Download Memoria\MARIA DEL CARMEN DE CACERES VELASCO

 FACULTAD DE FARMACIA
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
TRABAJO FIN DE GRADO
TÍTULO: Evolución de la resistencia
a antibióticos en Staphylococcus aureus.
Autor: Carmen de Cáceres Velasco
D.N.I.: 70065686-G
Tutor: Rafael Rotger Anglada
Convocatoria: Junio 2016
ÍNDICE
Resumen ……………………………………………………………………. 3
1. Introducción y antecedentes……………………………………………….. 3
1.1 Características microbiológicas …………………………………………. 3
1.2 Epidemiología…………………………………………………………… 3
1.3 Pincipales grupos de antibióticos con actividad frente a S.aureus……… 4
1.4 Resistencia a antibióticos en S.aureus: generalidades ………………….. 6
2. Objetivo……………………………………………………………………... 7
3. Metodología…………………………………………………………………. 7
4. Resultados y discusión …………………………………………………….. 8
4.1 Resistencia a betalactámicos …………………………………………..... 8
4.2 La expansión hacia el medio comunitario ……………………………… 12
4.3 Resistencia a glucopéptidos: vancomicina ……………………………... 13
4.4 Otras resistencias: aminoglucósidos, fluoroquinolonas, macrólidos,
lincosamidas y estreptograminas ……………………………………….. 16
4.5 Nuevas opciones terapéuticas: Daptomicina y Linezolid……………….. 17
5. Conclusiones ……………………………………………………………….. 19
6. Bibliografía ………………………………………………………………… 19
-2-
RESUMEN
Staphylococcus aureus es un patógeno oportunista responsable de un amplio espectro de
enfermedades, que van desde infecciones de piel y tejidos blandos hasta neumonía. La gran
capacidad adaptativa que presenta dio lugar en 1961 a la aparición de cepas meticilín resistentes
(SARM). Aunque tradicionalmente estaba limitado al ámbito hospitalario, desde la década de
los 90 las cepas comunitarias han ido aumentando rápidamente hasta la actualidad. Esta
multirresistencia propició la introducción de nuevos antibióticos en la terapéutica, pero a su vez
desencadenó la aparición de cepas con sensibilidad disminuida (VISA) y resistentes (VRSA) a
la vancomicina. Recientemente han surgido alternativas, como el linzolid y daptomicina,
eficaces en infecciones graves por bacterias multirresistentes. Sin embargo, una vez más,
S.aureus está demostrando su gran potencial evolutivo y ya se han notificado los primeros casos
de resistencia.
1. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES.
Desde su descubrimiento por el médico Alexander Ogston en 1880, Staphylococcus
aureus es considerado uno de los patógenos más relevantes hoy en día por su virulencia, su
habilidad para causar distintos tipos de infecciones y su capacidad para adaptarse a diferentes
condiciones ambientales (1, 2).
1.1 Características microbiológicas.
Staphylococcus
aureus
pertenece
al
género
Staphylococcus
de
la
familia
Micrococcaceae. Las especies se caracterizan por ser cocos gram-positivos, inmóviles,
anaerobios facultativos, no forman esporas y generalmente no están capsulados. Pueden
encontrarse solos o agrupados en pares, tétradas, cadenas cortas o formando racimos. S.aureus
crece en medios de cultivo no selectivos como el agar sangre, agar chocolate, agar cerebro
corazón (BHI) y medios con grandes cantidades de NaCl (7,5%). La mayoría de las cepas
producen β-hemólisis alrededor de las colonias cuando se cultivan en agar sangre. Se diferencia
de otros cocos gram-positivos por producir coagulasa y catalasa, ser resistente al calor y a la
desecación y fermentar manitol. Las colonias formadas presentan una pigmentación amarilla
dorada debido a la producción de carotenoides durante su crecimiento en agar sal manitol (1,3).
1.2 Epidemiología
S.aureus es un patógeno oportunista que forma parte de la microbiota humana, pudiendo
ser entre el 20% y 50% de la población mundial portadora del mismo en las fosas nasales, y el
-3-
30% de forma permanente en piel y tracto gastrointestinal(1). Cuando las barreras mecánicas se
rompen, esta bacteria puede alcanzar los tejidos más profundos y producir la enfermedad.
Determiandas características del hospedador pueden favorecer la invasión y predisponer al
individuo a la infección, entre ellos se incluye la pérdida de la barrera natural de la piel (heridas,
traumatismos, intervenciones quirúrgicas…) o la presencia de enfermedades subyacentes como
diabetes, SIDA o defectos en la función de los neutrófilos(4). Los pacientes con infecciones por
S.aureus suelen infectarse de la misma cepa que coloniza sus fosas nasales, la colonización
también permite la transmisión entre individuos tanto del hospital como en la comunidad(1).
Estos microorganismos constituyen una de las principales causas de las infecciones
nosocomiales y cada vez más, también del medio comunitario. Son responsables de infecciones
de la piel y partes blandas, bacteriemia, endocarditis y neumonía, pero además producen un
creciente número de infecciones relacionadas con la utilización de catéteres, prótesis articulares
y vasculares y otros dispositivos (5).
1.3 Principales grupos de antibióticos con actividad frente a S.aureus
Los antibióticos presentan un mecanismo de acción dirigido a estructuras y procesos que
son únicos e importantes para las bacterias, tales como la pared celular, ADN, ARN, maquinaria
de síntesis de proteínas e incluso metabolismo intermedio(6). A su vez, los antibióticos pueden
ejercer su acción de forma bacteriostática (inhibiendo temporalmente el crecimiento de la
bacteria) o bactericida (destruyendo la viabilidad celular).
De acuerdo con la actividad intrínseca, la experiencia clínica publicada y la disponibilidad
en España, los betalactámicos constituyen el primer grupo terapéutico en la lucha de las
infecciones contra S.aureus. Los betaláctamicos que tienen mayor actividad intrínseca frente a
las cepas sensibles a meticilina son: las penicilinas resistentes a penicilinasas (principalmente
penicilinas isoxazólicas como la cloxacilina y oxacilina), asociaciones de una penicilina y un
inhibidor de betalactamasas, las cefalosporinas (especialmente las de primera generación como
cefazolina) y los carbapenems. Las penicilinas isoxazólicas han demostrado ser hasta 8 veces
más activas que la meticilina, por lo que son consideradas como el tratamiento de elección en
infecciones de gravedad moderada o alta (7).
La vancomicina constituye uno de los posibles tratamientos contra la infección por
S.aureus resistente a la meticilina o en cepas sensibles a meticilina en pacientes alérgicos a los
betalactámicos. Este antibiótico presenta una actividad bactericida tiempo dependiente, más
lenta que la observada con los betalactámicos. El inconveniente que presenta es que no sólo
-4-
posee la capacidad de inducir la expresión y liberación de exotoxinas en cepas toxigénicas
(característica que comparte con los betalactámicos), sino también la pérdida de eficacia en
condiciones de anaerobiosis, lo que la hace poco o nada activa frente a poblaciones bacterianas
intracelulares o en el seno de biopelículas (7).
En infecciones estafilocócicas graves, es aconsejable determinar la CMI de la
vancomicina. El uso de vancomicina con un CMI ≥ 1mg/L está contraindicado ya que supondría
un aumento de dosis que conlleva un riesgo de toxicidad renal significativo(7). En tal caso,
habría que considerar la asociación potencialmente sinérgica de cloxacilina con daptomicina,
fosfomicina y/o un aminoglucósido valorando siempre la sensibilidad de la cepa, la localización
de la infección y el riesgo de toxicidad renal(7). Por otro lado, para evitar la liberación de
exotoxinas en cepas toxigénicas producida por betalactámicos o vancomicina, se recurre al
linezolid cuyo mecanismo de acción consiste en inhibir la síntesis de proteínas y por tanto, la
de toxinas.
Cuando la terapia con vancomicina puede resultar ineficaz (CMI≥1mg/L) en endocarditis,
bacteriemia primaria o asociada a un catéter por cepas resistentes a la meticilina se recurre a la
daptomicina. La daptomicina es un lipopéptido activo frente a todas las cepas de S.aureus con
actividad bactericida dependiente de la concentración(7,8). La bacteriemia persistente (más de 57 días) por cepas resistentes a la meticilina puede tratarse con daptomicina asociada a un
segundo antibiótico (cloxacilina, linezolid o fosfomicina) con o sin rifampicina, ya que
presentan un efecto sinérgico y favorece su actividad frente a S.aureus en el seno de
biopelículas(7,9).
Por otro lado, linezolid presenta actividad bacteriostática en cepas tanto sensibles como
resistentes a la meticilina. La ventaja que presenta este antibiótico es que en España el 99,8%
de los aislados resistentes a la meticilina son sensibles al linezolid, por lo que se posiciona como
un antibiótico de elección sobre todo en el tratamiento de la neumonía, meningitis y
endoftalmitis(7,9). A diferencia de la daptomicina no presenta actividad frente a poblaciones en
el seno de biopelículas ni microorganismos intracelulares y el sinergismo que presenta con la
rifampicina es moderado(7).
Además de los citados, también se emplean en la terapéutica otros grupos con actividad
frente a S.aureus como los aminoglucósidos (gentamicina) o las fluoroquinolonas
(moxifloxacino, levofloxacino), aunque se desaconseja su uso en monoterapia(7). Como
alternativa se recomienda pristinamicina, clindamicina, doxiciclina, tigeciclina o ácido
fusídico(9,10). En infecciones urinarias se utiliza también como primera línea el cotrimoxazol
-5-
(también como alternativa en nemunonía, bacteriemia o endocarditis(10)), mientras que para
infecciones de la piel leve-moderadas se recurre a mupirocina(7).
1.4 Resistencia a atibióticos en S.aureus: generalidades.
La introducción de la penicilina y posteriormente nuevas moléculas de antibióticos en la
terapéutica creó la ilusión de poder controlar las infecciones. Sin embargo, con el tiempo se
comprobó que las bacterias dificultarían el proceso. A pesar de que existen mecanismos de
resistencia intrínsecos o naturales (como la ausencia de diana para la acción del antibiótico), la
resistencia adquirida es la principal responsable de la pérdida de eficacia de nuestro arsenal
terapéutico. Ésta se produce mediante trasferencia vertical, por la aparición de mutaciones que
se transfieren de una generación a otra; mediante transferencia horizontal por plásmidos y
elementos móviles genéticos (integrones y transposones), o por transducción a través de
bacteriófagos. De esta forma, la resistencia se podría transmitir a otra especie y género (11).
Actualmente la resistencia a antimicrobianos en la mayoría de los patógenos bacterianos
y en especial en S.aureus, se ha convertido en un problema clínico, epidemiológico y de salud
pública reconocido en todo el mundo(5). En un mundo globalizado como el actual, tanto el
movimiento de personas como de alimentos facilita la diseminación de resistencias.
Desafortunadamente esto ha dado lugar a una disminución en la eficacia, lo que a su vez puede
generar procesos patológicos más graves y largos; un menor número de antibióticos disponibles
para el tratamiento, efectos secundarios más frecuentes (debidos al uso de antibióticos con un
rango terapéutico menor, de dosis más altas o tratamientos más largos) e ingresos hospitalarios
más prolongados (12,13).
Dada la importancia y la globalización del problema, la Unión Europea vigila desde 1998
la resistencia a antibióticos a través de la European Antimicrobial Resistance Surveillance
System (EARSS). La red (actualmente llamada EARS-Net) está coordinada y financiada desde
el 2010 por el European Centre for Disease prevention and Control (ECDC) y acoge datos
acerca de la aparición y propagación de resistencias bacterianas de los 28 Estados Miembros
(además de Islandia y Noruega), a través de laboratorios o centros nacionales de vigilancia (13).
Por otro lado, existen grupos de estudio como el European Study Group on Antibiotic
Resistance Surveillance (ESGARS), que recopila infromación sobre el consumo de antibióticos
y la resistencia a los mismos. Los objetivos son: construir las bases para comprender la
aparición y epidemiología de las resistencias y evaluar las estrategias para la prevención y
control de las mismas a nivel hospitalario(11).
-6-
En España existe la Red Española para la Vigilancia y el Estudio de la Resistencia a
Antibióticos (REVERA), centralizada y coordinada por el Centro Nacional de Microbiología
del Instituto de Salud Carlos III. Los datos obtenidos son enviados cada cuatro meses a la central
europea para la elaboración de los informes anuales (11).
En S.aureus la evolución de la resistencia se ha producido de forma continuada, desde la
detección de los primeros aislados con resistencia a la penicilina en 1942 hasta las cepas con
resistencia a la vancomicina y las más recientes descripciones de aislados resistentes a nuevos
antimicrobianos como linezolid o daptomicina(2,13).
2. OBJETIVO
El objetivo del presente trabajo es realizar una revisión bibliográfica para analizar el
desarrollo de las resistencias a antibióticos en Staphylococcus aureus. Se revisará la evolución
histórica de las cepas resistentes, su propagación, los mecanismos moleculares de resistencia a
los antibióticos seleccionados y el desarrollo de objetivos y nuevos enfoques para la
intervención terapéutica.
3. METODOLOGÍA
Se ha realizado una revisión bibliográfica para reunir información relevante acerca de la
evolución y aparición de las resistencias en S.aureus. Para ello se han consultando bases de
datos como MEDLINE a través del buscador PubMed con las palabras clave “Staphylococcus
aureus”, “resistance” y “antibiotics”. Por otro lado, también se seleccionaron artículos de la
plataforma BUCea de la Universidad Complutense de Madrid. Para una mayor comprensión y
valoración de la evolución de las resistencias, se seleccionaron aquellos artículos de especial
relevancia desde 1940 hasta 2015 excluyendo los casos índice y los referentes a métodos de
diagnóstico.
Con la intención de enfocar el trabajo a la Comunidad Europea y, especialmente, a
España, se seleccionaron los informes y artículos referentes a estas zonas geográficas. De este
modo, se consultaron webs como la Sociedad Española de Enfermedades infecciosas y
Microbiología Clínica (SEIMC), European Centre for Disease Prevention and Control
(ECDC) y European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID). Se
han tenido en cuenta igualmente los informes, tablas y mapas elaborados por el EARS-Net
desde el año 2000 al 2014. Finalmente, para recoger información sobre recomendaciones de
-7-
antibióticos en la terapéutica actual se consultaron guías de la Sociedad Española de
Quimioterapia y páginas web como European Medicines Agency (EMEA), Agencia Española
de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS), la Organización Mundial de la Salud
(OMS) y de nuevo, SEIMC.
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Resistencia a Betalactámicos.
La introducción de la penicilina en 1940 supuso una mejora significativa en el pronóstico
de las infecciones causadas por S.aureus(2). Sin embargo, ya Fleming en sus experimentos
observó que en ciertas colonias de bacterias el crecimiento no quedaba inhibido por la
penicilina(15). Ese mismo año E. Chain y E. P. Abraham confirmaron este hecho mediante
experimentos con E.coli, donde comprobaron que una enzima, a la que llamaron penicilinasa,
era capaz de inactivar al antibiótico(16). Posteriormente, en 1942 Rammelkamp identificó cepas
de S.aureus resistentes a la penicilina(17); pero no fue hasta 1944 cuando Kirby demostró que la
resistencia en S.aureus también se debía a la inactivación de la penicilina por acción de una
enzima bacteriana(2,16). Un año después, Bondi y Dietz demostraron el papel que jugaba esta
penicilinasa en la resistencia contra la penicilina(2).
Así pues, en los años 60 más del 80% de los aislados de S.aureus tanto de origen
comunitario como hospitalario eran resistentes a la penicilina(2). Estas infecciones estaban
frecuentemente asociadas a cepas de S.aureus conocidas como fago tipo 80/81. La pandemia
de S.aureus fago tipo 80/81 desapareció con la introducción de la meticilina a la terapéutica,
pero la prevalencia de cepas productoras de penicilinasas sigue siendo actualmente muy
elevada(4). Se estima que el 90-95% de las cepas actuales de S.aureus son productoras de estas
eszimas(12,16).
Estas penicilinasas son enzimas extracelulares cuya síntesis tiene lugar cuando S.aureus
está expuesto a betalactámicos(2), de tal forma que hidrolizan el anillo betalactámico
inactivando al antibiótico. Se encuentran codificadas por el gen blaZ, localizado en un plásmido
y transferible por transducción o conjugación(16). A su vez, blaZ se encuentra regulado por dos
genes reguladores, el represor blaI y el antirepresor blaR1(2).
Con la rápida diseminación de la resistencia a la penicilina, en 1959 se introdujeron las
penicilinas semisintéticas del tipo de la meticilina y oxacilina, convirtiéndose en la principal
arma terapéutica frente a las infecciones producidas por este microorganismo(16). Sin embargo
-8-
dos años después, en 1961, se detectó el primer aislado de S.aureus resistente a la meticilina
(SARM) en un hospital del Reino Unido(16,18). En este caso, a diferencia de la penicilina, la
resistencia a la meticilina era de amplio espectro, lo que confería resistencia a los
betalactámicos, incluyendo penicilinas, cefalosporinas y cabapenems(4).
A pesar de identificar los primeros aislados resistentes a la meticilina, tuvieron que pasar
20 años para poder entender el mecanismo de resistencia. Así, en 1981, se identificó una PBP
(Penicillin Binding Protein) con afinidad reducida a la que se denominó PBP2a(17). Las PBPs
son enzimas que catalizan la reacción de transpeptidación necesaria para el entrecruzamiento
de las cadenas de peptidoglicano. En SARM estas PBPs son sustituidas por PBP2a, lo que
reduce su afinidad por los betalactámicos y le permite sobrevivir a pesar de estar expuesto a
altas concentraciones de estos agentes(2). Estudios recientes han determinado la estructura de
un derivado soluble de PBP2a y han podido observar que estas enzimas bloquean la unión de
los betalactámicos a su centro activo pero permiten que tenga lugar la reacción de
transpeptidación(2).
El gen responsable de la síntesis de las PBP2a se conoce como mecA(2). Este gen forma
parte de un complejo genético móvil integrado también por dos genes reguladores, mecI y
mecR, y reside en una isla genómica denominada SCCmec (del inglés Staphylococcal Cassette
Chromosome mec) que constituye el 1-2% de los 2,9 millones de pares de bases del cromosoma
de S.aureus(1,17). Junto a ellos también se encuentra el complejo de genes ccr (cassette
chromosome recombinases) que codifican una recombinasa capaz de insertar o escindir
elementos del SCCmec; y unas secuencias de inserción (IS431 o IS1272)(18,19).
Fig.1: esquema básico de la estructura de SCCmec(18)
Algunos SCCmec contienen elementos genéticos adicionales como Tn554 (que confiere
resistencia a macrólidos, clindamicina y estreptogramina B) o pT181 (que confiere resistencia
a tetraciclinas)(17). Hasta el momento se conocen 11 tipos de SCCmec. De ellos, los SCCmec
-9-
tipo I (34.3 kb), IV (20.9-24.3 kb), V (28 kb), VI (20.9 kb) y VII (35.9 kb) sólo presentan
resistencia a betalactámicos, mientras que los tipos II (53 kb), III (66.9 kb) y VIII(32kb) son
resistentes a más clases de antibióticos debido a los genes de resistencia integrados en
plásmidos o transposones. Los tipos IX y X presentan resistencia a metales, pero solo han sido
encontrados en ganado y humanos en contacto con éstos(4,19).
El último tipo fue descubierto en 2009, cuando un grupo de investigadores de Reino
Unido y Dinamarca aislaron una cepa de S.aureus que presentaba un gen homólgo al mecA.
Este gen, denominado mecALGA251, difería del mecA clásico en las recombinasas y los genes
reguladores, siendo imposible su reconocimiento con las pruebas de aglutinación o de
amplificación de ácidos nucleicos empleadas habitualmente(7,21). Posteriormente se designó
como SCCmec de tipo XI y su gen cambió de denominación a mecC(21).
La expresión de PBP2a está inducida por la unión del betalactámico a un receptor de la
membrana citoplásmica, que actúa como sensor y transductor de señales, codificado por el gen
mecR1. Esto desencadena la cascada catalítica que libera al represor mecI de la zona operador
del gen mecA permitiendo la transcripción del gen y la consecuente síntesis de la enzima(17,19).
El gen mecA y sus elementos reguladores constituyen el denominado complejo mec. La
evolución ha originado cepas que expresan la PBP2a constitutivamente (complejo mec de clases
B y C) y cepas que lo expresan sólo bajo inducción por un betalactámico (complejo mec de
clase A)(7). Por otro lado, no todos los clones que poseen el gen mecA son resistentes a la
meticilina. El grado de resistencia dependerá de la eficiencia en la producción de PBP2a, que a
su vez se encuentra regulado por factores cromosómicos(7).
La aparición y expansión de SARM en los hospitales en 1961 se identificó como la
segunda ola de resistencias desarrolladas por S.aurus. La estirpe, conocida como clon Ibérico
y asociada con el SCCmec tipo I(16), permaneció en los hospitales europeos (principalmente
Reino Unido, Dinamarca, Francia y Suiza) hasta los años 70(4,20). A finales de esa década se
observó una disminución de los aislamientos en Europa. Las razones se desconocen, pero se
piensa que pudo ser debido a una mejora en la práctica médica en relación con el control de
infecciones y el uso de antibióticos(20).
La tercera ola de resistencia surgió a finales de la decáda de 1970 y principios de 1980 en
los hospitales de Europa, Australia y Estados Unidos(20). Desde 1970 se recibieron casos
esporádicos de distintos países, pero una epidemia en un hospital londinense hizó saltar de
nuevo las alarmas en 1981. En este caso, la cepa responsable fue nombrada EMRSA 1
- 10 -
(posteriormente se identificaron hasta 16 tipos distintos), por su similitud a la cepa epidémica
de Australia(20). Un año después se aisló una cepa (N315) en Japón que albergaba el SCCmec
tipo II(19) y tres años después, en 1985, una cepa que contenía SCCmec tipo II fue encontrada
en Nueva Zelanda(19). A partir de 1990, la mayoría de los aislados encontrados presentaban el
SCCmec tipo IV(19). Este nuevo cambio dio lugar a una ampliación de los linajes
desencadenando la pandemia mundial de SARM en los hospitales que continúa hasta la
actualidad(4).
Fig.2: Olas de resistencia en S.aureus (4).
El programa SENTRY de vigilancia antimicrobiana investigó esta tendencia creciente
desde 1997 hasta 1999. Para entonces, observaron que la prevalencia ya era del 23% en
Australia, 67% en Japón, 40% en América del Sur, 32% en EEUU y 26% en Europa. Sin
embargo, la prevalencia de las resistencias en Europa no tenía una distribución homogénea: los
países nórdicos mostraban un 1%, mientras que los países del sur alcanzaban el 45%(19). Esta
diferencia de distribución se mantiene actualmente. Así, según el último informe de vigilancia
antimicrobiana elaborado por el EARS-Net los porcentajes de resistencia más bajos se
encuentran en el norte de Europa (2.6% en Finlandia, 1% en Suecia, 1% en Noruega, 0.9% en
Holanda), mientras que los más altos se corresponden con países del sur y sureste de Europa
(56% en Rumanía, 37.1% en Grecia, 28% en Eslovaquia, 22.1% en España)(14).
Afortunadamente, el año 2006 marcó un punto de inflexión en la tendencia creciente de
resistencias que se observaba desde 1986(5). Desde entonces el porcentaje de aisaldos resistentes
a la meticilina ha ido disminuyendo alcanzando una media, según el último informe del EARSNet, del 17,4% (22,1% en España)(14). A pesar de los datos esperanzadores, el ECDC insiste
que hoy en día 7 de los 29 países que conforman la Unión Europea muestran porcentajes por
encima del 25% (Figura 3), reincidiendo en la importancia del problema(14).
- 11 -
Fig.3: Porcentaje de aislados resistentes a la meticilina (SARM), por países de la UE, 2014(14)
4.2 La expansión hacia el medio comunitario
La invasión de los SARM en el medio comunitario (SARM-CO) constituye la cuarta y
más reciente ola de resistencias a antibióticos. Los primeros casos de infecciones producidas
por SARM-CO se remontan a principios de la década de los 90 en las poblaciones del oeste de
Australia(4). Posteriormente, en 1999, se notificó la muerte de 4 niños norteamericanos
previamente sanos y sin factores de riesgo, lo que demostró el carácter potencialmente virulento
de los nuevos SARM-CO(17).
Estudios posteriores comprobaron que los SARM-CO diferían de los hospitalarios en el
espectro de la enfermedad y en la epidemiología. Estas cepas parecían tener un reservorio fuera
del hospital, y eran (y son) la causa de infecciones de piel y partes blandas (generalmente
forúnculos y abscesos) y, en ocasiones, de neumonía necrosante grave en niños y adultos
jóvenes(22).
Los clones de estos SARM-CO presentaban características genotípicas y fenotípicas
distintas de los aislados hospitalarios. En este caso eran resistentes a betalactámicos pero, a
diferencia de los SARM hospitalarios, susceptibles a otros antibióticos(4). Esto se debe a que
presentan SCCmec de tipos IV y V, los cuales no contienen genes que codifiquen resistencia a
otros antibióticos. No obstante, pueden adquirir resistencia a múltiples antibióticos mediante la
adquisición de plásmidos. Así, cada vez es más frecuente que presenten resistencia a
eritromicina y clindamicina por la adquisición de genes erm y msrA, o a las tetraciclinas por la
adquisición de genes tet(22).
- 12 -
Además de plásmidos, estos nuevos clones pueden haber adquirido por transmisión
horizontal profagos, islas de patogenicidad y transposones, los cuales no sólo conceden
resistencia a antibióticos, sino también la expresión de factores de virulencia(4). De este modo,
el profago ΦSA2 contiene los genes lukS-PV y lukF-PV que codifican la producción de la
leucocidina de Panton-Valentine (LPV), una citotoxina que destruye la integridad de los
leucocitos polimorfonucleares y produce necrosis tisular(4,22). La presencia de LPV en SARMCO no parece ser necesaria para la colonización ni para la diseminación. Sin embargo, hay una
gran correlación entre la presencia de los genes LPV y los aislados SARM-CO productores de
la enfermedad(22). Por otro lado, destaca también la isla de patogenicidad ACME (arginine
catabolic mobile element), la cual contribuye a la patogenicidad aumentando el crecimiento y
la supervivencia del clon(19,22).
El origen de SCCmec en los SARM-CO sigue siendo desconocido. Una de las hipótesis
que se plantea explica que el gen mecA o el SCCmec se habría transferido horizontalmente a
una o más cepas de S.aureus sensible a la meticilina que ocupaban nichos tradicionalmente
comunitarios(22). Esta posibilidad explicaría las diferencias genotípicas y fenotípicas del
SARM-CO.
Desde su descubrimiento, los SARM-CO se han extendido y propagado con gran rapidez.
Además de los Estados Unidos, se han notificado casos en Canadá, América del Sur y Australia,
así como en toda Europa, incluso en países con baja prevalencia de SARM como Noruega, los
Países Bajos, Finlandia y Dinamarca(4). Actualmente, la mayor incidencia de SARM-CO sigue
estando en Estados Unidos, donde los clones más frecuentes son el USA400 y USA300 con
secuencias ST1 y ST8 de MLST (multilocus sequence typing)(22). En España, el clon más
frecuente pertenece al ST8 y está relacionado con el clon USA300. Con menor frecuencia
también se han detectado otros como el ST80 y ST5 (pediátrico)(22).
4.3 Resistencia a glucopéptidos: vancomicina.
La multirresistencia que presentaban los SARM limitó en el tiempo las opciones
terapéuticas para el tratamiento de las infecciones y obligó a incrementar el consumo de
glucopéptidos, lo que trajo como consecuencia la aparición de cepas con sensibilidad
disminuida a la vancomicina. En 1997 se describe en Japón el primer aislado (Mu50) de
S.aureus con sensibilidad disminuida a la vancomicina (vancomycin-intermidiate S.aureus;
VISA), así como la existencia de cepas (Mu3) con resistencia heterogénea a este
antimicrobiano(13). Estas últimas (conocidas como hVISA) se caracterizan por presentar una
- 13 -
baja CMI (1-4mg/L) pero, en presencia de vancomicina, son capaces de desarrollar
subpoblaciones bacterianas con mayor resistencia al antibiótico, lo que podría conducir a un
fallo terapéutico(6).
S.aureus CMI (mg/L)
Clasificación
EUCAST
CLSI
Observaciones
Sensible (VSSA)
≤2
≤2
Por posibilidad de hVISA son necesarios test adicionales
Intermedio (VISA)
Resistente (VRSA)
4-8
≥4
EUCAST no define categoría intermedia
≥16
Tabla1. Resumen de las resistencias a vancomicina según EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility
Testing) y CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Adaptado de ref 24.
Una serie de mutaciones a lo largo del tiempo en S.aureus sensible a la vancomicina
dieron lugar a la aparición de hVISA y finalmente, de VISA. Los cambios más notables
afectaban a genes reguladores de rutas metabólicas, lo que provocó un cambio en el flujo de
nutrientes y metabolitos para la producción del peptidoglicano de la pared celular y una
reducción de la autolisis(18). Esto origina un aumento de la síntesis de peptidoglicano que trae
como resultado un engrosamiento de la pared celular y la adquisición de una forma irregular(2).
A su vez, la reducción de la autolisis contribuye al mantenimiento de las capas gruesas de
peptidoglicano al disminuir la tasa de recambio de la pared celular(18). Por otro lado, hay una
disminución en el entrecruzamiento de las cadenas de peptidoglicano (puentes de pentaglicina)
que da lugar a una mayor exposición de residuos D-Alanina-D-Alanina capaces de unirse y
atrapar moléculas de vancomicina(2). Una vez unidas, las moléculas de vancomicina quedan
atrapadas en esta malla que actúa como obstáculo impidiendo su difusión hacia la membrana
citoplásmica, donde se encuentra su diana(18).
El número de loci y mutaciones ligadas a la resistencia es muy elevado, sin embargo, la
mayoría de los autores coinciden que los genes principalmente involucrados en el fenotipo
VISA son: walKR, vraRS, graRS así como el gen que codifica a la subunidad B de la ARN
polimerasa (rpoB). vraRS es un sensor de histidina kinasa que forma parte del sistema regulador
de dos componentes (TCRS) y aumenta la expresión de genes necesarios para la síntesis de la
pared celular ante la exposición a antibióticos. Por otro lado, graRS es otro regulador de otro
TCRS, implicado en resistencias a antibióticos catiónicos proteicos. Sin embargo, de todos
ellos, las mutaciones en walKR son esenciales, ya que regula la síntesis de la pared celular y la
autolisis. Estudios recientes han demostrado cómo la introducción de una mutación en walKR
- 14 -
en una muestra de S.aureus sensible a la vancomicina eleva su resistencia pasando de una CMI
de 1mg/L a 3mg/L(23).
Las cepas VISA presentan también sensibilidad disminuida o resistencia a la teicoplanina,
por lo que hoy en día se suele ultilizar el término de GISA (del inglés glycopeptide intermidiate
S.aurus). Estas cepas se aislan con una frecuencia muy baja y generalmente después de un
tratamiento prolongado con glucopéptidos. El mecanismo de resistencia de estas cepas se debe
también al engrosamiento de la pared celular, pero al mismo tiempo se ha observado un
aumento de la expresión de PBP2 y/o PBP2a(24).
Además de las cepas VISA, en 2002 en Estados Unidos, se notificaron cepas
completamente resistentes a la vancomicina (vancomycin-resistant S.aureus; VRSA)(25,26).
Según estudios, estas nuevas cepas habrían adquirido la resistencia gracias a la transferencia
del gen van, por el transposón Tn1546, de Enterococcus faecalis(26). Este transposón contiene
el complejo de genes vanA, que incluye: vanA, vanH, vanX y vanY(18). Cuando estos cuatro
genes funcionan juntos, todos los residuos de D-Alanina-D-Alanina del sustrato para la síntesis
del peptidoglicano son reemplazados por D-Alanina-D-Lactato, al cual la vancomicina presenta
1000 veces menos afinidad(7,18). Este mecanismo se ha observado en casos aislados en los años
90, pero no se ha diseminado, probablemente debido a una pérdida de aptitud o eficacia
biológica (fitness) de las cepas que lo poseen(2,7).
Actualmente, la prevalencia de estas cepas VRSA no es elevada. Se han reportado casos
esporádicos en Estados Unidos, India e Irán(9). En España, la infección causada por este tipo de
cepas sólo se ha descrito de forma ocasional(25). No obstante, las guías terapéuticas frente a
S.aureus recomiendan que en caso de existir una CMI ≥1mg/L es necesario descartar la
existencia de resistencia heterogénea y resistente para prevenir una posible bacteriemia
persistente y/o fallo terapéutico(7).
Recientemente, un estudio llevado a cabo por K.Hiramatsu et al. ha podido identificar un
estado intermedio en el paso de hVISA a VISA. Este nuevo estado, denominado sVISA (slow
VISA, debido a su lento crecimiento), puede retornar a hVISA rápidamente cuando se elimina
la vancomicina del medio(18). Del mismo modo, otros estudios han podido describir la reversión
de VISA hacia niveles más bajos de resistencia. Sin embargo, esta reversión no siempre implica
una vuelta al estado sensible a la vancomicina(26). Por el momento, no se conocen en
profundidad los determinantes genéticos responsables(26).
- 15 -
4.4
Otras
resistencias:
aminoglucósidos,
fluoroquinolonas,
macrólidos,
lincosamidas, estreptograminas.
Aminoglucósidos. Son antibióticos de amplio espectro capaces de unirse a la subunidad
30S del ribosoma alterando la lectura del ARNm. La resistencia más común a este grupo se
debe a una modificación enzimática por O-fosforilación, N-acetilación u O-nucleotidilación
catalizada por fosfotransferasas, acetiltransferasas o nucleotidiltransferasas(6). Los genes que
codifican a estas enzimas se encuentran en transposones y elementos móviles, lo que explicaría
la rápida diseminación entre las bacterias gram positivas(6). El gen que codifica a la transferasa
más comúnmente encontrada en cepas de SARM se conoce como aac(6’)-aph(2’’), y se le
atribuye la resistencia a la gentamicina y a gran parte de los aminoglucósidos(6,24). Otra
resistencia frecuentemente aislada en hospitales españoles es mediada por la enzima
ANT(4’)(24). Se trata de cepas sensibles a la gentamicina y resistentes a la amikacina,
tobramicina y kanamicina(24).
Fluoroquinolonas. Fueron incialmente introducidas en el tratamiento de las bacterias
gram negativas en 1980(2). Sin embargo, debido a su actividad frente a bacterias gram positivas
se comenzaron a utilizar en el tratamiento de las infecciones causadas por Streptococcus
pneumoniae y Staphylococcus aureus(2). Poco tiempo después, la resistencia apareció en las
cepas meticilín resistentes de origen hospitalario(17). La resistencia surgió como resultado de
mutaciones cromosómicas espontáneas en la diana del antibiótico, es decir, en la topoisomerasa
IV o en la ADN girasa(2,6). La subunidad ParC de la topoisomerasa IV y la subunidad GyrA de
la ADN girasa han sido descritos como los lugares que más mutaciones presentan en este tipo
de resistencias(2). El segundo mecanismo de resistencia encontrado implica la expresión de
bombas de eflujo de la familia Nor. Se ha visto que la sobreexpresión de bombas de eflujo del
tipo norA no sólo desencadena la aparición de resistencias en norfloxacino, sino también en
betalactámicos, tetraciclinas y cloranfenicol(6).
Debido a estas multirresistencias no se recomienda el empleo de una quinolona en
monoterapia para el tratamiento de la infección estafilocócica, especialmente cuando la carga
bacteriana es elevada o se trata de una cepa de SARM ya que, en ambas situaciones, la
posibilidad de selección de mutantes resistentes es elevada(7). Según el informe del EARS-Net
correspondiente al año 2013(27), 28 países europeos notificaron cepas de S.aureus resistentes a
fluoroquinolonas, y de ellas, 84.1% eran SARM y 5.7% eran sensibles a la meticilina.
Macrólidos, lincosamidas y estreptogramina B (MLSB). A pesar de ser
estructuralmente diferentes, todos ellos inhiben la síntesis proteíca al unirse a la subunidad 50S
- 16 -
del ribosoma. La resistencia a este grupo de antibióticos se debe a la metilación o dimetilación
del ARNr por metiltransferasas. Estas metiltransfersas están codificadas por el gen erm (y en
raras ocasiones por el gen cfr) y utilizan la S-adenosil metionina para modificar una adenosina
del dominio V del ARNr de 23S, lo que confiere resistencia cruzada a macrólidos, lincosamidas
y estreptogramina B(6). A su vez, este fenotipo puede peresentar una resistencia constitutiva o
inducible por antibióticos como la eritromicina(24).
Otros mecanismos de resistencia se basan en la expulsión activa del antibiótico,
relacionado con diferentes genes (mef, msr y erp) o su inactivación (lnu, vat, vgb y mph)(24). La
mayoría de estos genes se transmite por plásmidos o transposones(7). Por otro lado, en pacientes
con fibrosis quística, se ha visto que el principal mecanismo de resistencia a macrólidos se debe
a mutaciones en una adenina de una proteína ribosomal que contribuye a la unión con el
antibiótico(6).
4.5 Nuevas opciones terapéuticas : Daptomicina y Linezolid.
Dada la limitada efectividad de la vancomicina en tratamientos prolongados, el aumento
progresivo de la CMI, la posible nefrotoxicidad y la aparición de cepas con sensibilidad
disminuida o resistentes, se hizo necesaria la búsqueda de nuevos tratamientos(4). Así, entre
2003 y 2007 se comercializaron en España 3 antibióticos -linezolid, tigeciclina y daptomicinaactivos frente a SARM, incluyendo aquellos con sensibilidad reducida a glucopéptidos(8).
Linezolid es una oxazolidinona de bajo peso molecular capaz de unirse reversiblemente
a la subunidad 23S del ribosoma e inhibir la síntesis de proteínas(3). Cuando se administra por
vía oral o intravenosa alcanza una biodisponibilidad cercana al 100% y un volumen de
distribución alto(8). Está indicado en neumonía nosocomial y adquirida, donde presenta una
elevada difusión pulmonar y una excelente actividad in vitro(7). Estudios clínicos han
demostrado mayores tasas de curación clínica, erradicación microbiológica y supervivencia que
vancomicina en neumonía nosocomial, especialmente en grupos asociados a ventilación
mecánica(8). Esto lo convierte en una alternativa en neumonía por SARM, más aún si el paciente
presenta insuficiencia renal o si la CMI de la vancomicina es >1mg/L(8). En infecciones
complicadas de la piel y tejidos blandos también ha demostrado ser más eficaz que la
vancomicina, manteniendo una menor estancia media, mayor erradicación microbiológica y
menor número de complicaciones(8).
En España, el 99.8% de los aislados de SARM son sensibles al linezolid(7). Sin embargo,
se han descrito algunas resistencias en pacientes tratados con este antimicrobiano durante
- 17 -
períodos largos(13). En Europa se alcanzan cifras similares, así, según el informe del EARS-Net
correspondiente al año 2013, las resistencia a linezolid fue de 1,2% entre cepas de SARM y de
un 0,1% entre cepas sensibles a meticilina(27). El desarrollo de resistencias puede deberse a
mutaciones cromosómicas que modifican el ARNr 23S o alguna de las proteínas ribosómicas;
o a la adquisición del gen cfr que codifica una metiltransferasa del ARNr 23S(7).
La tigeciclina es el primero de una nueva familia de antibióticos de amplio espectro, las
glicilciclinas, estructuralmente similares a las tetraciclinas. Está indicada para infecciones
complicadas de piel y tejidos blandos, aunque también ha sido empleada con éxito en neumonía
del paciente crítico, incluidas cepas de SARM y resistentes a linezolid(8).
La daptomicina es un lipopéptido con actividad bactericida dependiente de concentración,
indicado para el tratamiento de infecciones complicadas de piel y partes blandas, endocarditis
infecciosa del lado derecho y bacteriemia(7). Ensayos clínicos han comprobado su inactivación
por el líquido surfactante, por lo que no está indicada para el tratamiento de la neumonía(7,9).
Por otro lado, estudios han demostrado que la daptomicina es tan eficaz como la asociación de
vancomicina y gentamicina con un porcentaje de éxito de 45 frente a 27% en bacteriemia
persistente y 60 frente a 45% en bacteriemia no complicada(8). Debido a esto, las guías
españolas del SEIMC recomiendan la daptomicina como terapia de inicio en pacientes con
bacteriemia persistente o relacionada con catéter, cuando la CMI de vancomicina es >1mg/L o
en situaciones de riesgo (inmunocomprometidos, pie diabético, insuficiencia renal, etc)(8).
Son muy poco frecuentes las cepas de S.aureus no sensibles a daptomicina, pero se han
descrito casos en pacientes tras varias semanas de tratamiento con vancomicina y/o
daptomicina, especialmente aquellos con carga bacteriana elevada y catéteres protésicos o
intravenosos(13). La resistencia obedece a la existencia de varias mutaciones sucesivas en
diferenetes genes (mprF, yycG, rpoB y rpoC). Cada mutación genera cierto grado de resistencia
y en combinación muestran cambios fenotípicos consistentes en el engrosamiento y
alteraciones de la fluidez de la pared bacteriana y aumento de la carga positiva de superficie(7).
Recientemente, en el año 2011 y 2012 se ha aprobado la comercialización de dos nuevos
antibióticos, la telavancina y la ceftarolina. Ambos están indicados en la neumonía adquirida
en la comunidad y, en el caso de la ceftarolina, también se permite su uso en infecciones
complicadas de la piel y tejidos blandos(7).
El desarrollo de un nuevo antimicrobiano es, en general, un proceso largo que conlleva
unos costes elevados debido a la necesidad de realizar estudios de toxicidad y ensayos clínicos
- 18 -
que evidencien su eficacia. Por este motivo, una tendencia creciente es la reintroducción de
antibióticos previamente utilizados contra estas bacterias multirresistentes. Este es el caso de
antibióticos como la doxiciclina, fosfomicina, ácido fusídico, clindamicina y cotrimoxazol(10).
CONCLUSIONES.
S.aureus ha demostrado a lo largo del tiempo su gran capacidad en el desarrollo de
resistencias a la mayoría de antibióticos disponibles hasta la fecha, lo que a su vez ha provocado
un importante impacto en el control de las enfermedades infecciosas. Inicialmente, las cepas
resistentes se aislaban en hospitales y eran causantes de un gran número de infecciones
nosocomiales, sin embargo, a través de una serie de cambios y modifiaciones han conseguido
conquistar también el medio comunitario, creando la necesidad de realizar una detección
precoz. Este carácter potencialmente virulento y resistente que muestra S.aureus ha obligado a
buscar nuevas dianas terapéuticas y nuevos antibióticos con los que poder ganar la batalla.
Los cambios producidos en la epidemiología clínica de los SARM durante estos últimos
años hacen necesaria la vigilancia continua de resistencias, la educación del profesional
sanitario y la aplicación de políticas y directrices basadas en pruebas científicas, medidas
restrictivas y consultas con especialistas microbiólogos y farmacéuticos. Estas estrategias
combinadas pueden dar lugar a mejores prácticas de prescripción de antibióticos y a la
disminución de las resistencias.
BIBLIOGRAFÍA.
(1) Cervantes-García EG-G, R; Salazar-Schettino, PM. Características generales del Staphylococcus aureus. Rev
Latinoam Patol Clin Med Lab. 2014;61(1):28-40.
(2) Lowy FD. Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus. The Journal of clinical
investigation. 2003;111(9):1265-73.
(3) Kanafani ZA, Fowler Jr VG. Staphylococcus aureus Infections: New Challenges from an Old Pathogen.
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 2006;24(03):182-93
(4) Chambers HF, Deleo FR. Waves of resistance: Staphylococcus aureus in the antibiotic era. Nature reviews
Microbiology. 2009;7(9):629-41.
(5) Cuevas Ó, Cercenado E, José Goyanes M, Vindel A, Trincado P, Boquete T, et al. Staphylococcus spp. en
España: situación actual y evolución de la resistencia a antimicrobianos (1986-2006). Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica. 2008;26(05):269-77.
(6) McCallum N, Berger-Bachi B, Senn MM. Regulation of antibiotic resistance in Staphylococcus aureus.
International journal of medical microbiology : IJMM. 2010;300(2-3):118-29.
(7) Mensa J; Soriano A; Llinares P; et al. Guía de tratamiento antimicrobiano de la infección por Staphylococcus
aureus. Revista española de quimioterapia : publicación oficial de la Sociedad Española de Quimioterapia.
2013;26(Suppl.1):1-84.
(8) Candel González FJ. Daptomicina en el contexto de la resistencia a los antimicrobianos en bacterias
- 19 -
grampositivas. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 2012;30(Supl.1):10-6.
(9) Gould IM, David MZ, Esposito S, Garau J, Lina G, Mazzei T, et al. New insights into meticillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA) pathogenesis, treatment and resistance. International journal of antimicrobial
agents. 2012;39(2):96-104.
(10) Cassir N, Rolain JM, Brouqui P. A new strategy to fight antimicrobial resistance: the revival of old antibiotics.
Frontiers in microbiology. 2014;5:551.
(11) Llagunes J, Peña JJ. Resistencia a los antibióticos y unidad de cuidados críticos. Revista Española de
Anestesiología y Reanimación. 2011;58(09):535-7.
(12) Lázaro, E; Otero, J. Evolución del consumo y de la resistencia a antibióticos en España. Inf Ter Sist Nac
Salud. 2006;30(1):10-9. Disponible en: http://www.msssi.gob.es/biblioPublic/publicaciones/docs
/evolucionConsumoResistenciaAntibioticos.pdf
(13) Cercenado E. Update of antimicrobial resistance in Gram-positive microorganisms. Medicina Clínica.
2010;135(Supl.3):10-5.
(14) European Centre for Disease Prevention and Control. Antimicrobial resistance surveillance in Europe. 2014.
Disponible en: http://ecdc.europa.eu/en/Pages/home.aspx
(15) Fleming A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in
the Isolation of B. influenzæ. British journal of experimental pathology. 1929;10(3):226-236.
(16) Kim J. Understanding the Evolution of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Clinical Microbiology
Newsletter.31(3):17-23.
(17) Deresinski S. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: an evolutionary, epidemiologic, and therapeutic
odyssey. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America.
2005;40(4):562-73.
(18) Hiramatsu K, Katayama Y, Matsuo M, Sasaki T, Morimoto Y, Sekiguchi A, et al. Multi-drug-resistant
Staphylococcus aureus and future chemotherapy. Journal of infection and chemotherapy : official journal of
the Japan Society of Chemotherapy. 2014;20(10):593-601.
(19) Deurenberg RH, Stobberingh EE. The evolution of Staphylococcus aureus. Infection, genetics and evolution
: journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases. 2008;8(6):747-63.
(20) Ayliffe GA. The progressive intercontinental spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clinical
infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 1997;24 Suppl
1:S74-9.
(21) Paterson GK, Harrison EM, Holmes MA. The emergence of mecC methicillin-resistant Staphylococcus
aureus. Trends in microbiology. 2014;22(1):42-7.
(22) Cercenado E, Ruiz de Gopegui E. Staphylococcus aureus resistente a la meticilina de origen comunitario.
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 2008;26(Supl.13):19-24.
(23) Hiramatsu K, Kayayama Y, Matsuo M, Aiba Y, Saito M, Hishinuma T, et al. Vancomycin-intermediate
resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 2014;2(4):213-24.
(24) Torres C, Cercenado E. Lectura interpretada del antibiograma de cocos gram positivos. Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica. 2010;28(08):541-53.
(25) López-Medrano F, Aguado JM. Staphylococcus aureus con sensibilidad disminuida a vancomicina. Nuevos
problemas para el clínico. Medicina Clínica. 2010;135(04):160-1.
(26) Howden BP, Peleg AY, Stinear TP. The evolution of vancomycin intermediate Staphylococcus aureus
(VISA) and heterogenous-VISA. Infection, genetics and evolution : journal of molecular epidemiology and
evolutionary genetics in infectious diseases. 2014;21:575-82.
(27) European Centre for Disease Prevention and Control. Antimicrobial resistance surveillance in Europe. 2013.
Disponible en: http://ecdc.europa.eu/en/Pages/home.aspx
(28) Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios. Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e
Igualdad. Consultado el 17-04-16. Disponible en: http://www.aemps.gob.es/laAEMPS/portada/home.htm
- 20 -
- 21 -