Download decontaminación de bacterias en sangre mediante inactivación

DECONTAMINACIÓN DE BACTERIAS EN SANGRE MEDIANTE
INACTIVACIÓN FOTODINÁMICA
Mariana B. Spesia,a Marisa Roverab y Edgardo N. Durantinia
a
Departamento de Química, bDepartamento de Microbiología e Inmunología, Universidad Nacional de
Río Cuarto, Agencia Postal N° 3, X5804BYA Río Cuarto, Argentina. E-mail: [email protected]
En los últimos años, el patrón cambiante de enfermedades infecciosas y la resistencia
emergente a antibióticos de uso corriente han hecho necesario encontrar nuevas
alternativas para el tratamiento de infecciones bacterianas. El descubrimiento y uso
extensivo de antibióticos representa uno de los avances más revolucionarios en la
medicina científica. Sin embargo, la prescripción inapropiada y el hecho de que algunos
pacientes no completen los tratamientos o se automediquen, agravan este problema.
Además, el uso de antibióticos en la profilaxis post-operativa es otra de las razones para
la aparición de resistencia a drogas en los hospitales. Las nuevas terapias antibacterianas
propuestas incluyen a bacteriófagos, modificación del fenotipo bacteriano y la
inactivación fotodinámica (IFD) de microorganismos. Esta última metodología surge
como una alternativa probable, debida a que no se ha reportado resistencia ni efectos
mutagénicos. Además, la posibilidad de erradicar bacterias por la activación de drogas
con luz tiene un potencial terapéutico inmediato para el manejo de enfermedades
infecciosas. La IFD posee la ventaja de tener selectividad dual, ya que, no sólo el
fotosensibilizador puede ser específico de una clase de células, sino que también la luz
puede ser irradiada puntualmente en el área afectada. Los estudios indican que las
bacterias Gram-positivas son susceptibles al efecto producido por sensibilizadores
neutros y aniónicos, sin embargo las Gram-negativas han sido inactivadas solamente en
presencia de un agente que estimule la translocación del sensibilizador a través de la
membrana. Por otra parte, la presencia de cargas positivas en la periferia de los
sensibilizadores los hace aptos para la fotoinactivación directa de este tipo de bacterias,
sin la presencia de un agente adicional permeabilizante. En este trabajo, se investigó la
IFD de Escherichia coli en presencia de diferentes ftalocianinas catiónicas (Esquema)
en diferentes medios biológicos.
R
O
+
N
+
N
N
N
N
N
N
N
+
N
N
Zn
N
R O
Zn
N
N
N
N
ZnPPc4+ R:
N
N
N
ZnEPc4+ R:
N
N+
4+
ZnAPc
N+
N+
O R
O
R
Esquema
En primer lugar se analizó la habilidad de las ftalocianinas catiónicas para unirse a las
células bacterianas. Los cultivos de E. coli fueron tratados con 2 µM del sensibilizador
por diferentes tiempos de incubación a 37ºC en la oscuridad. La cantidad de
sensibilizador unido a las células fue determinada mediante la emisión de fluorescencia.
En estas condiciones, las ftalocianinas fueron incorporadas rápidamente a las células de
E. coli, en 5 min, y la cantidad de ftalocianina unida no cambia a mayores tiempos de
incubación. Las tres ftalocianina estudiadas mostraron una incorporación de ~0,8±0,1
nmol/106 células. Este valor indica que el sensibilizador entra considerablemente a las
células, dentro de las cuales produce especies reactivas del oxígeno, causando daño en
el funcionamiento normal de macromoléculas indispensables para el funcionamiento
celular. Después del tratamiento de las células de E. coli con 2 µM de los
sensibilizadores durante 30 min a 37ºC en la oscuridad, los cultivos en PBS fueron
irradiados con luz visible (90 mW/cm2). La mayor fotoinactivación fue presentada por
la ftalocianina ZnPPc4+, seguida de ZnEPc4+, mientras que la menor muerte fue causada
por ZnAPc4+, cuando los cultivos fueron irradiados durante 30 min. En estas
condiciones, ZnAPc4+ produce una disminución de ~2 log, lo cual corresponde a una
inactivación celular de ~99%. En cambio, la ZnEPc4+ causa una reducción de ~ 3,5 log,
(99,997%), y la viabilidad celular se reduce en ~4,5 log con ZnPPc4+ (99,9997%). Por
otro lado, los experimentos controles incubados en la oscuridad con la misma
concentración de ftalocianina durante 30 min, indican que la viabilidad de las células de
E. coli no es afectada por estos sensibilizadores cuando no son irradiados, ni cuando
están expuestos a la luz visible en ausencia del sensibilizador. En el tratamiento de
sangre contaminada con microorganismos patógenos, es conveniente encontrar
condiciones en las cuales puedan ser inactivadas las células microbianas sin producir un
daño apreciable en los componentes del fluido biológico. Los estudios indican que en
condiciones similares a los ensayos in vitro en PBS con E. coli, las ftalocianinas
ZnAPc4+ y ZnEPc4+ no producen hemólisis de los glóbulos rojos humanos. Estos
resultados sugieren que las ftalocianinas catiónicas presentan propiedades interesantes
como agentes sensibilizadores para su potencial aplicación en la decontaminación de
bacterias en sangre, ya que no producen daño en los glóbulos rojos.