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Cultivo de tejidos (Clonación in-vitro) de Epidendrum falcatum. Resumen Las orquídeas son plantas que pertencen a la familia Orchidaceae, con aproximadamente 700 a 800 géneros y 25 000 a 35 000 especies. Taxonomicamente representan una de las familias más evolucionadas. Esta familia aunque es muy numerosa, algunas especies se encuentran amenazadas o en peligro de erradicación, debido al saqueo indiscriminado, destrucción de espacios, contaminación ambiental y deforestación, aunado a los problemas de lento crecimiento y baja tasa de germinación en condiciones naturales. Epidendrum falcatum es una orquídea de hábito litófita con pseudobulbos fusiformes colgantes que portan una sola y estrecha hoja, articulada, coriácea, carnosa, linear-lanceolada y aguda, en forma de hoz. Florece en la primavera y se tiene una distribución discontinua en México, esta especie se encuentra en las rocas y acantilados de piedra caliza en bosques de pino y bosques húmedos de roble, en el matorral xerófilo y los bosques espinosos y en altitudes de 1000 a 2100 metros. La conservación ex situ de los recursos genéticos vegetales se puede lograr mediante el almacenamiento in vitro. Esta técnica es una herramienta que permite el estudio a corto y largo plazo de plantas vulnerables a la extinción. Así, el objetivo de esta investigación fue crear cultivos de Epidendrum falcatum para la regeneración y propagación de esta especie, así como promover su conservación y aprovechamiento. Los explantes utilizados fueron semillas, las cuales se cultivaron en medio MS (Murashige y Skoog), el cual es a base de minerales y nutrientes que el explante necesitó para desarrollarse; de la misma manera fueron agregados reguladores de crecimiento, en diferentes dosis (0.1/0.5, 0.1/1 AnA y BaP respectivamente) monitoreando su crecimiento con un lote testigo, dichos explantes presentaron una diferencia en cuanto a su desarrollo. El cultivo 0.1/1 presentó más cantidad de hormonas en comparación con los otros dos, por lo que se obtuvieron resultados más favorables en su crecimiento. El mayor número de PLB’s (en promedio 25) se obtuvo en los cultivos basal 0.1/1 1 INTRODUCCIÓN MARCO TEÓRICO. La forma tradicional de propagación de la mayoría de las especies vegetales es por medio de semillas (frijol, maíz, chile, etc.), aunque algunas especies también se propagan vegetativamente (papa, agaves, etc.). Sin embargo, en la actualidad, con el uso de diversas técnicas de cultivo de tejidos, a partir de diferentes tipos de explantes vegetales se han establecido múltiples cultivos (callos, suspensiones celulares, protoplastos, embriones, yemas axilares, meristemos, inflorescencias, etc.) y en muchos casos se han logrado regenerar plantas completas in vitro y escalar dichos procesos para multiplicar en forma masiva (micropropagación) algunas especies. Lo anterior ha permitido propagar millones de plantas sin necesidad de disponer de semillas o de depender del limitado número de brotes de la propagación vegetativa. Estos diferentes tipos de cultivos, permitieron un gran avance en los estudios bioquímicos, fisiológicos y moleculares de diferentes rutas biosintéticas de un gran número de metabolitos primarios y secundarios. El conocimiento adquirido con las diferentes técnicas del cultivo de tejidos vegetales, acopladas a las de la ingeniería genética permiten obtener plantas transformadas con nuevas características genéticas las cuales son de gran importancia en la agricultura actual. El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro, es una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre. A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menos tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de: plantas libres de patógenos, plantas homocigotas, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de 2 laboratorios de cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales lo que ha motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción. Es por esto que en diversos estados de la República se han implantado laboratorios de cultivo de tejidos para su exitosa propagación, como ejemplo tenemos el Colegio Profesional de Biólogos del Estado de Veracruz, A.C. el cual con el apoyo de la Secretaría de Desarrollo Social (SEDESOL) y el Gobierno del Estado de Veracruz desarrollan un proyecto de producción de plantas de ornato utilizando la técnica antes mencionada con el propósito de aprovechar sus bondades, adecuándola a la problemática económica de algunas colonias populares de la Ciudad de Xalapa y municipios circunvecinos; el proyecto inicio el primero de noviembre de 1994 con la instalación de un Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales en donde se contempla la producción de especies ornamentales de interés económico. A la fecha, se tienen resultados satisfactorios en la producción de Gloxinia (Sinningia speciosa). El fundamento teórico del cultivo in vitro es el concepto de la totipotencialidad celular. Schleiden y Schwan (1887) describen en su teoría celular, que la célula es capaz de subsistir por sí sola si las condiciones externas le son favorables. A Morgan (1901) se le atribuye el término de la totipotencialidad celular propiamente dicho, que dice que una célula es capaz de desarrollarse hasta formar un organismo completo si las condiciones ambientales le son favorables y si se le aplican los estímulos adecuados. Haberlandt (1902) con la idea de la totipotencialidad celular desarrolla el primer cultivo in vitro de tejidos vegetales. Desafortunadamente sus trabajos no fueron exitosos debido a que utilizó un medio de cultivo relativamente simple y por otra parte, tejidos vegetales demasiado diferenciados. En 1926 dos científicos japoneses descubrieron un compuesto hormonal, actualmente de uso ordinario en el cultivo in vitro de tejidos vegetales denominado giberelina el cual es producido por un hongo Gibberella fujikoroi; este compuesto fue descubierto cuando ellos estudiaban la causa de la pudrición en plántulas de 3 arroz. El efecto que producía dicha sustancia era un alargamiento excesivo en los tallos, sin desarrollo proporcional de la raíz. Actualmente se le atribuyen otros efectos como la inducción de germinación en semillas y la brotación en algunos tubérculos como la papa, etc. White (1932) logra el primer cultivo in vitro estable utilizando en sus experimentos ápices1 de raíces de jitomate. Los tejidos meristemáticos2 del ápice radical propiciaron crecimiento en longitud de los mismos en el medio de cultivo. La falla en los intentos realizados por varios investigadores entre 1902 y 1932 se debió, como lo menciona White, a la mala elección del material vegetativo y 1 a la simplicidad de los medios de cultivo utilizados. El logro de White le da un buen impulso al desarrollo de las técnicas de cultivo in vitro; sin embargo, en sus trabajos realizados hasta entonces no obtiene proliferación celular en forma, los ápices de raíz solo crecen en longitud como lo harían normalmente parte de la raíz de la planta intacta. No es sino hasta 1934 cuando Gautheret logra la proliferación celular in vitro en tejidos cambiales provenientes de plantas adultas. En 1939 el mismo Gautheret, Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de la planta de tabaco) publican casi simultáneamente la formación de una masa de células parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus experimentos. Este hecho significativo constituye en sí el despegue de las técnicas de cultivo in vitro. Un factor importante en el desarrollo de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek (1941) observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que estimulaba la división celular (efecto citocinínico). Cuando el agua de coco se combinaba con 2,4-D, tenía un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y Steward 1948, 1952). 1. Punta o extremo. 2. Tejidos meristemáticos, responsables del crecimiento vegetal. 4 Skoog y colaboradores observaron que el esperma de arenque, desnaturalizado por calor, tenía un efecto muy marcado en la formación de brotes a partir de tejidos de la planta de tabaco. De éste ácido desoxirribonucleico (DNA) desnaturalizado Miller y colaboradores aislaron un compuesto de naturaleza purínica denominado 6- furfuril-aminopurina o cinetina. Por otro lado las orquídeas son una de las más diversas familias de plantas con flores, con más de 800 géneros descritos y 25.000 especies. Las orquídeas son muy apreciadas por sus hermosas flores de larga duración que exhiben una increíble gama de diversidad en tamaños, forma y color. Hoy en día el cultivo de orquídeas es algo más que una afición, es una empresa internacional que cubre alrededor del 8% del comercio de la floricultura mundial y tiene el potencial de alterar el paisaje económico de un país. Como las orquídeas son alógamas3, su propagación mediante semillas conduce a la producción de plantas heterocigotas. Aunque la micropropagación de orquídeas muestra un desarrollo espectacular en los últimos años, se cree que el uso generalizado de la micropropagación es aún limitado debido a problemas como la exudación de compuestos fenólicos a partir de explantes, el trasplante al campo, la variación somaclonal 42 entre otras cosas. Organogénesis y micropropagación de orquídeas. Las principales aplicaciones de la técnica de cultivo de células, tejidos y órganos vegetales son en los campos de micropropagación, preservación de germoplasma5, mejoramiento genético, biosíntesis de metabolitos e investigación básica en áreas como la genética, la fisiología, etc. En micropropagación, la embriogénesis y la organogénesis pueden usarse para obtener clones somáticos y regenerar plantas completas con características 3. Tipo de reproducción sexual en plantas consistente en la polinización cruzada y fecundación entre individuos genéticamente diferentes. 4. Variación en las plantas que han sido producidas por medio del cultivo de tejidos. 5. Conjunto de genes que se transmite por la reproducción a la descendencia por medio de gametos o células reproductoras. 5 uniformes y así establecer cultivos de plantas valiosas, libres de microorganismos y difíciles de obtener por métodos de cultivo tradicionales. Los cultivos in vitro también pueden almacenarse por largos períodos de tiempo mediante alguno de los métodos de conservación utilizados para microorganismos como es la refrigeración y criopreservación6. 3 Esta es una forma de eliminar los problemas de espacio físico, exceso de mano de obra, contaminación de los cultivos y los efectos de la erosión genética. Si los cultivos in vitro se incuban o someten a condiciones de estrés fisiológico, pueden expresar características de adaptación y resistencia que en condiciones naturales nunca manifestaron, creciendo selectivamente sólo aquellas células capaces de adaptarse a sus nuevas condiciones. Esta variación genética también se puede inducir por técnicas de mutación, ingeniería genética, fusión de protoplastos y transformación genética por inclusión de DNA foráneo de manera similar a las aplicadas comúnmente en microorganismos. En este último caso se obtienen cultivos o plantas transgénicas en donde el DNA foráneo debe integrarse al genoma vegetal para garantizar una expresión estable en su progenie. Micropropagación de orquídeas usando varios explantes En 1926 Morel y Martin informaron de la producción de dalias libres de virus utilizando el cultivo de meristemos apicales y posteriormente aplicaron esta técnica para producir Cymbidium libre de virus (Morel, 1960). Aunque Morel no sugirió que su método podría ser utilizado para la propagación clonal masiva, sí dijo que “muy a menudo el cuerpo-protocormo se divide de 4 a 54 estructuras idénticas y cada una de ellas produce una nueva planta”. Cultura de hoja segmento. Al contrario que las yemas, los explantes son más fáciles de obtener y no requieren el sacrificio de la planta materna, además de que su disponibilidad no está restringida a ninguna estación como los explantes inflorescentes. Wimber 6. Proceso en el cual células o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas, generalmente entre -80 ºC y -196 ºC 6 (1965) fue pionero del cultivo de tejido filial y dio el primer reporte bien documentado de la producción de PLBs de hojas de Cymbidium. En la orquídea Malaxis paludosa, las yemas naturalmente formaban las hojas. Por lo tanto, la formación de callos y plantas a través de las hojas reflejaba un inherente tratado de la orquídea. Estos autores hicieron cortes de la mayor parte de la hoja (pecíolos, varias secciones de la hoja y la base) madura Laeliocattleya y en cultivos in vitro de Epidendrum. Las hojas sólo respondieron formando callos7 y PLBs8. En contraste con el anterior informe de explantes de hoja Vanda híbrido104la base de la hoja fue la región más susceptible de crecimiento con más del 80% que mostraron proliferación (Mathews y Rao, 1985). Además, las hojas jóvenes respondieron mejor que las hojas viejas. Conclusiones similares fueron reportados, cuando se evaluó el potencial de regeneración de segmentos foliares de Vanda testacea. La actividad se inició de manera meristemática en toda la superficie de hojas más jóvenes o se limitaba a la parte basal en las hojas más viejas.5 El éxito en la regeneración de un gran número de plantas de hoja uniforme en cultivo de tejidos en peligro de extinción de Renanthera imschootiana Rolfe, también conocida como la Cruz Vanda, ha informado (Seeni y Latha, 1992) que la formación de yemas se limitó a las bases de las hojas mientras el clorofílico respondía en la parte distal de las hojas de las plantas con flores y plantas cultivadas in vitro. Pero las hojas de V. coerulea (Vanda Azul) de las plantas maduras no formaron yemas o PLBs en la modalidad in vitro por lo cual los explantes de las plantas madre podían diferenciarse . La competencia por la regeneración (frecuencia de 7. Un callo de células de planta consiste en las células somáticas no diferenciadas de un espécimen de planta adulta. 8. Protocorms-like bodies. 9. Vanda es un género de aproximadamente 60 especies de orquídeas de la subfamilia Epidendroideae dentro de la familia Orchidaceae. 10. Especie de orquídea originaria del este del Himalaya China. 7 respuesta y el número y la naturaleza de regenerantes por callo) en los cultivos foliares de Vanda también fueron influenciados por la juventud de los tejidos en términos del tamaño de la hoja del donante. La diferencia respondía por los explantes de las hojas maduras y las jóvenes, bajo condiciones nutricionales idénticas, indicando la importancia de su fuente de alimentación. A diferencia de los informes anteriores donde hojas más jóvenes tienen mayor probabilidad de formar más PLB y disparar las yemas, el potencial de regeneración de explantes de hojas de plantas maduras de Vanda spathulata fue complementado por el significativo número de brotes por planta, comparado con los explantes in vitro en medio suplementado con 66.6 mM BAP11+ 28.5 mM IAA12.6 OBJETIVO. Realizar la clonación de Epidendrum falcatum, de modo que, se obtengan y propaguen nuevos individuos de esta especie. PROBLEMA. La biodiversidad de México está siendo disminuida por diversos factores, la deforestación ha degradado alarmantemente los ecosistemas forestales, lugar en el que se sustenta la familia Orchidaceae. Las orquídeas han sido objeto de extracción masiva, lo cual junto con la destrucción masiva del hábitat, han hecho que un gran número de especies se encuentren amenazadas y otras en peligro de extinción La dificultad que presentan las semillas de las orquídeas para germinar, entre otras problemáticas ya expuestas anteriormente, indican la importancia y necesidad de establecer estrategias eficientes para la micropropagación y conservación de estas especies. Epidendrum falcatum es una especie endémica de México, que al igual que otras orquídeas es de lento crecimiento, largo ciclo de vida, vulnerable a la destrucción de su hábitat. Para esta especie no existen estudios relacionados a su reproducción y desarrollo; por lo tanto, es importante generar una metodología que permita propagarla de manera eficiente. Las 11.Hormonas de crecimiento. 12.Hormonas de crecimiento. 8 técnicas de cultivo de tejidos vegetales pueden aplicarse como una herramienta de gran utilidad para el estudio, propagación y conservación de esta especie. HIPOTESIS. Las técnicas de clonación in vitro, permitirán obtener un determinado número de organismos de la especie Epidendrum falcatum a partir de cortes basales y apicales. DESARROLLO EXPERIMENTAL Se realizaron cortes de plántulas de Epidendrum falcatum en la parte media para obtener la parte apical y basal de las semillas. Se utilizó tres tipos de medio a dos de los cuales se les agrego diferentes cantidades de reguladores de crecimiento: Testigo - sin reguladores de crecimiento Experimental 1, con dosis de 0.5 mg de BaP (Ácido Benzylamino Purina) y 0.1 mg de AnA (Ácido Naftalenacetico) Experimental 2, con 1 mg de BaP y 0.1 mg de AnA. Se preparó litro y medio de medio de cultivo MS en cantidades específicas de cada sustancia que se agregaron conforme el siguiente orden. Macronutrientes (15 ml) • Calcio (15 ml) • Micronutrientes (7.5 ml) • Hierro (15 ml) • Vitaminas (10 ml) • Inocitol (10 ml) • Glicina (10 ml) • Azúcar refinada (45 gramos) • Agar (1.75 ml por cada concentración) Manteniéndolo en constante movimiento, al terminar de agregar el azúcar se dividió el medio en 3 porciones iguales (500 ml. cada una) y al final se añadió el agar. 9 El método para añadir los reguladores de crecimiento es muy importante y preciso, con una balanza electrónica se pesan 10 mg de AnA (Ácido Naftalenacético) y se agregan 5 gotas de Etanol 70 %, una vez disuelto el AnA, se afora a 10 ml con agua destilada. De igual manera se hace con el BaP (Benzylamino Purina) pero en lugar de usar Etanol se usó Hidróxido de Sodio. Se tuvo entonces 10 ml de AnA y otros 10 ml de BaP ahora para saber cuánto agregar de cada uno de los medios de cultivo se realizo lo siguiente: AnA. Cantidad del medio (ml) Multiplica Concentración deseada Igual Microlitros 500 ml x 0.1 = 50 mcl. 500 ml x 0.1 = 50 mcl. 500 ml x 0 = 0 mcl Concentración Igual Microlitros BaP Cantidad del medio (ml) Multiplica deseada 500 ml x 0.5 = 250 mcl. 500 ml x 1 = 500 mcl. 500 ml x 0 = 0 mcl Una vez agregados los reguladores de crecimiento se separaron en 3 frascos de 500 ml de medio con sus respectivas concentraciones. Se midió el PH, el cual debe estar en un rango de: 5.7 - 5.75 10 Para subir el PH Para disminuir el PH NaOH NaOH NaOH HCl (0.1) HCl (0.5) HCl (0.01) (0.1) (0.5) (0.01) Aumenta Aumenta Aumenta Disminuye Disminuye Disminuye 1.00 0.50 0.10 1.00 0.50 0.10 por gota por gota por gota por gota por gota por gota Se calentó en un horno de microondas de 4 a 5 minutos por cada concentración y posteriormente se vació 25 ml de medio en cada frasco, colocando su tapa y dejando enfriar hasta obtener una forma de gel, por último, se llevaron los frascos al autoclave un tiempo típico de esterilización de 15 a 20 minutos. Se obtuvieron 30 frascos, 10 por medio, una vez esterilizados los frascos, el bisturí, pinzas y cajas de Petri (en una de ellas se encuentran las semillas de las orquídeas), se colocaron en la campana de flujo laminar. Se abrieron las cajas de Petri y los frascos con medio, con la ayuda de un bisturí se partieron las semillas por la mitad para obtener los cortes apical y basal, con unas pinzas, se tomaron los cortes y se colocaron cuidadosamente sobre el gel, procurando que quedaran fijos en el medio sin sumergirlos. Se colocaron 1 corte basal en 5 frascos y 1 corte apical en los otros 5, esto se repitió con los 3 tipos de medio, por lo tanto, de los 10 frascos que le correspondían a cada medio, 5 fueron de cortes basal y 5 de cortes apical. Una vez cerrados los frascos se sellaron con plástico hermético, con un marcador se anotó en la tapa el nombre de la especie, la fecha y el nombre de quien sembró los explantes. Los frascos ya con los cortes se llevaran a la incubadora, la cual debe tener ciertas medidas específicas como tener el cuarto de cultivo bien acondicionado: 16 11 horas de fotoperiodo y un rango de temperatura entre 22-25°C. 8 horas de oscuridad con un material luminoso de 2500 a 300 Lux, provistos de fluorescentes de luz blanca. Cuarto de cultivo Se construyó una caja que cubriera la incubadora con láminas de madera prensada, pues este material resiste la humedad; se cortó la madera para las paredes de 45 cm de ancho y 35 cm de alto. En las paredes de los lados se colocaron dos listones: uno a cuatro centímetros desde el borde que quedó en el suelo y otro a seis centímetros del primero (estos listones fueron los soportes para las bandejas). En la parte frontal de la incubadora se realizó un corte en la tabla de madera en donde se colocó una puerta que a la cual se le coloco un vidrio para poder ver lo que sucedía dentro de la incubadora. Se instaló un termostato digital en una de las paredes de la incubadora, para regular la a temperatura la oscilo entre los 20° y los 25 °C. Se usaron bombillas para mantener la incubadora caliente, así como una bandeja para depositar los frascos en el interior de la incubadora, se estuvieron revisando los frascos cada semana. Anotando el desarrollo de cada explante en relación a crecimiento. RESULTADOS Tamaño Apical (mm) 25 15 10 20 22.5 20 15 15 9 Tamaño Apical (mm) 5 0 Apical 0/0 Apical 0.1/0.5 Tamaño Basal (mm) Apical 0.1/1 17 14 12 10 Tamaño Basal (mm) 5 0 Basal Basal Basal 0/0 0.1/0.5 0.1/1 Gráfica 1: Comparación de tamaños de Gráfica 2: Comparación de tamaños hojas entre los cultivos apical basal (0/0) de hojas entre los cultivos basal (0/0) (0.1/0.5) (0.1/1) (0.1/0.5) (0.1/1) 12 Gráfica 1 se observó un crecimiento promedio de la plántula, de 9 mm en apical 0/0, 15 mm en apical 0.1/0.5 y finalmente un desarrollo de hasta 22.5 mm en apical 0.1/1; Gráfica 2, el tamaño de las plántulas basal en 0/0 es de 12 mm, en 0.1/0.5 es de 14 mm y en 0.1/1 hay un crecimiento total de 17 mm. Comparando las gráficas 1 y 2 los cultivos sin hormonas (0/0) se observa una diferencia en el crecimiento de 3 mm; entre el cultivo basal con el apical, en cambio en el cultivo basal con hormonas 0.1/0.5 se observó una diferencia de 1mm, siendo más grande el apical; por último, en hormonas 0.1/1 se notó una mayor diferencia, siendo el cultivo basal 5.5 mm. menor que el apical. PLB's Apical 25 15 10 30 22 18 20 PLB's Basal 25 25 20 10 15 PLB's Apical 5 20 13 PLB's Basal 10 5 0 0 Apical Apical Apical 0/0 0.1/0.5 0.1/1 Basal 0/0 Basal 0.1/0.5 Basal 0.1/1 Gráfica 3: Comparación de cantidad de Gráfica 4: Comparación de cantidad de PLB’s entre los cultivos apical (0/0) PLB’s entre los cultivos basal (0/0) (1/0.5) (1/0.1) (1/0.5) (1/0.1) En las orquídeas, después del proceso de germinación se forma una masa de células con una alta totipotencialidad llamada protocormo, el cual puede diferenciarse en una plántula o formar cuerpos parecidos a protocormos (PLB’s). En la gráfica 3, en promedio, cada dos semanas crecía 1 PLB’s en apical sin hormonas, 3 PLB’s en apical 0.1/0.5 y hasta 3 PLB’s en apical con hormonas 0.1/1; en la gráfica 4, en cuanto a basal sin hormonas se desarrollaban 2 PLB’s cada dos semanas, 3 PLB’s en basal con hormonas 0.1/0.5 y en basal 0.1/1 llegaban a crecer hasta 4 PLB’s. 13 Por lo que se puede observar que los cultivos basal presentaron un desarrollo mayor de protocormos comparado con los cultivos apical. Imagen 1; Basal 10 mm, 12 PLB’s. Hormonas 0/0 Imagen 3; Basal 10.5 mm , 20 PLB’s. Hormonas 0.1/0.5 Imagen 2; Apical 9 mm, 2 PLB’s. Hormonas 0/0 Imagen 4; Apical 20.5 mm , 6 PLB’s. Hormonas 0.1/0.5 14 Imagen 5; Apical 22 mm, 17 PLB’s. Hormonas 0.1/1 Imagen 6; Basal 22 mm, 24 PLB’s. Hormonas 0.1/1 15 En la imagen 5 se muestra una plántula de apical con hormonas 0.1/1, presenta un tamaño de 22 mm y 17 protocormos, por otra parte la imagen 6 es de un cultivo basal 0.1/1, con un tamaño de 22 mm y 24 protocormos. En las seis imágenes se aprecia que los cultivos de apical (Imagenes 2, 4, 5) presentan más hojas que los cultivos de basal (Imagenes 1, 3, 6), no obstante tienden a desarrollar una cantidad inferior de protocormos. 14 12 10 8 Apical 6 Basal 4 2 0 Mes 1 Mes2 Mes3 Mes 4 GRÁFICA 6 Los cultivos realizados de Epidendrum falcatum tuvieron diferente desarrollo dependiendo de la concentración de indicadores de crecimiento. Después de tres meses, se realizo un cambio en el mismo ya que habían agotado los minerales presentes en el medio los explantes; de esta manera ocurrió un cambio en su ambiente pues se trasladaron a un medio que carecía de las hormonas a las que ya se habían acostumbrado las plantas, específicamente los explantes basales por este motivo las plantas pertenecientes al grupo tratado con 0.1/1 de reguladores de crecimiento tuvieron un cierto grado de disminución en su avance como se muestra en la Gráfica 7, a partir del segundo, al tercer mes muestran una disminución en el incremento de PLBs el cual hasta ese momento había sido de 3 a 5 PLBs por mes disminuyo a 2 o 3, por lo tanto al contraponerlo con el avance presentado por el grupo que se trato con hormonas 0.1/0.5 se observa un notable 16 cambio en las estadísticas de incremento de los mismos, (Gráfica 7) ya que estas habían experimentado un crecimiento de entre 2 a 3 PLBs por mes, al realizar su cambio de medio su crecimiento cambio sorprendentemente a 2 PLBs estabilizándose en ese número y acercándose al crecimiento experimentado por el anterior grupo. 30 25 20 0/0 15 0.1/0.5 0.1/1 10 5 0 Mes 1 Mes 2 Mes 3 Mes 4 GRÁFICA 7 ANALISIS DE RESULTADOS. Se observó que los explantes tratados con las hormonas BAP y ANA al 0.1/1 respectivamente, mostraron un desarrollo mayor en cuanto a tamaño (Gráfica1) y numero de PLBs (Gráfica 2) al que mostraron los otros dos grupos tratados con menos de estas hormonas, las cuales tienen un efecto catalítico en el crecimiento de las plántulas, al contar con estos reguladores más los minerales y nutrientes necesarios para desarrollarse presentes en el medio de cultivo se logra un crecimiento claramente notorio a los explantes que no presentaron reguladores de crecimiento en su medio. Tomando el avance presente en los explantes basales respecto al número de PLBs presentados por los explantes apicales del mismo lote se observa un incremento en el número de estos en el explante, ya que, al ser 17 la parte basal la que presenta el callo esta tiene más facilidad de crear nuevos organismos (totipotencialidad) en cambio los explantes apicales al tener la parte superior de la plántula, presentan para crear nuevos organismos únicamente las hojas presentes en ella como se muestra en la Imagen 5. Los explantes pertenecientes al grupo testigo mostraron un avance gradual (Gráfica 6), en relación al número de PLBs los explantes basales mostrando un incremento mayor desde el primer momento a los explantes apicales. CONCLUSIONES • Se observó que las plantas injertadas por los explantes de 0/0 tuvieron resultados poco favorables, teniendo entre 10 a 13 PLBs y 7 hojas; en el caso de los cortes apicales respecto de las plantas con los explantes sometidos al tratamiento de 0.1/0.5 hubo un rango entre 18 a 20 PLBs y por ultimo con mejores resultados 0.1/1 del cual se obtuvo un rango de 22 a 25 PLBs incluso hasta 10 hojas en el caso de los cortes apicales. • El medio tratado con hormonas 0.1/1, tuvo mayor contenido de nutrientes en comparación con el testigo, lo cual ayudo a que crecieran más algunos de los explantes. • Los explantes pertenecientes al grupo testigo, al estar sometidos al mismo tratamiento en ambos casos presentaron un crecimiento normal. • Se observó una diferencia clara en el comportamiento de las plántulas, así como un incremento en los cortes apicales del tratamiento testigo en PLBs (incrementaron en un 40%, pasando de 10 PLBs a 14 en un plazo de 2 meses); sobre los cortes apicales tratados con 0.1/1 los cuales se estancaron en el crecimiento cuando se cambiaron del medio a uno sin hormonas. 18 BIBLIOGRAFIA • Suárez, Q. 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