Download molecular tools for identification of wine yeasts

RESOLUCIÓN OIV-OENO 408-2011
HERRAMIENTAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR PARA IDENTIFICAR LA LEVADURA DE
VINIFICACIÓN SACCHAROMYCES CEREVISIAE Y OTRAS ESPECIES DE LEVADURA
RELACIONADAS CON LA VINIFICACIÓN
LA ASAMBLEA GENERAL
VISTO el artículo 2, párrafo 2 iv, del acuerdo del 3 de abril de 2001 relativo a la creación
de la Organización Internacional de la Viña y el Vino,
A PROPUESTA del grupo de expertos “Microbiología”,
DECIDE adoptar las siguientes herramientas de biología molecular para identificar la
levadura de vinificación Saccharomyces cerevisiae y otras especies de levadura
relacionadas con la vinificación.
DECIDE incluir el siguiente Preámbulo cuando se divulguen las Herramientas de biología
molecular para identificar la levadura de vinificación Saccharomyces cerevisiae y otras
especies de levadura relacionadas con la vinificación y las Herramientas de biología
molecular para la identificación de bacterias lácticas [Oeno-MICRO 09-409] en la uva y el
vino.
Preámbulo [a Oeno MICRO 09-408 y Oeno MICRO 09-409]
El origen, el desarrollo, los cambios y la sucesión de varias especies de levadura y
bacterias puede seguirse utilizando técnicas moleculares específicas que permiten la
diferenciación y tipificación de cepas de levadura. En los últimos años se han empleado
diferentes técnicas en el estudio de la microbiología enológica. Estos métodos son
sensibles y específicos, atendiendo a las diferentes necesidades, y son sencillos, rápidos,
reproducibles, eficientes, fiables y económicos. La implementación de métodos
moleculares para la identificación puede realizarse sin cultivo previo, o después de un
enriquecimiento, o también después de aislar un microorganismo. Esto permite conocer
mejor el sistema microbiano que se desarrolla sobre la superficie de la uva o en el vino.
El objetivo de esta guía es ayudar a los laboratorios que llevan a cabo análisis
microbiológicos en su tratamiento de la identificación de la levadura Saccharomyces
cerevisiae y de otras especies de levaduras [Oeno MICRO 09-408] relacionadas con la
vinificación y para la identificación de bacterias lácticas [Oeno MICRO 09-409] en la uva
y el vino. Las técnicas presentadas consisten en la utilización principal de las técnicas
moleculares existentes. Los métodos detallados se mencionan en la bibliografía.
Certificado conforme
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Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
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Herramientas moleculares para identificar la levadura de vinificación
Saccharomyces cerevisiae y otras especies de levaduras relacionadas con la
vinificación
Para identificar y caracterizar levaduras en las diferentes etapas de vinificación,
envejecimiento y almacenamiento se pueden usar métodos dependientes e
independientes del cultivo.
MÉTODOS DEPENDIENTES DEL CULTIVO
IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE LEVADURA A NIVEL DE ESPECIE
Reacción en cadena de la polimerasa y polimorfismo de longitud de los
fragmentos de restricción (PCR-RFLP) del ADN ribosómico (ADNr)
PRINCIPIO: Se trata de un método dependiente del cultivo porque requiere la
extracción de ADN de un cultivo puro. Se basa en la amplificación de regiones específicas
de las unidades de repetición del ADNr (como los espaciadores transcritos internos, ITS1
e ITS2, y el gen ARNr 5,8S situado entre los espaciadores o el gen ARNr 26S). Estas
regiones contienen secuencias con alto grado de conservación y secuencias que
presentan una gran variabilidad genética entre cepas de diferentes especies. En la
mayoría de los casos, los productos amplificados por PCR de cepas de la misma especie y
del mismo género tienen tamaños moleculares idénticos, y las especies del mismo
género tienen tamaños similares. Aun siendo del mismo tamaño, la secuencia de estas
regiones amplificadas difiere dependiendo de las especies. La diferencia entre secuencias
se detecta mediante un análisis de restricción usando endonucleasas de restricción
diferentes, tales como Cfo I, Hae III, Hinf I, DdeI, MboI. Los patrones de restricción
difieren entre las especies.
La enzima DdeI se requiere para la diferenciación entre H. uvarum y H. guilliermondii,
como fue señalado por Esteve-Zarzoso et al. (1999) y Cadez et al., 2002; mientras que
la enzima MboI es necesaria para distinguir C. zemplinina de C. stellata (Sipicki, 2004).
Además, se deben usar otras enzimas de restricción para diferenciar especies del género
Saccharomyces y sus híbridos (González et al., 2006).
RESULTADOS: Esta metodología ya se ha usado para identificar aproximadamente 145
especies de levaduras pertenecientes a 26 géneros diferentes y los perfiles de restricción
de todas las especies identificadas aparecen documentados en Esteve-Zarzoso et al.
(1999) y Zanol et al. (2010). Se encuentra información disponible sobre ITS-5,8S en la
web (http://www.yeast-id.com).
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REFERENCIAS:
Esteve-Zarzoso et al., (1999). Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8 S rRNA
gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. International Journal of
Systematic Bacteriology 49, 329-337.
Fernández-Espinar et al. (2000). RFLP analysis of the ribosomal transcribed spacers and
the 5.8 S rRNA gene region of the genus Saccharomyces: a fast method for species
identification and the differentiation of flor yeasts. Antoine Van Leeuwenhoek 78: 87-97.
De Llanos et al (2004). Identification of species of genus Candida by RFLP analysis of the
5.8 S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. Antoine Van
Leeuwenhoek 85: 175-185.
Baleiras Couto et al. (2005) Partial 26S rDNA restriction analysis as a tool to characterise
non-Saccharomyces yeasts present during red wine fermentations. Int. J. Food Microbiol
102, 49-56.
Zanol G., Baleiras-Couto M.M., Duarte F.L. (2010) Restriction profiles of 26S rDNA as a
molecular approach for wine yeasts identification. Ciência e Técnica Vitivinícola 25: 7585.
Cadez N., Raspor P., de Cock A.W.A.M., Boekhout T., Smith M.Th. (2002) Molecular
identification and genetic diversity within species of the genera Hanseniaspora and
Kloeckera. FEMS Yeast Research 1, 279-289.
Sipiczki M. (2004) Species identification and comparative molecular and physiological
analysis of Candida zemplinina and Candida stellata. J. Basic Microbiol. 44 (6), 471–479.
González S.S., Barrio E., Gafner J., Querol A. (2006) Natural hybrids from
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus and Saccharomyces kudriavzevii in
wine fermentations. FEMS Yeast Res 6, 1221–1234.
Secuenciación de la región D1/D2 tras la amplificación del PCR
PRINCIPIO: Este es un método dependiente de cultivo dado que requiere la extracción
de ADN desde un cultivo puro. Se basa en la amplificación de la región D1/D2 del gen
ARN 26S y de la posterior secuenciación del amplicón resultante. La secuencia de D1/D2
difiere más de un 1% entre especies distintas y menos de un 1% entre cepas
pertenecientes a la misma especie.
RESULTADOS: La secuencia de la región D1/D2 del gen ARNr 26S se puede distinguir
entre la mayoría de especies conocidas de levadura. La secuencia de la región D1/D2 del
gen ARNr 26S permite la clasificación y la identificación filogenética de aislados
desconocidos porque la base de datos existente es con mucho la mayor de los genes de
levaduras.
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REFERENCIAS:
Kurtzman y Robnett (1997) Identification of clinically important ascomycetous yeasts
based on nucleotide divergence in the 5' end of the large-subunit (26S) ribosomal DNA
gene. J Clin Microbiol. 35, 5 ::1216-23.
Kurtzman y Robnett (1998) Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from
analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie Van
Leeuwenhoek. 73, 4,: 331-71.
Baleiras Couto et al. (2005) Partial 26S rDNA restriction analysis as a tool to characterise
non-Saccharomyces yeasts present during red wine fermentations. Int. J. Food Microbiol
102, 49-56.
IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS DE VINIFICACIÓN A NIVEL DE CEPA
Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) del ADN
mitocondrial (mtDNA)
PRINCIPIO: el ADN mitocondrial (mtDNA) de S. cerevisiae es una pequeña molécula de
65-80 Kb cuyo grado de variabilidad se puede ver mediante análisis de restricción. El alto
grado de polimorfismo del mtDNA sirve para analizar la variabilidad de las cepas de S.
cerevisiae del vino. Se trata de uno de los métodos más usados para caracterizar
aislados de vino durante la fermentación alcohólica. Querol et al (1992) y López et al
(2001) simplificaron el método de análisis: sólo se necesita la extracción de ADN total de
un aislado de cultivo puro y un análisis de restricción con enzimas Hinf I o RsaI
(Guillamón et al, 1994, Schuller et al, 2004; Lopes et al, 2006).
RESULTADOS: Esta técnica permite analizar en poco tiempo una gran cantidad de
cepas. Se puede usar en la industria del vino porque es rápida y segura, y porque no
requiere equipos de PCR.
REFERENCIAS:
Querol et al (1992). A comparative study of different methods of yeast strain
characterization. Syst. Appl. Microbiol. 15: 439-446.
Guillamón et al (1994). Rapid characterization of four species of the Saccharomyces
sensu stricto complex according to mitochondrial DNA patterns. Int. J. Bacteriol. 44: 708714.
López et al (2001). A simplified procedure to analyse mtDNA from industrial yeast. Int. J.
Food Microbiology 68: 75-81.
Schuller D, Valero E., Dequin S., Casal (2004) Survey of molecular methods for the
typing of wine yeast strains. FEMS Microbiology Letters 231, 19-26.
Lopes C.A, Lavalle T.L, Querol A., Caballero A.C. (2006) Combined use of killer biotype
and mtDNA-RFLP patterns in a Patagonian wine Saccharomyces cerevisiae diversity
study. Antonie van Leeuwenhoek 89, 147–156.
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Amplificación de secuencias Delta (δ)
PRINCIPIO: Las secuencias Delta son elementos de 0,3 Kb (334 bp) que flanquean los
retrotransposones Ty1 en S. cerevisiae. Se han encontrado entre 35 y 55 copias de
secuencias delta en el genoma de la levadura como parte de los retrotransposones Ty1 o
como elementos aislados. No obstante, estas secuencias delta se concentran en las
regiones genómicas que unen los genes del ARNt. El número y la ubicación de estos
elementos tienen una cierta variabilidad intraespecífica que Ness et al (1993) usaron
para diseñar cebadores específicos: δ 1 y δ 2 útiles para la diferenciación de cepas S.
cerevisiae. Legras y Karts (2003) optimizaron esta técnica diseñando dos nuevos
cebadores: δ 12 y δ 21, que están situados cerca de δ 1 y δ 2. El uso de δ 12 y δ 21 o de δ 12 con
δ 2 revelan un mayor polimorfismo que se ve reflejado en la aparición de un mayor
número de bandas en el gel de electroforesis.
RESULTADOS: Legras y Karts (2003) distinguieron 53 cepas comerciales con la
combinación de δ 12 y δ 21 o δ 12 con δ 2. Schuller et al. (2004) fueron capaces de
diferenciar un buen número de cepas de levadura de vinificación usando cebadores δ 12 y
δ 2.
REFERENCIAS:
Ness et al. (1993). Identification of yeast strains using the polymerase chain reaction. J.
Sci. Food Agric. 62: 89-94.
Legras y Karst, 2003. Optimisation of interdelta for Saccharomyces cerevisiae strain
characterization. FEMS Microbiol. Lett. 221: 249-255.
Schuller et al. 2004. Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains.
FEMS Microbiol. Lett. 231: 19-26.
Genotipado por microsatélites
PRINCIPIO: Los microsatélites son secuencias cortas compuestas de repeticiones en
tándem de uno a diez nucleótidos. Dichas secuencias se dispersan a lo largo del genoma
de la levadura, tanto en regiones codificantes como no codificantes, pero su tasa es
menor en regiones codificantes. Los marcadores microsatélites son locus polimórficos
cuya diversidad alélica permite diferenciar entre variedades de una misma especie de
levadura. Se conocen varios loci que pueden utilizarse para tipificar las cepas de S.
cerevisiae (Legras et al. 2005). Los perfiles que se obtienen al combinar al menos seis
microsatélites permiten una diferenciación eficiente de cepas de S. cerevisiae.
RESULTADOS: Los marcadores microsatélites se utilizan frecuentemente como
marcadores genéticos en estudios de mapeo genético y en genética de poblaciones. La
combinación de seis loci microsatélites se muestra como una técnica altamente
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discriminante y reproducible y a su vez revela relaciones geográficas y tecnológicas entre
cepas. Estos loci polimórficos pueden utilizarse fácilmente para determinar el perfil de
cepas de S. cerevisiae durante la fermentación.
REFERENCIAS:
Schuller et al. (2004). Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains.
FEMS Microbiol. Lett. 231: 19-26.
Legras et al. (2005) Selection of hypervariable microsatellite loci for the characterization
of Saccharomyces cerevisiae strains. Int J Food Microbiol. 102: 73– 83.
Schuller and Casal (2007) The genetic structure of fermentative vineyard-associated
Saccharomyces cerevisiae populations revealed by microsatellite analysis. Antonie van
Leeuwenhoek 91:137–150.
MÉTODOS INDEPENDIENTES DEL CULTIVO
PCR CUANTITATIVA (qPCR)
CAMPO DE ESTUDIO: Detección y cuantificación rápida de levaduras a nivel de especie
en mosto o vino
PRINCIPIO: Este método se basa en el uso de cebadores universales de levaduras
designados en los campos variables D1/D2 del gen ARNr 26S. Se trata de una de las
pocas secuencias genéticas disponibles de todas las especies conocidas de ascomicetos.
La cuantificación es posible a partir de la determinación del número de ciclos de
polimerización necesarios para superar una señal umbral. Cuanto más elevada sea la
concentración de ADN de la especie objetivo en la muestra, menor será el número de
ciclos necesarios para traspasar el umbral. Las curvas de calibración permiten una
cuantificación precisa.
RESULTADOS: Esta técnica se ha usado para el recuento de células de Candida stellata,
Dekkera bruxellensis, Hanseniaspora uvarum y Saccharomyces cerevisiae en
fermentaciones mixtas, tanto en medio sintético como en vino. El ensayo es lineal en 5
grados de magnitud, siendo el límite de detección de aproximadamente 102 UFC/ml. La
presencia de otros microorganismos no diana (levaduras y/o bacterias) en las muestras
no afecta significativamente el estudio de la PCR cuantitativa.
Se desarrolló un método rápido de PCR cuantitativa para detectar y cuantificar varias
levaduras no Saccharomyces, usando cebadores específicos de cada especie para C.
zemplinina, T.delbrueckii, I. orientalis, y M. pulcherrima (Zott et al., 2010).
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REFERENCIAS:
Hierro, Esteve-Zarzoso, Gonzalez, Mas y Guillamon et al (2006) Real-Time Quantitative
PCR (qPCR) and Reverse Transcription-QPCR for Detection and Enumeration of Total
Yeasts in Wine. Appl. Environ. Microbiol. 72: 7148–7155.
Zott K, Claisse O, Lucas P, Coulon J, Lonvaud-Funel A, Masneuf-Pomarede I (2010)
Characterization of the yeast ecosystem in grape must and wine using real-time PCR.
Food Microbiology 27:559-567.
Electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (PCR-DGGE)
CAMPO DE ESTUDIO: Identificación de levaduras a nivel de especie en mosto o vino
PRINCIPIO: Este método se basa en la amplificación del ADNr 26S de la levadura
usando cebadores universales U1 (unidos con una abrazadera de GC) y U2. Los
fragmentos de amplificación se separan según su longitud y composición nucleótida en
un gel de poliacrilamida desnaturalizante (gradiente de 20 a 60% de urea y formamida).
Los fragmentos de amplificación interesantes se pueden escindir directamente del gel y
secuenciarlos para identificar las especies microbianas, refiriéndose a la banda de
frecuencia ADN 26S de las levaduras. Una de las ventajas es la posibilidad de identificar
también levaduras viables pero no cultivables para las cuales el ADN es también
amplificable.
RESULTADOS: Esta técnica se ha usado para identificar poblaciones microbianas en
muestras de uva y de vino de diferentes especies de levadura (Candida diversa, Candida
sorboxylosa, Candida stellata, Dekkera bruxellensis, Hanseniaspora occidentalis,
Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia hanoiensis, Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia
orientalis, Issatchenkia terricola, Kluyveromyces thermotolerans, Metschnikowia
pulcherrima, Pichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycodes ludwigii,
Torulaspora delbrueckii y Zygosaccharomyces bailii). Las poblaciones de levaduras de
más de 103 células/ml se detectan y se identifican bien mediante PCR-DGGE. La PCRDGGE no es una herramienta cuantitativa.
REFERENCIAS:
Cocolin L, Heisey A, y Mills D.A. et al. (2001) Direct Identification of the Indigenous
Yeasts in Commercial Wine Fermentations. Am. J. Enol. Vitic. 52:01:49-53.
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