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CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CONSORCIOS BACTERIANOS
CAPACES DE CRECER SOBRE PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS
Maria Luisa CASTREJÓN GODINEZ1, Enrique SÁNCHEZ SALINAS2, Ma. Laura ORTIZ
HERNÁNDEZ2
1
Facultad de Ciencias Biológicas y 2 Laboratorio de Investigaciones Ambientales.
Centro de Investigación en Biotecnología. Universidad Autónoma del Estado de
Morelos. Av. Universidad No 1001 col. Chamilpa, Cuernavaca Morelos, C.P 62209 Tel.
(777) 329-7057. [email protected], [email protected]
Palabras claves: plaguicidas, bacterias, consorcios bacterianos, suelo
RESUMEN
Los plaguicidas aplicados constantemente a suelos agrícolas, los envases
contenedores y los productos caducos, generan grandes cantidades de residuos
líquidos y sólidos que contaminan suelos y cuerpos de agua, afectando a las cadenas
tróficas y al hombre mismo. Ante esta situación, es importante generar alternativas para
el tratamiento de residuos de estos xenobióticos y/o para la limpieza de sitios
contaminados. La biodegradación con bacterias aisladas de sitios expuestos a estos
xenobioticos, es una alternativa valiosa. Sin embargo, estas bacterias pueden ser
patógenas, de ahí la importancia de identificarlas para utilizarlas de manera segura o
bien emplear estrategias moleculares para su aprovechamiento en el tratamiento de
residuos de plaguicidas o en la restauración de sitios contaminados. El consorcio
bacteriano aislado de suelos agrícolas esta compuesto por 11 bacterias, seis con
capacidad de crecer en presencia de Paratión metilico y cinco para cadusafos. Las
especies identificadas son: Bacillus brevis, Stenotrophomonas maltophilia,
Pseudomonas
aeruginosa,
Yersinia
pseudotuberculosis,
Weeksella virosa,
Flavobacterium odoratum, Burkholderia cepacia, Pseudomonas stutzeri. La cepa
identificada como Bacillus brevis resultó con mayor capacidad de crecimiento en un
medio mínimo con paratión metílico como única fuente de carbono y en medio líquido.
Burkolderia cepacia es una bacteria con capacidad de crecer en medio liquido con
cadusafos; se ha reportado para la recuperación de suelos contaminados con residuos
tóxicos. Diferentes bacterias identificadas son patógenas, sin embargo pueden ser
utilizadas en el tratamiento de residuos de paratión metílico y cadusafos y
probablemente, de otros plaguicidas de la misma familia química, con el debido control
o utilizando herramientas moleculares.
INTRODUCCION
La extraordinaria diversidad biológica de la tierra, no solo comprende a los animales,
plantas, hongos y otros organismos macroscópicos, sino también a los millones de
especies microscópicas, distribuidas en los hábitats más diversos que incluyen a suelos
y aguas contaminados con xenobioticos. Debido al papel particular que juegan las
1
bacterias en los ecosistemas y su importancia en la vida del hombre, se han empezado
a investigar sus patrones de diversidad y las factores que los regulan (Horner-Devine et
al. 2003). Los estudios de diversidad microbiana en sitios con constantes aplicaciones
de plaguicidas permiten la caracterización e identificación de especies bacterianas con
un potencial de aplicación en procesos de biorremediación de sitios contaminados y/o el
tratamiento de residuos caducos u obsoletos.
Se estima que 4.5 billones de libras de plaguicidas, son comercializados en todo el
mundo anualmente (Klaasen 2001). Están incluidos insecticidas, rodenticidas,
fungicidas, herbicidas y fumigantes, de uso agrícola, industrial y doméstico. Esto genera
grandes cantidades de residuos y productos obsoletos, dispuestos de manera
inadecuada, principalmente de la familia de los organofosforados, que son los más
usados a nivel mundial.
La presencia de bacterias capaces de metabolizar compuestos organofosforados ha
recibido una especial atención, debido a que han sido el resultado de un proceso de
evolución de poblaciones microbianas autóctonas que se han adaptado a estos
contaminantes y porque proveen la posibilidad de ser usadas in situ en la detoxificacion
de ambiente severamente contaminados. Por esta razón, estos sitios son los mas
apropiados para el aislamiento de cepas capaces de crecer y en consecuencia de
degradar estos xenobioticos (Ortiz-Hernández et al. 2001).
MARCO TEORICO
Definición de plaguicida. La Organización de las Naciones Unidas para la
alimentación (FAO 2002) define a un plaguicida como cualquier sustancia o mezcla de
sustancias destinadas a prevenir, destruir o controlar cualquier plaga, incluyendo los
vectores de enfermedades humanas o de los animales, las especies de plantas o
animales indeseables que causan perjuicio o que interfieren de cualquier otra forma en
la producción, elaboración, almacenamiento, transporte o comercialización de
alimentos, productos agrícolas, madera y productos de madera o alimentos para
animales, o que pueden administrarse a los animales para combatir insectos, arácnidos
u otras plagas en o sobre sus cuerpos. El término incluye las sustancias destinadas a
utilizarse como reguladoras del crecimiento de las plantas, defoliantes, desecantes,
agentes para reducir la densidad de fruta o agentes para evitar la caída prematura de la
fruta, y las sustancias aplicadas a los cultivos antes o después de la cosecha para
proteger el producto contra la deterioración durante el almacenamiento y transporte.
Cronología del desarrollo de los plaguicidas. La era de los plaguicidas químicos
comenzó en el siglo pasado cuando se desarrollaron los sulfuros y se les encontró una
aplicación práctica como fungicidas. Posteriormente fueron los compuestos arsenicales
los que se emplearon para el tratamiento de las plagas de insectos en la producción
agrícola. En ambos casos se trataba de sustancias de una elevada toxicidad, lo que
limitó su empleo generalizado. Fue en 1940 cuando aparecieron en el mercado los
primeros plaguicidas organoclorados que tienen su máximo exponente en el dicloro
2
difenil tricloroetano (DDT). Desde entonces se han empleado tanto en los tratamientos
agrícolas como en el control de plagas vehiculizadas por insectos portadores.
En el transcurso de los últimos 150 años el hombre ha fabricado muy diversos
compuestos químicos con objeto de satisfacer las necesidades crecientes del desarrollo
tecnológico y mejorar su calidad de vida. Desde el inicio de la revolución industrial, se
estiman en más de 120,000 las sustancias químicas de nueva síntesis y los
subproductos derivados de éstas producidos por la actividad humana, censo que se
incrementa día a día y que parece no tener fin si se considera que se incorporan a la
lista cerca de 2.000 nuevos compuestos cada año (Olea y Fernández 2001).
Importancia de los plaguicidas. Se ha manifestado frecuentemente que debido al
empleo de plaguicidas, herbicidas y fertilizantes, las cosechas se han visto
incrementadas significativamente y las pérdidas en la producción se han reducido de
forma espectacular. Se sustenta que es indudable el gran beneficio derivado del empleo
de los plaguicidas en los programas de salud y en la lucha contra enfermedades
transmitidas por vectores o con huéspedes intermediarios (Olea y Fernández 2001).
Efecto de los plaguicidas en el ambiente. El empleo de agroquímicos en las
actividades agropecuarias es una de las más grandes amenazas para la pérdida de la
fertilidad de los suelos, de su capacidad biodegradadora y otras funciones,
frecuentemente mediante prácticas inadecuadas, constituye una de las formas de
contaminación más importantes, que impactan no sólo los suelos de las áreas en donde
se aplican, sino que llegan a través de los ríos hasta las zonas costeras afectando las
especies marinas. La aplicación de plaguicidas genera conflictos sociales por el elevado
número de trabajadores del campo intoxicados por estos productos, con un alto índice
de mortalidad, así como también por la sospecha de efectos adversos sobre la salud de
las comunidades vecinas, la flora y la fauna (Lichtinger et al. 2001).
Los microorganismos del suelo. El suelo contiene básicamente cinco grupos de
microorganismos: bacterias, actinomicetos, hongos, algas y protozoarios. Como
ecosistema, el suelo incluye además a los constituyentes orgánicos e inorgánicos
propios de un determinado lugar (Alexander 1980). En la tabla 1 se muestra la
distribución de los microorganismos en varios horizontes del suelo.
Los hábitats naturales de los microorganismos son extremadamente diversos. Cualquier
hábitat que sea adecuado para el crecimiento de organismos superiores, también lo es
para el crecimiento de microorganismos. Pero además, hay muchos hábitats donde,
debido a las extremas condiciones físicas o químicas, no se encuentran organismos
superiores; sin embargo, en ellos pueden existir microorganismos que, en algunos
casos, incluso crecen mejor ahí. En la tabla 2 se muestra el número aproximado de
organismos comúnmente encontrados en suelos.
3
Tabla 1. Distribución de microorganismos en diferentes profundidades de un perfil de
suelo (Alexander 1980).
PROFUNDIDAD
(cm)
3-8
20-25
35-40
65-75
135-145
BACTERIAS
AEROBIAS
7,800
1,800
472
10
1
BACTERIAS
ANAEROBIAS
1,950
379
98
1
0.4
ACTINOMICETOS
HONGOS
ALGAS
2,080
245
49
5
-
119
50
14
6
3
25
5
0.5
0.1
-
Tabla 2. Número aproximado de organismos comúnmente encontrados en suelos
(Martínez 1997).
Organismos
Número estimado
Bacterias
3,000,000 a 500,000,000/g
Actinomicetos
1,000,000 a 20,000,000/g
Hongos filamentosos
5,000 a 900,000/g
Algas
1,000 a 500,000/g
Protozoarios
1,000 a 500,000/g
Levaduras
1,000 a 100,000/g
Nemátodos
5,000 a 20,000/100g
Requerimientos fisiológicos de los microorganismos degradadores. La mayoría de
los microorganismos necesitan de diferentes factores para su óptimo crecimiento, se
enlistan continuación (Ortiz et al. 1997):
1. Nutrimentos y oxígeno: Las bacterias heterotróficas para crecer necesitan una
fuente de carbono, otros nutrimentos y un aceptor final de electrones, el cual es
el oxígeno para el caso de las aerobias. Las bacterias llegan a necesitar
micronutrimentos en concentraciones traza y algunos factores de crecimiento
como aminoácidos, vitaminas u otras moléculas orgánicas.
2. Humedad del suelo: Los microorganismos, igual que todos los organismos,
necesitan humedad para crecer, ya que se componen por más de un 80% de
agua. Por lo tanto, es importante mantener el contenido de humedad a un nivel
adecuado, que de acuerdo a varios autores, es de 50 a 80%.
3. pH del suelo: La acidez o alcalinidad de una solución afecta el crecimiento de los
microorganismos. La mayoría de las bacterias crecen de manera óptima, en un
rango de 6.5 a 7.5, aunque hay excepciones.
4. Temperatura: La temperatura óptima para el crecimiento de las bacterias
aisladas del suelo es entre 20 y 25°C.
OBJETIVO GENERAL
Caracterizar e identificar bacterias de consorcios bacterianos aislados de suelos
agrícolas, con capacidad de crecimiento sobre plaguicidas organofosforados.
4
MATERIAL Y METODOS
Los consorcios bacterianos previamente aislados de suelos agrícolas del estado
Morelos (Sánchez-Salinas 2005) fueron empleados para la obtención de cepas puras.
Se realizaron cinéticas de crecimiento de los consorcios y fueron cultivaron en 30 mL de
medio mineral a 10, 25 y 40 mg/L de paratión metilico y 40,60 y 100 mg/L de cadusafos
como única fuente de carbono. Se cultivaron por un periodo de 120 horas, a una
temperatura de 25°C, 150 rpm y bajo ausencia de luz.
Proceso de selección y obtención de colonias puras (Ortiz-Hernández et al. 2002).
Las colonias se eligieron en función de su morfología, tamaño, color, consistencia,
bordes y superficie. Fueron cultivadas en placas con agar de soya de tripticaseína
(ATS) conteniendo 15 mg/L de paratión metilico y cadusafos (concentración final). Se
tomaron aquellas que se lograron aislar para asegurar la pureza. Las colonias se
incubaron durante 24 horas a 37ºC, este procedimiento fue repetido varias veces para
asegurar el aislamiento de las colonias.
Caracterización de los consorcios bacterianos. El sistema de identificación
bacteriana BBL-Crystal® fue empleado para la identificación bacteriana, adicionalmente
se aplicaron diferentes pruebas bioquímicas como rojo de metilo, Voges Proskauer,
Indol, tinción de Gram, oxidasa, fermentación de carbohidratos, motilidad y citrato de
Simons (Koneman et al. 1992). El procedimiento para la identificación fue realizado de
acuerdo con Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology (Krieg y Holt 1984).
Conservación de los consorcios. Los consorcios bacterianos y las cepas puras se
adicionaron a la colección bacteriana del Laboratorio de Investigaciones Ambientales,
utilizando tubos eppendorf con glicerol adicionado con cada plaguicida a una
concentración final de 25 mg/L y conservados a una temperatura de -70ºC en un
congelador REVCO (Yañez-Ocampo 1998).
RESULTADOS Y DISCUSION
De los consorcios seleccionados se aislaron 6 cepas puras para el consorcio bacteriano
aislado en presencia de Paratión metílico (CB-SP) y 5 para el consorcio bacteriano
aislado sobre medio con Cadusafos (CB-SC). Las diversas pruebas bioquímicas
aplicadas, además del sistema de BBL Crystal, proporcionaron la información que
permitió la identificación y el porcentaje de confiabilidad para cada cepa bacteriana
(tabla 3). Las cepas fueron identificadas como: Bacillus brevis, Stenotrophomonas
maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pseudotuberculosis, Weeksella virosa,
Flavobacterium odoratu, Burkholderia cepacia, Pseudomonas stutzeri.
5
Tabla 3. Pruebas bioquímicas de las cepas aisladas.
Clave
CB-SP1
CB-SP2
CB-SP3
CB-SP4
CB-SP5
CB-SP6
CB-SC1
CB-SC2
CB-SC3
CB-SC4
RM
-
V-P
-
Gram
+
-
Indol
-
Mot
+
+
+
+
++
-
Cat
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
F-C
Ac
SC
Alc-SC
Alc-SC
SC
Alc-SC
Alc-SC
Alc-SC
Alc-SC
Ox
+
-(+)
+
+
+
-
CS
+
+
+(-)
+
+
+
-
Forma
Bacilo
Bacilo
Bacilo
Bacilo
Cocobacilo
Bacilo
Cocobacilo
Coco
Bacilo
Bacilo
Identificación (sistema BBL)
Bacillus brevis 97%
Stenotrophomonas maltophilia 98%
Pseudomonas aeruginosa 97.67%
Stenotrophomonas maltophilia 97.19%
Yersinia pseudotuberculosis 99.99%
Weeksella virosa 97.67%
Flavobacterium odoratum 85%
Burkholderia cepacia 75%
Burkholderia cepacia 99.8%
Stenotrophomonas maltophilia 99.8%
Alc-SC
CB-SC5
+
+
Alc-SC
+
+
Coco
Pseudomonas stutzeri 87.67%
RM = Rojo de metilo; V-P = Voges-Proskauer; Gram = Tinción de gram; Mot = Motilidad; F-C = Fermentación de carbohidratos; CS
= Citrato de simons; Ac = Acido.
Características de las bacterias identificadas
Bacillus brevis. Este género es típico de la familia Bacillaceae, comprende más de 40
especies de bacilos aerobios y anaerobios facultativos grampositivos que producen
endosporas y son generalmente cilíndricos o elipsoidales. La mayor parte de las
especies producen catalasa (Grimont et al. 1991). Las especies de Bacillus son de
naturaleza ubicua y habitan en el suelo, agua y polvo del aire. Bacillus brevis mide 0.60.9 µm x 1.5-4 µm. Algunas pueden ser parte de la flora intestinal normal del hombre y
los animales (Krieg y Holt 1984). B. brevis, se ha aislado principalmente de suelos, de
agua y de alimentos. Este microorganismo produce antibióticos como la gramicidina y la
tirotricina (Zinsser 2004). Esta especie fue aislada a partir de suelos agrícolas con un
amplio historial de aplicaciones de plaguicidas organofosforados. Crawford (1975)
informa que esta especie presenta una importante eficiencia en remoción de
hidrocarburos. B. brevis, resultó ser la cepa con mayor capacidad de crecimiento en un
medio mínimo con paratión metílico como única fuente de carbono.
Stenotrophomonas maltophilia. Anteriormente conocida como Pseudomonas maltophilia
o Xantophomonas maltophilia, es un bacilo gram-negativo no fermentativo, aerobio,
(Schaumann 2003). Móvil mediante varios flagelos polares, es un microorganismo
ubicuo que ha sido aislado en numerosas fuentes de agua: ríos, pozos, lagos, agua
embotellada, y aguas negras; suelo; animales; alimentos; plantas y residuos orgánicos
(López et al. 2003). Lee et al. (2002), reportan a esta especie con capacidad para
degradar tolueno, benceno, etilbenzeno, y xileno, esto permite plantear su potencial en
la degradación de residuos de plaguicidas, suelos y aguas contaminados con estos
xenobioticos.
Pseudomonas aeruginosa. Es un bacilo gram-negativo versátil, aerobio, pertenece a la
familia pseudomonadaceae, mide 0,5 a 0,8 µm por 1,5 a 3,0 µm, son móviles por medio
de un flagelo polar, habita en suelo y agua. Su temperatura óptima para el crecimiento
es 37ºC y crece a temperaturas de hasta 42ºC. Es un patógeno oportunista causa
infecciones de la zona urinaria, infecciones del sistema respiratorio, dermatitis,
bacteremia, y las infecciones gastrointestinales. Es resistente a las altas
concentraciones de sales y de tintes, de antisépticos débiles, y de muchos antibióticos
6
comúnmente usados (Zinsser 2004). Esta bacteria es capaz de utilizar una enorme
variedad de compuestos orgánicos como sustrato para crecer, capacidad que le permite
colonizar nichos en los que son escasos los nutrimentos que otros organismos pueden
asimilar. Se han reportado cepas de P. aeruginosa que tienen la capacidad de degradar
alcanos y alquenos de cadena ramificada y que, por tanto, son útiles en la limpieza de
sitios contaminados con estos compuestos o con metales pesados (Soberón-Chávez et
al. 1994).
Yersinia pseudotuberculosis. El genero Yersinia incluye 11 especies, tres de las cuales
son potencialmente patógenas para humanos: Yersinia pestis, Yersinia
pseudotuberculosis y Yersinia enterocolitica. Yersinia Pseudotuberculosis es un
cocobacilo gram negativo, pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Aislada por
primera vez en 1883 por Malasez y Vignal el organismo recibió distintos nombres hasta
concluir en el genero Yersinia. La designación de pseudotuberculosis deriva de la
característica histopatológica encontradas en nodos linfáticos mesentéricos. Yersinia
pseudotuberculosis se encuentra distribuida ampliamente en el ambiente (suelo, agua,
vegetales, etc) esta bacteria es el patógeno principal de animales salvajes y domésticos
en todos los continentes. Casi todas las especies de animales son vectores. Es la
causante, en los gatos, de la pseudotuberculosis felina, enfermedad de pronóstico fatal
en la que se producen lesiones piogranulomatosas generalizadas. El contagio es por la
ingestión de pequeñas aves y roedores que son portadores de la bacteria; en el hombre
es la responsable de la peste bubónica. Aun cuando no hay reportes de su posible
capacidad de degradación de xenobioticos y su patogenicidad, es importante realizar
experimentos de cinéticas de degradación de la cepa y de sus extractos enzimáticos,
afín de confirmar su capacidad de transformación de los organofosforados y la
posibilidad de continuar con otros trabajos con herramientas moleculares.
Weeksella virosa. Es un bacilo gram-negativo, catalasa positiva. (Reina et al. 1990). Se
reporta como un nuevo género y una nueva especie, aerobias, no presentan movilidad,
son aisladas de los especimenes clínicos humanos (Holmes et al. 1986). En relación
taxonómica las flavobacterias son suficientemente similares al género Weeksella por lo
que Botha et al. (1989) sugieren la inclusión posible en este género. Además
mencionan que Weeksella virosa presenta una semejanza con Bergeyella, al ser
examinadas por taxonomía numérica (Botha et al. 1998). Hasta el momento no se sabe
donde clasificarla, debido a la semejaza que presenta con estas dos bacterias. No se
encontraron reportes acerca de su capacidad de crecer o degradar algún xenobiotico.
Flavobacterium Odoratum. Se encuentra en suelo, agua, plantas y materias del
alimento. Mide 0.5 µm x 1.0-2.0 µm, es un cocobacilo gram negativo, aerobio facultativo
y presenta movilidad por flagelos peritricos. Las colonias son generalmente de color
amarillo, producen olor a frutas. Es característico que reduzcan nitritos pero no nitratos.
Son no fermentadores, indol negativo, oxidasa positiva. Algunas especies del
Flavobacterium son capaces de degradar el pentaclorofenol y otros compuestos
similares. Éste es un ejemplo de las capacidades de biodegradación de este género
(Korin 2004).
7
Burkolderia cepacia. Pertenece a la familia Pseudomonadaceae que incluye cuatro
géneros diferentes (Pseudomonas, Xanthomonas, Frateuria y Zooglea). Esta especie
se ubica dentro del género Pseudomonas. En medio sólido TS en un periodo de 24
horas a 28ºC se observan colonias grandes 4-6 mm de diámetro, distribuidas por todo
el medio, poseen una forma fusiforme con bordes ondulados irregulares y una
superficie convexa, presentan un color café claro y son opacas (Yañez-Ocampo 1998).
B. cepacia (antes denominadas Pseudomonas cepacia) es un bacilo Gram negativo no
fermentador, multiresistente. Es un reconocido patógeno en pacientes portadores de
fibrosis quística (FQ) y neutropénicos. Descrito en 1950 como patógeno de plantas,
especialmente encontrado en cebollas y ampliamente distribuido en el suelo, puede
también crecer en antisépticos (Gil 2001). Burkholderia cepacia se reporta para la
biorecuperación de suelos contaminados con residuos tóxicos (Hillyard 2005).
Pseudomonas stutzeri. Es una bacteria gram negativa, presenta respiración aeróbica,
presenta motilidad, crece a una temperatura optima de 37ºC. Auto compiten con otras
bacterias a un pH 8.2. Puede crecer en niveles bajos de hierro y degradar el tetracloruro
de carbono a bióxido de carbono o a otros compuestos inertes (Dybas 1995). Secretan
una biomolecula, pyridine-2,6-bis (thiocarboxylic acid) (PDTC). Esta biomolécula es
usada en transformaciones de tetracloruro de carbono a CO2 (Lewis 1999). Es un
microorganismo con una extraordinaria variabilidad fenotípica y genotípica. Debido a
esta enorme variabilidad genotípica la especie se subdivide en genomovares,
entendiendo a la genomovar como un estatus taxonómico provisional que agrupa a
cepas genotípicamente similares dentro de una misma especie. En la actualidad se
conocen 18 genomovares diferentes (Cladera et al. 2005). Son muy numerosas las
publicaciones en las que se hace referencia a la capacidad de Pseudomonas sp. Para
sobrevivir e incluso degradar una amplia variedad de compuestos orgánicos como los
plaguicidas, los hidrocarburos derivados del petróleo y otros compuestos halogenados
(Fuenmayor y Rodríguez 1997, Lee y Kim 1997, Ashok et al. 1995, Lebkowska et al.
1995, Chablain et al. 1997, Whyte et al. 1997, Kallastu et al. 1998, Kumasi et al. 1998,
Moller et al. 1998, Bieszkiewics et al. 1998, Hubert et al. 1999, Isken et al. 1999).
Diferentes bacterias identificadas son reportadas como patógenas, sin embargo con un
manejo adecuado como el tratamiento de residuos en reactores, o bien utilizando
herramientas moleculares como la clonación y la transformación, pueden ser utilizadas
en el tratamiento de residuos de plaguicidas como el paratión metílico y cadusafos y
probablemente de otros de la misma familia química.
CONCLUSIONES
Se identificaron ocho especies bacterianas: Bacillus brevis, Stenotrophomonas
maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pseudotuberculosis, Weeksella virosa,
Flavobacterium odoratu, Burkholderia cepacia, Pseudomonas stutzeri.
Bacillus
brevis,
Stenotrophomonas
maltophilia,
Pseudomonas
aeruginosa,
Flavobacterium odoratu, Burkholderia cepacia, Pseudomonas stutzeri, han sido
reportadas por su capacidad de degradar diferentes xenobioticos.
8
Los géneros identificados son pobladores frecuentes de suelos y aguas.
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