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Ingeniería Genética
Enzimas
Mariano N. Belaich, Vanina A. Rodríguez, Facundo Temprana
Universidad Nacional de Quilmes
Ingeniería genética
Construcciones
genéticas
Construcciones genéticas
La generación de construcciones genéticas nos introduce en el clonado
molecular.
El clonado molecular consiste en multiplicar copias idénticas de una
molécula.
En nuestro caso, las moléculas son ácidos nucleicos, y la multiplicación la
logramos utilizando materia viva.
Construcciones genéticas
Plano
Softwares
Plataforma
Vectores de clonado
Insumos
Ácidos nucleicos naturales y
artificiales
Herramientas
Enzimas
Equipamiento
Electroforesis/incubadores/PCR
Procedimientos
Estrategias y protocolos
Construcciones genéticas
Plano
Softwares
Plataforma
Vectores de clonado
Insumos
Ácidos nucleicos naturales y
artificiales
Herramientas
Enzimas
Equipamiento
Electroforesis/incubadores/PCR
Procedimientos
Estrategias y protocolos
Clonado molecular
Identificar objetivo
In silico
Diseño in silico
Aislar la plataforma
Aislar el inserto
Apertura de la plataforma
In vitro
Compatibilización de extremos
Ligación
Transferencia horizontal
Selección de ORG/plataforma
Selección de ORG/plataforma Recombinante
In vivo
Enzimas
Proteínas globulares
Solubles en entornos acuosos
Catalizadores de reacciones químicas
Enzimas
Definición de unidad enzimática
(cantidad de proteína necesaria para generar una concentración de
producto determinada a partir de una cantidad de sustrato
establecida y en condiciones de reacción fijas)
Condiciones de reacción químicas y físicas
(Entorno físico-químico en los que se realiza la reacción)
Enzimas
Buffer de almacenamiento
Criopreservante
Buffer de reacción
Tampón de pH
Fuerza iónica
Cofactores
Otros
Enzimas
Reactivos
Volúmenes
Buffer de reacción NX
1X
Ácidos nucleicos
n ng
Enzima ( n U/ul)
Unidades deseadas
otros
n ul
H2O
c.s.p.
Vf
Tiempo:
10-20 ul
Temperatura:
Presión:
Enzimas
Incubación
Inactivación
Cambio de condiciones de reacción
Enzimas
Clasificación
Nucleasas
Enzimas
modificadoras
Ligasas
Polimerasas
Enzimas: Nucleasas
Son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces fosfodiéster
DNAsas
Según sustrato
RNAsas
Endonucleasas
Según actividad
Exonucleasas
Enzimas: nucleasas
A-G-C-T-T-T-G-G-C-A-T-G-C-T
T-C-G-A-A-A-C-C-G-T-A-C-G-A
Endonucleasas
A-G-C-T-T-T-G-G-C-A-T-G-C-T
T-C-G-A-A-A-C-C-G-T-A-C-G-A
Exonucleasas
Enzimas: Endonucleasas
Endonucleasas dependientes de secuencia
Endonucleasas de Restricción
Endonucleasas independientes de secuencia
DNAsa I
Nucleasa SI
RNAsa T1
RNAsa T2
RNAsa A
RNAsa H
Endonucleasas de Restricción
Origen de estas enzimas
Clasificación de estas enzimas
Características de las Endonucleasas de Restricción Tipo II
Otras Endonucleasas
DNAsa I
Nucleasa SI
RNAsa T1
RNAsa T2
RNAsa A
RNAsa H
Enzimas: Endonucleasas
Específicas de
secuencia
5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´
3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´
3´
5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C
3´
5´
3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G
5´
5´
5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C
3´
3´
3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G
5´
Enzimas: Endonucleasas
No específicas
de
secuencia
5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´
3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´
3´
5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C
5´
3´
5´
3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G
3´
5´
5´
5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C
3´
3´
3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G
5´
Enzimas: Exonucleasas
Exonucleasas con dirección de hidrólisis 3´ a 5´
Exonucleasa I
Exonucleasa III
Exonucleasas con dirección de hidrólisis 5´ a 3´
Exonucleasa Lambda
Exonucleasa T7
Exonucleasas con dirección de hidrólisis 3´ a 5´ y 5´ a 3´
Nucleasa Bal31
Enzimas: Modificadoras
Enzimas que catalizan modificaciones de las bases nitrogenadas
y enzimas que catalizan la modificación de los extremos de un
polinucleótido
Metilasas
Fosfatasas
Quinasas
Enzimas: Metilasas
5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´
3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´
3´
5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C
3´
5´
3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G
5´
5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C
5´
3´
3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G
3´
5´
CH3
CH3
5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´
3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´
CH3
CH3
CH3
CH3
5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´
3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´
CH3
CH3
Enzimas: Fosfatasa alcalina
Enzima que cataliza la eliminación de grupos fosfato de los
extremos de un DNA/RNA
Enzimas: Polinucleótido quinasa
Enzima que cataliza la incorporación de grupos fosfato a los
extremos 5´ de un DNA/RNA
Enzimas: Ligasas
Enzimas que catalizan la formación de enlaces fosfodiéster
DNA ligasa
RNA ligasa
Requieren ácidos nucleicos con un extremo 5´ fosforilado y un extremo
3´ con OH
Requieren ATP
Enzimas: DNA Ligasas
Enzimas que catalizan la formación de enlaces fosfodiéster entre
2 dsDNA lineales
con un extremo 5´ fosforilado y un
extremo 3´ con OH
con extremos romos o cohesivos
compatibles
Enzimas: DNA Ligasas
PO4 -A-G-C-T-T-A-G-OH
OH -T-C-G-A-A-T-C- PO4
+
PO4 -T-C-A-T-G-A-C-OH
OH -A-C-T-A-C-T-G- PO4
PO4 -A-G-C-T-T-A-G -T-C-A-T-G-A-C-OH
OH -T-C-G-A-A-T-C -A-C-T-A-C-T-G- PO4
Enzimas: RNA Ligasas
Enzimas que catalizan la formación de enlaces fosfodiéster entre
2 ssDNA lineales o 2 ssRNA
con un extremo 5´ fosforilado y un
extremo 3´ con OH
Enzimas: Polimerasas
Enzimas que catalizan la polimerización de ácidos nucleicos
DNA pol I de Escherichia coli
Fragmento Klenow
Taq DNA polimerasa
Pfu DNA polimerasa
Transferasa Terminal
PolyA polimerasa
Transcriptasa Reversa
RNA polimerasa
Enzimas: Polimerasas
Necesidad de molde
Necesidad de cebador
Dirección de síntesis
Tipo de Producto
Procesividad
Actividad nucleasa
Tasa de error