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Departamento de Biotecnología
Biotecnología de enzimas: Inmovilización
Sergio Huerta Ochoa
UAM-Iztapalapa
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Catálisis enzimática heterogénea
Para combinar las ventajas de la catálisis homogénea y heterogénea,
se desarrolló la heterogenización de la catálisis homogénea
Las enzimas inmovilizadas son enzimas físicamente confinadas o
localizadas en una cierta región definida de espacio con la
retención de sus actividades catalíticas, que pueden ser usadas
repetidamente y continuamente
Los métodos más comunes de inmovilización de enzimas
Heterogenización de enzimas solubles a través del acoplamiento de
un soporte insoluble mediante: adsorción o enlace covalente, por
entrecruzamiento de la enzima o por atrapamiento en un enrejado o
en microcápsulas
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Las propiedades de las enzimas inmovilizadas están gobernadas
por las interacciones de las propiedades de la enzima y el material
del soporte
Enzima
Soporte
Propiedades bioquímicas
Características químicas
Tipo de reacción y cinética
Propiedades mecánicas
Método de inmovilización Efectos de transferencia de masa Estabilidad operacional
Rendimiento (%)
Eficiencia (η)
# de ciclos
Comportamiento
Consumo de enzima (U/kg producto)
Productividad (kg producto/U)
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Inmovilización de enzimas
• Costo de la enzima
• Grado de purificación requerido de la enzima
• Costo del proceso de inmovilización
• Estabilidad de la enzima
• Efectos de inhibición y envenenamiento
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Pros y contras de la Inmovilización
PROS
Alta estabilidad y resistencia al
esfuerzo cortante y a la
contaminación
Fácil de desarrollar procesos
continuos
Rápidas tasas de reacción
Fácil separación de los productos
Uso repetitivo del catalizador
CO(TRAS
Existencia de la resistencia a la
transferencia de masa
Necesidad del proceso de
inmovilización
Costos adicionales de reactivos
para la inmovilización
Pérdida de actividad durante la
etapa de inmovilización
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Inmovilización de enzimas
La inmovilización es la restricción espacial de la movilidad de la enzima
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Métodos de inmovilización
A
B
A: Métodos de enlace a
soportes
a) Enlace covalente;
b) Adsorpción física;
c) Fuerzas electrostáticas
C
B: Entrecruzamiento
C: Atrapamiento
Enzyme in Industry: Production and Applications, pg 66.
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Atributos ideales de un soporte
•
•
•
•
•
•
•
•
Alta área superficial
Permeable
Insoluble
Alta rigidez
Regenerable
Resistente a ataque microbiano y químico
Estable mecánicamente y térmicamente
Hidrofobicidad controlada
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Métodos de inmovilización claves
• Unión Covalente
–
–
–
–
Glutaraldehido
CNBr-activación
Ácidos cíclicos (glicoproteinas)
Carbodimidas
Más común para enzimas
• Adsorción
– Intercambio iónico
– Hidrofobicidad
• Entrecruzamiento
• Encapsulación
– Geles poliméricos
– Liposomas y otras bicapas
• Métodos emergentes
–
–
–
–
Avidin/streptavidin y biotin
Oligonucleótidos-protein fusions
Materiales biocatalíticos
Silicones/silicatos/sol-geles
Más común para células
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Métodos de inmovilización: Soportes
Tipos de enlace
Tipos de Soporte
• Enlace covalente
• Inorgánicos: p.ej.
Sílica, Vidrio poroso
• Adsorción física
• Orgánicos: p.ej.
Poliamida,
Poliacrilamida
• Enlace iónico
• Biológicos: p.ej.
Celulosa, Quitosano
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Enlace Covalente
El soporte en este caso es amino alkoxy silano
Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237
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Enlace Covalente
Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237
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Adsorción Física
• Los biocatalizadores enlazan a los soportes por
interacciones físicas tales como interacciones
hidrofóbicas, fuerzas de van der Waal’s, etc.
• Frecuentemente se usan soportes inorgánicos.
Actualmente, están disponibles varios materiales
naturales que tienen fuertes capacidades de adsorción.
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Unión a un soporte por adsorción física
El método se basa en la adorción física de las moléculas de
enzima en la superficie de una matriz sólida, poniendo en
contacto una solución acuosa de enzima con el soporte.
Métodos de
adsorción física
Procedimiento estático
Electrodeposición
Proceso de reactor
Baño con agitación
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Métodos de inmovilización : Atrapamiento
El método de atrapamiento de inmovilización está
basado en la localización de una enzima dentro de un
enrejado de una matriz polimérica o membrana de tal
forma que previene la liberación de proteina mientras
permite la penetración de substrato.
- La enzima no se enlaza de ninguna forma a la matriz
del gel o a la membrana.
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Métodos de inmovilización : Entrecruzamiento
Definición: Formación de enlaces covalentes entre las
moléculas de enzima, por medio de reactivos bi- o
multifuncionales, formando agregados entrecruzados
tridimensionales.
Métodos: Adición de una cantidad apropiada de agente
entrecruzante a una solución de enzima bajo condiciones
que den un aumento en la formación de enlaces covalentes
múltiples.
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Métodos de inmovilización: Entrecruzamiento (cont…)
Handbook of Enzyme Biotechnology, pg. 585
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Limitaciones difusionales en sistemas de enzimas
inmovilizadas
J s = k L ( Sb − S s ) =
Da =
Vm S s
K m + Ss
V
maximum rate of reaction
= m
maximum rate of diffusion k L Sb
Da<<1
Limitado por reacción
Da≈1
Reacción y difusión resistencias comparables
Da>>1
Limitado por difusión
Da = úmero de Damhköler
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Factor de efectividad
Para reacciones donde las limitaciones pueden ser importantes, la
tasa de reacción aparente es frecuentemente expresada en términos
de un factor de efectividad, η
reaction with diffusional limitations
η=
intrinsic reaction rate
Para una reacción enzimática que sigue la cinética de Michaelis-Menten
rsurface
Vm S s
=η
K m + Ss
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Limitaciones difusionales para enzimas inmovilizadas
en pellets porosos
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Perfil de concentración en estado estacionario en pellets
porosos
Consideraciones:
Cinética de Michaelis-Menten
Enzima uniformemente distribuida a través del pellet
No hay partición de substrato entre el interior y el exterior del pellet
Ecuaciones gobernantes:
 d 2 S 2 dS 
Vm S
De  2 +
=
r dr  K m + S
 dr
S ( R) = S s
dS
dr
=0
r =0
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Adimensionalización
Km
S
r
S = ,r = ,β =
Ss
R
Ss
Definir variables adimensionales:
Introducir en los balances de masa y las condiciones frontera
d2S
2 dS
S
2
+
=φ
2
r dr
S
dr
1+
β
dS
S (1) = 1,
dr
r =0
Vm K m
= 0, φ = R
De
A menos que la reacción sea de 1er orden, el sistema no tiene solución
analítica con la cinética de Michaelis-Menten
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Gráfica η versus φ en el sistema Michaelis-Menten
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Diseño de pellets inmovilizados
• Minimizar el radio de partícula
dentro las limitaciones
mecánicas
• Optimizar la carga de la
enzima
– Alto contenido de enzima
incrementa la tasa intrínseca de la
reacción pero disminuye el factor
de efectividad
– Bajo contenido de enzima
incrementa el factor de
efectividad pero disminuye la tasa
intrínseca de la reacción
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Reactores enzimáticos
Discontínuos (Enzimas libres e
inmovilizadas)
Tipos de
reactores
Contínuos (Enzimas inmovilizadas)
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Reactores discontínuos
Tipo tanque agitado con paletas
que incluyen enzimas inmobilizadas
Reactor de lecho empacado
con reciclado total
Tipo tanque agitado con mamparas
que incluyen enzimas inmobilizadas
Reactor de lecho fluidizado
con reciclado total
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Reactores contínuos
Reactor de lecho
empacado
Reactor de lecho
fluidizado
Reactor de fibra
hueca
Tipo tanque agitado con recuperación por ultrafiltración
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Reactor de tanque agitado contínuo
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Reactor de lecho empacado
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Reactor de lecho fluidizado
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Reactor de membrana
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Tecnología de enzimas comerciales
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
High fructose corn syrup (xylose isomerase)
L-Amino acids (amino acylase, amino acid dehydrogenases, lyases)
D-Amino acids (hydantoinase)
L-Aspartic acid (aspartase)
L-Malic acid (fumarase)
Glycidyl butyrate (lipase)
Cis-dihydrodiols (dioxygenase)
Muconic acid, chiral amines (aminotransferase)
Semisynthetic penicillins and cephalosporins (penicillin amidase)
Acrylamide (nitrile hydratase)
Phenolic resins (peroxidase)
Food applications (many)
Industrial enzyme market ca. $1.5 billion
Chiral market estimated at $5-10 billion
Discovery markets - ??? (pharma spends ca. $15B/yr)
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Aplicaciones industriales
Glucosa isomerasa inmovilizada
Información estructural
•
•
•
•
From Bacillus Coagulans, Isolated by
Novozyme, Inc.
•
GI es un tetrámero de 4 unidades
idénticas de cerca de 45,000 kDa
Compuesto como un dímero de
dímeros
Cada monómero está compuesto
de aproximadamente 16 hélices
alfa y 15 láminas beta
La interface monómeromonómero es 3 veces más
grande y fuerte que la interface
dímero-dímero
2 Mn2+ son necesarios para la
actividad xilosa y 2 Co2+ para la
actividad glucosa isomerasa
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Aplicaciones industriales
Glucosa isomerasa inmovilizada
La isomerización de glucosa a jarabes de maíz de alta fructosa
(HFCS), exclusivamente como un reemplazo de costo reducido para
soluciones de sacarosa y azúcar invertida
•Background:
Altas temperaturas de reacción para altos rendimientos de fructosa
pH ≥ 7 para la actividad y estabilidad de la enzima
PERO, la glucosa y la fructosa son inestables, fácilmente se
descomponen a ácidos orgánicos y subproductos coloreados
El tiempo de reacción debe ser minimizado
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Aplicaciones industriales
Glucosa isomerasa inmovilizada
• Condiciones del proceso:
En reactores de lecho fijo contínuos
Temperatura: 55-60 oC
pH: óptimo pH de la enzima
Los gránulos de la enzima deben ser
suficientemente rígidos para prevenir la
compactación durante la operación
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Aplicaciones industriales
Glucosa isomerasa inmovilizada
Rendimiento
Método de Inmovilización
1. La enzima, después del aislamiento y
purificación, es covalentemente
inmovilizada sobre un soporte inerte
2. Entrecruzamiento de células que
contienen las enzimas deseadas
3. La enzima parcialmente purificada es
inmovilizada sobre resinas de
intercambio iónico
(kg producto
seco/ kg enzima)
20,000
2,000-4,000
7,000- 10,000
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Conclusiones
• La inmovilización permite el uso repetitivo de la enzima
lo que significa un ahorro significativo en los costos
• La selección de los métodos de inmovilización deberán
estar basados en los requerimientos técnicos específicos
y en el marco global de su aplicación comercial