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Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005
Frecuencia de Aislamientos de Staphylococcus spp
Meticilina Resistente en el Hospital Pediátrico
"William Soler".
Leonora González1, Astrid Ramos1, Mabel González2, Loreta Nadal1, Leudis Chacon2,
Janet Morffi1, Aniurka Garcés1 y Carlos Vallin1.
1
Departamento de Investigaciones Biomédicas, Centro de Química Farmacéutica, Calle 200 y 21, Atabey,
Playa, Ciudad Habana, Cuba.
2
Hospital Pediátrico "William Soler "Doble vía San Fco. y Perla Altahabana, Ciudad Habana, Cuba.
Correo electrónico: leonora.gonzalez@ cnic.edu.cu
RESUMEN: Los Staphylococcus spp meticilina resistentes (SMR) son importantes patógenos causantes de
morbi-mortalidad en todo el mundo. Esta resistencia es mediada por la producción de una proteína de unión a
penicilina alterada (PBP 2a), la cual tiene baja afinidad por los antibióticos beta-lactámicos y esta codificada por
el gen mecA. Unos pocos antimicrobianos están disponibles para el tratamiento de estas infecciones, hoy en día
la mayoría de los aislados permanecen sensibles vancomicina, única opción terapéutica en nuestro país, para
el tratamiento de infecciones causadas por SMR. El presente estudio tuvo como objetivo determinar la
frecuencia de aislamientos de SMR en el hospital pediátrico "William Soler". Fueron estudiados 128 aislados de
Staphylococcus spp provenientes de muestras clínicas (32 Staphylococcus aureus y 96 Staphylococcus
coagulasa negativos). La identificación de las especies se determino por el sistema Rapi Stha (Biomeriux). Los
valores de concentración mínima inhibitoria (CMI), el crecimiento en placas de oxacilina y los patrones de
resistencia de SMR a otros antimicrobianos, se realizaron siguiendo las recomendaciones de las guías NCCLS.
Para la detección del gen mecA, se utilizo la reacción en cadena de la polimerasa. El 15% de los S. aureus y el
43% de los Staphylococcus coagulasa negativos fueron intrínsecamente resistentes a meticilina, CMI > 2
µg/mL y presentaban el gen mecA. Los SMR poseen resistencia cruzada a otras familias de antibióticos,
especialmente macrolidos, no se encontró resistencia a vancomicina. Nosotros recomendados que se
apliquen medidas de aislamientos a pacientes con infecciones por SMR, para evitar la diseminación de estos
microorganismos.
ABSTRACT: Methillin resistant staphylococci (MRS) are significant pathogens, and they are cause of morbidity
and mortality in a worlwide. This resistance is mediated by the production of an altered penicillin-binding protein
(PBP2a), which has a low affinity for beta-lactam antibiotic, and the gene encoding is mecA. Just a few
antimicrobial agentes are available for the treatment of these infections, to date the majority of all these isolates
remain susceptible to vancomycin, only drug of choise in our country for treatment of infecctions cused by MRS.
The present study, was carried out in order to determine the isolation frcuency of MRS in the hospital pediatrics
"William Soler". A total of 128 staphylococcal isolates (32 Staphylococcus aureus y 96 coagulase-negative
Staphylococci) from clinical specimens were studied. Species identification of sthaphylococci was based in the
Rapi Stha (Biomeriux). The MIC values, the oxacillin agar screen and the resistance patterns of MRS against
other antibiotic was determined using the recommended by the guide NCCLS. The mecA gene detection was
carried out for a polymerase chain reation. The 15% of Staphylococcus aureus and 43 % coagulase-negative
Staphylococci were intrinsic methicillin resistant MIC>2 µg/mL, whit the presence of the mecA gene. The MRS
have a cross-resistance to other antibiotic families in special to macrolides; vancomycin resistance was not
found. We recommended isolate patients with methillin resistant staphylococci infections in this hospital to
prevent the spread of these organisms.
Palabras claves: Staphylococcus spp, resistencia a meticilina, susceptibilidad a antimicrobianos, gen mecA.
Key words: Staphylococcus spp, methicillin resistant, antibacterial susceptibility, gen mecA.
Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005
INTRODUCCIÓN
Los Staphylococcus meticilina resistentes (SMR) son importantes patógenos que emergieron hace 40 años y
en los últimos años son considerados los principales responsables de infecciones nosocomiales y adquiridas en
la
comunidad.1 Los SMR son resistentes a todos los betalactámicos (penicilinas, cefalosporinas,
monobactámicos y carbapenémicos), por presentar el gen mecA que codifica para la producción de una nueva
proteína fijadora de penicilina (PBP 2a), que presenta baja afinidad por estos antibióticos; como resultado de
transposición y la integración de sitios específicos en el cromosoma los SMR presentan además resistencia a
otros grupos de antibióticos como los macrólidos, aminoglucósidos, tetraciclinas, sulfas y quinolonas, quedando
como única opción terapéutica el antimicrobiano glucopéptido vancomicina.2,3 Esta resistencia; esta presente
en S. aureus y Staphylococcus coagulasa negativos (SCN), estos últimos se han convertido en la causa más
frecuente de bacteriemia adquirida en los hospitales; asociados a pacientes con estados severos de
inmunosupresión y materiales prostéticos.4 La expresión de la resistencia a meticilina es complicada y difícil de
detectar ya que ha menudo se expresa heterogéneamente, donde unas pocas células dentro del rango de 1 en
104 a 108 expresan el fenotipo de resistencia.5 Teniendo en cuenta estos factores, el Comité Nacional para
Estándares de Laboratorios Clínicos (NCCLS) ha sugerido varios ensayos para la determinación de la
susceptibilidad a los SMR, con el objetivo de aumentar al máximo la expresión fenotipica de la resistencia; sin
embargo ocasionalmente han sido aislados microorganismos difíciles de clasificar por estos métodos, a
menudo existe discordancia entre los resultados por difusión en agar y dilución en agar.6 Aunque las NCCLS
describe un solo punto de corte para la resistencia (oxacilina MIC > 2 µg/mL), muchos investigadores definen
una categoría de borderline (1 - 8 µg/mL) que implica otro mecanismo, diferente al de PBP 2a.7
En este estudio se utilizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RCP), para la identificación de
SMR; la cual se comparó con los métodos estándares de susceptibilidad y garantizó la clasificación de los
aislados, tanto los que presentan resistencia intrínseca, como los que presentan resistencia borderline.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismos ensayados.
Se analizaron un total de 128 cepas, aisladas de hemocultivos y secreciones de heridas quirúrgicas, durante un
periodo de ocho meses. La conservación de las cepas se llevó a cabo por el método de crioconservación a -700
C, en medio Caldo de Mueller-Hinton (Unipath-Oxoid, UK). con 30% de glicerol y suplementado con oxacilina si
la cepa era resistente meticilina. Las cepas Staphylococcus aureus 1870 (CCMBCQF 172) sensible a meticilina
y Staphylococcus aureus 1426 (CCMBCQF 171) resistente a meticilina; donadas por el Dr. Eddie Power del St
Thomas Hospital, en Londres, fueron utilizadas como controles en los ensayos. Para el control de calidad se
utilizó la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923, según lo recomendado en las guías NCCLS.8
Clasificación de las cepas.
Todas las cepas de Staphylococcus spp fueron clasificadas utilizando el método de Rapi-Staph y la prueba de
la Staphylasa de la BioMereux, así como los criterios morfológicos de crecimiento en placas de agar sangre de
carnero al 5% y en el medio Staphylo 110 (Unipath-Oxoid, UK).9,10
Ensayos de susceptibilidad.
Se utilizó el método de difusión en discos para la determinación de la susceptibilidad de los siguientes
antibióticos:
Penicilina G (P), Oxacilina (OX), Eritromicina (E), Clindamicina (DA), Tetraciclina (TE),
Ciprofloxacina (CIP), cotrimoxasol (SXT) y Vancomicina (VA). (Unipath-Oxoid, UK), según NCCLS.8
Ensayo de crecimiento en placas de oxacilina.
Las cepas de Staphylococcus spp fueron sembradas en medio Mueller-Hinton agarizado que contenía oxacilina
(Sigma, St. Louis, Mo., U.S.A) a 6 µg/mL más 4% NaCl e incubada a 350 C por 24 horas, las cepas capaces de
crecer en este medio fueron clasificadas como Staphylococcus meticilino resistentes (SMR). Según lo
recomendado en las guías NCCLS.8
Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI).
Cada cepa SMR se le determinó la concentración mínima inhibitoria por el método de microdilución en caldo,
según NCCLS,8 con una concentración inicial de células de aproximadamente 5x105 ufc/mL. Se utilizo oxacilina
(Sigma) a concentraciones desde 0.25 hasta 256 mg/mL.
Preparación del lisado bacteriano.
El lisado de los SMR, se llevo a cabo mediante digestión con lysostaphina y proteinasa K (Sigma, St Louis,
MO), seguido de la adición de fenol-cloroformo antes de la precipitación con etanol, según describe Murakami,
K., Minamide W.11
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Detección de la presencia del gen mecA, en SAMR.
Para la detección de la presencia del gen mecA, se utilizó la metodología descrita por Steven M. Salisbury y
col, de reacción múltiple en cadena de la polimerasa (RCP) utilizando los primer descritos por Predari y col y los
primer universales modificados por Relman y col para la identificación del RNA 16S ribosomal.12 Los reactivos
utilizados para la reacción fueron obtenidos de Amershan, Inglaterra.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Fueron analizadas un total de 128 cepas de Staphylococcus spp (32 Staphylococcus aureus y 96
Staphylococcus coagulasa negativos); aislados de hemocultivos y secreciones de heridas quirúrgicas. De las
cuales 76 (59%) mostró resistencia a meticilina por el método de difusión en discos, 58 (45%) crecieron en
placas de agar con 6µg/mL de oxacilina y solamente 46 (36%) fueron portadores del gen mecA (tabla. 1). De las
32 cepas de S.aureus, 15% crecieron en placas con oxacilina y mostraron la presencia del gen mecA, en el
caso de los Staphylococcus coagulasa negativos (SCN), la presencia del gen mecA solamente condicionó el
43% de los aislados.
Tabla. 1. Resultados obtenidos en las cepas de Staphylococcus spp analizadas.
Cepas
Resistencia a Oxa por
Kirby - Bauer
OXA Screen Plate
(OSP)
Gen mec A
S.aureus
N = 32
8
(25%)
5
(15%)
5
(15%)
SCN
N = 96
68
(71%)
53
(55%)
41
(43%)
Total
N = 128
76
(59%)
58
(45%)
46
(36%)
Leyenda: Oxa: oxacilina, OSP: crecimiento en placas de oxacilina, S. aureus: Staphylococcus aureus, SCN:
Staphylococcus coagulasa negativos.
La frecuencia de aislamientos de SMR, encontrados en este estudio, se corresponde con los datos disponibles,
los cuales indican que la resistencia a meticilina en S. aureus, no es un problema en América Latina, donde
según un estudio de Resist Net13 la prevalencia del Staphylococcus aureus meticilina resistentes (SAMR)
osciló entre 5 y 26% en diversos países suramericanos. Sin embargo El Sistema Nacional de Vigilancia de
Infecciones Nosocomiales de Estados Unidos (NNIS), reportó un incremento del 40% en la frecuencia de cepas
de SAMR hacia 1999, comparado con el basal de 1994-1998. Adicionalmente se describe que la mortalidad en
sujetos que presentan bacteriemia por este agente se encuentra entre 15-60%.14, 15 Los resultados descritos
para las cepas de Staphylococcus coagulasa negativo (SCN) resistentes a meticilina de un 43% se
corresponden con los niveles declarados para estas cepas en los estudios realizados en Cuba en el año 2002,
de un 42%16 y son menores a los diferentes reportes encontrados en E. U. A 57%, Canada 51%, Europa 59%
y América Latina de un 68%.17,18 Este resultado constituye una alerta en este hospital; teniendo en cuenta que
el nicho ecológico y las frecuencias de infección por este germen están relacionados al uso de dispositivos
invasivos, como catéteres, o casos de pacientes que reciben repetidos y prolongados tratamientos.4 El número
de aislados SCN resistente a oxacilina está en aumento, es necesario seguir muy de cerca el uso del
antibiótico glucopéptido (vancomicina), ya que este tipo de aislado limita la terapia a este antibiótico. Las
infecciones causadas por S.aureus intermedios y resistentes a vancomicina (SA-VIR) son raros; hasta la fecha
en Estados Unidos solo se han reportado ocho casos de SAVI y dos casos de SAVR, lo que representa un
verdadero desafío para la terapia antimicrobiana.19 En este estudio todas las cepas SMR ensayadas se
mostraron sensibles a vancomicina.
Los resultados para la detección del gen mecA, mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa
(RCP), se observan en la (Fig. 1). Fueron evaluados un total de 46 aislados, utilizando el ADN purificado de las
cepas SMR y la combinación de 2 sets de oligonucleótidos. Se amplificaron 2 fragmentos de ADN, uno de 876
pb correspondiente al RNAr 16S especifico para el género Staphylococcus spp y el fragmento de ADN del gen
mecA de 533 pb.
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Fig.1. Electroforesis en gel de agarosa para la detección del RNAr 16S y mecA. Líneas: 1.Estándar de peso
molecular; 2. Control negativo; 3. Control positivo; De la línea 4 a 25. Aislados clínicos.
1
2
3 4 5
6 7
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
− RNAr 16S
− mecA
El estudio de la concentración mínima inhibitoria (CMI), de las cepas SMR, demuestran la presencia de cepas
con valores de CMI borderline para oxacilina (2-8 µg/mL), lo cual confirma la presencia del fenotipo de
resistencia heterogéneo.
De los 8 SAMR, el 50% mostró CMI > 16 µg/mL, indicando el mecanismo de resistencia homogéneo debido la
presencia del gen mecA (tabla 2). Solo una cepa MIC = 2 µg/mL, no mostró resistencia cruzada a otras familias
de antibióticos, indicando la posible presencia de proteínas de unión a penicilinas (PBP) modificadas.
Tabla. 2. Características de los S.aureus resistentes a oxacilina por el método de difusión en discos.
Disco
de
Amoxicilina/
ácido clavulanico
Interpretación
Resultados
+
R
Resistencia Intrínseca
32
+
R
-
4
-
S
8
+
2
-
S
Resistencia Intrínseca
Hiperproducción de βlactamasas
Posible
PBP modificadas
2315
0
+
128
+
R
Resistencia Intrínseca
2319
0
+
256
+
R
2391
10
-
4
-
S
2394
0
-
2
-
S
Resistencia Intrínseca
Hiperproducción de βlactamasas
Hiperproducción de βlactamasas
SAMR171
0
+
>256
+
R
Control Positivo
SAMS-172
20
-
0.5
-
S
Control Negativo
No.
aislado
R a OXA
K-B (mm)
OSP
CMI
(oxa
µg/mL)
Gen
mec
A
2277
10
+
32
2293
10
+
2300
0
2314
de
los
Leyenda: OXA: oxacilina, K-B: método de Kirby-Bauer, CMI: Concentración Mínima Inhibitoria, SAMR:
Staphylococcus aureus meticilina resistentes, SAMS: Staphylococcus aureus meticilina sensible, PBP:
Penicillin Binding Protein.
Para las cepas SCN el 41 (60%) presento el fenotipo de resistencia homogéneo (CMI > 16 µg/mL), mientras
que 12 (18%) mostraron valores de CMI borderline para oxacilina (CMI 2-8 µg/mL), indicando fenotipo de
resistencia heterogéneo (tabla. 3). El método considerado gold standard para identificar las cepas de
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Staphylococcus con resistencia intrínseca a meticilina es mediante la detección del gen mecA; este puede ser
detectado por RCP. Sin embargo, este método todavía no es usado de rutina en el laboratorio.20 La detección
de esta resistencia es complicada ya que el gen mecA existe en todas las cepas de S. aureus con una CMI a
oxacilina > 2 µg/ml y está ausente en aquellas cepas con una CMI < 2 µg/ml. El punto de corte que el NCCLS
había designado para oxacilina en Staphylococcus spp era de 2 µg/ml. Sin embargo, estudios hechos en SCN
demostraron que cepas que tenían una CMI de 0,5 µg/ml tenían el gen mecA y por lo tanto, deberían ser
consideradas resistentes.21 Además, informes de fallas de tratamiento con estos agentes en infecciones
producidas por SCN con CMI de 0,5 a 1 µg/ml sugerían que estas cepas se comportaban clínicamente como
resistentes a oxacilina. Cuando se informa la susceptibilidad de Staphylococcus spp es necesario tener
presente si se trata de S. aureus o de SCN e interpretar el resultado de la oxacilina de acuerdo a la especie.
También es necesario recordar que todas las cepas de Staphylococcus spp que son resistentes a oxacilina
(SAMR o SCNMR) deben ser informadas como resistentes a todos los β-lactámicos y a las combinaciones de βlactámicos con inhibidores de β-lactamasas.22
Tabla. 3. Características de los SCN resistentes a oxacilina por el método de difusión en discos
Disco
de
No.
R a OXA
OSP
CMI
Gen
Amoxicilina/
Interpretación
de
aislado
K-B (mm)
(oxa
ácido clavulanico Resultados
mec
µg/mL)
A
2283
15
2
S
Hiperproducción
de
lactamasas
2296
10
+
8
+
R
Resistencia Intrínseca
2301
13
4
S
Hiperproducción
de
lactamasas
2302
14
4
S
Hiperproducción
de
lactamasas
2307
16
2
S
Hiperproducción
de
lactamasas
2313
11
+
4
S
Posible PBP modificadas
2321
14
+
2
+
R
Resistencia Intrínseca
2325
10
+
8
S
Hiperproducción
de
lactamasas
2326
0
+
8
+
R
Resistencia Intrínseca
2336
0
4
S
Hiperproducción
de
lactamasas
2340
0
4
S
Hiperproducción
de
lactamasas
2350
12
+
2
+
R
Resistencia Intrínseca
SARM0
+
>256
+
R
Control Positivo
171
SASM-172 20
0.5
S
Control Negativo
los
ββββ-
βββ-
Leyenda: OXA: oxacilina, K-B: método de Kirby-Bauer, CMI: Concentración Mínima Inhibitoria, SAMR:
Staphylococcus aureus meticilina resistentes, SAMS: Staphylococcus aureus meticilina sensible, PBP:
Penicillin Binding Protein.
La resistencia a meticilina suele asociarse con la resistencia a otros fármacos antiestafilocócicos no
betalactámicos (macrólidos, clindamicina, fluoroquinolonas, etc.). En el presente estudio los SMR presentaron
multiresistencia a otras familias de antibióticos, (penicilina, oxacilina, eritromicina, gentamicina) con diferencias
entre los Staphylococcus aureus y los Staphylococcus coagulasa negativos (tabla. 4), hallazgos similares a los
observados por otros investigadores.23 No se encontró resistencia a vancomicina; hasta la fecha la vancomicina
ha sido el tratamiento de elección de las infecciones graves producidas por SMR. A su vez, cada vez son más
frecuentes las bacteriemias originadas en catéteres y las infecciones relacionadas con la instrumentación y
colocación de diferentes dispositivos en el cuerpo del paciente. En estas situaciones la vancomicina se utiliza
profusamente ya que .los microorganismos que la producen (Staphylococcus aureus, Staphylococcus
coagulasa negativos, Corynebacterium sp, Enterococcus sp, etc.) suelen ser vancomicina sensibles y
resistentes al resto de los antibióticos.24
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Tabla. 4 Se muestran los porcientos de resistencia observados en las cepas resistentes a meticilina para otros
antibióticos.
Antibióticos
Penicilina
Oxacilina
Eritromicina
Clindamicina
Cotrimoxasol
Tetraciclina
Ciprofloxacina
Gentamicina
Cloranfenicol
Vancomicina
Porciento de Resistencia
S.
aureus
meticilina
resistentes
N=5
100%
100%
80%
60%
0%
60%
60%
55%
40%
0%
SCN meticilina resistentes
N=41
100%
100%
85%
24%
73%
22%
44%
58%
46%
0%
CONCLUSIONES
La frecuencia de aislamientos de Staphylococcus meticilina resistentes (SMR) en el Hospital Pediátrico “William
Soler” fue de un 36%. La técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) resulto útil en la detección de
la resistencia intrínseca (mediada por el gen mecA); el resultado de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
demostró la presencia de cepas con resistencia borderline, la cual fue 25% para S.aureus y 18% en SCN. Los
aislados SMR presentaron altos niveles de resistencia para a otras familias de antibióticos con valores altos
para eritromicina; todos fueron sensibles a vancomicina.
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