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PROYECTO FIN DE CARRERA
Título
Microbiología residual en vinos tintos
Autor/es
Beatriz Garcia Azofra
Director/es
Marta María Inés Dizy Soto
Facultad
Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Titulación
Proyecto Fin de Carrera
Departamento
Agricultura y Alimentación
Curso Académico
2013-2014
Microbiología residual en vinos tintos, proyecto fin de carrera
de Beatriz Garcia Azofra, dirigido por Marta María Inés Dizy Soto (publicado por la
Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia
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El autor
Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2014
publicaciones.unirioja.es
E-mail: [email protected]
AGRADECIMIENTOS
i En primer lugar quisiera dar las gracias a todo el personal docente que me ha ayudado
a realizar este proyecto, en especial a Marta Dizy por su implicación, por su paciencia
y por los conocimientos que gracias a ella he adquirido. A Leticia Miranda Fernandes,
a Joao Verdial y a todo el personal del laboratorio del Instituto Politécnico de
Bragança (IPB) por acogerme allí y hacerme sentir como en casa.
A mi familia, en especial a mis padres y abuelos por tener una paciencia infinita y
comprender los buenos y los malos días. Os quiero.
A Seila y a Fernando, cada uno a su forma me han apoyado de forma incondicional, de
ellos he aprendido muchas cosas, me han aportado tranquilidad y ánimo en los
momentos más difíciles, siempre me hacéis sonreír.
A mis amigos, Raquel, Mónica, Ovidiu, Alberto, Juan y otros muchos que han estado
a diario a mi lado, apoyándome en los mejores y peores momentos.
A mis compañeros de la Oficina del Estudiante de la Universidad de La Rioja que día
tras día se han preocupado por mí y por el trabajo que estaba realizando. Feli, gracias
por tu comprensión y preocupación.
Por último, quisiera agradecer de forma muy especial a todas aquellas personas que de
una forma u otra han hecho posible este trabajo.
¡Gracias a todos¡
ii A mi familia y amigos.
Este trabajo es de todos vosotros
iii ÍNDICE
iv ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS ............................................................................................... 4 1.1. Introducción ...................................................................................................................... 4 1.1.1. El vino y sus orígenes ............................................................................................ 4 1.1.2. Producción mundial de vino.................................................................................. 5 1.1.3. La elaboración del vino y la microbiología enológica............................................ 5 1.1.4. Microorganismos residuales ................................................................................. 9 1.1.5. Factores que influyen en el desarrollo de los microorganismos......................... 12 1.1.6. Medios de cultivo ................................................................................................ 13 1.1.7. Estabilidad de los vinos: defectos y enfermedades ............................................ 14 1.1.8. Región de Tràs‐os‐Montes e Alto Douro y sus vinos........................................... 16 1.1.9. Planteamiento de la investigación ...................................................................... 17 1.2. Objetivos ........................................................................................................................ 17 2. MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................................................... 19 2.1. Equipo de laboratorio empleado ................................................................................ 19 2.2. Materiales ................................................................................................................... 19 2.3. Reactivos ..................................................................................................................... 19 2.4. Muestras de vino......................................................................................................... 19 2.5. Métodos ...................................................................................................................... 20 2.5.1. Preparación de las muestras ............................................................................... 20 2.5.2. Preparación de los medios de cultivo ................................................................. 20 2.5.3. Siembra, recuento y aislamiento de colonias. .................................................... 22 2.5.4. Siembra de microorganismos en los medios de cultivo...................................... 22 2.5.5. Procedimiento para la determinación de presencia de microorganismos y producción de acidez .......................................................................................................... 23 2.5.6. Recuento de microorganismos y estimación de población ................................ 23 2.5.7. Aislamiento de microorganismos........................................................................ 24 2.5.8. Técnicas para la identificación de microorganismos .......................................... 24 2.6. 3. Medios de cultivo ........................................................................................................ 26 RESULTADOS ....................................................................................................................... 28 _Toc391298751 3.1. Determinación Ausencia/Presencia de microorganismos .......................................... 28 v 3.1.1. Levaduras............................................................................................................. 28 3.1.2. 3.2. Bacterias .............................................................................................................. 29 Recuento de microorganismos y estimación de población ........................................ 30 3.2.1. Levaduras ............................................................................................................ 30 3.2.2. Bacterias .............................................................................................................. 31 3.3. Identificación de microorganismos ............................................................................. 32 3.3.1. Identificación fisiológica de levaduras ................................................................ 32 3.3.2. Especies de levaduras y población total para las muestras de vino terminado. 35 3.3.3. Especies de levaduras y población total para las muestras de vino a los dos meses (t = 40). ...................................................................................................... 39 3.3.4. Identificación fisiológica de bacterias lácticas .................................................... 42 3.3.5. Especies de bacterias lácticas y población total para las muestras de vino terminado............................................................................................................................ 45 3.3.3. Especies de bacterias lácticas y población total para las muestras de vino a los dos meses (t = 40). .............................................................................................................. 49 4. 5. DISCUSIÓNYCONCLUSIONES .......................................................................................... 55 4.1. Discusión ..................................................................................................................... 55 4.2. Conclusiones................................................................................................................ 57 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 60 vi RESUMEN
1 RESUMEN
En este trabajo se pretende realizar el recuento, la estimación de población y la identificación de los microorganismos residuales presentes en los vinos tintos de D.O.C. Douro (Portugal). Para ello, distintas bodegas de la zona han proporcionado muestras de vino tinto terminadas y embotelladas preparadas para su comercialización, todos ellos han sido criados en barrica. Se trata de bodegas familiares o pequeñas cooperativas de los pueblos de alrededor interesadas en conocer la estabilidad de sus vinos. Las muestras analizadas proceden de los alrededores de Bragança, región de Tràs‐os‐Montes, al norte de Portugal. Para analizar la estabilidad de los vinos, se han llevado a cabo ensayos de bacterias lácticas, bacterias acéticas y levaduras prestando especial atención al género Dekkera/Brettanomyces, ya que en esa zona la contaminación por este tipo de levadura es muy problemática. Este género produce aromas desagradables: cuero, establo, sudor de caballo. Se utilizaron distintos medios de cultivo sintéticos específicos y diferenciales tanto en placa como en tubos de ensayo con diferentes concentraciones. Los microorganismos se aislaron y se llevó a cabo la observación macro y microscópica de las colonias y posteriormente, se utilizaron test comerciales de asimilación de carbohidratos/polialcoholes para realizar un diagnóstico de las especies. Todo el trabajo de laboratorio se ha llevado a cabo en el Laboratorio de Microbiología de IPB (Instituto Politécnico de Bragança). La población residual de levaduras se situó entre 104 y 105 céls/ml en los vinos terminados y aumentó hasta 105 céls/ml en todas las muestras a los dos meses de apertura de las botellas. Los géneros identificados fueron: Saccharomyces, Candida, Brettanomyces/Dekkeras y Rhodotorula. La población residual de bacterias lácticas se mantuvo prácticamente constante a lo largo del tiempo, habiendo un pequeño aumento de población a los dos meses de apertura de las botellas, no superando 102 céls/ml en ningún caso. Se identificaron los géneros Oenococcus y Lactobacillus. En ninguna de las muestras se produjo crecimiento de bacterias acéticas. 2 INTRODUCCIÓN
Y
OBJETIVOS
3 1. INTRODUCCIÓNYOBJETIVOS
1.1. Introducción
1.1.1. Elvinoysusorígenes
La forma más sencilla de definir el vino es, bebida alcohólica producida por la fermentación del jugo de la uva. Otra definición más completa es la establecida en la ley 24/2003, de 10 de julio, de la Viña y el Vino en nuestro País. "El vino es el alimento natural obtenido exclusivamente por fermentación alcohólica, total o parcial, de uva fresca, estrujada o no, o de mosto de uva". La graduación alcohólica adquirida no puede ser inferior a 8,5 % aunque dependiendo de la legislación vigente en cada región, el grado alcohólico puede descender a 7 %. La fermentación se produce por la acción metabólica de las levaduras, que transforman los azúcares del fruto en alcohol y dióxido de carbono. Los ácidos y azúcares presentes en la uva suelen ser suficientes para que se lleve a cabo la fermentación. Los orígenes del vino se remontan a la antigüedad, en torno a los años 6.000‐5000 a.C. Existen indicios del cultivo de la especie salvaje Vitis vinifera sylvestris y de la obtención de bebidas a partir de uva de esa época. El verdadero nacimiento del vino se puede situar en la Edad de Bronce alrededor del 3.000 a.C. El origen de las primeras cosechas de uva se fija en Súmer, en la antigua Mesopotamia, en las tierras fértiles del Próximo Oriente. Se extendió a Egipto, donde rivalizó con la cerveza que allí se elaboraba. Las orillas fértiles del Nilo se convirtieron en tierras de cultivo de la vid y se desarrollaron actividades laborales e industriales en torno a este cultivo. El mosto se fermentaba en grandes vasijas de barro y se producía vino tinto que era utilizado en ritos religiosos y llego a convertirse en símbolo de estatus social. La adaptabilidad de la especie Vitis vinífera favoreció su expansión por la Europa Occidental a través de las rutas comerciales, llegando hasta China. Hacia el 700 a.C. el vino llegó a la Grecia clásica. Los griegos tomaban el vino aguado y como en Egipto, se utilizaba en ritos religiosos, ritos funerarios y fiestas, se asignó por primera vez una divinidad al vino, Dionisio. Roma extendió el cultivo de la vid por todo su imperio y asignó también una divinidad al vino, Baco. El vino fue cobrando cada vez más importancia. En la Edad Media, las órdenes religiosas se encargaban de elaborar vino en las abadías para su uso en los rituales religiosos, seleccionando las variedades más resistentes y adaptadas. La conquista de los distintos continentes por los grandes imperios fue expandiendo el cultivo y la cultura de la vid a prácticamente todo el mundo. 4 1.1.2. Producciónmundialdevino
La uva es una de las frutas más recolectadas en el mundo. El 60% de la superficie de viñedos mundial se encuentra repartida entre los diferentes estados de la Unión Europea, el territorio americano (norte y sur) poseía tan sólo un 12% de la superficie. Del total de la recolección de la uva la mayoría se dedica a producción vinícola (aproximadamente un 66%). El porcentaje varía de país en país debido a su situación geopolítica y a sus creencias religiosas. El país que más dedica la uva al consumo en forma fruta es China. La vid supone tan sólo un 0.5% del total de la superficie dedicada mundialmente a la agricultura. Los tres países con gran tradición vitivinícola son los mayores productores y exportadores, y son Francia, Italia y España. En América del Norte el mayor productor es EE.UU. y en Sudamérica es Argentina seguido de Chile. Casi un 70% de la producción mundial y también la exportación se encuentra en la Unión Europea. Desde los años 70 la producción mundial ha estado en torno a los 250 hasta los 330 millones de hectolitros. España es el país que posee mayor superficie de viñedos del mundo, seguido de Francia, pero tiene tendencia a decrecer. Países como Portugal y Chile tienen un alto grado de exportación de sus vinos pudiendo llegar a decir que exportan casi un 80% de su producción. Según la estimación de la Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV), la producción mundial de vino de 2013, se situó en 252 millones de hectolitros, 15 millones menos que en el año anterior. El primer país productor de vino fue Francia, con 41,4 millones de hl, seguido por Italia, con 40,1 millones de hl, y España, con 30,4 millones de hl. Con menor volumen, la producción creció en Portugal, Grecia y disminuyó en Alemania. 1.1.3. Laelaboracióndelvinoylamicrobiologíaenológica
La vendimia o cosecha es una operación de gran trascendencia para la calidad del futuro vino. Ha de determinarse el momento óptimo para vendimiar, el grado de madurez de la uva, su estado sanitario y la forma en que se realice la recolección, tiene importancia decisiva en el mantenimiento de la calidad del producto final. Seguidamente se realiza el transporte de la uva a bodega, este debe reunir los siguientes requisitos, debe realizarse en condiciones tales que la uva llegue los más entera posible a la bodega, y en el tiempo lo más breve posible. Una vez que la partida de uva se ha dado de paso, tras haberse sometido a la inspección visual y toma de muestra, se procede a la descarga de ésta. Acto seguido se procede al despalillado y al estrujado, el despalillado consiste en separar el raspón del grano de uva y el estrujado en el 5 que se provoca la rotura de los hollejos y el desprendimiento de la pulpa, para facilitar la salida del zumo, sin llegar a romper las partes sólidas. El estrujado va tener dos funciones fundamentales en el proceso de vinificación: propicia el desarrollo de levaduras en masa, como consecuencia de la dispersión del zumo y de la aireación y facilita la maceración, porque aumenta la superficie de contacto zumo − hollejo. Después se llevará a cabo el sulfitado que consiste en la adición de anhídrido sulfuroso en el procesado de la uva. El sulfitado se emplea desde la antigüedad en la elaboración del vino, se puede añadir a la uva, al mosto y al vino. Actualmente casi todos los vinos de mesa reciben mayor o menor cantidad de anhídrido sulfuroso, en la vinificación y durante su conservación. Las principales propiedades que llevan a emplear el sulfuroso son: efecto antioxidante, por su avidez por el oxígeno, efecto antioxidásico, por su capacidad de inhibir las polifenoloxidasas y efecto antiséptico, principalmente frente a bacterias. Una vez ha sido despalillada y estrujada la vendimia debe llevarse hasta los depósitos para encubar e iniciar la maceración. El transporte de la masa se realiza mediante bombas de pastas y tuberías. Las bombas de pasta, deben tratar suavemente la masa y evitar aireaciones, pero la verdad es que este transporte no es bueno para la calidad del producto final, hay que procurar acortarlo y realizarlo en las mejores condiciones posibles. Después la descarga en el depósito también debe ser cuidadosa procurando no aplastar y golpear demasiado la masa. La maceración es el proceso más decisivo de la vinificación en tinto. Deben conocerse muy bien los principios que la rigen y que factores intervienen. Durante esta etapa no sólo se obtiene el color, sino todos los componentes que nos van a determinar las características organolépticas finales del vino. Entre esos componentes están los polifenoles y taninos, los compuestos responsables de extracto, las sustancias aromáticas, que pueden considerarse positivas. Pero también se extraen sustancias responsables de sabores y olores vegetales, en general no deseables. Una vez encubado el mosto, se deja en reposo para que tenga lugar la fermentación, que permitirá la verdadera transformación del mosto en vino. La fermentación es el fenómeno clave del proceso de vinificación. Sin él no tendríamos vino y si no se cuida que tenga lugar en las mejores condiciones posibles, no llegaremos a obtener vino de calidad. La fermentación dura aproximadamente 10−15 días, durante los 8−10 primeros días tiene lugar la fermentación tumultuosa, en la que la actividad de las levaduras es máxima. Coincide con el momento de descenso más brusco de la densidad y con el máximo desprendimiento de carbónico e incremento de la temperatura. Después el nivel de nutrientes del mosto desciende, apenas queda azúcar por consumir y el alcohol empieza a ser tóxico para las levaduras. La actividad fermentativa se ralentiza y el descenso de densidad es muy lento, se desprende carbónico reducido y la temperatura se mantiene. La fermentación es un proceso exotérmico que libera energía al medio en forma de calor. Temperaturas elevadas durante la fermentación no son adecuadas, y en casos extremos 6 pueden llegar a ser peligrosas, ya que se pueden producir paradas en la fermentación, aumento de las pérdidas de alcohol por evaporación, pérdida de aromas varietales... La temperatura de la fermentación suele oscilar entre 20−26 ºC. Los aumentos bruscos de temperatura durante la fermentación deben ser controlados. Los remontados son operaciones realizadas durante el encubado de los tintos para favorecer la extracción de las sustancias del hollejo, pero sobre todo para propiciar su difusión por toda la masa de líquido. El remontado consiste en extraer el líquido por la parte inferior del depósito y añadirlo por la parte superior consiguiendo airear la masa y propiciando un desarrollo mayor de las levaduras y una mayor actividad fermentativa. El descube constituye el final de la maceración. Consiste en sangrar el depósito por la parte inferior extrayendo el líquido (vino yema) para llevarlo a otro depósito donde concluirá la fermentación, si aún no lo ha hecho. Los orujos se extraen en este momento y se llevan a la prensa, para poder extraer el resto de vino que les queda. Se trata de un punto muy importante para la calidad del producto final. El vino pasará a otro depósito donde se realizará la fermentación maloláctica. Se trata de un proceso controlado llevado a cabo por bacterias lácticas, presentes en la uva. Durante la fermentación maloláctica tiene lugar la transformación del ácido málico, que forma parte de la composición del vino, en ácido láctico. Para el vino tinto se considera la descomposición bacteriana de la acidez un factor de calidad: sin descomposición de la acidez no se produce el verdadero vino tinto. Por un lado debido al aumento del pH como consecuencia de la formación de ácido láctico y de la descomposición del ácido málico, y por otro, debido a los productos metabólicos, que tienen influencia sobre el sabor del vino, haciéndolo más redondo, suave... Las bacterias lácticas que llevan a cabo esta operación son sensibles al SO2. No sólo al SO2 libre, sino a unos 50 mg de ácido sulfuroso fijado. Con estas cantidades podemos inhibir su actividad y retrasar la actividad y la descomposición de la acidez. Se debe tener mucho cuidado por lo tanto a la hora de dosificar el sulfuroso, ya que una dosis excesiva puede impedir que se lleve a cabo la fermentación maloláctica. La temperatura óptima para el desarrollo de la fermentación maloláctica se sitúa por encima de los 20ºC. A estas temperaturas la actividad de las bacterias lácticas se incrementa. Temperaturas inferiores provocan la inhibición de la actividad de este tipo de bacterias, retrasando la transformación del ácido láctico en ácido málico. La fermentación maloláctica tiene lugar durante los meses de invierno, cuando las temperaturas ambientales son bajas. Es normal que los vinos después de la fermentación aparezcan turbios. Con el tiempo y con los trasiegos se produce una sedimentación natural. Por una parte las partículas en suspensión van sedimentando por gravedad. Por otro lado los coloides de vino: taninos, proteínas y pectinas, pueden perder la estabilidad por diferentes motivos (fenómenos de polimerización y coagulación, acción de enzimas) formando flóculos y sedimentando. Es decir, el vino permanece durante un tiempo en el depósito para terminar con un aspecto limpio. Una vez terminada también esta fermentación, se procederá a descubar nuevamente. 7 En ocasiones, el proceso de sedimentación de las partículas es muy lento por lo que hay que forzar y acelerar el proceso mediante una clarificación. Los vinos jóvenes deben salir al mercado pronto y no hay tiempo suficiente para que se clarifiquen espontáneamente, además, siempre quedan en el vino sustancias de naturaleza coloidal que podrían desestabilizarse y enturbiar el vino después en el proceso de comercialización. Una vez finalizada la clarificación se procede a la aplicación de frío al vino para precipitar aquellas sustancias contenidas en el vino que son lábiles a bajas temperaturas (proteínas, cristales, tartratos...). El proceso dura unas semanas y es necesario para evitar el precipitado de tartratos y otros cristales, si una vez embotellados son sometidos a bajas temperaturas. A continuación, y transcurrido el período de estabilización por frío, se procederá al filtrado, con la finalidad de eliminar los tartratos y cristales. Como filtro suele utilizarse tierras de diatomeas, que recibe este nombre porque el lecho filtrante está constituido por una capa o torta de tierras filtrantes en este caso de diatomeas. Una vez finalizado el proceso de estabilización del vino, éste es introducido en barricas de roble americano y francés para iniciar un largo período de crianza, cuya duración dependerá del tipo de vino que se pretenda elaborar. Un factor muy importante a tener en cuenta durante el período de crianza son las mermas que se producen en barricas llenas hasta el tapón. Se trata de cantidades de vino que, como consecuencia de la evaporación, de los cambios de temperatura, de la pérdida de CO2 y de la absorción de vino por parte de la madera de la barrica entre otros. Ya que en la superficie del vino se desarrollan microorganismos perjudiciales. Para evitar oxidaciones nocivas y el desarrollo de organismos aerobios perjudiciales, se debe proceder a un rellenado periódico de la barrica y a un continuo control de la operación de crianza. Tras estos procesos se procede al embotellado consiste en llenar las botellas hasta un volumen preciso de vino, dejando el espacio vacío necesario para la puesta del tapón más una cámara de aire que permita cierta dilatación. Durante las 24 h que siguen al embotellado, la botella debe conservarse de pie para permitir la perfecta adaptación del tapón al vidrio del cuello, sin dar lugar a pérdidas de líquido y al desarrollo de los hongos parásitos del corcho. El envejecimiento en botella sólo va a ser practicada en vinos con las denominaciones reserva y gran reserva. El período de envejecimiento en botella variará en función de lo dispuesto en el Reglamento del Consejo Regulador. Una vez finalizado el embotellado y el período de envejecimiento en botella se procede al capsulado, etiquetado y empaquetado de las botellas. La microbiología enológica tiene su origen en el S.XVII cuando Anton Von Leeuwenhoeck llevó a cabo estudios sobre el mundo microbiano. Casi dos siglos después, Desmazières confirmó estos estudios gracias a la mejora de las técnicas microscópicas. En 1858 Louis Pasteur demostró que las levaduras eran las responsables de la fermentación alcohólica del mosto, y que ciertas especies de bacterias eran las causantes del deterioro de los vinos. Obtuvo también los primeros cultivos de levaduras. 8 Guilliermond fue conocido como el iniciador de la citología de organismos unicelulares y describió la estructura interna de las levaduras. El danés Winge destacó en el campo de la genética de levaduras. Todos estos autores observaron células apiculadas al principio de la fermentación, otras células globosas y alargadas cuando el proceso avanzaba y un tercer tipo, de forma elíptica que se depositaban en el fondo al final de la fermentación. La microbiología moderna tiene su origen en los trabajos de Gino de Rossi y Castelli que establecieron directrices y técnicas para la toma de muestras, aislamiento de microorganismos y criterios taxonómicos de clasificación. Se puso en evidencia que la fermentación tiene dos etapas biológicas diferenciadas, la fermentativa en la que participan distintas especies de microorganismos de forma sucesiva y la aeróbica en la que aparecen velos sobre el vino terminado. Desde entonces, la microbiología de la vinificación ha sido extensamente estudiada y, en consecuencia, se ha revelado la gran complejidad de la ecología de las fermentaciones. Se deben considerar como principales grupos microbianos los mohos, las levaduras y las bacterias. Las levaduras, principalmente pertenecientes al género Saccharomyces, son las encargadas de realizar la fermentación alcohólica, las bacterias lácticas llevan a cabo la fermentación maloláctica, las bacterias acéticas junto con algunas bacterias lácticas son causantes de las alteraciones del vino. Los mohos pueden desarrollarse sobre la uva o en las vides, disminuyendo la calidad de los vinos. 1.1.4. Microorganismosresiduales
Los microorganismos residuales son aquellas poblaciones microbianas que tras la elaboración del vino, estabilización, clarificación, sulfitado… son capaces de desarrollarse y formar colonias, provocando enfermedades e inestabilidad en los vinos ya terminados. 
Levaduras Las levaduras son hongos microscópicos unicelulares, con organización eucariotas. Su morfología celular es variada: esférica, ovalada, alargada, apiculada… La reproducción asexual ó vegetativa se produce generalmente por gemación, aunque algunas especies lo hacen por bipartición. La reproducción sexual se produce por formación de esporas. Son las responsables de la fermentación alcohólica. Las principales especies de levaduras vínicas son: Saccharomyces cerevisiae, Kloeckera apiculata, Hanseniaspora guillermondii, Metschnikowia pulcherrima y Schizosaccharomyces pombe. Otras levaduras presentes también en los vinos corresponden a los géneros: Brettanomyces/Dekkeras, Torulaspora, Cryptococcus, Debaryomyces, Kluyveromyces, Rhodotorula, Candida, Pichia, Hansénula y Zygosaccharomyces. La presencia de las distintas especies a lo largo de la fermentación alcohólica varía. En la fase inicial se pueden encontrar levaduras con baja producción de alcohol aunque alta producción de ácidos volátiles como Rhodotorula, Candida, etc. En la fase tumultuosa el género Saccharomyces invade el medio ya que su tolerancia al etanol es más alta, predominando 9 hasta el final de la fermentación, durante esta fase, la producción de compuestos secundarios será menor y las especies iniciales prácticamente desaparecen. Los principales requerimientos nutricionales de las levaduras son azúcares, una fuente de nitrógeno, minerales y vitaminas. Requieren también la presencia de oxígeno, ya que interviene en la síntesis de esteroles, constituyentes de la membrana celular. Estos microorganismos tienen su origen en la propia uva, en la superficie de la maquinaria de la bodega y en la inoculación. 
Bacterias lácticas Las bacterias lácticas son bacterias Gram‐positivas, catalasa‐negativas, no esporuladas e inmóviles. Se trata de microorganismos anaerobios facultativos y fermentadores de azúcares. Su morfología celular es de coco ó bacilo y su reproducción se produce por división celular (bipartición). Los principales géneros implicados en la vinificación son: Lactobacillus, Pediococcus, Oenococcus y Leuconostoc. Son las responsables de la fermentación malolática. Las podemos distinguir en homofermentativas, que metabolizan la glucosa en ácido láctico y heterofermentativas, que la metabolizan en ácido láctico pero también en ácido acético, etanol, diacetílo y otros compuestos. La presencia a lo largo de la vinificación comienza con distintas especies, casi todas ellas homofermentativas y concentraciones de 103‐104 ufc/ml. Cuando se produce el inicio de la fermentación alcohólica, la población disminuye hasta concentraciones de 102 ufc/ml ya que la concentración de etanol y otros compuestos tóxicos para las bacterias, aumentan. Tras la fermentación alcohólica predomina el género Oenococcus, puesto que tiene mayor resistencia al etanol y resiste pHs bajos. Permanecen en fase de latencia durante unos días y posteriormente se multiplican gracias a los nutrientes aportados por la autolisis de las levaduras hasta alcanzar concentraciones de 106 ufc/ml, se desarrollará así la fermentación maloláctica. Tras la fermentación, el género Oenococcus disminuye su población, manteniéndose los géneros Lactobacillus y Pediococcus. El origen de estas bacterias está también en las uvas, en la maquinaria de bodega y en los inóculos que se puedan realizar. 
Bacterias acéticas Se trata de bacterias Gram‐negativas, catalasas positivas y oxidasa negativa, no esporuladas, de morfología variable: elípticas o con forma de bastón. Son móviles por la presencia de flagelos polares o pericéntricos. Son aerobias estrictas, siendo necesaria la presencia de oxígeno molecular para su desarrollo, en casos muy extremos pueden utilizar otro aceptor terminal de electrones. Tienen alta tolerancia a la acidez y al etanol y son capaces de oxidar el alcohol a ácido acético. Los principales géneros son: Gluconobacter y Acetobacter. Durante la fermentación alcohólica el desarrollo de las levaduras y la adicción de sulfuroso no afectan a estas bacterias. A lo largo de la fermentación maloláctica, la población se mantiene y es durante la conservación del vino donde se pueden producir el desarrollo de estas poblaciones y causar enfermedades. 10 Se trata de bacterias muy extendidas en la naturaleza, suelen encontrarse sobre substratos azucarados y bebidas alcohólicas. Durante el proceso de vinificación, estos microorganismos pueden ser beneficiosos o perjudiciales según el momento en que aparezcan (Ej. Saccharomyces cerevisiae, es la principal responsable de la fermentación alcohólica y puede ser causante de la enfermedad del velo). Otros por el contrario, son perjudiciales siempre, ya que no aportan beneficio a los vinos y son precursores de enfermedades. En las Tablas 1.1. y 1.2. se muestran los principales géneros de levaduras y bacterias, su procedencia y las principales enfermedades que puede causar su desarrollo ó su crecimiento en momentos inadecuados. Tabla 1.1. Principales géneros de levaduras presentes en el proceso de vinificación, procedencia y principales enfermedades. Género Procedencia Enfermedades Brettanomyces/Dekkeras Barrica Anomalías olfativas Saccharomyces Mosto de uva Refermentación, velo Rhodotorula Mosto de Uva Velo Candida/Metschnikowia Mosto de Uva Velo Kloeckera/Hanseniaspora Mosto de uva Schizosaccharomyces Ácido volátil Mosto de uva Desacidificación del mosto Mosto de uva Velo Pichia Uva Velo Hansenula Uva Velo Zygosaccharomyces Mosto de uva Velo Debaryomyces Mosto de uva Velo Cryptococcus Uva Velo Torulaspora 11 Tabla 1.2. Principales géneros de bacterias presentes en el proceso de vinificación, procedencia y principales enfermedades. Género Procedencia Enfermedades Pediococcus Uva y mosto Olores indeseables Oenococcus Uva y mosto Olores indeseables Lactobacillus Uva y mosto Ahilado, vuelta, amargor, olores indeseables Leuconostoc Uva y mosto Amargor, ahilado Gluconobacter Uva y mosto Picado acético Acetobacter Uva y mosto Picado acético, ahilado 1.1.5. Factoresqueinfluyeneneldesarrollodelosmicroorganismos
Existen varios factores que van a influir en el desarrollo de estos microorganismos: 
Acción de los agentes químicos Las sustancias químicas según su intensidad pueden tener una acción indiferente, estimulante o letal para el microorganismo. 
Acción del potencial redox En el proceso de obtención de energía están implicadas reacciones químicas de óxido‐
reducción que utilizan el oxígeno como último aceptor de electrones. Hay microorganismos que necesitan la presencia de oxígeno para desarrollarse mientras que otros por el contrario, la presencia de oxígeno inhibe su crecimiento. Existen por tanto tres grandes grupos: los aerobios obligados que necesitan la presencia de oxígeno, los microorganismos anaerobios dentro de los cuales tenemos los anaerobios estrictos y los anaerobios aerotolerantes y los microorganismos facultativos que pueden desarrollarse en presencia de oxígeno y en su ausencia, utilizando otros compuestos como aceptores últimos de electrones. 12 
Acción del pH y la acidez El pH es logaritmo del valor recíproco de la concentración de iones hidrógeno (H+) y nos va a indicar la acidez, basicidad ó neutralidad de las soluciones. El vino es una solución más bien ácida, con un pH que puede variar entre 3 y 4 aproximadamente. Las levaduras del vino se desarrollan muy bien a pHs entre 3 y 4, las bacterias propias del vino son muy acidófilas, el crecimiento óptimo de bacterias lácticas se produce a pHs en torno a 3,2‐3,8 y las bacterias acéticas se desarrollan incluso a pH 2,5. 
Acción de la temperatura La temperatura es un factor determinante para el desarrollo microbiano, siendo la temperatura óptima aquella en la que el microorganismo desarrolla al máximo todas sus funciones vitales, la temperatura mínima es aquella a la que el microorganismo está vivo pero no desarrolla correctamente las funciones de crecimiento y reproductivas y la temperatura máxima es aquella a la cual el microorganismo queda vivo pero inactivo. 
Actividad de agua Para que los microorganismos puedan utilizar las distintas sustancias como alimento, éstas han de encontrarse disueltas en agua, dependiendo de la humedad del alimento los microorganismos podrán o no asimilar estas sustancias. 
Acción de la luz La mayoría de los microorganismos se ven dañados por la luz solar directa, sin embargo no se ven afectados por la luz difusa. 
Acción de los agentes biológicos En los procesos naturales de transformación de la materia suelen intervenir distintas especies de microorganismos que influyen recíprocamente unas sobre otras. Si la influencia se da en sentido favorable se le llama sinergia, si por el contrario, es desfavorable, se conoce como antagonismo. 1.1.6. Mediosdecultivo
Para realizar el aislamiento de microorganismos, se utilizaron distintos medios de cultivo, tanto medios específicos como diferenciales. Es importante la elección de medios ya que la composición de los medios específicos permite el desarrollo de un tipo de microorganismos y la composición de los medios diferenciales permite el desarrollo de una especie concreta. Se han de buscar medios de cultivo para cada tipo de microorganismo que se quiera estudiar y se ha de prestar especial atención a los géneros o especies que más dificultad de desarrollo puedan tener y a las interacciones que se puedan producir entre los propios microorganismos presentes en las muestras. Para el desarrollo de levaduras se escogieron los medios Yeast Extract Peptone Dextrose (YPED), Wickerham y Dekkera Diferential Medium (DDM), para el crecimiento de bacterias 13 lácticas el medio Man Rogosa Sharpe (MRS) y para el desarrollo de bacterias acéticas los medios Agar Manitol y medio de Carr. 1.1.7. Estabilidaddelosvinos:defectosyenfermedades
Se pueden definir los defectos del vino como aquellos que están originados por procesos físicos o químicos que añaden sustancias extrañas al vino y producen variaciones de aspecto, olor y sabor. Las enfermedades, sin embargo, son todos los cambios perjudiciales provocados por microorganismos. Se producen modificaciones en la composición química del vino y se forman sustancias nuevas indeseables. Estas enfermedades pueden llegar hasta el punto de que el vino no sea apto para el consumo. Suele ser más fácil prevenir los defectos que las enfermedades. DEFECTOS Las quiebras son defectos producidos durante la elaboración del vino que pueden tener un efecto negativo sobre su limpidez, su color y sus propiedades organolépticas. Pueden tener un origen físico‐químico, ya sea por excesiva oxidación o por presencia de enzimas oxidaxas, por contaminación de minerales y compuestos químicos, por precipitaciones de bitartratos. 
Quiebra parda El vino se torna color pardo en contacto con el aire, comienza por la superficie y continúa extendiéndose a todo el vino, los pigmentos rojos del vino se vuelven castaños y puede llegar incluso a modificar las características organolépticas del vino. Esto es debido a la presencia de la enzima oxidasa presente en los hollejos y en los raspones del racimo. Si el sulfitado del mosto se realiza correctamente, estas enzimas prácticamente desaparecen. 
Quiebra férrica Se observa un velo blanco en la superficie, decoloración y enturbiamiento del vino. Suele estar también asociado a precipitaciones de otros compuestos. El sabor del vino solo suele modificarse si hay cantidades muy elevadas de hierro. Esta quiebra se produce cuando el vino ha permanecido en contacto con hierro durante su elaboración y después entra en contacto con el aire. 
Quiebra cúprica Se produce la formación de compuestos de cobre insolubles que enturbian el vino. El sabor del vino se vuelve desagradable. Cuando el vino estuvo en contacto con utensilios de cobre o latón y entra en contacto con el aire se produce este enturbiamiento. 14 
Quiebra negra El vino adquiere un color verde‐azulado ó negro‐azulado cuando entra en contacto con el aire. Es debido a que durante el proceso de maceración, el vino estuvo en contacto con hierro. Esta quiebra dependerá también del contenido de taninos, siendo más fuerte cuantos más taninos tiene el vino. 
Precipitación de tartárico Se pueden producir precipitados de tartrato de potasio o cálcico, cuando las botellas se depositan en una bodega fría ó si fueron llenadas en un ambiente frío. La formación de cristales se da en vinos embotellados que fueron tratados con carbonato cálcico y no se dejaron reposar el tiempo adecuado en el depósito, por tanto, los cristales precipitan en la botella. En ocasiones con el tartrato potásico precipitan otras sustancias que perjudican el aspecto del vino. 
Precipitación proteica Se da en vinos blancos debido al contenido en proteínas de las uvas que son degradadas lentamente y precipitan cuando la temperatura es elevada. Este tipo de precipitado sucede después del embotellado, principalmente en los vinos de alto grado alcohólico. El vino se enturbia en el fondo de la botella quedando el resto del líquido sin enturbiamiento. ENFERMEDADES 
Flores del vino Esta alteración se produce por el desarrollo de levaduras en la superficie del vino debido a su metabolismo aeróbico. Comienzan desarrollándose islotes que se van uniendo lasta cubrir toda la superficie. El color puede variar desde blanco hasta rosado y suele desarrollarse en vinos jóvenes pobres en alcohol. Actúa sobre la acidez y sobre el alcohol. Los principales géneros a los que se asocia esta enfermedad son: Pichia, Candida, Hansenula, Zygosaccharomyces, Brettanomyces, Torulopsis, Cryptococcus, Rhodotorula, Debaromyces y Trigonopsis. 
Refermentación Se da el desarrollo de levaduras por vía anaerobia cuando el vino aún contiene cantidades elevadas de azúcares, se produce un enturbiamiento y desprendimiento de gas carbónico. Es típica del género Saccharomyces. 
Género Brettanomyces/Dekkeras Es un género que provoca contaminaciones problemáticas, debido a que genera graves anomalías olfativas y afecta a las características organolépticas del vino. Este tipo de 15 microorganismos no suelen encontrarse de forma endógena en la uva, sin embargo si lo hace en las barricas de roble utilizadas para las crianzas de los vinos. 
Mohos Durante el desarrollo del grano de uva, éste puede ser atacado por distintos géneros de mohos que provocan tanto la reducción del volumen de la cosecha como la disminución de la calidad del vino obtenido. Los principales géneros causantes de estas enfermedades son: Botrytis, Penicillum, Aspergillus, Mucor y Cladosporium. 
Ahilado ó enfermedad de la grasa El vino presenta un aspecto aceitoso debido a los mucílagos producidos por los microorganismos. Se produce en vinos blancos de baja acidez fija. Los principales géneros que producen esta enfermedad son: Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Penicilium y Acetobacter. 
Vuelta o rebote El vino presenta enturbiamientos, cambios de coloración y burbujas de gas. Se produce en vinos de pH superior a 3,5 y a temperaturas de 25 ºC. El olor y el sabor de los vinos se ven alterado debido a la formación de compuestos derivados de tetrahidropiridinas por la degradación de ácido tartárico. El género principal es Lactobacillus. 
Enfermedad del amargor Suele afectar a vinos tintos de bajo grado alcohólico y presenta sabor insípido ó amargo, enturbiamientos y precipitación de materia colorante. La glicerina se degrada a acroleína. Los géneros implicados son Lactobacillus y Leuconostoc. 
Picado acético ó avinagramiento A consecuencia de la presencia de bacterias acéticas, el alcohol etílico se oxida y se produce acetaldehído y acetato de etilo, cuando la enfermedad está más avanzada se puede apreciar turbidez. 1.1.8. RegióndeTràs‐os‐MonteseAltoDouroysusvinos
La región de Tràs‐os‐Montes e Alto Douro está situada al noroeste de Portugal. Se trata de una región que tiene frontera con las Comunidades Autónomas de Galicia y Castilla y León. El distrito de Bragança del cual proceden las muestras limita con las provincias españolas de Ourense y Zamora. El clima de la zona es un clima templado con influencias continentales y oceánicas. Los veranos son soleados y cálidos, con variación térmica entre al día y la noche es muy acusada y las precipitaciones escasas. Los inviernos son muy fríos y húmedos con lluvias frecuentes. 16 La producción de vino en esta región es alta, sobre todo de vinos tintos con crianza, aunque también se producen vinos blancos, rosados, tintos jóvenes, espumosos y de aguja. El grado alcohólico es variable dependiendo la variedad de uva utilizada y la bodega de la que procede, pudiendo encontrar vinos desde 7,5‐8º hasta vinos de 13,5‐14º. Las principales variedades de uva tinta cultivadas en la zona son: Trincadeira, Bastardo, Marufo, Tinta Roriz, Touriga Nacional y Touriga Franca. 1.1.9. Planteamientodelainvestigación
La investigación que se plantea es el estudio de las poblaciones de microorganismos residuales en vinos regionales (Vinhos Regionais). Todas las muestras estudiadas son vinos tintos de crianza procedentes de la región de Tràs‐os‐Montes e Alto Douro. La investigación se llevó a cabo en el Instituto Politécnico de Bragança (IPB). 1.2. Objetivos
Los objetivos que se persiguen con esta investigación son el estudio de microorganismos residuales, la estimación de poblaciones por mililitro y la identificación de las distintas especies presentes en las muestras de vino. Se pretende conocer la estabilidad de los vinos. Estas poblaciones pueden ser el origen de enfermedades y alteraciones de los vinos, por tanto es importante conocer las especies y la población viable de cada grupo de microorganismos. 17 MATERIALES
Y
MÉTODOS
18 2.
MATERIALESYMÉTODOS
2.1. Equipodelaboratorioempleado
Mechero de Bunsen, autoclave, estufa, agitador, balanza precisión, balanza analítica, microscopio. 2.2. Materiales
Ernlenmeyer 100‐250 ml, matraz Quitasato, frascos Pyrex 250‐500 ml, trompa de vacío, embudo de Buchner, tubos de ensayo, tapones para los tubos de ensayo, vidrios de reloj, espátulas, pipetas de distintos volúmenes, asa Drigalsky, micropipeta y puntas de 100 µl, placas Petri, aspirapipetas, porta y cubreobjetos, cuentagotas, membranas para filtrado 0.45 µm, algodón, papel de aluminio, papel de estraza, esparadrapo de papel, manopla resistente al calor, rotulador permanente, asa de siembra y alcohol 96º. 2.3. Reactivos
La casa comercial Panreac proporcionó: Etanol, peptona, glucosa, verde de bromocresol, cloranfenicol, extracto de carne, agar y tween‐80. El ácido p‐cumárico, el dipotasio hidrógeno‐fosfato, el diamonio, el acetato de sódio, el sulfato de magnésio, sulfato de manganeso y el D‐Manitol. La empresa Difco suministró los siguientes reactivos: Yeast Nitrogen Base (YNB) y extracto de levadura. Y la empresa Oxoid, cicloheximida. 2.4. Muestrasdevino
Se realizaron varios ensayos de un total de 4 muestras de vino tinto con crianza. Las bodegas que proporcionaron los vinos pertenecen a la región de Tràs‐os‐montes (Portugal). Se trata de pequeñas cooperativas o bodegas familiares de la zona de Bragança. Estos vinos han salido al mercado recientemente o que serán puestos a la venta en un corto periodo de tiempo. Serán comercializados en botella bordelesa de ¾ de color verde musgo. Las muestras analizadas fueron denominadas muestra 1 (M1), muestra 2 (M2), muestra 3 (M3), muestra 4 (M4). 19 2.5. Métodos
Se llevó a cabo la siembra del cultivo, posterior recuento de colonias, aislamiento de los diferentes microorganismos e identificación. Se emplearon distintos métodos para la detección, cuantificación e identificación de microorganismos residuales. Para detectar la presencia/ausencia de los mismos se utilizaron medios de cultivo líquidos, con diluciones seriadas. El recuento se llevo a cabo en placa, en medios sólidos específicos para cada tipo de microorganismo. La identificación se realizó de forma morfológica y fisiológica. 2.5.1. Preparacióndelasmuestras
Para preparar las muestras de vino se filtraron 20 ml de cada una de las muestras M1, M2, M3 y M4 a través de membranas de 0.45 µm. Se utilizó filtración al vacío con el material previamente esterilizado, todo el proceso se realizó junto a un mechero Bunsen para mantener estéril el perímetro de trabajo. Una vez filtradas las muestras, se colocaron en Erlenmeyer esterilizados, tapados con algodón y papel de aluminio para evitar contaminaciones. 2.5.2. Preparacióndelosmediosdecultivo
Para preparar los diferentes medios de cultivo (Tabla 2.1.) se pesaron los reactivos necesarios en las balanzas. Se disolvieron en agua destilada y se colocaron en los frascos Pyrex para su esterilización dejando la rosca un poco floja para evitar la sobrepresión al entrar en ebullición. Las placas se envolvieron en papel de estraza, los tubos de ensayo se colocaron en gradillas y las pipetas se introdujeron en un estuche metálico. Se introdujo todo el material en el autoclave para llevar a cabo la esterilización. Se empleó la técnica empleada fue la esterilización por calor húmedo, que destruye todas las formas de vida microbiana, tanto la forma vegetativa como las esporas. El tratamiento con vapor de agua es muy efectivo, a 120º C durante 15‐20 min elimina incluso las endosporas más resistentes. Una vez terminado el tratamiento de esterilización, se distribuyeron los medios de cultivo con agar en las placas para que solidifique. En los tubos de ensayo se distribuyeron 9 ml de los medios líquidos. Cuando la temperatura descendió a temperatura ambiente, se introdujo los medios de cultivo en el refrigerador hasta su utilización. Aquellos medios que precisen etanol, éste se incorporó en el momento de utilizarlo, evitando así su evaporación durante la esterilización. 20 Tabla 2.1. Composición de los medios. MEDIO DE CULTIVO Dekkera Diferential Medium (DDM) 
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Wickerham Yeast Extract Peptone Dextrose (YEPD) Man Rogosa Sharpe (MRS) CARR Agar Manitol COMPOSICIÓN YNB 0,67 % (p/v) Cicloheximida 10 ppm Etanol 6 % (p/v) Verde de bromocresol 22 ppm Ácido p‐cumárico 100 ppm Agua destilada Agar 2% (p/v) 
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Peptona 1% (p/v) Extracto de levadura 0,5% (p/v) Glucosa 1% (p/v) Agua destilada Agar 2% (p/v) 
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Extracto de levadura 1% (p/v) Peptona 2% (p/v) Glucosa 2% (p/v) Cloranfenicol 0,05% (p/v) Agua destilada Agar 2% (p/v) Extracto de carne 0,8% (p/v) Extracto de levadura 0,4% (p/v) Peptona 1% (p/v) Glucosa 2% (p/v) Dipotasio hidrógeno‐fosfato 0,2% (p/v) Tween‐80 0,1% (p/v) Diamonio 0,2% (p/v) Acetato de sódio 0,5% (p/v) Sulfato de magnésio 0,02% (p/v) Sulfato de manganeso 40 ppm (p/v) Agua destilada Agar 1,4% (p/v) 
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Extracto de levadura 3% (p/v) Cicloheximida 50ppm (p/v) Verde de bromocresol (2,2%) 1 ppm Etanol 2% (v/v) Agua destilada Agar 2% (p/v) 
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D‐Manitol 2,5% (p/v) Extracto de levadura 0,5% (p/v) Peptona 0,3% (p/v) Agua destilada Agar 1,5% (p/v) Para la preparación de medios sólidos se adicionó agar al 20 % como endurecedor. 21 2.5.3. Siembra,recuentoyaislamientodecolonias.
Habitualmente las muestras que se estudian contienen poblaciones muy elevadas de microorganismos y es necesario diluirlas para poder realizar el recuento. Los bancos de diluciones y la posterior siembra en placas con medios de cultivos son muy frecuentes. Esta técnica nos va a permitir conocer el número de microorganismos viables que hay en la muestra. Los microorganismos viables son aquellos que tienen capacidad para multiplicarse en medios de cultivos solidificados y formar colonias. Métodos de las diluciones sucesivas Se llenan los tubos de ensayo con 9 ml de agua destilada. Se toma 1 ml de la muestra problema y se añade a uno de los tubos, se agita el tubo para homogeneizar. Este tubo presenta una concentración 10 veces menor que la muestra inicial, concentración 10‐1. Se repite la operación a partir de esta dilución para conseguir la dilución 10‐2 y así de forma sucesiva. A partir de las diluciones obtenidas sembramos las placas, la cantidad de inóculo que se debe sembrar vendrá dada por el tipo de microorganismo que se quiera estudiar. Figura 2.1. Diluciones para recuento de microorganismos. Microbiology Mc. Graw Hill. 2.5.4. Siembrademicroorganismosenlosmediosdecultivo
Según el tipo de estudio a realizar, el tipo de siembra que se debe realizar será diferente. 22 
Siembra de medios líquidos Se colocan 9 ml del medio líquido en un tubo de ensayo, se añade 1 ml de inóculo y se agita con ayuda del agitador para homogeneizar los microorganismos en todo el medio. Esta siembra es común a los distintos tipos de microorganismos objeto de estudio. 
Siembra por versación Se coloca 1 ml del inoculo en una placa Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo fundido, se mueve la placa cuidadosamente en distintas direcciones y realizando semicírculos para garantizar la distribución homogénea de los microorganismos en el medio y se deja solidificar. Se utiliza para microorganismos anaerobios (bacterias lácticas). 
Siembra en superficie Se vierte sobre la placa Petri el medio de cultivo fundido y se deja solidificar, una vez sólido se añade 100 µl de inóculo y se extiende por la superficie con ayuda de un asa Drigalsky. Se utiliza para microorganismos aerobios (levaduras y bacterias acéticas). 2.5.5. Procedimiento para la determinación
microorganismosyproduccióndeacidez
de
presencia
de
Para la determinación de presencia de microorganismos se emplearon medios de cultivo líquidos, analizando la turbidez de los mismos en el caso de los medios YEPD, CARR, MRS y Manitol como consecuencia del crecimiento de microorganismos y el cambio de coloración en el caso de los medios DDM y Wickerham debido a la producción de ácido. 2.5.6. Recuentodemicroorganismosyestimacióndepoblación
Tras el periodo de incubación de las placas, se seleccionan aquellas que poseen entre 30 y 300 colonias aproximadamente del microorganismo que se quiere estudiar, puesto que nos proporciona la precisión estadística necesaria. Las placas que tengan un número inferior a 30 colonias no se tendrán en cuenta ya que el margen de error estadístico es bastante elevado, por encima de 300 colonias es muy común el solapamiento de las mismas y el recuento tampoco sería correcto. Aquellas colonias que se encuentren presentes en un número reducido serán útiles para la identificación del microorganismo pero no para el recuento. Para estimar la población se calculan el número de unidades formadoras de colonias por ml de muestra (UFC/ml) se calcula: 23 UFC/ml = 2.5.7. Aislamientodemicroorganismos
Cada microorganismo se aisló en una placa diferente para garantizar el cultivo puro del mismo. El criterio seguido para el aislamiento fue el aspecto de la colonia, de cada muestra se tomaron 6 cepas de levaduras y 6 cepas de bacterias. Se incubaron las placas para el crecimiento de microorganismos y después se conservaron en el refrigerador a una temperatura de 4º C aproximadamente. Para realizar los análisis de utilizaron cultivos jóvenes, en caso de haber necesitado una conservación a largo plazo pueden emplearse técnicas de congelación ó liofilización. 
Aislamiento en medios sólidos por siembra en estrías El aislamiento se realizó tomando con un asa de siembra 6 colonias de cada muestra en las placas de recuento y cada una se trasladó a una placa Petri. Se procedió a la siembra en superficie en estrías paralelas en un cuarto de superficie de la placa Petri, posteriormente se esterilizó el asa y se giró la placa 90º aproximadamente, se extendió en estrías nuevamente sobre otro cuarto de superficie tocando 3‐4 veces el área sembrada anteriormente cubriendo otro cuarto de la placa. Se repitió este proceso dos veces más, sin esterilizar el asa, hasta completar la siembra en toda la superficie de la placa. Ésta técnica Se utiliza para el aislamiento de todos los microorganismos objeto de estudio. 2.5.8. Técnicasparalaidentificacióndemicroorganismos
Para la identificación de microorganismos se utilizaron técnicas morfológicas y fisiológicas. Morfológicamente se analizó el aspecto visual macroscópico de la colonia: tamaño, color, brillo, contorno ó características especiales y microscópicamente el aspecto visual celular: forma de las células del cultivo joven. Para realizar la observación al microscopio hemos de colocar una gota de agua destilada sobre el portaobjetos, con ayuda del asa de siembra se coloca una pequeña cantidad del cultivo puro, dejándolo en suspensión en la gota de agua. Se coloca el cubreobjetos. El sistema de identificación empleado para las levaduras y bacterias se realizó empleando las galerías API, que están constituidas por una serie de cúpulas que contienen substratos deshidratados y permiten realizar ensayos de asimilación. Las cúpulas se inoculan con los microorganismos en estudio en un medio mínimo semi‐agar y solamente crecen si son capaces de utilizar el substrato correspondiente. Se realizó la lectura de estas reacciones por comparación con el testigo de crecimiento y la identificación se obtuvo con la ayuda del programa informático de identificación. 
Identificación de levaduras 24 Se empleó el Galería comercial Api 20 C AUX de Biomérieux (France). Está compuesto de una galería y un medio para realizar la suspensión del microorganismo. La galería posee 21 cúpulas, 19 de las cuales contienen carbohidratos deshidratados, un control y una última cúpula en la cual se puede observar la formación de micelio/paseudomicelio por parte del microorganismo añadiendo una gota de Tween 80. El medio está constituido por sulfato amónico, fosfato monopotásico, fosfato dipotásico, fosfato disódico, cloruro sódico, cloruro cálcico, sulfato magnésico, L‐Histidina, L‐Triptófano, L‐Metionina, agente gelificante, solución de vitaminas, solución de oligo‐elementos y agua desmineralizada. Para preparar el inóculo, esterilizamos tubos de ensayo con 5 ml de solución salina NaCl al 0,85%. Con ayuda de un asa de siembra se toma una muestra de la colonia y se disuelve en el tubo. Se transfieren 100 µl de esta suspensión al medio que proporciona el Galería. Para preparar la galería, se toma uno de los fondos de las cámaras de incubación y se reparte agua destilada en los pocillos, se coge una galería y se deposita en la cámara de incubación. Se llenan las cúpulas con la suspensión obtenida en el medio API 20 CAUX Medium, procurando que el líquido quede con un nivel ligeramente cóncavo y sin burbujas. Se cubre con la tapa y se lleva a la estufa donde permanece 24 h a 30º C, una vez transcurrido ese tiempo, se anotan como positivas las cúpulas que presenten más turbidez que la cúpula control. Se deben comprobar los resultados a las 72 h. Con los resultados positivos/ negativos se crea un perfil numérico de siete dígitos, el fabricante proporciona una base de datos y un catálogo analítico donde se comprueba a que levadura pertenece ese perfil. Tabla 2.2. Carbohidratos que componen la galería API 20 C AUX. Carbohidratos Galería API 20 C AUX Control D‐Glucosa Glycerol D‐ Sorbitol Metil‐αD‐
Glucopiranosa N‐Acetil‐ Glucosamina 2‐ceto‐
glucanato cálcico D‐
Cellobiosa L‐
Arabinosa D‐
Xylosa Adonitol Xylitol D‐
Galactosa Inositol D‐Lactosa D‐
Maltosa D‐
Sacarosa D‐
Trehalosa D‐
Melezitosa D‐
Rafinosa 
Identificación de bacterias Se empleó la galería comercial API 50 CHL de Biomérieux (France). Esta galería está compuesto por 5 galerías y un medio de suspensión. El aislamiento de los microorganismos para la utilización de la galería se ha de realizar sobre medio de cultivo MRS. La prueba se basa en el catabolismo de 49 azúcares/polialcoholes y un control. Los recipientes tienen una pequeña zona aerobia y otra anaerobia. La zona anaerobia tiene forma tubular que contiene los distintos sustratos y la zona aerobia tiene forma de cúpula. El medio está constituido por polipeptona, extracto de levadura, Tween 80, fosfato dipotásico, acetato sódico, citrato diamónico, sulfato de magnesio, sulfato de manganeso, púrpura de bromocresol, agua desmineralizada. 25 Para preparar el inóculo, se toman varias colonias hasta crear una suspensión en el medio API 50 CHL Medium. Se reparte esta suspensión en los tubos de las galerías y se recubre con aceite de parafina. Se incuban las galerías a 37º C durante 48 h. Se forman ácidos orgánicos que provocan el cambio de coloración de púrpura a amarillo, en el caso de la esculina el viraje se produce de púrpura a negro. Con los resultados obtenidos, se crea un perfil bioquímico que se comprobará en la base de datos ó catálogo analítico proporcionado por el fabricante. Tabla 2.3. Carbohidratos y polialcoholes que componen la galería API 50 CHL para identificación de bacterias. Carbohidratos y polialcoholes Galería API 50 CHL Control Metil‐αD‐
Manopiranosa D‐Melibiosa D‐Turanosa Glycerol Galactosa Glucosa Metil‐αD‐
Glucopiranosa D‐Zaharosa D‐Lyxosa Erythrol Fructosa N‐Acetilglucosamina D‐Trehalosa D‐Tagatosa D‐Arabinosa Amigdalina Inulina D‐Fucosa L‐Arabinosa Manosa Sorbosa Arbutina D‐Melezitosa L‐Fucosa Ribosa Rhamnosa Esculin D‐Rafinosa D‐Arabitol D‐Xylosa Dulcitol Salicin Almidón L‐Arabitol L‐Xylosa Inozitol Glycogen Gluconato de potasio Adonitol Manitol D‐Cellobiosa D‐Maltosa Xylitol 2‐Keto‐Gluconato Β‐Metil‐Xylosida Sorbitol D‐Lactosa Gentiobiosa 5‐Keto‐Gluconato 2.6.
Mediosdecultivo
Para la determinación de presencia y para el recuento de los microorganismos residuales se emplearon distintos tipos de medios de cultivo: medios selectivos y medios diferenciales. Los medios selectivos permiten el desarrollo de un determinado grupo de microorganismo e inhibe el crecimiento de los demás. Son selectivos los medios de cultivo Wickerham, Yeast Extract Peptone Dextrose (YEPD), Man Rogosa Sharpe (MRS), CARR y Agar Manitol. Los medios diferenciales permiten el desarrollo de una especie concreta de microorganismos dentro de una mezcla mediante caracteres diferenciales. El medio Dekkera Diferential Medium (DDM) es un medio de cultivo diferencial. La incubación para el tratamiento de levaduras es de 26 24‐48 h a una temperatura de 25º C y el periodo de incubación para el tratamiento de bacterias es de 24 h a 37º C. RESULTADOS
27 3. RESULTADOS
Los resultados que se presentan, son aquellos obtenidos tras realizar el cultivo de microorganismos en tubos y en placas en el momento de apertura de las botellas, es decir, del vino terminado (t = 0) y pasados dos meses (t = 40), la conservación de las botellas entre los ensayos se realizó en refrigeración a 4 ºC para tener control sobre la temperatura de las botellas. La presencia de oxígeno es un factor que influyó en el desarrollo de los microorganismos, ya que cuando se descorchó la botella se potenció la entrada de aire en el recipiente. Las botellas se conservaron en posición horizontal y se homogeneizaron antes de tomar las muestras. 3.1.
DeterminaciónAusencia/Presenciademicroorganismos
Para determinar la presencia de microorganismos se emplearon medios de cultivo líquidos. En los medios DDM y Wickerham se valoró el cambio de coloración de los medios debido a la producción de acidez y el cambio de pH, en el medio DDM el viraje se produce de azul a verde y en el medio Wickerham de dorado hacia transparente. En los medios CARR, Manitol, YEPD y MRS, se observó la turbidez que presentaban los tubos a causa del crecimiento de los microrganismos. En todos los casos los tubos permanecieron en la estufa 24 h, los tubos que contenían medios para el crecimiento de levaduras a 25º C y los tubos para el crecimiento de bacterias a 37º C. 3.1.1. Levaduras
En la Tabla 3.1. se muestra la turbidez que presentó el medio de cultivo en el vino terminado y a los dos meses, en la muestra M2 se observa un pequeño aumento en la turbidez a los dos meses respecto del inicio. En la Tabla 3.2. se muestra la producción de acidez en dos medios de cultivo distintos, en la mayoría de los casos la producción de acidez es más notable a los dos meses que en el vino terminado. Se trata de un medio selectivo (Wickerham) y de un medio diferencial (DDM) para el género Brettanomyces/Dekkeras. 28 Tabla 3.1. Determinación de la presencia de levaduras mediante turbidez en el medio YEPD líquido en los vinos terminados (t = 0) y a los dos meses (t = 40). PRUEBA TIEMPO (días) MUESTRAS Control C1 Crecimiento/ turbidez (Medio YEPD) 0 40 C2 M1 C3 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ M11 M12 M2 M13 +++ +++ + + +++ +++ + + M21 M22 M3 M23 + + + + + + + + + M31 M32 M4 M33 ++ ++ ++ ++ ++ ++ M41 M42 M43 +++ + + + + +++ + + + + Tabla 3.2. Determinación de la presencia de levaduras mediante producción de acidez en los medios DDM y Wickerham líquidos en los vinos terminados (t = 0) y a los dos meses (t = 40). PRUEBA TIEMPO (días) MUESTRAS Control C1 Producción de acidez (Medio DDM) Producción de acidez (Medio Wickerham) 0 40 0 40 C2 M1 C3 M11 M12 M2 M13 M21 M22 M3 M23 M31 M32 M4 M33 M41 M43 + + + + + + +++ +++ +++ + + + + + + + + + + + + +++ +++ +++ + + + + + + + + + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + + + + + + +++ +++ +++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 3.1.2. Bacterias
El crecimiento de bacterias lácticas fue bastante bajo en todos los casos y la turbidez no se vio afectada por el paso del tiempo. En la Tabla 3.3. se muestran los resultados obtenidos en el vino terminado y a los dos meses. Las bacterias acéticas no llegaron a desarrollarse en ningún caso, ni en los vinos terminados ni a los 40 días como se refleja en la Tabla 3.4. 29 M42 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 3.1.2.1.
Bacteriaslácticas
Tabla 3.3. Determinación de la presencia de bacterias lácticas mediante turbidez en medio MRS líquido. TIEMPO (días) PRUEBA MUESTRAS Control C1 Crecimiento/ turbidez (Medio MRS) 0 40 C2 M1 C3 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ M11 M12 M2 M13 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ M21 M22 M3 M23 + ‐ ‐ + ‐ ‐ M31 M32 M4 M33 M41 ++ + + ++ + + Bacteriasacéticas
No se produjo turbidez de bacterias acéticas en los medios de cultivos sembrados en ninguna de las muestras de vino, no encontrándose población residual de bacterias acéticas ni en los vinos terminados ni a los dos meses (t = 40). 3.2.
Recuentodemicroorganismosyestimacióndepoblación
El recuento de microorganismos se realizó una vez transcurrido el periodo de incubación en las placas Petri que desarrollaron entre 30 y 300 colonias aproximadamente. El cálculo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) se llevó a cabo en las muestras de vino una vez terminada la vinificación (t = 0) y a los cuarenta días (t = 40) empleando para las levaduras los medios selectivos Wickerham y YEPD y para las bacterias lácticas el medio selectivo MRS. 3.2.1. Levaduras
La Tabla 3.4. muestra los resultados obtenidos para el recuento de colonias y estimación de población de levaduras en los medios de cultivo Wickerham y YEPD. En todas las muestras se produce un aumento de la población a los dos meses de la apertura de las botellas. 30 M43 + ‐ ‐ + ‐ ‐ 3.1.2.2.
M42 Tabla 3.4. Recuento de colonias y población de levaduras residuales (células/ml) en las muestras de vino terminado (t = 0) y a los cuarenta días (t = 40). TIEMPO (días) MUESTRA Dilución Medio Wickerham 0 40 M1 M11 M2 M12 M13 M21 M3 M22 M23 M31 M4 M32 M33 M41 M42 M43 4 1 2 287 271 292 7 5 ‐ 105 104 98 5 8 1 307 315 300 54 40 13 203 209 184 0 * * * 3,5 x 10 40 2,8 x 10 1 x 10 3,1 x 10 6 x 10 174 167 182 258 235 248 59 62 67 79 99 84 9 4 2 100 105 142 101 110 97 94 107 122 4
* 1 x 10 5
1,2 x 10 ‐2 10
‐2
10 4
UFC (cels/ml) Medio YEPD 0 40 5
‐2
10 ‐2
10 5
6,2 x 10 5
2,6 x 10 0 1,7 x 10 40 2,5 x 10 UFC (cels/ml) 5
5
5
5
5
5
1,1 x 10 *: La estimación de población residual de levaduras por ml presente en esta muestra es inferior a 103 células /ml. 3.2.2. Bacterias
En la Tabla 3.5. se muestra el recuento de colonias y la estimación de población residual de bacterias lácticas. Únicamente se realizó la estimación en la muestra M3, ya que en los otros casos el recuento de colonias fue muy bajo. La población incrementó ligeramente a los dos meses de apertura de las botellas. 31 Tabla 3.5. Recuento de colonias y población de bacterias lácticas residuales (células/ml) en las muestras de vino tinto terminado (t = 0) y a los cuarenta días (t = 40). TIEMPO (días) MUESTRA Dilución 0 40 Medio MRS M1 M11 M12 M2 M13 M21 M22 M3 M23 M31 M4 M32 M33 1 ‐ 7 ‐ 3 6 10 6 7 14 6 8 37 44 41 38 46 42 0 * * 4 x 10
40 * * 4 x 10 ‐1 10
‐1
10 M41 M42 3 3 5 3 5 6 2 * 2
* UFC (cels/ml) *: La estimación de población residual de bacterias por ml presente en esta muestra es inferior a 102 células /ml. 3.3. Identificacióndemicroorganismos
La identificación de microorganismos se realizó tras el aislamiento y el periodo de incubación de las colonias obtenidas en las placas con medios sólidos. Se aislaron un total de 24 levaduras (6 levaduras/muestra) y 24 bacterias lácticas (6 bacterias lácticas/muestra) de las muestras de vino terminado y el mismo número de ellas a tiempo 40 días. 3.3.1. Identificaciónfisiológicadelevaduras
En las Tablas 3.6. y 3.7. se muestra el diagnóstico de levaduras aisladas en las muestras de vino terminado y a los dos meses de apertura de las botellas. Se realizaron pruebas de asimilación de carbohidratos para poder realizar el diagnóstico. Se identificaron los géneros Rhodotorula, Candida, Saccharomyces y Brettanomyces/Dekkeras aunque no se diagnosticaron las mismas especies en los vinos terminados y a los dos meses. 32 M43 Tabla 3.6. Diagnóstico de las cepas de levaduras aisladas en las muestras de vino terminado (t = 0). 3 PRUEBA DE ASIMILACIÓN DE CARBOHIDRATOS Número de Cepas 1 3 4 Substrato 13 Control D‐Glucosa Glycerol 2‐ceto‐ gluconato cálcico L‐Arabinosa ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐ +/‐ ‐ +/‐ +/‐ ‐ + +/‐ +/‐ + ‐ + + ‐ ‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ D‐Xylosa Adonitol Xylitol D‐Galactosa Inositol D‐Sorbitol Metil‐αD‐Glucopiranosida N‐Acetil‐Glucosamina D‐Cellobiosa D‐Lactosa D‐Maltosa D‐Sacarosa D‐Trehalosa D‐Melezitosa D‐Rafinosa DIAGNÓSTICO ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ +/‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Candida krusei +/‐ + ‐ + +/‐ + +/‐ ‐ +/‐ +/‐ +/‐ + +/‐ +/‐ ‐ Rhodotorula glutinis + +/‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Rhodotorula mucilaginosa + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + + + + + + + + + Candida tropicalis ‐ ‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + + ‐ ‐ + Saccharomyces cerevisiae 33 Tabla 3.7. Diagnóstico de las cepas de levaduras aisladas en las muestras de vino a los 2 meses (t = 40). 15 PRUEBA DE ASIMILACIÓN DE CARBOHIDRATOS Número de cepas 1 3 1 4 Substrato Control D‐Glucosa Glycerol 2‐ceto‐ gluconato cálcico ‐ + +/‐ +/‐ ‐ +/‐ ‐ +/‐ ‐ + +/‐ +/‐ ‐ + + ‐ ‐ + ‐ ‐ L‐Arabinosa D‐Xylosa Adonitol Xylitol D‐Galactosa Inositol D‐Sorbitol Metil‐αD‐Glucopiranosida N‐Acetil‐Glucosamina D‐Cellobiosa D‐Lactosa D‐Maltosa D‐Sacarosa D‐Trehalosa D‐Melezitosa D‐Rafinosa DIAGNÓSTICO +/‐ ‐ +/‐ +/‐ +/‐ ‐ +/‐ +/‐ +/‐ ‐ +/‐ +/‐ +/‐ +/‐ +/‐ No Identificado +/‐ +/‐ + ‐ + +/‐ + +/‐ ‐ +/‐ +/‐ +/‐ + +/‐ +/‐ ‐ Rhodotorula glutinis + + +/‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Rhodotorula mucilaginosa ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + + + + + + + + + Candida tropicalis ‐ ‐ ‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + + ‐ ‐ + Saccharomyces cerevisiae Algunas cepas de levaduras no pudieron ser identificadas ya que la asimilación de carbohidratos era muy variable y el software del fabricante no proporcionó un diagnóstico concreto fiable. Se diagnosticaron como pertenecientes al género Brettanomyces/ Dekkeras por discriminación olfativa y por el periodo de incubación. Es muy característico de este género el olor a cuero, a sudor de caballo, a establo y el periodo de incubación fue de 7‐8 días. La especie Pichia guilliermondii es capaz de desarrollarse en el mismo medio de cultivo que Brettanomyces/Dekkeras, para diferenciarlos se debe tener en cuenta el periodo de incubación. En el caso de Pichia guilliermondii las primeras colonias se observan a los 2‐3 días y en el caso del género Brettanomyces/Dekkeras el periodo de incubación es de 6‐7 días ó incluso superior (Millet and Lonvaud‐Funel, 2000; Rodrigues et al. 2001). 34 3.3.2. Especies de levaduras y población total para las muestras de vino
terminado.
En las siguientes tablas se muestran las especies de levaduras que se aislaron en las distintas muestras de vino terminado. Saccharomyces cerevisiae fue la especie con mayor presencia en todas las muestras. Tabla 3.8. Especies aisladas y población de levaduras de la muestra M1 de vino tinto terminado. Caracteres morfológicos Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Aspecto de la colonia Forma celular Especie M10 L1 Color blanco cremoso, brillante, lisa, bordes irregulares Esférica‐subesférica Candida krusei M10 L2 Color blanco, brillante, convexa, forma regular Alargada, globosa Saccharomyces cerevisiae M10 L3 Color blanco, brillante, superficie lisa, bordes regulares Esférica‐subesférica Candida krusei M10 L4 Color blanco, lisa, regular y brillante Alargada, elíptica Saccharomyces cerevisiae M10 L5 Color blanco brillante, lisas, bordes regulares Alargada, elíptica Saccharomyces cerevisiae Globosa y alargada Saccharomyces cerevisiae Muestra Cepas M10 Color blancas, aspecto M10 L6 húmedo, brillante, bordes muy regulares Población total de la muestra: 1,7 x 105 céls/ml 35 Tabla 3.9. Especies aisladas y población de levaduras de la muestra M2 de vino tinto terminado. Caracteres morfológicos Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Muestra Cepas Aspecto de la colonia Forma celular Especie M20 L1 Color blancas, aspecto húmedo, brillante, bordes muy regulares Esférica‐alargada Rhodotorula mucilaginosa Color rosado, rugosa y húmeda Esférica‐alargada Rhodotorula mucilaginosa Color coral y aspecto rugoso Globosa y alargada Saccharomyces cerevisiae Color blancas, aspecto húmedo, brillante, bordes muy regulares Alargada, globosa Saccharomyces cerevisiae Color blanco, brillante, convexa, bordes regulares Alargada y globosa Saccharomyces cerevisiae Color blanco, brillante, convexa, forma regular Alargada, elíptica Saccharomyces cerevisiae M20 L2 M20 L3 M20 M20 L4 M20 L5 M20 L6 Población total de la muestra: 6,2 x 104 céls/ml 36 Tabla 3.10. Especies aisladas y población de levaduras de la muestra M3 de vino tinto terminado. Caracteres morfológicos Muestra Cepas M30 L1 Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Aspecto de la colonia Forma celular Especie Color rosado, rugosa y húmeda Esférica‐alargada Rhodotorula mucilaginosa Ovoide, globosa Rhodotorula glutinis M30 L2 Color anaranjado, aspecto graso, satinada, bordes irregulares M30 L3 M30 M30 L4 M30 L5 M30 L6 Color blanco cremoso, brillante, lisa, bordes irregulares Esférica‐ subesférica Color blanco brillante, lisas, bordes regulares Alargada, elíptica Color blanco‐crema, brillantes, con bordes irregulares Esférica‐subesférica Color blanco, brillante, convexa, forma regular Alargada, globosa Candida krusei Saccharomyces cerevisiae Candida tropicalis Saccharomyces cerevisiae Población total de la muestra: 1,3 x 105 céls/ml 37 Tabla 3.11. Especies aisladas y población de levaduras de la muestra M4 de vino tinto terminado. Caracteres morfológicos Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Muestra Cepas Aspecto de la colonia Forma celular Especie M40 L1 Color blanco, brillantes, con bordes irregulares Esférica‐subesférica Candida tropicalis Color blanco, aspecto húmedo, brillante, bordes muy regulares Globosa y alargada Saccharomyces cerevisiae Color y aspecto cremoso, superficie lisa, con bordes irregulares Esférica‐subesférica Candida tropicalis Color crema, aspecto graso, contorno irregular Esférica‐subesférica Candida tropicalis Color blanco, brillante, convexa, forma regular Alargada, globosa Saccharomyces cerevisiae Color blanco brillante, lisas, bordes regulares Alargada, elíptica Saccharomyces cerevisiae M40 L2 M40 L3 M40 M40 L4 M40 L5 M40 L6 Población total de la muestra: 3,5 x 104 céls/ml 38 3.3.3. Especies de levaduras y población total para las muestras de vino
alosdosmeses(t=40).
A continuación se muestran las especies de levaduras que se aislaron en las distintas muestras de vino transcurridos dos meses desde la apertura de las botellas. El género Brettanomyces/Dekkeras el más aislado a los dos meses en todas las muestras. Tabla 3.12. Especies aisladas y población de levaduras de la muestra M1 de vino tinto a los dos meses (t = 40). Caracteres morfológicos Muestra Cepas M140 L1 M140 L2 M140 L3 M140 M140 L4 M140 L5 M140 L6 Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Aspecto de la colonia Forma celular Especie Color blanco, de pequeño tamaño, convexa Ojival Brettanomyces/Dekkeras Color cremoso‐blanco, diámetro pequeño, brillante Cilíndrica Brettanomyces/Dekkeras Color crema, brillante, de bordes regulares Cilíndrica Brettanomyces/Dekkeras Color blanco marfil, brillante, contorno regular Alargada, elíptica Saccharomyces cerevisiae Color cremoso, aspecto brillante, tamaño pequeño Ojival Brettanomyces/Dekkeras Color blanco, convexa, brillante Ojival Brettanomyces/Dekkeras Población total de la muestra: 5,3 x 105 céls/ml 39 Tabla 3.13. Especies aisladas y población de levaduras de la muestra M2 de vino tinto a los dos meses (t = 40). Caracteres morfológicos Muestra Cepas M240 L1 M240 L2 M240 L3 M240 M240 L4 M240 L5 M240 L6 Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Aspecto de la colonia Forma celular Especie Color blanco marfil, brillante, aspecto húmedo, bordes regulares Globosa Saccharomyces cerevisiae Color blanco, convexa, brillante Ojival Brettanomyces/Dekkeras Color rosado, rugosa, aspecto húmedo Esférica Rhodotorula mucilaginosa Color cremoso, aspecto húmedo, de pequeño tamaño Cilíndrica Brettanomyces/Dekkeras Color blanco‐crema, convexa, contorno regular Ojival‐cilíndrica Brettanomyces/Dekkeras Color coral, rugosa, bordes regulares Alargada Rhodotorula mucilaginosa Población total de la muestra: 3,6 x 105 céls/ml 40 Tabla 3.14. Especies aisladas y población de levaduras de la muestra M3 de vino tinto a los dos meses (t= 40). Caracteres morfológicos Muestra Cepas M340 L1 M340 L2 M340 L3 M340 M340 L4 M340 L5 M340 L6 Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Aspecto de la colonia Forma celular Especie Color blanquecino, convexa, contorno regular Ojival Brettanomyces/Dekkeras Color rosa coral, aspecto húmedo, bordes poco irregulares Alargada Rhodotorula mucilaginosa Color blanco marfil, brillante, lisa, convexa, regular Alargada Saccharomyces cerevisiae Color crema, compacta, convexa, regular Esférica Brettanomyces/Dekkeras Color anaranjado, estriada, aspecto graso, perímetro irregular Ovoide Rhodotorula glutinis Color crema, pequeña, brillante, bordes regulares Ovoide Brettanomyces/Dekkeras Población total de la muestra: 4,3 x 105 céls/ml 41 Tabla 3.15. Especies aisladas y población de levaduras de la muestra M4 de vino tinto a los dos meses (t = 40). Caracteres morfológicos Muestra Cepas M440 L1 M440 L2 M440 L3 M440 M440 L4 M440 L5 M440 L6 Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Aspecto de la colonia Forma celular Especie Color crema, compacta, brillante, bordes regulares Ojival Brettanomyces/Dekkeras Color blanco‐crema, pequeña, convexa, regular Ovoide Brettanomyces/Dekkeras Color blanco, aspecto brillante, contorno regular Cilíndrica Brettanomyces/Dekkeras Color cremoso, de pequeño tamaño, compacta, circular Cilíndrica Brettanomyces/Dekkeras Color blanco, brillante, lisa, perímetro regular Alargada Saccharomyces cerevisiae Color crema, convexa, brillante, grasa, bordes irregulares Esférica‐subesférica Candida tropicalis Población total de la muestra: 7,1 x 105 céls/ml 3.3.4. Identificaciónfisiológicadebacteriaslácticas
En las Tablas 3.16. y 3.17. se muestra el diagnóstico de las bacterias lácticas aisladas en las muestras de vino terminado y a los dos meses. Se realizaron pruebas de asimilación de carbohidratos y polialcoholes para realizar el diagnóstico. Se identificaron los géneros Lactobacillus y Oenococcus, se diagnosticaron las mismas especies en los vinos terminados y transcurridos dos meses desde la apertura de las botellas. 42 Tabla 3.16. Diagnóstico de las cepas de bacterias lácticas aisladas en las muestras de vino terminado (t = 0). Substrato Prueba de asimilación Substrato (cont.) Prueba de asimilación (cont.) Control Glycerol Erythrol D‐Arabinosa L‐arabinosa Ribosa D‐Xylosa L‐Xylosa Adonitol B‐Metil‐Xylosida Galactosa Glucosa Fructosa Manosa Sorbosa Rhamnosa Dulcitol Inozitol Manitol Sorbitol Metil‐αD‐
Manopiranos Metil‐αD‐
Glucopiranosa N‐Acetilglucosamina ‐ ‐ ‐ + ‐ ‐ + ‐ ‐ ‐ + + + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + + ‐ ‐ ‐ ‐ + + + + ‐ ‐ ‐ ‐ + + + Esculin Salacin D‐Cellobiosa D‐Maltosa D‐Lactosa D‐Melibiosa D‐Zarahosa D‐Trehalosa Inulina D‐Melezitosa D‐Rafinosa Almidón Glycogen Xylitol Gentiobiosa D‐Turanosa D‐Lyxosa D‐Tagatosa D‐Fucosa L‐Fucosa D‐Arabitol + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + + + + + + + + ‐ + + ‐ ‐ ‐ + + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ L‐Arabitol ‐ ‐ ‐ + ‐ +/‐ Amigdalina ‐ + ‐ ‐ Arbutina ‐ + Gluconato de potasio 2‐Keto‐
Glucanato 5‐Keto‐
Glucanato DIAGNÓSTICO ‐ ‐ Oenococcus oeni Lactobacillus plantarum Número de Cepas 11 13 43 Tabla 3.17. Diagnóstico de las cepas de bacterias lácticas aisladas en las muestras de vino a los dos meses (t = 40). Substrato Control Glycerol Erythrol D‐Arabinosa L‐arabinosa Ribosa D‐Xylosa L‐Xylosa Adonitol B‐Metil‐Xylosida Galactosa Glucosa Fructosa Manosa Sorbosa Rhamnosa Dulcitol Inozitol Manitol Sorbitol Metil‐αD‐
Manopiranos Metil‐αD‐
Glucopiranosa N‐Acetilglucosamina Prueba de asimilación Substrato (cont.) Prueba de asimilación (cont.) ‐ ‐ Esculin + + ‐ ‐ Salacin ‐ + ‐ ‐ D‐Cellobiosa ‐ + + ‐ D‐Maltosa ‐ + ‐ + D‐Lactosa ‐ + ‐ + D‐Melibiosa ‐ + + ‐ D‐Zarahosa ‐ + ‐ ‐ D‐Trehalosa ‐ + ‐ ‐ Inulina ‐ ‐ ‐ ‐ D‐Melezitosa ‐ + + + D‐Rafinosa ‐ + + + Almidón ‐ ‐ + + Glycogen ‐ ‐ ‐ + Xylitol ‐ ‐ ‐ ‐ Gentiobiosa ‐ + ‐ ‐ D‐Turanosa ‐ + ‐ ‐ D‐Lyxosa ‐ ‐ ‐ ‐ D‐Tagatosa ‐ ‐ ‐ + D‐Fucosa ‐ ‐ ‐ + L‐Fucosa ‐ ‐ ‐ + D‐Arabitol ‐ ‐ ‐ ‐ L‐Arabitol ‐ ‐ ‐ + ‐ +/‐ Amigdalina ‐ + ‐ ‐ Arbutina ‐ + Gluconato de potasio 2‐Keto‐
Glucanato 5‐Keto‐
Glucanato DIAGNÓSTICO ‐ ‐ Oenococcus oeni Lactobacillus plantarum Número de Cepas 9 15 44 3.3.5. Especiesdebacteriaslácticasypoblacióntotalparalasmuestrasde
vinoterminado.
En las siguientes tablas se muestran las especies de bacterias lácticas aisladas en las muestras de vino terminado. Tabla 3.18. Especies aisladas y población de bacterias lácticas de la muestra M1 de vino tinto terminado. Caracteres morfológicos Muestra Cepas M10 B1 M10 B2
M10 B3
M10 M10 B4
M10 B5
M10 B6
Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Aspecto de la colonia Forma celular Especie Color blanco, circular, opaca, lisa, irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color blanco, lisa, redondeada Coco‐bacilo Oenococcus oeni Color grisáceo, pequeña, lisa, contorno redondeado Coco Oenococcus oeni Color blanco‐amarillo, convexa, forma alargada e irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color marfil, lisa, de pequeño tamaño, bordes regulares Coco Oenococcus oeni Color blanco, forma circular, opaca, convexa, bordes irregulares Bacilo Lactobacillus plantarum Población total de la muestra: < 102 céls/ml 45 Tabla 3.19. Especies aisladas y población de bacterias lácticas de la muestra M2 de vino tinto terminado. Caracteres morfológicos Muestra Cepas M20 B1 M20 B2
M20 B3
M20 M20 B4
M20 B5
M20 B6 Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Aspecto de la colonia Forma celular Especie Color grisáceo, lisa y redondeada Coco Oenococcus oeni Color blanco marfil, pequeña, bordes regulares Coco Oenococcus oeni Color blanco, lisa, brillante, regular Coco Oenococcus oeni Color blanco, lisa, pequeña, bordes regulares Coco‐bacilo Oenococcus oeni Color blanco‐amarillo, opaca, convexa, irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color blanco‐grisáceo, pequeña, brillante, contorno regular Coco Oenococcus oeni Población total de la muestra: < 102 céls/ml 46 Tabla 3.20. Especies aisladas y población de bacterias lácticas de la muestra M3 de vino tinto terminado. Caracteres morfológicos Muestra Cepas M30 B1 M30 B2
M30 B3
M30 M30 B4
M30 B5
M30 B6 Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Aspecto de la colonia Forma celular Especie Color amarillo suave, convexa, lisa, irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color blanco, aspecto suave y brillante, circular Bacilo Lactobacillus plantarum Color blanco‐grisáceo, pequeña, regular Coco Oenococcus oeni Color blanco, lisa, redondeada Coco Oenococcus oeni Color vainilla, convexa, opaca, alargada e irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color marfil, pequeña y redondeada Coco Oenococcus oeni Población total de la muestra: 4 x 102 céls/ml 47 Tabla 3.21. Especies aisladas y población de bacterias lácticas de la muestra M4 de vino tinto terminado. Caracteres morfológicos Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Muestra Cepas Aspecto de la colonia Forma celular Especie M40 B1 Color crema, aspecto suave, opaca, lisa, circular e irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color blanco grisáceo, lisa, regular Coco Oenococcus oeni Color blanco, convexa, alargada, bordes irregulares Bacilo Lactobacillus plantarum Color blanco marfil, brillante, lisa, contorno regular Coco Oenococcus oeni Color amarillo suave, opaca, alargada, contorno irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color blanco, aspecto suave, lisa, convexa, bordes irregulares Bacilo Lactobacillus plantarum M40 B2
M40 B3
M40 M40 B4
M40 B5
M40 B6 Población total de la muestra: < 102 céls/ml 48 3.3.3.Especiesdebacteriaslácticasypoblacióntotalparalasmuestras
devinoalosdosmeses(t=40).
En las tablas que se presentan a continuación se muestran las especies de bacterias lácticas aisladas en las muestras de vino a los dos meses. Tabla 3.22. Especies aisladas y población de bacterias lácticas de la muestra M1 de vino tinto a los dos meses (t = 40). Caracteres morfológicos Muestra Cepas M140 B1 M140 B2 M140 B3 M140 M140 B4 M140 B5 M140 B6 Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Aspecto de la colonia Forma celular Especie Color crema, aspecto suave, opaca, lisa, circular e irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color blanco, aspecto suave y brillante, circular Bacilo Lactobacillus plantarum Color marfil, pequeña y redondeada Coco Oenococcus oeni Color blanco, lisa, redondeada Coco Oenococcus oeni Color blanco‐amarillo, convexa, forma alargada e irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color blanco, forma circular, opaca, convexa, bordes irregulares Bacilo Lactobacillus plantarum Población total de la muestra: < 102 céls/ml 49 Tabla 3.23. Especies aisladas y población de bacterias lácticas de la muestra M2 de vino tinto a los dos meses (t = 40). Caracteres morfológicos Muestra Cepas M240 B1 M240 B2 M240 B3 M240 Macroscópico Microscópico Diagnóstico Aspecto de la colonia Forma celular Especie Color blanco‐amarillo, opaca, convexa, irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color amarillo suave, opaca, alargada, contorno irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color blanco, circular, opaca, lisa, irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Coco Oenococcus oeni Color amarillo suave, convexa, lisa, irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color grisáceo, pequeña, lisa, contorno redondeado Coco Oenococcus oeni M240 B4 Color blanco grisáceo, lisa, regular M240 B5 M240 B6 Caracteres fisiológicos Población total de la muestra: < 102 céls/ml 50 Tabla 3.24. Especies aisladas y población de bacterias lácticas de la muestra M3 de vino tinto a los dos meses (t= 40). Caracteres morfológicos Muestra Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Cepas Aspecto de la colonia Forma celular Especie M340 B1 Color blanco marfil, brillante, lisa, contorno regular Coco Oenococcus oeni Color blanco‐amarillo, convexa, forma alargada e irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color blanco, forma circular, opaca, convexa, bordes irregulares Coco‐bacilo Lactobacillus plantarum Color blanco‐grisáceo, pequeña, regular Coco Oenococcus oeni Color blanco, aspecto suave y brillante, circular Coco Oenococcus oeni Color blanco, lisa, redondeada Coco Oenococcus oeni M340 B2 M340 B3 M340 M340 B4 M340 B5 M340 B6 Población total de la muestra: 4 x 102 céls/ml 51 Tabla 3.25. Especies aisladas y población de bacterias lácticas de la muestra M4 de vino tinto a los dos meses (t = 40). Caracteres morfológicos Muestra Cepas M440 B1 M440 B2 M440 B3 M440 M440 B4 M440 B5 M440 B6 Caracteres fisiológicos Macroscópico Microscópico Diagnóstico Aspecto de la colonia Forma celular Especie Color blanco, aspecto suave, opaca, alargada e irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color grisáceo, brillante, lisa, redondeada Coco Oenococcus oeni Color vainilla, lisa, forma circular, irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color amarillo suave, convexa, opaca, irregular Bacilo Lactobacillus plantarum Color crema, sin brillo, alargada, bordes irregulares Bacilo Lactobacillus plantarum Color blanco, lisa, redondeada, bordes regulares Coco Oenococcus oeni Población total de la muestra: < 102 céls/ml 52 Tabla 3.26. Microorganismos residuales presentes en las muestras de vinos analizadas. Muestra Tiempo (días) M1 Microorganismos presentes Levaduras Saccharomyces cerevisiae Candida krusei Saccharomyces cerevisiae Brettanomyces/Dekkeras Candida krusei 0 40 0 M2 40 Bacterias Oenococcus oeni Lactobacillus plantarum Oenococcus oeni Lactobacillus plantarum Saccharomyces cerevisiae Rhodotorula mucilaginosa Saccharomyces cerevisiae Rhodotorula mucilaginosa Brettanomyces/Dekkeras Oenococcus oeni Lactobacillus plantarum Oenococcus oeni Lactobacillus plantarum M3 M4 Saccharomyces cerevisiae Rhodotorula mucilaginosa Rhodotorula glutinis Candida tropicalis Candida krusei 0 40 0 40 Saccharomyces cerevisiae Rhodotorula mucilaginosa Rhodotorula glutinis Brettanomyces/Dekkeras Saccharomyces cerevisiae Candida tropicalis Saccharomyces cerevisiae Candida tropicalis Brettanomyces/Dekkeras Oenococcus oeni Lactobacillus plantarum Oenococcus oeni Lactobacillus plantarum Oenococcus oeni Lactobacillus plantarum Oenococcus oeni Lactobacillus plantarum 53 DISCUSIÓN
Y
CONCLUSIONES
54 4. DISCUSIÓNYCONCLUSIONES
4.1.
Discusión
Los análisis microbiológicos se realizaron en las muestras de vino tinto una vez embotellado para su comercialización y, a los dos meses, tras exponerlos al aire para inducir el desarrollo de posibles microorganismos presentes que pudieran desarrollarse durante el periodo de conservación. Se tomaron en consideración los grupos microbianos más significativos de levaduras y bacterias desde el punto de vista enológico. Rescpeto a las levaduras, la especie Saccharomyces cerevisiae es la principal encargada de la fermentación alcohólica aunque se pueden encontrar especies que provocan alteraciones en los vinos, como los géneros Brettanomyces/Dekkeras, Kloeckera, Candida, Metschnikowia, Rhodotorula. En cuanto a las bacterias, es habitual encontrar bacterias pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Pediococcus, Oenococcus, Leuconostoc y Acetobacter. Siendo Oenococcus oeni y algunas especies del género Lactobacillus aptas para realizar el proceso de la fermentación maloláctica, habitual en la elaboración de vinos tintos y, que tiene lugar, una vez terminada la fermentación alcohólica. Así pues, se realizaron ensayos para detectar la presencia de población residual de microorganismos así como la estimación de población e identificación de las principales especie presentes en los vinos tintos sometidos a estudio. POBLACIÓN RESIDUAL DE LEVADURAS La población residual de levaduras aumenta de forma general con el tiempo. De los dos medios selectivos empleados para el desarrollo de levaduras, el mayor aumento de población se dio en el medio Wickerham a los dos meses de apertura de las botellas. Con la cámara de aire que se forma en el interior de las botellas tras su apertura se pretendía potenciar el crecimiento de levaduras pertenecientes al género Brettanomyces/Dekkeras. En los vinos terminados predominó el género Saccharomyces mientras que, a los dos meses, el género predominante fue Brettanomyces/Dekkeras. La presencia de oxígeno es un factor determinante para el crecimiento de este tipo de levaduras, de forma que a los 40 días se produjo el desarrollo de población de este género. En el medio de cultivo Dekkera Diferential Medium (DDM) líquido hubo producción de acidez, virando el color de los tubos en todos los casos (Tabla 3.2.), sin embargo, en las placas no se produjo desarrollo de colonias. Según la información de la que se dispone, existe la posibilidad de la presencia de estas levaduras aunque no se manifiesten en el medio de cultivo. 55 En el vino terminado la estimación de población residual es mayor en las muestras M10 y M30, alcanzándose poblaciones de 1,7 x 105 y 1,3 x 105 céls/ml respectivamente, las poblaciones de M20 y M40 son del orden de 104 céls/ml. Transcurridos dos meses, las poblaciones de levaduras aumentan hasta alcanzar poblaciones del orden de 105 céls/ml, siendo la estimación más elevada en la muestra M440 (7,1 x 105 céls/ml) y la más baja en el caso de la muestra M240 (3,6 x 105 céls/ml). ESPECIES DE LEVADURAS IDENTIFICADAS Se identificaron distintos géneros de levaduras en los vinos terminados: Saccharomyces, Candida y Rhodotorula. En todas las muestras se produjo crecimiento de la especie Saccharomyces cerevisiae. A parte de esta especie, en la muestra M10 se identificó la especie Candida krusei, en la muestra M20 la especie Rhodotorula mucilaginosa, en la muestra M40 la especie Candida tropicalis y en la muestra M30 se identificó Rhodotorula glutinis además de todas las anteriores. En los vinos guardados en botella con una cámara de aire durante dos meses (t = 40), se identificó el género Brettanomyces/Dekkeras en todas las muestras de vino y además se identificaron los mismos géneros que en los vinos recién embotellados: Saccharomyces, Candida y Rhodotorula aunque en algunos casos no se identificaron en las mismas muestras que en los vinos terminados. La especie Saccharomyces cerevisiae también se detectó en todas las muestras. A los cuarenta días, en la muestra M340 no se identificó ninguna especie de Candida, en el resto de muestras se identificaron las mismas especies que en los vinos terminados. La muestra M3 presenta la mayor diversidad de especies de levaduras en los dos momentos del muestreo. POBLACIÓN RESIDUAL DE BACTERIAS La población residual de bacterias lácticas aumentó ligeramente con el tiempo, aunque en ningún caso la población superó la carga de 102 céls/ml. La estimación de población sólo se realizó en la muestra M3 ya que el recuento de colonias fue muy bajo en los otros casos. La población estimada en la muestra M3 fue de 4 x 102 céls/ml tanto en el vino terminado como a los 40 días. En ninguna de las muestras se produjo desarrollo de poblaciones de bacterias acéticas, ni en los vinos terminados ni a los dos meses. Aunque no podemos descartar la presencia de estas bacterias, ya que su desarrollo en medios de cultivo es muy difícil y que durante la fermentación alcohólica la población de levaduras restringe el crecimiento de los principales géneros, sobre todo Acetobacter y Gluconobacter (Joyeux et al., 1984a, Drysdale and Fleet 1985). También existe interacción entre la especie Saccharomyces cerevisiae y poblaciones elevadas de estas bacterias durante la fermentación alcohólica. Una población de 106 céls/ml 56 es suficiente para causar la muerte de S. cerevisiae (Grossmann and Becker 1984). Al haber identificado esta especie en todas las muestras y al haberse desarrollado la fermentación alcohólica correctamente podemos pensar que la población de bacterias acéticas no es muy elevada o incluso que no exista población residual. Las bacterias acéticas pueden influir en la actividad antimicrobiana del SO2 y aumentar el SO2 total. ESPECIES DE BACTERIAS LÁCTICAS IDENTIFICADAS Se identificaron dos géneros de bacterias lácticas: Oenococcus y Lactobacillus. Ambos géneros fueron identificados en todas las muestras de vino terminado y también a los dos meses. Las especies identificadas fueron Oenococcus oeni y Lactobacillus plantarum. En todas las muestras la presencia de Oenococcus oeni descendió con el tiempo, siendo más abundante en los vinos terminados. La población de Lactobacillus plantarum fue más elevada a los dos meses. La población residual de levaduras es bastante elevada en todos los casos, identificándose varios géneros causantes de alteraciones microbianas, en su mayoría olores desagradables. La población de bacterias lácticas no es muy elevada en las muestras aunque las especies identificadas pueden también pueden producir olores desagradables. Todas las especies de levaduras identificadas ya habían sido descritas como microorganismos residuales presentes en el vino por V. Loureiro y M. Malfeito‐Ferreira en la publicación: Spoilage yeasts in the wine industry. Las especies de bacterias lácticas que se diagnosticaron se habían encontrado previamente en vinos tintos, en vinos de Rioja, en vinos de Sudáfrica y en vinos de Portugal. La publicación Performance of malolactic fermentation by inoculation of selected Lactobacillus plantarum and Oenococcus oeni strains isolated from Rioja red wines, fue escrita por I. López, R. López, P. Santamaría, C. Torres y F. Ruiz‐Larrea. Selection and Characterisation of Oenococcus oeni and Lactobacillus plantarum South African Wine Isolates for Use as Malolactic Fermentation Starter Cultures fue escrita por E. Lerm, L. Engelbrecht y M. du Toit. Y Genomic diversity of Oenococcus oeni from different winemaking regions of Portugal, escrito por Ana P Marques, Ana J. Duarte, Lélia Chambel, Maria F. Teixeira, Maria V. San Romão y Rogério Tenreiro. 4.2.
Conclusiones
Podemos concluir que las muestras analizadas presentan especies de levaduras pertenecientes a los géneros Rhodotorula, Candida, Brettanomyces/Dekkeras y Saccharomyces cerevisiae. Se puede afirmar la influencia del oxígeno en el desarrollo de las levaduras pertenecientes al género Brettanomyces/Dekkeras, principales productoras de defectos organolépticos. 57 En estos vinos están presentes los géneros de bacterias lácticas Oenococcus y Lactobacillus, ambos implicados en la fermentación maloláctica. La población residual de bacterias acéticas es muy baja ó inexistente en las muestras analizadas. Aunque no puede descartarse por completo y deberían realizar más estudios para confirmar completamente la ausencia de bacterias acéticas Finalmente, se puede concluir que las muestras de vino analizadas no son microbiológicamente estables ya que están presentes numerosas especies causantes de enfermedades microbianas y la estimación de población, sobre todo en el caso de las levaduras es bastante elevada. 58 BIBLIOGRAFÍA
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