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Ingeniería Genética Enzimas Mariano N. Belaich, Vanina A. Rodríguez, Facundo Temprana Universidad Nacional de Quilmes Ingeniería genética Construcciones genéticas Construcciones genéticas La generación de construcciones genéticas nos introduce en el clonado molecular. El clonado molecular consiste en multiplicar copias idénticas de una molécula. En nuestro caso, las moléculas son ácidos nucleicos, y la multiplicación la logramos utilizando materia viva. Construcciones genéticas Plano Softwares Plataforma Vectores de clonado Insumos Ácidos nucleicos naturales y artificiales Herramientas Enzimas Equipamiento Electroforesis/incubadores/PCR Procedimientos Estrategias y protocolos Construcciones genéticas Plano Softwares Plataforma Vectores de clonado Insumos Ácidos nucleicos naturales y artificiales Herramientas Enzimas Equipamiento Electroforesis/incubadores/PCR Procedimientos Estrategias y protocolos Clonado molecular Identificar objetivo In silico Diseño in silico Aislar la plataforma Aislar el inserto Apertura de la plataforma In vitro Compatibilización de extremos Ligación Transferencia horizontal Selección de ORG/plataforma Selección de ORG/plataforma Recombinante In vivo Enzimas Proteínas globulares Solubles en entornos acuosos Catalizadores de reacciones químicas Enzimas Definición de unidad enzimática (cantidad de proteína necesaria para generar una concentración de producto determinada a partir de una cantidad de sustrato establecida y en condiciones de reacción fijas) Condiciones de reacción químicas y físicas (Entorno físico-químico en los que se realiza la reacción) Enzimas Buffer de almacenamiento Criopreservante Buffer de reacción Tampón de pH Fuerza iónica Cofactores Otros Enzimas Reactivos Volúmenes Buffer de reacción NX 1X Ácidos nucleicos n ng Enzima ( n U/ul) Unidades deseadas otros n ul H2O c.s.p. Vf Tiempo: 10-20 ul Temperatura: Presión: Enzimas Incubación Inactivación Cambio de condiciones de reacción Enzimas Clasificación Nucleasas Enzimas modificadoras Ligasas Polimerasas Enzimas: Nucleasas Son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces fosfodiéster DNAsas Según sustrato RNAsas Endonucleasas Según actividad Exonucleasas Enzimas: nucleasas A-G-C-T-T-T-G-G-C-A-T-G-C-T T-C-G-A-A-A-C-C-G-T-A-C-G-A Endonucleasas A-G-C-T-T-T-G-G-C-A-T-G-C-T T-C-G-A-A-A-C-C-G-T-A-C-G-A Exonucleasas Enzimas: Endonucleasas Endonucleasas dependientes de secuencia Endonucleasas de Restricción Endonucleasas independientes de secuencia DNAsa I Nucleasa SI RNAsa T1 RNAsa T2 RNAsa A RNAsa H Endonucleasas de Restricción Origen de estas enzimas Clasificación de estas enzimas Características de las Endonucleasas de Restricción Tipo II Otras Endonucleasas DNAsa I Nucleasa SI RNAsa T1 RNAsa T2 RNAsa A RNAsa H Enzimas: Endonucleasas Específicas de secuencia 5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´ 3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´ 3´ 5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´ 5´ 3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´ 5´ 5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´ 3´ 3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´ Enzimas: Endonucleasas No específicas de secuencia 5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´ 3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´ 3´ 5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 5´ 3´ 5´ 3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 3´ 5´ 5´ 5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´ 3´ 3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´ Enzimas: Exonucleasas Exonucleasas con dirección de hidrólisis 3´ a 5´ Exonucleasa I Exonucleasa III Exonucleasas con dirección de hidrólisis 5´ a 3´ Exonucleasa Lambda Exonucleasa T7 Exonucleasas con dirección de hidrólisis 3´ a 5´ y 5´ a 3´ Nucleasa Bal31 Enzimas: Modificadoras Enzimas que catalizan modificaciones de las bases nitrogenadas y enzimas que catalizan la modificación de los extremos de un polinucleótido Metilasas Fosfatasas Quinasas Enzimas: Metilasas 5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´ 3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´ 3´ 5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´ 5´ 3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´ 5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 5´ 3´ 3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 3´ 5´ CH3 CH3 5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´ 3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´ CH3 CH3 CH3 CH3 5´ A-G-C-T-G-A-T-A-T-C-T-G-C 3´ 3´ T-C-G-A-C-T-A-C-A-G-A-C-G 5´ CH3 CH3 Enzimas: Fosfatasa alcalina Enzima que cataliza la eliminación de grupos fosfato de los extremos de un DNA/RNA Enzimas: Polinucleótido quinasa Enzima que cataliza la incorporación de grupos fosfato a los extremos 5´ de un DNA/RNA Enzimas: Ligasas Enzimas que catalizan la formación de enlaces fosfodiéster DNA ligasa RNA ligasa Requieren ácidos nucleicos con un extremo 5´ fosforilado y un extremo 3´ con OH Requieren ATP Enzimas: DNA Ligasas Enzimas que catalizan la formación de enlaces fosfodiéster entre 2 dsDNA lineales con un extremo 5´ fosforilado y un extremo 3´ con OH con extremos romos o cohesivos compatibles Enzimas: DNA Ligasas PO4 -A-G-C-T-T-A-G-OH OH -T-C-G-A-A-T-C- PO4 + PO4 -T-C-A-T-G-A-C-OH OH -A-C-T-A-C-T-G- PO4 PO4 -A-G-C-T-T-A-G -T-C-A-T-G-A-C-OH OH -T-C-G-A-A-T-C -A-C-T-A-C-T-G- PO4 Enzimas: RNA Ligasas Enzimas que catalizan la formación de enlaces fosfodiéster entre 2 ssDNA lineales o 2 ssRNA con un extremo 5´ fosforilado y un extremo 3´ con OH Enzimas: Polimerasas Enzimas que catalizan la polimerización de ácidos nucleicos DNA pol I de Escherichia coli Fragmento Klenow Taq DNA polimerasa Pfu DNA polimerasa Transferasa Terminal PolyA polimerasa Transcriptasa Reversa RNA polimerasa Enzimas: Polimerasas Necesidad de molde Necesidad de cebador Dirección de síntesis Tipo de Producto Procesividad Actividad nucleasa Tasa de error