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BIODEGRADACIÓN DE COLORANTES AZO BAJO CONDICIONES
REDUCTORAS POR BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS MESOFÍLICAS
AISLADAS DE DIVERSOS AMBIENTES
María S. PEDRAZA CHAN1 , Gunther GEISSLER DAHLHEIM1, Ma. Lilia CEDILLO
RAMÍREZ1,2 y Andrés A. MUÑOZ GARCÍA1,2.
1
Posgrado en Ciencias Ambientales. Instituto de Ciencias Benemérita Universidad
Autónoma de Puebla. Edif. 76 1er. Piso. Ciudad Universitaria. Puebla.
2
Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas. Instituto de Ciencias
Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Edif. 76. 3er Piso. Ciudad
Universitaria. Puebla. [email protected]
Palabras claves: Biodegradación, Shewanella, Colorantes Azo
RESUMEN
Los colorantes son hoy en día un problema ambiental creciente en la
contaminación de ríos, debido a su pobre biodegradación, estos permanecen
mucho tiempo en el ambiente transformándose naturalmente bajo condiciones
reductoras y que en el peor de los casos se transforman en aminas aromáticas
potencialmente cancerigenas. En la búsqueda de tratamientos amigables con el
ambiente como es la biorremediación como una opción para la remoción de estos
compuestos de las aguas residuales principalmente industrial se llevó a cabo este
trabajo para lo cual se aislaron microorganismos de diversos ambientes que bajo
diferentes condiciones de crecimiento y dependiendo de la capacidad del
microorganismos para mineralizar el colorante se seleccionaron 27 colonias que
se lograron identificar mediante pruebas bioquímicas estandarizadas; encontrando
Morganella morganii,, Aeromonas hydrophila/caviae, Escherichia coli, Shewanella
putrefaciens, Agrobacterium radiobacter, Kluyvera spp, Proteus vulgaris,
Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa,
Citrobacter spp., Sphingomonas sp., Pseudomonas fluorescens. Shewanella
putrefaciens pudo ser aislada tanto de aguas residuales, lixiviados del relleno
sanitario de la ciudad de Puebla, como de lodos activados de la planta de
tratamiento municipal y mostró ser una bacteria con capacidades de degradación
de colorantes en medio líquido hasta con 100ppm del colorante en tan solo 1 día
de inoculado.
INTRODUCCIÓN
La contaminación ambiental con colorantes es un problema presente en México,
desde épocas remotas, en el estado de Puebla (1835) con el inicio de las
actividades de la industria textil “La Constancia Mexicana” que fue el pivote de la
industrialización de la región y la primera en América Latina. Actualmente son
pocas las industrias que se dedican a la elaboración de colorantes en nuestro país
pero si hay gran número de ellas que los usan dentro de sus procesos industriales.
1
Siendo la principal la industria textil que consume dos terceras partes de la
producción total de los colorantes. (Melgoza et al. 2004).
En base a la estructura química o grupo cromóforo se pueden diferencias
entre 20 y 30 diferentes grupos de colorantes. Los colorantes azo, antraquinonas,
ftalocianinas y triarilmetanos son cuantitativamente los grupos más importantes.
El vasto conjunto de colorantes es clasificado en términos de su color, estructura y
método de aplicación en el Colour Index (C.I.), en el cual en su tercera edición lista
cerca de 28,000 nombres comerciales, que representan aproximadamente 10,500
diferentes colorantes, 4,500 de los cuales son recientemente producidos. (Van der
Zee, 2002).
En proceso ineficiente de teñido grandes cantidades de colorante se
pierden en las aguas residuales afectando directamente al ambiente; la cantidad
perdida depende de la clase de colorante y de su aplicación, esto puede variar
entre 2% para colorantes básicos y 50% para colorantes azo reactivos (Melgoza et
al, 2004).
Los colorantes azo son usados por un sin número de industrias dentro de
las que se encuentran la textil, la de alimentos, la farmacéutica, la papelera, la
curtiduría, de cosméticos, la fotográfica etc.
El sistema cromóforo de los colorantes consiste esencialmente del grupo
azo (−N=N−) en asociación con uno o más sistemas aromáticos (Lorimer et al
2001 ); su estructura puede contener uno o varios de estos grupos. El fundamento
de la producción de los colorantes azo fue desarrollada en 1858 cuando Gries
descubrió el mecanismo de reacción: la diazotización, para los productos de los
compuestos azo.
Datos recientes sobre la producción mundial no están disponibles, sin
embargo, se puede asumir que se han producido mayores cantidades de
colorantes en vista de la producción de muchos pigmentos. Estos colorantes son
compuestos xenóbioticos y cerca de 700 mil toneladas son producidas anualmente
en todo el mundo. Estos compuestos conservan íntegro su color y estructura bajo
exposiciones a la luz solar, polvo, bacterias y humedad, también muestran una
alta resistencia a la degradación microbiana en sistemas de tratamiento de agua
residual. En telas sintéticas como nylon, lycra, rayón y poliéster se pueden
adherir, y continuamente se actualizan para producir nuevos colores, por lo que se
incrementa su presencia en las descargas de aguas residuales industriales. El
tratamiento de efluentes con descargas de colorantes azo es de interés debido a
sus impactos estéticos y sobre todo tóxicos a los ecosistemas. Estos compuestos
en un sistema acuático sufren varias reacciones alterando su estructura química
que pueden dar por resultado nuevos compuestos xenóbioticos precarcinogénicos
o cancerígenos.
Estos colorantes en su forma purificada son rara vez
directamente mutagénicos o carcinogénicos, excepto para algunos que poseen un
grupo amino libre. La reducción de los grupos azo en el intestino, libera aminas
aromáticas que son absorbidas por el intestino y excretadas en la orina. El riesgo
de toxicidad aguda de aminas aromáticas es el cáncer de vejiga.
Los compuestos azo son difíciles de biodegradar debido a su alta
estabilidad a la luz y al ataque microbiano por lo que persisten en el ambiente.
(Cabral et al. 2005, Wallace 2001). Estos compuestos sintéticos son resistentes a
la degradación de la mayoría de las bacterias aerobias, ya que el fuerte carácter
2
capturador de electrones del grupo azo estabiliza estos agentes contaminantes
aromáticos contra conversiones de la oxigenasa. Debido a su carácter
recalcitrante en el ambiente aerobio, los colorantes azo eventualmente acaban en
sedimentos anaerobios, acuíferos poco profundos, y aguas subterráneas o en el
tracto grastrointestinal de animales superiores. (Razo, et al. 1997)
La decoloración de colorantes azo por bacterias es iniciada por la
reducción catalizada por la azoreductasa , como una consecuencia de los
procesos de tratamiento de agua residual convencionales usualmente no pueden
remover eficientemente el color azo ya que estos compuestos son aeróbicamente
recalcitrantes; pero si el microorganismo aerobio es sujeto a condiciones
microaerofilicas, entonces aumenta la tasa de decoloración. (Padamavathy et al.
2003). En un estudio realizado por Tan-Nico (2001) se probó la degradación
secuencial de un sistema anaerobio/aerobio con colorantes azo sulfonados, Isik
trabajó (2002) sobre la decoloración del rojo congo y negro directo 38 por E. coli y
Pseudomonas sp en condiciones aeróbicas, anaeróbicas y microaerofilicas. Se
han investigado la biodegradación con cultivos mixtos como los realizados por Itoh
al lograr un cultivo mixto con Bacillus sp. y Pseudomonas stutzeri (2002). La
biodegradación con hongos también es posible como lo muestra Tatarko (1998) al
degradar el rojo congo por medio del hongo filamentoso Phanerochaete
chrysosporium y en otro trabajo por la levadura Candida zeylanoides (Martins,
1999).
MATERIALES Y MÉTODOS
Los microorganismos que se usaron en el tratamiento de colorantes azo se
aislaron de diversos ambientes: del efluente del sistema de tratamiento de una
industria textil (ETT), de lixiviados del relleno sanitario de la ciudad de Puebla
(LIX), de lodos activados de la planta de tratamiento municipal del río Alseseca
(LPT), del influente de la planta de tratamiento municipal Alseseca (IPT) y de
aguas residuales del río Zahuapan del estado de Tlaxcala (AGZ). La composición
del medio para el aislamiento fue (gr / litro) peptona de carne (5), extracto de
levadura (2.5), NaCl (5), ZnSO4 (0.1), colorante azo (0.05), agar (20), a pH de 6.87.0. Los colorantes usados en el aislamiento fueron marino remazol RGB, marino
remazol C, azul de levafix CA y rojo intenso RGB que fueron proporcionados por
Spintex, S.A. de C.V.; los colorantes naranja de metilo (Fig 1) y rojo congo (Fig. 2)
se utilizaron como estándares. Todos los colorantes fueron de grado industrial.
Fig 1 Naranja de Metilo
Fig 2. Rojo Congo
3
Para la identificación de estos microorganismos se contó con pruebas
bioquímicas estandarizadas API20E, API20NE, y crecimiento en agar CPS ID3.
Las pruebas preliminares y los experimentos de degradación se hicieron en
placas de petri y en tubos de ensaye en condiciones aerobias, microaerofilicas y
condiciones reductoras (bajo tensión de CO2, 5%) con el mismo medio usado para
el aislamiento, el seguimiento de la decoloración se hizo con espectroscopia UVVIS (Perkin Elmer Lambda 20 UV/VIS). Los experimentos aerobios y bajo
condiciones reductoras se mantuvieron ambos en agitación a 200 rpm a 30ºC
durante 3 días.
RESULTADOS
Se aislaron 114 cepas como posibles candidatas para la degradación de los
colorantes azo de los diferentes sitios muestreados, con la realización de pruebas
preliminares se seleccionaron 27 colonias que mostraron resultados positivos en
los experimentos de decoloración de las cuales 11 colonias provienen de IPT, 1
colonia de AGZ, 3 colonias de LPT, 4 de ETT y 8 colonias de LIX. En las figuras 3
y 4 se muestra como se observaron las placas para el aislamiento.
Fig.3. Crecimiento en Rojo Congo.
Fig. 4. Crecimiento en Rojo Intenso RGB
Siguiendo las técnicas de API y confirmando los resultados mediante el
medio CPS ID 3 y algunas pruebas complementarias se lograron identificar las
cepas seleccionadas como Morganella morganii,, Aeromonas hydrophila/caviae,
Escherichia coli , Shewanella putrefaciens, Agrobacterium radiobacter, Kluyvera
spp, Proteus vulgaris, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas putida, Pseudomonas
aeruginosa, Citrobacter spp., Sphingomonas sp., Pseudomonas fluorescens.
Aunque cabe hacer mención que para el caso de algunos bacilos Gram Negativos
no fermentadoras aún no ha sido posible establecer el género al que pertenecen.
Se realizaron algunos experimentos en el medio acetato-nitrato (1.0g KNO3,
0.5g K2HPO4, 0.1g MgSO4, 0.1g NaCl, 2.5G Agar, 100mg ZnSO4, 1mg K1, 100ppm
colorante) con diferentes fuentes de carbono, usando etanol, metanol, acetato de
sodio y al colorante como tales. Pero aunque la mayoría de las colonias crecieron
a las 24hrs., ninguna de ellas mostró una decoloración del medio con excepción
de la cepa 14AgBUAP que con etanol mostraba una ligera decoloración. Se decidió
realizar nuevamente este experimento pero cambiando las condiciones, se usó el
medio nutritivo con el que se hicieron las primeras pruebas de decoloración
probando las mismas fuentes de carbono, los tratamientos no mostraron
4
diferencias significativas, esto posiblemente se deba a que la degradación del
colorante no esta en función de la fuente de carbono para las cepas aisladas.
En los tratamientos de la decoloración de los colorantes solo se utilizaron el
rojo congo, naranja de metilo y azul de levafix, los experimentos fueron realizados
en tubos de ensaye con rosca en medio liquido y semigelificado.
Once cepas fueron capaces de decolorar 100 ppm del rojo congo, cinco 100
ppm de naranja de metilo y 27 cepas fueron capaces de decolorar el azul de
levafix en condiciones microaerofilicas.
Las mismas cepas se probaron en condiciones aerobias y condiciones
anaerobias dando resultados positivos de decoloración en ambas condiciones, con
excepción de la cepa AOBUAP que muestra su actividad de decoloración lenta en
condiciones aerobias. La tabla I muestra porcentajes de remoción de colorantes
de algunos cepas seleccionadas por su gran actividad de decoloración.
Tabla I. Porcentaje de remoción de las cepas que mostraron mejores resultados en condiciones
aerobias y condiciones reductoras de CO2.
TRATAMIENTO AEROBIO
COLONIA
IDENTIFICACIÓN
6AgBUAP
Aeromonas hydrophila/caviae
7AgBUAP
Bacilo gram negativo
5% de CO2
ROJO CONGO
AZUL DE LEVAFIX
ROJO CONGO
% remoción
90.42
% remoción
99.62
% remoción
95.00
98.81
98.43
96.79
12AgBUAP
Shewanella putrefaciens
99.85
90.13
94.77
12aAgBUAP
Agrobacterium radiobacter
99.34
17.97
94.77
14AgBUAP
Escherichia coli
no se determino
40.17
no se determino
15AgBUAP
Shewanella putrefaciens
89.58
no se determino
91.08
3LDhBUAP
Proteus vulgaris
no se determino
54.63
no se determino
5LDhBUAP
Shewanella putrefaciens
97.52
100.00
95.17
5' LDhBUAP
Shewanella putrefaciens
98.22
97.10
92.63
36BUAP
Pseudomonas putida
23.21
no se determino
78.05
40BUAP
Pseudomonas aeruginosa
5.79
no se determino
no se determino
1MRG BUAP
Sphingomonas sp.
66.77
49.98
49.09
GBUAP
Citrobacter spp.
no se determino
41.78
no se determino
AO BUAP
Bacilo gram negativo
17.69
no se determino
98.56
ANBUAP
Shewanella putrefaciens
98.22
94.69
no se determino
La principal especie bacteriana con actividad azoreductasa fue Shewanella
putrefaciens con una remoción detectada por la desaparición del color hasta del
97% del rojo congo y 100% del azul de levafix, seguida por Aeromonas y por tres
especies de Pseudomonas (P. aeruginosa, P. putida y P. stutzeri ) y algunas
enterobacterias ( E. coli, Morganella morganii, Proteus vulgaris y Kluyvera sp). Las
siguientes figuras muestran los espectros de decoloración del rojo congo y azul de
levafix para la bacterias Aeromonas hydrophila/caviae y Shewanella putrefaciens.
5
Testigo
Shewanella putrefaciens
Aeromonas hydrophila/caviae
1.4
Testigo
Shewanella putrefaciens
Aeromonas hydrophila/caviae
1.2
1.0
1.5
λmáx 570nm
Abs
0.8
Abs
λ máx 478nm
2.0
1.0
0.6
0.4
0.5
0.2
0.0
0.0
300
400
500
600
300
700
400
500
600
700
nm
nm
Fig. 5 Efecto de la actividad bacteriana en el
azul de levafix en condiciones aerobias a 30°C
y pH 6.8-7.0, durante
3.0 un periodo de 3 días.
Fig. 6. Efecto de la actividad bacteriana en el
rojo congo en condiciones aerobias a 30°C y
Rojo Congo pH 6.8-7.0, durante un periodo de 3 días.
Shewanella putrefaciens
Aeromonas hydrophila/caviae
2.5
Abs
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
300
400
500
600
700
nm
Fig. 7. Efecto de la actividad microbiana en el rojo
congo en condiciones anaerobias a 30°C y pH 6.87.0, durante un periodo de 3 días.
DISCUSIÓN
La capacidad de bacterias anaerobias facultativas para la degradación de
colorantes azo puede ser una respuesta a los problemas de contaminación con
estos colorantes, como la composición del medio utilizado en los tratamiento fue
nutritivo esto puede sugerir que para sistema de tratamiento de colorantes puede
ser adicionado con aguas de plantas de tratamiento municipal debido a la gran
cantidad presente de materia orgánica.
Se logró aislar Shewanella putrefaciens tanto de LPT, de IPT y de LIX
sugiriendo que es una bacteria que podemos encontrar en diferentes ambientes
tanto en agua, como en residuos sólidos y que tiene gran versatilidad metabólica
6
para degradar contaminantes (Jahn M.K., et al. 2006), al lograrla aislar de los
lixiviados del relleno sanitario. Esta bacteria que presentó mejores resultados de
decoloración en condiciones aerobias y reductoras en concentraciones de 100
ppm de colorante rojo congo y azul de levafix. Los espectros de UV-VIS sugieren
que los metabolitos producidos al atacar al rojo congo, difieren de los que
aparecen al atacar el azul de levafix, ya que está en dependencia de la estructura
química de cada colorante (Genc N. 2004).
Tanto Shewanella putrefaciens como Aeromonas hydrophila/caviae
mostraron ausencia de color en los medios antes de 24 h de inoculados, reflejando
su gran actividad azoreductasa.
CONCLUSIONES
La desaparición del color en los experimentos se debe principalmente a la
ausencia del grupo cromóforo. Esta ausencia del grupo cromóforo se debe a la
ruptura de grupo azo que es característico en estos colorantes debido al ataque de
la azoreductasa de las bacterias microaerofilicas .
Los metabolitos producidos por la ruptura de estos enlaces son aminas
aromáticas, que para el caso del rojo congo puede ser la bencidina , una potencial
amina cancerigena
Se encontraron bacterias de diferentes géneros capaces de atacar estos
colorantes, entre las que se encuentran Enterobacterias y de las cuales ya se han
reportado estudios debido a su presencia en el tracto grastrointestinal donde
llevan a cabo la reducción de los colorantes azo como es el caso de E. coli, y
Proteus vulgaris.
Se pudo comprobar en este trabajo de la amplia variedad de
microorganismos que podemos encontrar en el ambiente y que tiene capacidades
para ser utilizadas dentro de la biotecnología, así como llevarnos a la idea de que
bacterias que puedan estar mutando debido a la presencia de grandes
contaminantes xenobióticos en la aguas residuales.
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