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Tema 6. Enzimas. Clasificación. Principios de la catálisis
enzimática. Energía de activación. Velocidad de reacción y
equilibrio de reacción. Cinética enzimática: ecuación de
Michaelis-Menten. Ecuación de los dobles recíprocos.
Inhibición enzimática. Tipos de inhibición. Mecanismos de
regulación de la actividad enzimática. Isoenzimas
Dpto. Biología Molecular
Universidad de Cantabria
ENZIMAS
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Catalizadores de las reacciones biológicas.
La mayoría son proteínas
Gran poder catalítico
Alto grado de especificidad
Actúan en soluciones acuosas en condiciones
suaves de temperatura y pH
• Su actividad puede regularse
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
IMPORTANCIA DE LOS ENZIMAS
• La medida de la actividad enzimática en fluidos
biológicos o tejidos es importante para el
diagnóstico de muchas enfermedades.
• Muchas fármacos son inhibidores de la actividad
enzimática
• Importancia en la industria de alimentación y
agricultura.
ENZIMAS: RESEÑA HISTORICA
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Primera descripción (finales del siglo XVIII)
1850. Estudios de Pasteur
1897. Buchner
1926. Summer cristaliza la ureasa
Segunda mitad del siglo XX: se purifican y
caracterizan millares de enzimas, lo que ha
permitido conocer su mecanismo de acción.
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Cofactor (iones metálicos o coenzima)
Apoenzima
Holoenzima: apoenzima + cofactor o g. prostético
Nomenclatura:
SUSTRATO + TIPO DE REACCION + ASA
Un tercio de los enzimas requieren algún ión metálico para catalizar
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)33
Muchas vitaminas son cofactores o precursores
de cofactores de enzimas
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Clasificación internacional de enzimas
1. Oxidoreductasas
transferencia de electrones
2. Transferasas
reacciones de transferencia de grupo (no agua)
3. Hidrolasas
reacciones de hidrólisis (transferencia al agua)
4. Liasas
Adición de grupos a dobles enlaces o formación
de dobles enlaces por eliminación de grupos
5. Isomerasas
transferencia de grupos dentro de la misma molécula
para dar isómeros
6. Ligasas
Formación de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N por reacciones
de condensación acopladas a hidrólisis de ATP
Los enzimas aceleran las reacciones bajando la energía de activación
E + S = ES = E + P
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
“Basic Medical Biochemistry” Marks,
Marks & Smith Lippincott. 1999
Los enzimas son estereoespecíficas porque forman varias
interacciones entre aminoácidos del centro activo y los
distintos grupos del sustrato
(“Bioquímica”, Mathews and van Holde
McGraw-Hill, 1998)
El centro activo de los enzimas es complementario al estado
de transición de la reacción catalizada
Progreso de la reacción
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Encaje
inducido
Cambio conformacional inducido por glucosa en la hexoquinasa
(Hexoquinasa = ATP:glucosa fosfotransferasa = 2.7.1.1 )
D-Glucosa
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Velocidad inicial
La Vmax se alcanza cuando todos los centros
activos están ocupados con sustrato
1/2 Vmax
Vmax (S)
=Vo
Km + (S)
Km
Concentración de sustrato [S]
("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham,
C.M. Saunders College Publishing. 1999.)
Relación entre Vo y [E]
Vo
[E]
La velocidad inicial es función lineal de la concentración de
enzima siempre que la concentración de sustrato sea alta
Ecuación de Michaelis-Menten
V
(S)
max
Vo =
Km + (S)
K1
E+S
K2
ES
K-1
Km =
K2 + K-1
K1
P
Velocidad inicial
La Vmax se alcanza cuando todos los centros
activos están ocupados con sustrato
1/2 Vmax
Km
Concentración de sustrato [S]
("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham,
C.M. Saunders College Publishing. 1999.)
Calculo de Km y Vmax por la representación de Lineweaver-Burk
(“dobles recíprocas” de Michaelis-Menten)
("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham,
C.M. Saunders College Publishing. 1999.)
Parámetros enzimáticos
1. Km (constante para cada enzima) = concentración de S a la que la Vo es 1/2
Vmax. Es una medida de la afinidad del enzima por S. Cuanto menor es Km, mayor
es la afinidad del enzima por S
2. Kcat (constante para cada enzima) = número de recambio = número de moléculas
de sustrato convertidas en producto por molécula de enzima y unidad de tiempo, en
condiciones de saturación de sustrato.
3. Vmax = velocidad máxima teórica = la velocidad cuando todos los centros activos
están ocupados con sustrato (nunca alcanzada en la realidad)
4. Unidad de enzima = cantidad de enzima que transforma 1 µmol de sustrato por
min = una forma común de expresar la velocidad
5. Actividad específica = unidades por mg de proteína total de la preparación
enzimática. En el caso de enzimas en suero: unidades/L
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Inhibición competitiva
+ Inhibidor
Unión del Inhibidor al centro
activo, compitiendo con S
• Aumenta Km
• No cambia Vmax
Sustrato
Inhibidor
competitivo
(Adaptado de: ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Inhibición no competitiva
+ Inhibidor
Unión del Inhibidor a un sitio
del enzima distinto del centro
activo: no compite con S
• No cambia Km
• Disminuye Vmax
Sustrato
Inhibidor
Sustrato
no competitivo
(Adaptado de: ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Inhibición acompetitiva
+ Inhibidor
Unión del Inhibidor a enzima-S,
estabilizando el complejo
enzima-S pero impidiendo la
formación de producto:
• Disminuye Km
• Disminuye Vmax
Sustrato
Inhibidor
acompetitivo
(Adaptado de: ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Inhibidor
competitivo
Sustrato
Sustrato
Sustrato
Inhibidor
acompetitivo
Inhibidor
no competitivo
("Biochemistry" 5th ed. Berg, Tymoczko
and Stryer. Freeman and Co. 2002)
Efecto del pH sobre actividad enzimática
(Garret and Grisham)
Inhibición irrevesible de una enzima de síntesis de la pared bacteriana
("Biochemistry" 5th ed. Berg, Tymoczko
and Stryer. Freeman and Co. 2002)
Fármacos antitumorales que actúan como análogos de la citidina
• Citarabina
• Azacitidina
• Gemcitabina
MECANISMOS DE REGULACIÓN ENZIMÁTICA
• Regulación de la cantidad de enzima sintetizada por las células
• Degradación por proteasas citosólicas o lisosomales
• Inhibición reversible por productos
• Interacción con proteínas moduladoras
• Activacion/inhibición alostérica
- El modulador alostérico se une a un sitio distinto del centro activo
- La unión del modulador es reversible e implica cambio conformacional
- Suelen ser enzimas multiméricas
- Tienen cinética sigmoidea
• Modificación covalente:
- fosforilación
- ADP-ribosilación
- metilación
• Activación proteolítica de pro-enzimas
Efectos alostéricos de moduladores positivo y negativo
(al no ser cinética michaeliana no se puede usar el término Km, sino el K0,5)
+ Modulador alostérico
positivo: favorece la forma R
El sustrato es
modulador positivo
+ Modulador alostérico
negativo: favorece la forma T
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Enzima homotrópico alostérico
(al no ser cinética michaeliana no se puede usar el término Km, sino el K0,5)
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Activación/inactivación de enzimas por fosforilación.
Ejemplo: glucógeno fosforilasa
Fosfatasa
que activa
otra enzima
Quinasa
que inactiva
otra enzima
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Una enzima puede tener varios mecanismos de regulación
("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham,
C.M. Saunders College Publishing. 1999.)
Activación de proenzimas por proteolisis: enzimas digestivas
Auto-activación
de quimotripsina
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.
Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)