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XII Jornadas de Divulgación Técnico Científicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNR Jornada Nacional de Divulgación Técnico Científica 2011 Facultad de Ciencias Veterinarias, UNR – UNL 250º Aniversario de la Enseñanza Veterinaria Identificación de especies de Estafilococos Coagulasa Negativos Aislados de muestras de leche de Mastitis Bovina por PCR-RFLP del gen gap (Comunicación Preliminar) Srednik, M.; Bentancor, A.; Gentilini, E. Cátedra de Microbiología. Facultad de Ciencias Veterinarias, UBA. Subsidio UBACyT V011, Mastitis Bovina La mastitis bovina es una enfermedad de distribución mundial que afecta la salud de los animales y produce grandes pérdidas económicas en la industria lechera. Los estafilococos coagulasa negativos (ECN) son un grupo heterogéneo de bacterias aislados frecuentemente de mastitis bovina. Para la identificación fenotípica de los ECN se utilizan una variedad de métodos incluyendo tests comerciales (API STAPH, Staph-Zym, Vitek 2,3 system, entre otros) y el esquema convencional de Kloos y Schleifer . Estos métodos, basados en reacciones fenotípicas, muchas veces dan resultados contrapuestos en la identificación de las distintas especies de ECN. Métodos alternativos basados en características moleculares han sido 1,4 propuestos para la identificación de Staphylococcus spp . El objetivo de este estudio es aplicar polimorfismo en el largo de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP) del gen gap para la identificación de las diferentes especies de ECN aisladas de leche de mastitis bovina. Se analizaron n=29 aislamientos de ECN identificados fenotípicamente, provenientes de leches mastíticas. Las cepas de referencia incluídas en los ensayos fueron pertenecientes al American Type Culture Collection (ATCC): S. simulans ATCC 27851, S. warneri ATCC 49954, S. capitis ATCC 35661, S. sciuri subsp. sciuri ATCC 29060, S. cohnii subsp cohnii ATCC 35662, S. saprophyticus ATCC 15305, S. xylosus ATCC 29972, S. haemolyticus ATCC 29970, S. epidermidis ATCC 12228. La extraccion de ADN en todas las cepas se realizó con Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Se amplificó por PCR un fragmento de ~933 bp correspondiente al gen gap: Gap1- for 5’ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA y Gap2-rev 5’GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG. Mediante RFLP in sílico se determinaron los patrones RFLP del amplicón del gen gap y la enzima de restricción AluI utilizando el programa Restriction Mapper a partir de 20 secuencias de 20 especies ECN obtenidas de la base de datos del GenBank: S. xylosus DQ321700.1, S. warneri DQ321699.1, S. simulans DQ321698.1, S. sciuri DQ321697.1, S. lentus DQ321692.1, S. hycus DQ321689.1, S. hominis DQ321688.1, S. haemolyticus DQ321687.1, S. cohnii DQ321681.1, S. chromogenes DQ321680.1, S. caprae DQ321677.1, S. capitis subsp. urealyticus HM352966.1, S. epidermidis GU968738.1, S. cohnii subsp. urealyticus HM352971.1, S. intermedius XII Jornadas de Divulgación Técnico Científicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNR Jornada Nacional de Divulgación Técnico Científica 2011 Facultad de Ciencias Veterinarias, UNR – UNL 250º Aniversario de la Enseñanza Veterinaria DQ321690.1, S. saccharolyticus HM352969.1, S. aureus DQ647036.1, S. saprophylitus DQ321695.1, S. epidermidis DQ321683.1, S. succinus FJ578003.1. Los diferentes amplicones del gen gap obtenidos por PCR fueron digeridos con AluI. Los fragmentos de ADN resultantes se analizaron por electroforesis en gel de agarosa 2,5%. Con esta metodología de PCRRFLP se identificaron 82,8% de los aislamientos (24/29). De los 29 aislamientos evaluados se identificaron 7 especies: S. haemolyticus (3/29), S. hominis (1/29), S. caprae (1/29), S. chromogenes (12/29), S. cohnii (2/29), S.simulas (2/29) y S. xylosus (3/29) porque presentaron igual patrón que las cepas de referencia y los patrones RFLP in sílico. A su vez, las identificadas como S. chromogenes y S. caprae obtuvieron un perfil de RFLP compatible in sílico con S. intermedius y S. saprophyticus respectivamente. El 6,9% de los aislamientos (2/29) presentaron un patrón no compatible con ninguna especie. Del 10,3% de los aislamientos (3/29) no se obtuvo el amplicón del gen gap. Del análisis de los resultados hasta el momento se hace necesario el uso de otra enzima de restricción para poder diferenciar aquellas especies que mostraron idéntico patrón de digestión. La correcta identificación es esencial para conocer la participación de los ECN en las infecciones intramamarias y tomar decisiones apropiadas para su manejo. BIBLIOGRAFÍA 1. Ghebremedhin, B.; Layer, F.; König, W.; König, B. Genetic Clasification and Distinguishing of Staphylococcus Species Based on Different Partial gap, 16S rRNA, hsp60, rpoB, sodA, and tuf Gene Sequences. J. Clin. Microbiol. 46, 3: 1019-1025. 2008. 2. Ieven, M.; Verhoeven, J.; Pattyn, S.R.; Groossens, H. Rapid and economical method for species identification of clinically significant coagulase-negative staphylococci. J. Clin. Microbiol. 33, 1060-1063, 1995. 3. Kloos, W.E.; Schleifer, K.H. Simplified scheme for rutine identification of human Staphylococcus aureus species. J. Clin. Microbiol. 1: 82-88, 1975. 4. Yugueros, J.; Temprano, A.; Sánchez, M.; Luengo, J.M.; Naharro, G. Identification of Staphylococcus spp. by PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism of gap Gene. J. Clin. Microbiol. 39, 10: 3693-3695, 2001.