers para la amplificación del gen completo de la proteína mayor de la cápside de
PYVV.
Primer Dirección
Secuencia
Referencia
3
Reverse
5’ AAG CTT CTA CTC AAT AGA TCC TGC TA 3’
Rodríguez et al., 2009
F2
Forward
5’ CTC GAG GAT CCT CAT GGA AAT CCG AT 3’
Como control positivo se utilizó una muestra de planta que expresaba síntomas para
PYVV y que había sido positiva por RT-PCR y como controles negativos una muestra de
C. madurensis, Lour (Calamondino) infectada con CTV y una muestra de S. tuberosum
Grupo Phureja libre de virus (obtenida por cultivo in vitro de meristemos). Los productos
de PCR fueron visualizados en geles de agarosa 1% preparados en TAE 1X (0.04M TrisAcetato, 0.001M EDTA) y teñidos con SYBR®Safe (Invitrogen), corridos a 70V
constantes durante una hora y visualizados en digitalizador Gel Doc® (BIO-RAD).
PCR en tiempo real
Las reacciones de qPCR se realizaron en el Laboratorio de Biología Molecular de Plantas
del IBUN utilizando el equipo LightCycler 480 (Roche), usando la química de sondas
TaqMan® amplificando un fragmento de 79pb de la proteína mayor de la cápside de
PYVV y como control interno se amplficó un fragmento de 79pb de un gen de expresión
constitutiva de la planta (citocromo oxidasa). Se utilizaron las sondas y primers descritos
por López et al. (2006) con algunas modificaciones en el marcaje de las sondas (Tabla
8-3).
102
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Tabla 8-3. Secuencias de los primers y sondas que se utilizaron en los ensayos de qPCR
Iniciador
Sonda
PYVV-591-F
PYVV-670-R
Sonda CP
(465:510)
COX – F
COX – R
Sonda COX
(533:580)
Dirección
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Secuencia
5’ CGG AGA TTA TGT CAA TGG TTC GA 3’
5’ TTG CTG CAT TCT TGA ACA GGT AA 3’
5’ 6-FAM AAC CAA CAT TTC TGA TGA TGA TTT GAC
TGC AA 3’ BHQ1
5’ CGT CGC ATT CCA GAT TAT CCA 3’
5’ CAA CTA CGG ATA TAT AAG AGC CAA AAC TG 3’
5’ HEX TGC TTA CGC TGG ATG GAA TGC CCT 3’ BHQ2
Gen
Tamaño
esperado (pb)
Proteína mayor
de la cápside
79
*Citocromo
Oxidasa
79
Los valores entre paréntesis corresponden a las longitudes de onda en nanómetros de
excitación:emisión de los fluorocromos. En el trabajo de López et al.(2006) la sonda para detectar
a COX estaba marcada con JOE, en este caso el marcaje se hizo con HEX.
•
Control interno de la reacción
Las reacciones de amplificación se realizaron en placas opacas (Roche) de 98 pozos y
se utilizó 1X de buffer NH4, 5.5mM de MgCl2, 0.5mM de dNTPs, 0.3µM de cada primer,
0.24µM de la sonda (Tabla 8-3), 1U de biolasa, 2µl de cDNA en un volumen final de 10µl.
El programa de amplificación consiste de una denaturación inicial durante 10min a 95ºC,
45 ciclos de amplificación con una denaturación a 95ºC por 10s y alineamiento a 55ºC
por 30s.
En las reacciones de qPCR se incluyeron los siguientes controles: (1) control positivo:
muestra de papa criolla infectada con PYVV RT-PCR positivo para el gen de la proteína
mayor de la cápside de PYVV, (2) control positivo: uno de los puntos de la curva estándar
(3) control para evaluación de contaminación de reactivos: reacción en la que el molde es
agua, (4) control para la evaluación de reacciones cruzadas con genes de otros virus:
muestra de C. madurensis, Lour infectada con CTV que es un miembro de la familia
Closteroviridae (5) control para la evaluación de reacciones cruzadas con genes de la
planta: planta de papa criolla libre de virus obtenida a partir de cultivo de meristemos in
vitro.(6) control para evaluar si los extractos están contaminados con DNA: muestra en la
cual el molde es el control positivo pero en este no se adiciona retrotranscriptasa durante
la síntesis de cDNA.
Adicionalmente todas las muestras fueron amplificadas con una pareja de primers para el
gen citocromo oxidasa (CP) con el objetivo de validar los resultados negativos de los
ensayos de amplificación del gen de la proteína mayor de la cápside utilizando la misma
reacción y condiciones descritas anteriormente.
Artículo 3. Evaluación de la distribución del Potato yellow vein virus (PYVV)
en brotes tubérculos de Solanum tuberosum Grupo Phureja utilizando
cuantificación absoluta por la técnica de PCR en tiempo real (qPCR) con
Sondas TaqMan®
103
Curva estándar para la cuantificación absoluta
Para poder determinar el número de copias del gen de la proteína mayor de la cápside
en cada una de las muestras, se construyó una curva estándar utilizando diluciones
seriadas de transcritos de RNA de concentración conocida. Los transcritos se obtuvieron
a partir de un plásmido pGEM-T® (Promega) cuyo inserto era el gen completo de la
proteína mayor de la cápside de PYVV y que presentaba un promotor T7 para que
pudiera ser utilizado para hacer transcripción in vitro del gen (el plásmido fue donado por
Patricia Rodríguez del Laboratorio de Virus Vegetales del IBUN).
Los transcritos fueron cuantificados utilizando el kit Quant-iTTM RiboGreen Assay
(Invitrogen) teniendo en cuenta las instrucciones del fabricante (Anexo B) y se utilizaron
para construir la curva estándar graficando el valor Ct (threshold cycle) de cada una de
las diluciones versus el logaritmo del número de copias del gen de la proteína mayor de
la cápside de PYVV, el ensayo se realizó por duplicado en dos corridas independientes.
Con la curva estándar se pudo determinar la carga viral en cada una de las muestras por
la interpolación del valor Ct. La estimación del número de copias del gen CP de los
estándares utilizados para la construcción de la curva estándar se hizo de acuerdo a la
siguiente ecuación:
En donde la cantidad de transcrito de RNA debe ser expresada en mg, el número de
avogadro corresponde a
, # pb a número de pares de bases del transcrito,
340 es el peso molecular de una hebra de RNA.
La eficiencia de amplificación fue calculada a partir de la pendiente de la curva estándar
usando la fórmula:
104
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
8.2.4 Análisis Estadísticos
Se calculó el promedio del número de copias para cada órgano evaluado, la desviación
estándar y coeficiente de variación (CV%) interensayo (porcentaje de la desviación
estándar en comparación con el promedio del número de copias). Los análisis
estadísticos se realizaron utilizando el Software R (R Development Core Team, 2008). La
distribución de todos los datos fue evaluada utilizando el test de normalidad Shapiro Wilk
y debido a que los resultados no presentaron una distribución normal se realizaron
comparaciones para evaluar si se presentaban diferencias en la carga viral entre
tubérculo provenientes de plantas sintomáticas y no sintomáticas, entre los tubérculos
provenientes de la misma planta y entre los brotes provenientes de un mismo tubérculo
mediante la aplicación de la prueba Mann Whitney (Yuan et al., 2006).
8.3 Resultados
8.3.1 RT – PCR y qPCR en muestras de brotes de tubérculo
Se hizo ensayos de RT-PCR para la detección de PYVV en muestras de brotes de
tubérculo provenientes de plantas sintomáticas y no sintomáticas. El 93.8% de las
muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas sintomáticas (107/114) fueron
positivas por RT.-PCR convencional (Figura 8-1A, carril 2 una de las muestra
sintomáticas que resultó negativa por RT-PCR); mientras que en las muestras de brotes
de tubérculo provenientes de plantas no sintomáticas solamente tres de las 301 muestras
evaluadas resultaron positivas (Figura 8-1B, en el carril 9 se evidencia una de estas
muestras). En todas las reacciones se incluyó dos controles negativos para verificar la
especificidad de la reacción y en ningún caso se presentó la amplificación de estas
muestras.
A partir de los resultados de RT-PCR los brotes fueron clasificados en cuatro categorías:
sintomáticas RT-PCR positivo (S+), sintomáticas RT-PCR negativo (S-), no sintomáticas
RT-PCR positivo (NS+) y no sintomáticas RT-PCR negativo (NS-) (Figura 8-2C). Todas
las muestras de estas categorías fueron evaluadas por qPCR en donde se detectó el
virus en todas las muestras que habían resultado positivas en las reacciones de RT-PCR
convencional, y en el 12.7% de las muestras (39/305) que habían resultado negativas en
las reacciones de RT-PCR convencional, lo que indica que en RT-PCR convencional hay
Artículo 3. Evaluación de la distribución del Potato yellow vein virus (PYVV)
en brotes tubérculos de Solanum tuberosum Grupo Phureja utilizando
cuantificación absoluta por la técnica de PCR en tiempo real (qPCR) con
Sondas TaqMan®
105
una menor sensibilidad para la detección del virus encontrándose que el porcentaje de
falsos negativos para la detección del virus en muestras de tubérculo por RT-PCR fue del
12.7% (Figura 8-2C).
Figura 8-1 .RT-PCR con la pareja de primers para la detección de la proteína mayor de la cápside
de PYVV (tamaño esperado 769pb) en muestras de brotes de tubérculo en ambos geles M
corresponde al marcador de peso molecular GeneRuler 100pb (Fermentas), el control positivo
corresponde a una muestra de planta que expresaba síntomas para PYVV y que había sido
positiva por RT-PCR y como controles negativos una muestra de C. madurensis, Lour
(Calamondino) infectada con CTV y una muestra de S. tuberosum Grupo Phureja libre de virus
(obtenida por cultivo in vitro de meristemos) A. RT-PCR de muestras de brotes de tubérculo
provenientes de plantas sintomáticas, carriles 1-7 corresponden a muestras de brote de tubérculo
provenientes de plantas sintomáticas, carril 8 corresponde al control positivo y los carriles 9 y 10 a
los controles negativos. B. RT-PCR de muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas
no sintomáticas, carriles 1-10 corresponden a muestras de brote de tubérculo provenientes de
plantas no sintomáticas, carril 11 corresponde al control positivo y los carriles 12 y 13 a los
controles negativos
8.3.2 Estimación del número de copias del gen CP de PYVV en
muestras de brote de tubérculo
Para poder estimar el número de copias del gen CP en cada una de las muestras de
brote de tubérculo se construyó una curva estándar para lo que se utilizaron transcritos
de RNA del gen de la proteína mayor de la cápside de PYVV de diferentes. La curva
construida presentó una alta eficiencia de amplificación (cercana a 2) y cubrió un amplio
rango de concentraciones (de 106 a 1010 número de copias del gen CP), mostró una alta
reproducibilidad (fue corrida en tres ensayos independientes y se obtuvo resultados
similares) permitiendo una cuantificación absoluta del número de copias del gen CP con
una alta precisión. Adicionalmente se incluyeron controles negativos los cuales no
cruzaron el umbral por lo tanto la reacción no presentó problemas de contaminación o de
reacción cruzada con otros genes.
106
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
El número de copias del gen de la proteína mayor de la cápside estimado en muestras de
brotes de tubérculo se encontró entre 7.04 105 y 6.93 107, en las Figuras 8-2ª y C
puede observarse que las muestras negativas por RT-PCR que lograron ser detectadas
por PCR en tiempo real presentaron una carga viral significativamente menor (p 0.0098)
que las muestras de brote de tubérculo detectadas por PCR en tiempo real que habían
sido positivas por RT-PCR convencional (1.41 107 1.18 107 en muestras RT-.PCR
positivas y 1.29 106 8.75 105 en muestras no sintomáticas).
Figura 8-2. Estimación de la carga viral de PYVV en muestras de brotes de tubérculo. A.
Promedio del número de copias del gen CP acumulados en muestras RTR-PCR negativas y RTPCR negativas. B. Promedio del número de copias del gen CP acumulado en muestras de brotes
de tubérculo provenientes de plantas no sintomáticas y de plantas sintomáticas. C. Promedio del
número de copias del gen CP acumulados en las cuatro categorías evaluadas. El radio que se
encuentra dentro de las barras corresponde al número de muestras que pudieron ser detectadas
por qPCR/número de muestras totales correspondientes a dicha categoría, y el valor entre
paréntesis al porcentaje de muestras que resultaron positivas por qPCR
Las muestras de las categorías S- y NS- que lograron ser detectadas por qPCR
presentaron un promedio de la carga viral menor que los brotes de las categorías S+ y
Artículo 3. Evaluación de la distribución del Potato yellow vein virus (PYVV)
en brotes tubérculos de Solanum tuberosum Grupo Phureja utilizando
cuantificación absoluta por la técnica de PCR en tiempo real (qPCR) con
Sondas TaqMan®
107
NS+ así como se observa en la Figura 8-2C (NS-: 1.05 106 2.08 104; NS+:
3.31 106 2.77 105; S-: 1.54 106 6.49 105; S+:3.49 107 1.14 106).
En la Figura 8-2B se observa que las muestras de brote de tubérculo que provenían de
plantas sintomáticas presentaron una carga viral significativamente mayor (p 0.00212)
que las muestras provenientes de plantas no sintomáticas (1.43 107 1.18 107 en
plantas sintomáticas y 1.29 106 8.44 105 en plantas no sintomáticas) (Figura 8-2B).
En la Figura 8-3 se observa un grupo de muestras analizadas por qPCR que incluye
brotes de tubérculo provenientes de plantas no sintomáticas y sintomáticas, los controles
negativos no presentaron amplificación y se puede distinguir que el grupo de muestras de
brotes provenientes de plantas no sintomáticas presentaron un Ct mayor (superior a 26)
que el grupo de muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas sintomáticas
(Ct inferior a 24).
Figura 8-3. Curvas de amplificación de brotes de tubérculo derivados de plantas sintomáticas y no
sintomáticas.
8.3.3 Acumulación de PYVV en brotes de tubérculo provenientes
de plantas sintomáticas y no sintomáticas
En las muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas sintomáticas se obtuvo
un resultado positivo en ambas técnicas en casi la totalidad de las muestras (113/114)
(Figura 8-2C, el virus no fue detectado en un brote de esta categoría), por consiguiente
todos los brotes provenientes de un mismo tubérculo (en los tubérculos en los que se
analizó más de un brote) fueron amplificados. Al analizar si se presentaban diferencias
108
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
en la acumulación de virus en brotes de tubérculo entre plantas de esta categoría se
encontró que las diferencias no fueron significativas lo que sugiere que la distribución era
homogénea (Tabla 8-4).
En las muestras de brotes de tubérculo provenientes de plantas no sintomáticas se
presentaron diferencias significativas en la carga viral acumulada entre las plantas de
esta categoría (Tabla 8-4) lo cual puede ser debido a: (1) para la categoría de plantas no
sintomáticas se analizó un total de 30 plantas, de las cuales en siete plantas sólo se
detectó el virus en un brote por planta, hay que tener en cuenta que en promedio por
planta se evaluó 6 tubérculos y en algunos casos se estimó la carga viral en más de un
brote por tubérculo (en promedio 4 brotes por tubérculo), para un total de más o menos
24 brotes de tubérculo por planta; (2) en cuatro plantas se detecto el virus en varios
tubérculos (un brote por tubérculo); (3) en tres plantas se logró detectar el virus en varios
brotes por tubérculo, en una se logró detectar el virus en todos los brotes de un
tubérculo, en las otras dos sólo se detectó el virus en algunos brotes (más no en todos).
(4). En las 16 plantas restantes no se detecto el virus en ninguno de los brotes
evaluados. Los anteriores resutlados sugieren que brotes provenientes de plantas no
sintomáticas presentan una distribución heterogénea del virus.
Finalmente se evaluó si se presentaban diferencias en la carga viral acumulada entre los
tubérculos provenientes de una misma planta y entre los brotes provenientes de un
mismo tubérculo y de acuerdo a los resultados se encontró que no se presentaron
diferencias estadísticamente significativas en la carga viral acumulada en tubérculos de
una misma planta, ni tampoco entre brotes de un mismo tubérculo (Tabla 8-4).
Tabla 8-4. Comparaciones para evaluar la acumulación de PYVV en las muestras de tubérculo.
Sintomatología
Comparación
Valor de p
Entre plantas
0.00466
No sintomática
Entre tubérculos de una misma planta
0.101
Entre brotes de un mismo tubérculo
0.985
Entre plantas
0.341
Sintomática
Entre tubérculos de una misma planta
0.816
Entre brotes de un mismo tubérculo
0.924
Artículo 3. Evaluación de la distribución del Potato yellow vein virus (PYVV)
en brotes tubérculos de Solanum tuberosum Grupo Phureja utilizando
cuantificación absoluta por la técnica de PCR en tiempo real (qPCR) con
Sondas TaqMan®
109
8.4 Discusión
En este trabajo se quería evaluar como era la distribución del virus en muestras de brotes
de tubérculo infectados con PYVV para ver si las observaciones realizadas por otros
autores como Salazar et al. (2000) y Guzmán et al. (2011) que habían reportado que a
partir de tubérculos infectados con el virus se puede obtener progenies conformadas por
plantas sintomáticas y no sintomáticas, eran debidas a la carga viral acumulada en los
tubérculos y a una posible distribución heterogénea del virus dentro del tubérculo.
Los resultados indican que la técnica de qPCR fue más sensible para la detección del
virus debido a que esta permitió detectarlo en muestras que habían resultado negativas
por RT-PCR convencional (6/7 muestras provenientes de plantas sintomáticas y 33/ 298
provenientes de no sintomáticas). Los resultados de PCR en tiempo real permitieron la
detección del virus en casi la totalidad de las muestras provenientes de plantas
sintomáticas (113/114); en muestras provenientes de plantas no sintomáticas se logró la
detección en el 11.9% de las muestras lo que indica que a pesar de que estas plantas no
expresaron síntomas posiblemente debido a su baja carga viral (Figura 8-2B), las plantas
madres pasaron el virus a los tubérculos; algunos autores como Silva et al. (2002) y
Basky y Almasi (2004) han reportado que el movimiento del virus a larga distancia sigue
las rutas de los metabolitos, generalmente de órganos fuente a vertederos, posiblemente
esto es lo que ocurre en las plantas de papa criolla en donde a pesar de que las que las
plantas madres no expresan síntomas durante su ciclo de vida si permiten el movimiento
de virus a través del floema hacia los tubérculo que son un órgano vertedero.
El hecho de que se haya presentado una carga viral significativamente mayor en
tubérculos provenientes de plantas sintomáticas hace pensar que la expresión de
síntomas sea dependiente de la carga viral (Figura 8-2B), pero los análisis de las cuatro
categorías obtenidas después de amplificación por RT-PCR convencional sugieren lo
contrario debido a que a pesar de que en las categorías S- y NS- se observó que la carga
viral fue significativamente menor (S-: 1.54 106
6.49 105; NS-: 1.05 106
2.8 104)
con respecto a la carga viral obtenida en las muestras de las categorías S+ y NS+ (S+:
3.49 107 1.14 106; NS+: 3.31 106
2.77 105), las categorías S- y NS- presentaron
cargas virales similares lo que sugiere que la carga viral no esta relacionada con la
110
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
expresión de síntomas. El rango del número de copias fue variable en ambas categorías
(S: 1.57 106 – 6.93 107; NS: 7.04 105 3.66 106) por lo tanto se puede observar que
algunas muestras no sintomáticas presentaron cargas virales dentro del rango de las
plantas sintomáticas y a pesar de esto no expresaron síntomas. De todas maneras, los
resultados en este ensayo no permiten concluir que hay una relación entre la expresión
de síntomas y la carga viral acumulada en tubérculos porque el hecho de que la carga
viral en el tubérculo sea baja no implicada que la carga viral de la parte aérea (zona de
expresión de síntomas) también sea baja.
A pesar de los resultados obtenidos al evaluar la carga viral acumulada en tubérculos de
una misma planta y en brotes de un mismo tubérculo (Tabla 8-4), los resultados
mostraron que cuando se analizó más de un brote de tubérculo por tubérculo en
muestras provenientes de plantas no sintomáticas en una sola ocasión se logró detectar
el virus en todos los brotes de tubérculo de un tubérculo, en otros casos solo se dio la
detección en algunos brotes de tubérculo/ por tubérculo, y en otros sólo se detectó el
virus en un brote de tubérculo por tubérculo lo que sugiere que la distribución del virus en
este órgano es irregular cuando la planta no expresa síntomas. No hay otros estudios
que evalúen la distribución de PYVV en muestras de tubérculos, pero si con otros virus
como PVY (Singh and Singh, 1996; Fox et al., 2005) y PVA (Singh and Singh, 1998)
quienes también reportaron la distribución heterogénea de estos virus en este órgano
La presencia de PYVV en brotes de tubérculo provenientes de plantas no sintomáticas
podría sugerir que factores medio ambientales, el tiempo que se demora el virus en llegar
al tubérculo, la carga viral, u otros factores pueden tener algún efecto en el desarrollo de
síntomas. Aunque esto también podría ser el resultado de eventos de coninfección que
pueden resultar en sinergismo en donde se puede dar un incremento en la expresión de
síntomas cuando hay coinfecciones así como lo reportaron Karyeija et al. (2000) y
Untiveros et al. (2007) en donde la coinfección entre SPCSV y SPFMV en camote
incrementa: la severidad de síntomas, la acumulación del virus, el movimiento del virus
en las plantas y afecta la producción. Para PYVV Silvestre et al. (2012) reportó la
coinfección de PYVV con PVY, y aunque aún no se ha evaluado si la interacción es
sinergística o no, podría especularse que cuando se da la expresión de síntomas en
plantas puede ser debido a la coinfección con PVY, mientras que las plantas no
Artículo 3. Evaluación de la distribución del Potato yellow vein virus (PYVV)
en brotes tubérculos de Solanum tuberosum Grupo Phureja utilizando
cuantificación absoluta por la técnica de PCR en tiempo real (qPCR) con
Sondas TaqMan®
111
sintomáticas posiblemente presenten el virus y este pueda ser transmitido a otras zonas
de la planta a través del floema.
La transmisión ineficiente del virus a través de tubérculos ha sido descrita para otros
virus como PLRV, el cual infecta el floema de las plantas (Taliansky et al., 2003), este
virus es transmitido eficiente a través de tubérculos de plantas infectadas de genotipos
susceptibles, sin embargo algunos autores han reportado que cultivares de papa
susceptibles pueden producir tubérculos libres de virus (Hutton and Brock, 1953; citado
por Wilson y Jones, 1992; y Solomon-Blackburn et al,. 2008). Según ellos, esto puede ser
debido a que hay un impedimento en el movimiento del virus en este órgano, previniendo
su dispersión en los tubérculos; pero esto estaría por confirmarse en PYVV en donde se
ha observado que posiblemente el mecanismo podría ser diferente debido a que se
reportan plantas no sintomáticas que en la progenie presentan hijas sintomáticas, lo que
sugiere un eficiente movimiento del virus en los tubérculos.
Otro aspecto que pueda explicar este fenómeno son infecciones tardías, es posible que
el insecto transmita el virus en plantas que ya se encuentran terminando su ciclo de vida
y por lo tanto no se alcanza a dar la expresión de síntomas, pero a pesar de esto el virus
puede ser transportado hasta el tubérculo a través del floema, en estos casos la
distribución podría ser heterogénea debido a que el tiempo no es suficiente para que el
virus alcancé a ser distribuido en toda la planta y de esta manera se distribuye
heterogéneamente.
La técnica de PCR en tiempo real ha demostrado ser altamente sensible y específica
para la detección de PYVV en muestras de brotes de tubérculo (Boonham et al., 2000),
además permite la detección de virus que se encuentre en bajas cargas virales y que no
expresan síntomas, que es un aspecto muy importante para tener presente en planes de
control porque además hay que tener en cuenta que este virus se distribuye
heterogéneamente. Los resultados obtenidos en el presente trabajo resultan muy útiles
en programas de certificación de semillas y de fitomejoramiento.
112
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
Agradecimientos
Esta investigación se realizó gracias al apoyo económico y técnico del Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia y a Colciencias (201010016538). Al
Laboratorio de Biología Molecular de Plantas del IBUN por el préstamo del equipo de
tiempo real.
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9. Conclusiones y recomendaciones
9.1 Conclusiones
1. En el presente trabajo se detectó por primera vez el virus PYVV en diferentes
órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja (papa criolla) como foliolo,
peciolo, tallo, pedúnculo floral, pétalo, brotes de tubérculo y raíz; utilizando la
técnica de PCR en tiempo real.
2. Los resultados obtenidos permiten confirmar las hipótesis planteadas en donde se
planteó que la distribución del virus era heterogénea en diferentes órganos de
plantas de S. tuberosum Grupo Phureja infectadas, principalmente muestras de
brotes de tubérculos.
3. En el presente trabajo se evaluaron tres métodos de extracción de RNA a partir
de muestras de diferentes órganos de plantas de S. tuberosum, debido a que se
que se planteó la realización de ensayos basados en PCR en diferentes órganos
de plantas de papa criolla y para lograrlo es necesario contar con un RNA de
buena calidad y cantidad. Trizol® (Invitrogen) reunió la mayor cantidad de
atributos para ser el método de elección para la extracción de RNA a partir de
diferentes órganos de plantas debido a que con este método se obtuvo el mejor
rendimiento y calidad (260/280nm), además se logró la detección del virus por
RT-PCR en todos los órganos evaluados (pedúnculo floral, antera, pétalo, tallo,
peciolo, foliolo, raíz y brotes de tubérculo) y en un mayor número de muestras que
por los otros dos métodos de extracción evaluados.
4. Los resultados obtenidos permiten hacer la selección de órganos que pueden ser
utilizados en procesos de detección, sugiriendo que los mejores órganos serían
pedúnculo floral y foliolo. En pedúnculo floral se detectó el virus en un alto
porcentaje de muestras infectadas, presentó una alta acumulación del virus, un
116
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
alto rendimiento, relación de absorbancias 260/280nm y una relación de las
subunidades ribosomales 28S/18S cercanas a dos en los extractos de RNA; y
foliolo que aunque no presentó los mayores valores en los parámetros evaluados
para la selección del mejor método de extracción si presentó la mayor
acumulación de PYVV y se logró la detección del virus en un alto porcentaje de
las muestras (mayor al 90%).
5. El órgano menos adecuado para la detección de PYVV fue raíz, este órgano
presentó los menores valores en los parámetros evaluados para la selección del
método más apropiado para la extracción de RNA, y a pesar de que el virus logró
ser detectado por RT-PCR y qPCR, PYVV presentó una menor acumulación en
este órgano.
6. No se encontró una relación entre el rendimiento de la extracción de RNA y la
carga viral acumulada debido a que en los ensayos de evaluación de los tres
métodos de extracción de RNA se observó que los órganos con los que se obtuvo
el mayor rendimiento de RNA fueron pedúnculo floral y antera y aunque en
pedúnculo se presentó una alta acumulación del virus, en antera la acumulación
fue baja.
7. En cuanto a la acumulación del virus las plantas que presentan síntomas de
amarillamiento (M y S) presentan heterogeneidad en la distribución de PYVV en
los diferentes órganos evaluados encontrándose una acumulación diferencial
entre los órganos de la zona aérea y los de la zona radical, mientras que en
plantas no sintomáticas el virus presenta una distribución homogénea.
8. Los ensayos de evaluación de la acumulación del virus en diferentes órganos de
plantas infectadas sugieren que hay una relación entre la expresión de síntomas y
la carga viral acumulada debido a que en todos los órganos evaluados se
presentó una menor acumulación de PYVV en muestras provenientes de plantas
no sintomáticas. Aunque esto no pudo ser confirmado para tubérculo en donde se
encontró
que
algunos
tubérculos
provenientes
de
plantas
sintomáticas
presentaron cargas virales similares a las acumuladas en tubérculos provenientes
de plantas no sintomáticas (bajas cargas virales).
Conclusiones y Recomendaciones
117
9. En tubérculos provenientes de plantas no sintomáticas se encontró que la
distribución del virus era heterogénea, mientras que en tubérculos de plantas
sintomáticas la distribución parece ser homogénea.
10. Es la primera vez que se reporta la detección de PYVV en órganos reproductivos
como en antera, lo que podría aportar información sobre los mecanismos que
evitan la transmisión sexual de este virus.
11. La técnica de qPCR presentó un mayor porcentaje de detección en todos los
órganos (mayor al 90%) que la técnica de RT-PCR convencional encontrándose
que por esta última técnica se presentó un 12.7% de falsos negativos, mostrando
que la técnica de qPCR presenta una mayor sensibilidad para la detección del
virus, además permitió la detección de PYVV en muestras que provenían de
plantas no sintomáticas.
12. Es la primera vez que se utiliza la técnica de PCR en tiempo real para el estudio
de aspectos de la biología del virus. Previamente López et al. (2006) y Hernández
et al (2010) habían reportado el uso de esta técnica pero con fines de diagnóstico.
13. La información generada en este trabajo puede ser de gran importancia para
dilucidar algunos aspectos relacionados con la transmisión del virus tanto
vegetativamente a partir de semilla-tubérculo, como por transmisión por vector.
También puede ser útil en programas de fitomejoramiento, de indexado de
plantas de papa contra PYVV, programas de cuarentena y de certificación de
semillas de papa libres de virus.
9.2 Recomendaciones
1. Sería interesante ampliar la evaluación al órgano reproductor femenino (pistilo y
ovario) porque podría aportar información sobre los mecanismos que impiden la
transmisión sexual de este virus.
2. En este trabajo las plantas infectadas por vector y mantenidas en invernadero no
tuberizaron. Por lo tanto es recomendable ampliar la evaluación en
tubérculos para confirmar los patrones de acumulación del virus
estos
118
Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos
de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja
3. Ampliar la evaluacióAmpliar el número de muestras para la evaluación de la
distribución del PYVV en diferentes órganos de plantas infectadas, incluyendo la
evaluación de muestras de tubérculo (que no fueron analizadas en este ensayo
debido a que las plantas no tuberizaron) para confirmar los patrones de
acumulación del virus.
4. Realizar un análisis focalizando en el sitio de infección para evaluar la distribución
y movimiento del virus en diferentes órganos de plantas infectadas, incluyendo el
uso de otras técnicas como inmunoimpresión de tejido (IMI), hibridación in situ o
microscopía electrónica de transmisión para hacer un análisis a nivel de tejido.
5. Hacer un análisis de la acumulación del virus en plantas de papa criolla que
presenten infecciones mixtas con PYVV para evaluar como es la interacción (si se
presenta o no sinergismo) y como se afecta la acumulación de los virus en los
diferentes órganos.
6. Se recomienda ampliar el estudio con otras variedades de papa, para ver si los
patrones encontrados son generalizados o pueden ser diferentes entre
variedades.