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EXPRESIÓN DE GENES CATABÓLICOS DURANTE LA BIODEGRADACIÓN
DE HIDROCARBUROS AROMATICOS BAJO CONDICIONES AEROBIAS Y
ANAEROBIAS.
1,2*
1
Jesús Antonio Morlett Chávez , Hugo Barrera Saldaña , Ángeles del Carmen Flores
2
2
3
Samaniego , Xochitl Areli Gonzalez Gonzalez , Nagamani Balagurusamy .
1
Depto. de Bioquímica y Medicina Molecular, Facultad de Medicina, Universidad autónoma de Nuevo
León. Av. Madero Pte. y Dr. Aguirre-Pequeño s/n, Monterrey, N.L., México.
2
Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Coahuila, Unidad Saltillo. Blvd. V.
Carranza y J. Cárdenas V., Saltillo, Coahuila, CP 25280. Tel/Fax: (844) 415 57 52,
3
Nagamani Balagurusamy, Escuela de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma de Coahuila, Unidad
Torreón. *Correo electrónico: [email protected]
1.
RESUMEN
La creciente utilización de hidrocarburos en actividades cotidianas deriva en un constante problema de
contaminación. Sin embargo existen microorganismos que han desarrollado la capacidad de degradar este tipo de
compuestos, siendo este un método práctico que pudiera ser eficaz para disminuir el problema en los sitios
contaminados. En este trabajo se pretende marcar la atención a la biorremediación, dando especial atención a un
grupo de genes catabólicos capaces de remover hidrocarburos aromáticos bajo condiciones aerobias y anaerobias.
2. INTRODUCCIÓN
La extraordinaria versatilidad de las bacterias para utilizar diferentes hidrocarburos como única fuente de carbono y
de energía se evidenció debido a su potencial por oxidar diferentes compuestos xenobióticos. Estos compuestos
son de origen natural o químicamente sintetizados por las actividades humano-industriales, sin embargo, estos
compuestos diariamente son descargados al medio ambiente, generando un gran problema de contaminación. Para
tratar de disminuir la contaminación de estos compuestos aromáticos se han utilizado bacterias, estas bacterias
contienen una amplia variedad de rutas catabólicas. Sin embargo, hay limitaciones para aislar microorganismos con
capacidad de crecer en diferentes compuestos orgánicos y en la comprensión acerca de los genes que codifican
para las proteínas relacionadas con la degradación de los compuestos xenobióticos.
3. DEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS POR DIFERENTES MICROORGANISMOS.
La presencia de los compuestos aromáticos en la biosfera a través de la historia, explica por qué los
microorganismos han desarrollado diferentes vías metabólicas usando estos compuestos como un sustrato y una
fuente de energía para su crecimiento, consiguiendo así que una gran variedad de microorganismos puedan
mineralizar los compuestos de interés (Widdel y Rabus, 2001). Las primeras investigaciones acerca de este tema se
enfocaron en el medio ambiente que rodeaba a los microorganismos que se localizaban en los depósitos de petróleo
(Chakraborty y Coates, 2004).
Diferentes procesos han sido diseñados para la remoción de compuestos aromáticos, como: métodos físicos
(adsorción por carbono activado), químicos (por extracción con solventes, oxidación química) y biológicos (utilizando
microorganismos aerobios y/o anaerobios) (Shan Gen, 2002). Siendo, los procesos microbiológicos, por su
versatilidad bioquímica y molecular, así como por razones de protección ambiental, la mejor alternativa para la
remoción de los compuestos aromáticos, ya sea en condiciones aerobias o anaerobias (Cuadro 1) (Kleerebezem y
cols., 1999).
Cuadro 1. Comparación de los procesos aerobios y anaerobios en la degradación de compuestos aromáticos.
AEROBIO
ANAEROBIO
Activación del anillo aromático
Aceptor final de electrones
Producción de biomasa
Requerimientos nutricionales
Productos intermedios
Enzimas
Productos finales
4.
O2
O2
Mayor producción
Menor
Catecol, protocatecuate
Mono, di-oxigenasas
CO2, H2O
CH3, H2O, COOH
NO-3, SO2-4 , Fe (III) y CO2-3
Menor producción
Mayor
Benzoil CoA, Floroglucinol, resorcinol
CoA ligasa, Benzoil CoA
CH4, CO2, H2S/N2
CATABOLISMO DE LOS COMPUESTOS AROMÁTICOS.
a. CATABOLISMO AEROBIO.
En los procesos aerobios, la remoción de los compuestos aromáticos puede llevarse a cabo por hongos,
actinomicetos y bacterias que contienen mono o di-oxigenasas, utilizando el oxígeno para la activación y ruptura del
anillo aromático. El oxígeno sirve también como aceptor final de electrones para la oxidación completa de estos
compuestos. Sin embargo, la disminución del oxígeno disuelto de los sitios contaminados limita la biodegradación
del Benceno, Tolueno, Etilbenceno y Xileno (BTEX) (Grbic-Galic y Vogel, 1986).
Los estudios por la vía aerobia para el catabolismo de los compuestos aromáticos han demostrado que estas
enzimas (mono-oxigenasas y di-oxigenasas), llevan a cabo el primer paso que es la activación para la conversión
de los compuestos aromáticos. Posteriormente, los compuestos son transformados a un número ilimitado de
productos intermedios como son el protocatecuate y catecol. La ruptura del catecol es catalizada por la 1, 2 dioxigenasa y la del protocatecuate por la 3,4 di-oxigenasa, convirtiéndolos en piruvato o acetaldehído. Cuando el
anillo del catecol o protocatecuate se rompe en su posición meta u orto, se convierten a β-Cetoadipato. Dos pasos
adicionales completan la conversión de β-Cetoadipato a productos intermedios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos
como se muestra en la Figura 2. Si el anillo se rompe en su posición para, se convierte en piruvato o acetaldehído y
entran directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Heinaru y cols., 2000 y Buchan y cols., 2000). Los estudios
filogenéticos de la secuencia de aminoácidos de las proteínas relacionadas con la biodegradación de los BTEX
demostraron una alta similitud en sus secuencias, lo cual indica que estas proteínas provienen de un gen ancestral
común (Figura 1) (Hendrickx y cols., 2006).
Figura 1. Formación de Protocatecuate en condiciones aerobias (Buchan y cols., 2000).
b. CATABOLISMO ANAEROBIO.
La biodegradación anaerobia es un simple pero efectivo proceso biológico para el tratamiento de diferentes residuos
orgánicos y la producción de energía en forma de biogás CH4 (Karakashev y cols., 2005). Además es un proceso
mediado por la asociación sintrófica (consorcios) de grupos de bacterias (tabla) como las a) fermentativas
(Acidogénicas y Acetogénicas) b) Desnitrificantes (BD), c) Sulfato Reductoras (BSR) y d) Metanogénicas (BM), entre
otras (Figura 2) (Schink, 1997 y Fries y Cols., 1994).
Figura 2. Bacterias participantes dentro de los consorcios metanogénicos; 1) bacteria fermentativa primaria; 2)
metanogénica hidrogenotrófica; 3) metanogénica acetoclástica; 4) Bacteria fermentativa “secundaria” 5) bacteria
homoacetogénica (Schink, 1997).
Algunas bacterias mencionadas como nitrato-, sulfato-reductoras (Thauera aromática y
Rhodopseudomonas palustris) y fototróficas, han sido estudiadas para establecer las vías metabólicas. Para que un
compuesto pueda ser utilizado como nutriente y degradado a través de una ruta catabólica es necesario que exista
un mecanismo de introducción de los compuestos aromáticos hacia el interior de la célula bacteriana. El transporte
de las moléculas a través de la membrana bacteriana puede ocurrir mediante tres procesos diferentes: difusión
simple, difusión facilitada y/o transporte activo por medio de la proteína permeasa. El transporte activo como bien se
sabe se realiza en contra del gradiente de concentración con intervención de la permeasa. Esta enzima presenta
alta especificidad por el sustrato y es capaz de introducir en la célula dichos compuestos. Sin embargo, los
compuestos aromáticos primero deben de ser activados antes de ser introducidos a la célula (Figura 4) Harwood y
Gibson (1997). En la degradación de los compuestos aromáticos se han estudiado por lo menos dos vías
metabólicas que son: a) la vía del fumarato y b) la vía benzoil CoA.
En cada una de ambas vías se llevan a cabo tres fases llamadas:
a) VÍA DEL FUMARATO
En esta vía se adiciona el fumarato a los compuestos aromáticos como paso inicial para la activación del proceso
catabólico, proceso llevado a cabo por la enzima benzoil succinato sintetasa (Bss), homologa a la enzima benzoil
CoA ligasa. Sin embargo, otras reacciones alternas dependen del aceptor de electrones utilizado o del tipo de
compuesto que se degrada (Chakraborty y Coates, 2004; Shinoda y cols; 2005).
b) VÍA BENZOIL COA
i) activación de la reacción: los compuestos aromáticos son activados con sustituyentes como el grupo carboxil
(carboxilación), metil (metilación) o hidróxil (hidroxilación), acyl. Las enzimas que llevan a cabo esta reacción son
hidroxilasas y la benzoil CoA ligasa (BclL), respectivamente. Por último, los productos son incorporados al material
celular.
ii) metabolismo periférico: en esta etapa se lleva acabo la reducción del anillo aromático por la benzoil CoA
reductasa (BclR). El benzoato CoA es el producto intermedio de mayor relevancia. El fluoroglucinol y el resorcinol
también son formados.
iii) metabolismo central: reacción de β oxidación (reacción final que produce acetil CoA o ácidos grasos volátiles).
Después de la formación del producto intermedio, el anillo del benzoato o Benzoil CoA es degradado por medio de
dos vías:
1) Vía pimílica: algunas bacterias reutilizan el CoA para pimelil CoA. En algunos casos este se utiliza para producir
ácidos grasos volátiles o acetil CoA. Por último el acetil CoA entra al ciclo del ácido cítrico. Está vía es utilizada por
bacterias sintróficas.
2) Vía adípica: los productos finales son convertidos hasta ácidos grasos. Vía utilizada por las BD (Figura 3).
Para las reacciones posteriores se requiere de una asociación sintrófica entre las acetogénicas (productoras de
hidrogeno y acetato), las metanogénicas (hidrogenotróficas o acetoclásticas) y/o nitrato- sulfato-reductoras. Estas
bacterias llevan al acetato y al hidrógeno en productos metabólicos comunes como CO2, CH4 y H2S (Annweiler y
cols., 2002; Heider y Fuchs, 1997; Harwood y Gibson, 1997).
Figura 3. Incorporación de los compuestos aromáticos al catabolismo celular.
5. GENES CATABOLICOS EN LAS BACTERIAS BIODEGRADADORAS.
En años recientes, se ha incrementado la búsqueda de microorganismos capaces de biodegradar compuestos
contaminantes. Estos avances se han logrado gracias al desarrollo de nuevas técnicas en genética molecular. La
detección de microorganismos biodegradadores (Cuadro 2) ha permitido explorar tanto a los genes catabólicos
como a sus productos (proteínas). Por lo tanto estas enzimas (proteínas) representan un punto importante en la
biodegradación de contaminantes. Sin embargo, existen pocos reportes sobre la diversidad genética de los
consorcios que participan en la degradación de aromáticos, porque solo pocas enzimas han sido purificadas y
además solo han sido estudiadas superficialmente (Song y Ward, 2005; Breinig y cols., 2000; Heinaru y cols., 2000;
Egland y cols., 1997; Harwood y Gibson, 1997).
Cuadro 2. Bacterias capaces de degradar compuestos aromáticos en condiciones aerobias y anaerobias.
Funte de carbono
Bacterias aerobias
Fuente de carbono
Bacterias anaerobias
Desulfotomaculum
gibsoniae,
T. aromatica
R. palustres
Desulfobacula toluolica
Fenol y p-cresol
Pseudomona putida, P.
fluorescens, P. mendocina,
P. corrugada
Fenol
Ácido fenil acético, ácido
3 y 4 hidroxifenilacético
E.coli
Fenil-acetato
Tricloro etileno
Rhodococcus sp.
Alquil bencenos
T. selenatis
Tolueno y naftaleno
Sphingomonas capsulata,
Sphingomonas pavcimobilis
Resorcinol
Azoarcus anaerobius
Naftaleno,
dibenzotiofenos,
fenantreno y fluoreno.
Cycloclastycus sp.
Etil-benceno
Azoarcus strain
2 secbutil 4,6 dinitrofenol
Tolueno
Naftaleno y fenantreno
2,6 diclorofenol
A. evansii
Clostridium bifermentans
Mycobacterium sp.
Neptumonas naphtovorans
Ralstonia sp
Tolueno
T. aromática,
Decloromonas, A.
tolulyticus
D. cetonicum, D.
toluolica
m-Xyleno,
o-Xyleno y
p- Xyleno
mXyS1, oXyS1
Benceno
Decloromonas
Catecol
A. anaerobius,
D. anilina
a. GENES CATABÓLICOS REGULADOS AERÓBICAMENTE.
La biorremediación (término también conocido como biodegradación) bajo condiciones aerobias de los compuestos
aromáticos es comúnmente iniciada por un grupo de enzimas conocidas como mono-, di-oxigenasas (Witzig y cols.,
2006). Estás enzimas actúan sobre un amplio grupo de hidrocarburos aromáticos incluyendo a los BTEX, los cuáles
son utilizados por los microorganismos como única fuente de carbono y de energía. El gen Bed, codifica para la
enzima benceno 1,2 dioxigenasa (BeD) y esta es una enzima ampliamente estudiada. Así mismo el gen Tod codifica
para la tolueno dioxigenasa, las secuencias de Bed y Tod tiene alta similitud, sin embargo, solo describiremos la
enzima BeD. Esta enzima cataliza la hidroxilación del benceno para producir benceno cis-hidrodiol, primer paso
durante la biodegradación de los compuestos xenobióticos. Las proteínas tienen un sistema de 3 componentes a)
flavoproteína reductasa; b) una ferredoxina (transfiere electrones desde el NADH) y c) un centro catalítico con un
clúster de Fierro-Sulfuro (ISP). El ISP está formado por dos proteínas diferentes, estás son conocidas como la
subunidad α y la subunidad β. La subunidad α participa en la transferencia de electrones, contiene el centro
catalítico de estás enzimas y contiene el sitio de unión al sustrato y es responsable de la especificidad sobre el
substrato. Los genes que codifican para la benceno y tolueno dioxigenasa han sido clonados secuenciados y
expresados en E. coli. pero la estructura molecular de estas proteínas aún no ha sido determinada (Witzig y cols.,
2006; Bagneris y cols., 2006 y Baldwin y cols., 2005).
Otra enzima importante durante la biodegradación de los BTEX, es la catecol dioxigenasa (C23O). Esta
enzima pertenece a la familia de las extradiol dioxigenasas y cataliza la ruptura del catecol, para producir cloro-,
metil y etil catecol. Una amplia variedad de C23O han sido aisladas de diferentes bacterias. La C23O llega a ser
inestable debido a que en el sitio activo se encuentra un Fe (III). La bacteria tiene un sistema para reducir el Fe (III)
del sitio catalítico a Fe (II), para que C23O sea activa. Los genes xyl E y nanH, ambos codifican la enzima catecol
dioxigenasa (Parales y cols., 1997) (Figura 4).
Figura 4. Organización génica de Rhodococcus sp. cepa DK17. Las flechas negras representan a los
genes relacionados con la degradación de los BTEX. En gris se muestra a los genes regulatorios. En blanco se
muestra a los genes con una función desconocida.
b. GENES CATABÓLICOS REGULADOS ANAERÓBICAMENTE.
Bajo condiciones anaerobias los genes que codifican para las enzimas BclL y BclR, así como, Bss; se han
identificado (Figura 5). Los genes BadDEFG/BcrCBD de R. palustris codifican para la proteína Bclr, mientras que el
gen BadA/BcrA codifica para la enzima BclL, las secuencias nucleotídicas en ambos genes están altamente
conservadas. Estos genes se transcriben en forma de operón y son inducidos por los compuestos aromáticos (Song
y Ward, 2005; Schühle y cols., 2003 y Egland y Cols., 1997).
BssD
BssC
BcrC
BssA
BcrB
BssB
BcrA
BssE
BcrD
Figura 5. El operón Bcr de R. palustris tiene su homologo en T. aromatica (Bcr).
La enzima BclR es un heterotetramero compuesto por las subunidades α, β, γ y δ (BcrCBAD). Las
subunidades α y δ tienen sitios de unión al ATP. Mientras que las subunidades γ y β contienen sitios de unión al
benzoato CoA (Song y Ward, 2005). Wischgoll y cols. (2005), clonaron el gen BadA de Geobacter metallireducens
(cepa anaerobia estricta y crece en presencia de diferentes compuestos aromáticos) y lo expresaron en E. coli
(Figura 6). La enzima Bclr como ya se ha mencionado es esencial para la reducción del anillo aromático.
Figura 6. Análisis de la fracción de proteínas (gel desnaturalizante de acrilamida) durante la purificación de la
benzoato CoA ligasa de G. metallireducens. M= Peso molecular, 1-3 extractos celulares de E. coli que contienen la
benzoil CoA sobre-expresada; 4-5 purificación de la benzoil CoA, 6 residuos de la purificación.
También en A. tolulyticus y en T. aromatica, se han identificado los genes estructurales que codifican para
la enzima Bss. Esos genes se han denominado BssCAB, que junto con otro par de genes denominados BssD y E,
están organizados también en un operón de la siguiente forma BssDCABE. BssA codifica para la Bss subunidad α,
mientras que el gen B codifica para la subunidad β. Se cree que BssD codifica para una enzima que activa a BssAB.
Por su parte, Shinoda y cols. (2005), indicaron que en la cepa Magnetospirillum, se encuentran ambos operones
(BadDEFG y BssDCABE) homólogos a los operones de A. tolulyticus, T. aromatica y R. palustris. Sin embargo,
también indicaron que los genes bss se transcribieron solo en las células que se expusieron al tolueno en
anaerobiosis. Mientras que los genes bclL y BclR se expresaron en las células que tienen como única fuente de
carbono benzoato y tolueno. En estas bacterias se ha encontrado un segundo operón que está relacionado con la
reacción de β-oxidación. Este operón es conocido como BbsEFGHCDBAI y se expresa solo en aquellas células que
han crecido en presencia de tolueno (Washer y Edwards, 2006; Kühner y cols., 2005; Leuthner y Heider, 2000).
6. CONCLUSIÓN
El empleo de microorganismos para la biorremediación de sitios contaminados con hidrocarburos es una opción
viable por ser una tecnología sencilla, de bajo costo y afín con el medio ambiente, sin embargo, una desventaja es
que los microorganismos son específicos para la degradación de un solo compuesto. Por su parte, el estudio de
genes catabólicos nos permitirá realizar mejoras génicas en los microorganismos, para incrementar los procesos de
bioremediación. Así pues, la construcción de operones genéticamente modificados puede ser un nuevo reto para la
biología molecular e ingeniería genética, en donde un compuesto aromático sea capaz de inducir varios operones
catabólicos o producir enzimas especializadas para la remoción de compuestos xenobióticos/recalcitrantes.
Además, en los últimos años, se han identificado proteínas involucradas en el metabolismo de los hidrocarburos
aromáticos y se ha observado que algunos genes/proteínas catabólicas presentan modificaciones o cambios de un
solo nucleótido que los hace mejores en el reconocimiento y remoción de los xenobioticos, sin embargo, no se ha
aprovechado al máximo cada una de esas proteínas. En nuestra región escasos procesos biotecnológicos se han
desarrollado para su uso en la biorremediación. Por lo que es necesario, realizar estudios acerca de los
microorganismos que juegan un papel importante en la biodegradación, de los genes catabólicos y su expresión
traducida en proteínas.
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