Download Chips de proteína

CHIPS DE
PROTEINAS
DE GENÓMICA A PROTEÓMICA
PROTEOMA es el conjunto de proteínas codificado por el genoma.
El estudio del proteoma es la PROTEÓMICA
• Proteínas de cualquier célula
• Isoformas
• Proteínas modificadas
• Interacciones entre proteínas
• Descripción estructural de las proteínas
• Descripción estructural de los complejos proteicos
• Por extensión: cualquier cosa post-genómica
High-throughput Biochemistry
Proteómica (en la actualidad): Bioquímica de proteínas a gran escala
con gran precisión y rendimiento.
Objetivo: Descripción completa de la función celular
Plataformas para la proteómica y genómica funcional
Escalabilidad de la proteómica
Genómica: GRAN escalabilidad  PCR, secuenciadores automáticos,etc.
Proteómica: POCA escalabilidad. Motivos:
• Material limitado y variable
• Degradación de la muestra
• Rango dinámico de abundancia muy grande (106)
• Modificaciones post-traduccionales abundantes
• Especificidad temporal y de desarrollo
• Perturbaciones patológicas
• Perturbaciones farmacológicas
Análisis de proteínas a escala proteómica
Si queremos definir la:
Debemos de poder:
- Identidad
Generar un conjunto de
- Cantidad
CLONES que expresen las
proteínas individuales
- Estructura
- Función
de todo o parte un
PROTEOMA
De todas o un grupo de proteínas
(dentro de un contexto celular)
Seguido de:
ANÁLISIS
Proteínas en un formato ÚTIL
TÉCNICAS NECESARIAS
• Genéticas
• Bioquímicas
• Biología celular
•
Construcción de chips
•
Identificación de interacciones
• Localización de proteínas en
compartimentos celulares
1. Expresión y purificación de proteínas
2. Pruebas de actividad a escala proteómica
a) Aproximación genómica bioquímica
b) Microarrays
- Analíticos
- Funcionales
1. Expresión y purificación de proteínas
Localización de los ORFs
Problemas:
(pautas abiertas de lectura)
- A veces difícil localización
- Señales de “splicing”
- Poliadenilación
Problemas:
Clonación de los ORFs
- Se trata de una simplificación
- Se elige un mRNA y se descartan las
isoformas
- Las modificaciones posttraduccionales
(fosforilación, glicosilación, metilación,
acetilación) pueden no ser consideradas
- No vale para proteínas de membrana
Clonación de los ORFs
Métodos de síntesis de HT:
Requiere:
- Cebadores (“primers”) para la PCR
- Inserción en vectores
- Síntesis automática
- Precio razonable
- Rapidez y precisión
Inserción en vectores
A) Recombinación mediada por la reparación del hueco
B) Clonaje independiente de ligación (T4 polimerasa + dCTP o dGTP)
C) Sistema Gateway de Invitrogen (integración/excisión del fago )
Inserción en vectores
Expresión
Sistemas homólogos  Es el mejor (modificaciones post traduccionales,
interacciones con sus parejas proteicas, etc)
Sistemas heterólogos  Son necesarios para muchos organismos. Una
alternativa son las células de insecto (modificaciones similares a mamíferos)
Incorporación de marcadores
Fusión de péptidos o proteínas a las proteínas de interés
Alta AFINIDAD y SELECTIVIDAD
Conservación de la ACTIVIDAD
- Glutatión-S-transferasa / agarosa de glutatión
- Marcador de Hisx6 / agarosa de Ni
- Péptido de unión a calmodulina / agarosa de calmodulina
- Proteína A / -inmunoglobulina
- Combinación de anteriores con sitios de corte (trombina, TEV, etc)
- Proteína de unión a maltosa
- Epítopos: hemaglutinina, Myc y FLAG
- Derivados de GFP. Detección mediante FRET
Detección GFP mediante FRET
PROBLEMAS GENERALES:
- Cada proteína de fusión requiere un esquema y un protocolo diferente
- Hay proteínas que no se dejan purificar
- Hay proteínas que se inactivan al fusionarse
2. Actividad proteica a escala proteómica
a) Aproximación Bioquímica genómica
b) Microarrays (Chips)
a) Aproximación bioquímica genómica
Uso de análisis bioquímico en paralelo de grupos de proteínas
provenientes de un proteoma. El objetivo es identificar a una
proteína como responsable de una función.
Clonación GST-ORF  Expresión y purificación en grupos de 96
Ensayo bioquímico  Grupos Positivos  Subgrupos 
Ensayo en los subgrupos  Positivos (deconvolución)
Ventajas:
- Rapidez de asignación de función a ORFs.
- Válido para cualquier tipo de ensayo de actividad
- Alta sensibilidad
- Permite la detección de complejos proteicos
b) Microarrays
Objetivo: análisis de alto rendimiento, a gran escala de la función génica, de
forma rápida y barata.
Metodología: las proteínas purificadas individuales se depositan en una
superficie, generalmente una lámina de vidrio para analizar su actividad
Comparación con los chips de DNA
Chips de DNA:
- No dan información directa de la función génica
- Sencillos de hacer
Chips de proteína:
- información directa de función
- Complejos de hacer, ya que la función proteica es
dependiente de estado, como las modificaciones posttraduccionales, interacción con otras proteínas,
localización subcelular, modificaciones covalentes
reversibles, etc.
Manufactura de chips
Deben retener la función de la proteína
Ser compatibles con las tecnologías de fabricación
Deben permanecer en un ambiente húmedo
Sustratos blandos
Se usan superficies de poliestireno, nitrocelulosa o
PVDF.
No permiten alta densidad de empaquetamiento
Los puntos de aplicación difunden en la superficie
Relación señal ruido muy bajos
Orientación al azar
Estructuras de superficie 3D
- Se hace una capa fina de poliacrilamida o agarosa sobre el vidrio
- Se depositan las proteínas con
fotolitografía
- Se entrecruzan para inmovilizarlas
Ventajas
Alta capacidad de inmovilización
Ambiente acuoso
Proteínas activas
Desventajas
Difícil cambiar tampones
Difícil recuperar las moléculas
Orientación al azar
Nanopocillos
Vidrio recubierto de PDMS
Se hacen nanopocillos en los
cuales se depositan las
proteínas
Las proteínas se inmovilizan
por entrecruzamiento
Ventajas
- Alta capacidad de inmovilización
- Reducen la evaporación
- Minimizan las contaminación cruzada
- Minimizan ruido de fondo
-Son abiertos, con lo que se pueden
tratar secuencialmente con tampones,
lavados , etc.
- Recuperación de las muestras fácil
Desventajas
Requiere equipo especializado,
sofisticado y caro
Orientación al azar
Vidrio
Unión de la proteína directamente en la
superficie del vidrio o bien después de
aplicar recubrimientos de diferentes
tipos:
- Poli-L-Lisina (adsorción)
- Activación con aldehido (covalente)
- Activación con epoxy (covalente)
- Recubrimiento de oro (covalente)
O bien
- Biotina (afinidad)
- Hisx6 (afinidad)
Ventajas
-Enlace covalente disminuye
probabilidad de alteración de la
conformación nativa
- Afinidad: orientación correcta
Desventajas
Grupos –NH2 de cadenas laterales
pueden modificar actividad.
Afinidad: hay que biotinilar o marcar
con Hisx6 todas las proteínas
Tipos de chips
Superficie
Ventajas
Desventajas
Sustratos
blandos 2D
Poliestireno
Membranas de nitrocelulosa
PVDF (fluoruro de
polivinilideno)
(Adsorción y absorción)
No requiere modificar la
proteina. Alta capacidad
de retención de proteína
Unión no especifica de la
proteína. Orientación al azar.
Ruido de fondo. Chips de baja
densidad
Estructuras
superficiales
3D
Poliacrilamida y
agarosa
(difusión)
No requiere modificar la
proteina. Alta capacidad
de retención de proteína
No disponibles comercialmente
Nanopocillos
Vidrio recubierto de PDMS
(polidimetilsilosano)
(entrecruzamiento)
Unión fuerte y alta
densidad de
empaquetamiento
Oreintación al azar de las
proteínas
Vidrio
Vidrio solo
Cubierta de poli-L-Lys
Activación con aldehido
Activación con epoxy
Cubierta de oro
Unión por afinidad:
Avidina o resina de Ni2+
(adsorción, absorción,
entrecruzamiento o unión por
afinidad)
Idem a 2D
Idem a 2D
Chips de alta densidad
Alta densidad y resolución
Acoplado a SPR y MS
Unión fuerte, especifca y
de alta densidad
Idem a 2D
Idem a 2D
Orientación al azar
Orientación al azar
Orientación al azar
Proteinas deben ser
biotiniladas o Hisx6
Sistemas de depósito de proteínas
Baja densidad: Sistemas de DOT-BLOT de 96 pocillos
Alta densidad: Robots capaces de depositar >30000 proteínas
- Contacto directo con la superficie
- Tecnología de chorro de tinta (ink-jet). No toca superficie
- Electrospray. Disminuye mancha de 150 a 30 µm.
Sistemas de detección de proteínas
Fluorescencia (preferido porque)
- Sencillo
- Seguro
- Muy sensible
- Puede tener muy alta resolución
ELISA
Marcaje radioisotópico
La detección por fluorescencia:
- 1 paso: molécula fluorescente
- 2 pasos: usando un marcador de
afinidad (p.e. biotina +
estreptavidina fluorescente)
- RCA (rolling circle amplification)
Estudio de interacción proteína
con proteína, DNA o fármaco
Sistemas de detección de proteínas (2)
SELDI-MS: espectroscopia de masas con desorción ionización láser
incrementado en superficie
- No necesita marcaje de ningún tipo: detección directa
- Se utiliza en chips recubiertos de capa metálicas, donde el láser
vaporiza las proteínas y la MS revela la identidad de la proteína
AFM: microscopia de fuerza atómica
- Aprovecha cambios en al topológicos en la superficie para identificar
las proteínas capturadas
SPR: resonancia de plasma en superficie
- Permite detección en tiempo real
- Seguimiento cinética de interacción (p.e.) antígeno-anticuerpo
- Amplio rango de pesos moleculares, afinidad y velocidad de unión
Chips analíticos
Se unen diferentes tipos de ligandos,
como anticuerpos, antígenos, aptámeros
de DNA o RNA, carbohidratos pequeñas
moléculas
Muestras de proteína de dos
estados biológicos se marcan
separadamente con agentes
fluorescentes rojos y verdes, se
mezclan, e incuban en el chip. Las
manchas indican sobreexpresión
Determinar niveles de
expresión de proteínas.
Perfiles de expresión
Diagnóstico clínico
Chips analíticos: anticuerpos
- Es el más usual
- Se depositan los anticuerpos a alta densidad en el chip
- Se pasa un extracto celular, suero o incluso células vivas sobre el chip
- El antígeno se une
- Detección con antígeno (extracto) marcado o con un segundo anticuerpo
Desventajas:
- Tener agentes que reconozcan la
proteína de interés: anticuerpos
- Anticuerpos policlonales poco
específicos y caros
- Anticuerpos monoclonales mucho
mas caros, más difíciles de
producir y tardan más tiempo
Alternativa a producción de
anticuerpos o sucedáneos
- Presentación de Ab en fagos
- Presentación de ribosomas
- SELEX (evolución sistemática de
ligandos por enriquecimiento
exponencial)
- Presentación de mRNA
- Affibody display
Construcción de un amplio repertorio de
regiones con actividad de unión “potencial”
Chips analíticos: alergenos o antígenos
- Inverso al anterior
- Se depositan los antígenos a alta densidad en el chip
- Se detectan los anticuerpos (normalmente suero) sobre el chip
- Detección de los anticuerpos
Ejemplo 1: Hiller et al.
94 alergenos purificados unidos a vidrio
Perfiles de reactividad frente a las IgE de pacientes alérgicos
Pequeñas cantidades de suero
Test de alergia alternativo al de piel
Ejemplo2: Robinson et al.
>300 autoantígenos de 8 enfermedades autoinmunes, sobre vidrio
Pequeñas cantidades de suero
Chips analíticos: péptidos
Objetivo: Detección de epitopos en las proteínas que definan su
“actividad básica”
Ejemplo 1: Houseman et al
- Inmovilización en vidrio recubierto de oro de >3000 péptidos de
9 aminoácidos de longitud
- Localización de sustratos de la c-Src tirosina quinasa
- Detección con SPR, fluorescencia e imagen de fósforo
Ventajas:
- Péptidos más cortos
- Péptidos más estables que las proteínas
- Permiten fabricación de chips de alta densidad
- Síntesis del péptido in situ mediante fotolitografía o síntesis
dirigida por luz (ahorro económico ya que se necesita muy poco
material)
Chips analíticos: carbohidratos
Chips funcionales
Las proteínas o los péptidos provenientes del proteoma de un organismo
se purifican o se sintetizan individualmente usando métodos de alto
rendimiento o capacidad de ejecución (HT)
Muestras de proteína de dos
estados biológicos se marcan
separadamente con agentes
fluorescentes rojos y verdes, se
mezclan, e incuban en el chip. Las
manchas indican sobreexpresión
Permite analizar:
- Actividad de proteínas
- Propiedades de unión a ligando
- Modificaciones post-traduccionales
- Identificación dianas farmacológicas
- Construcción de redes biológicas
Chips funcionales: ejemplos
Ejemplo 1: Zhu et al
Análisis de interacción de familias de proteínas
-119 proteinas quinasas y 17 sustratos
-Los sustratos son inmovilizados en nanopocillos
-Las quinasas se incuban con los sustratos en presencia de ATP*
-Se detectan los sustratos marcados con imagen de fósforo
Ejemplo 2: Zhu et al
Análisis de un proteoma completo
- 5800 de 6200 ORFs de levaduras.
- Las proteínas se marcaron con GST y con Hisx6 (ambos). Se obtuvo un rendimiento del 80% de proteínas funcionales
- Se unen al chip recubierto de Ni-NTA con la His x6
- Chequeo de calmodulina y fosfoinosítidos (PIs)
- Se obtuvieron 6 interacciones conocidas junto con 33 nuevas de
calmodulina y mas de 150 proteínas que interaccionaban con los PIs
Aplicaciones generales de los chips
Genómica Bioquímica vs Chips
Genómica bioquímica:
- Requiere 64 ensayos para cubrir el genoma de levadura (grupos de 96 proteínas)
- Es muy flexible para muchos tipos de ensayos bioquímicos
- Particularmente útil para ensayos de actividad enzimática
Desventajas:
El uso de los grupos de proteínas (o pools) no asegura la calidad de las proteínas
Las otras 95 proteínas pueden interferir con la medida
No permite medidas fiables de unión con fluorescencia
No puede maneja múltiples positivos al mismo tiempo
Chips de proteína:
Permite chequear la calidad individual de cada proteína
Identificación inmediata de ORFs responsables de una actividad específica
Identificación de positivos múltiples en una sola vuelta
Análisis de alto rendimiento de actividades proteicas
Automatización de la construcción, ensayo y lectura de resultados
Desventajas:
Se necesitan cultivar 6000 cepas (levadura) y 6000 purificaciones de proteínas
Se necesita inmovilizar los sustratos para los ensayos de unión fluorescentes
Conclusiones
• Los chips pueden ser una herramienta poderosísima en la
biología a gran escala
• La metodología de fabricación sobre vidrio está validada para
análisis de proteína a partir de un proteoma completo
• La metodología de fabricación esta robotizada, así como la
de ensayo y lectura de resultados
• La mejora de la producción de anticuerpos como reactivos
influirá en la mejora de los chips como herramientas en el
análisis del proteoma