Download Preguntas esenciales

Preguntas esenciales
1. ¿Se pueden crear nuevos genes usando DNA
recombinante?
2. ¿Se puede modificar la herencia de un organismo
usando DNA recombinante?
3. ¿Cuales son los métodos que usan los científicos
para crear moléculas de DNA recombinantes?
Tecnología del DNA recombinante,
clonación y creación de genes
quiméricos
Pero primero vamos a recordar un poco…
+ (hebra
sentido)
Un gen típico eucariota!
• ¿Qué significa Clonar?
• ¿Qué es una librería o genoteca de DNA?
• ¿Se puede amplificar DNA sin usar un organismo
vivo?
• ¿Es posible hacer cambios dirigidos en la herencia
de un organismo?
PROMOTOR
intrón 1
5’
+ (hebra
sentido)
3’
exón 3
5’
U (sólo RNA)
T pirimidinas
||
A purinas
PROMOTOR
GEN
intron 1
GEN
5’
intron 1
exón 1
intrón 2
exón 2
+ cadena
DNA hace RNA hace PROTEINA
5’
exón 1
3’
C
|||
G
PROMOTOR
GEN
exon 1
intron 2
exon 2
3’
exon 3
intron 2
exón 2
exón 3
3’
3’
RNApol
5’
3’
3’
RNApol
5’
5’
Pre-mRNA
La complementaria de una cadena negativa se sintetiza para
producir la copia de un gen: TRANSCRIPCIÓN
1
3’
RNApol
5’
3’
5’
3’
mRNA
5’
proteína
Pre-mRNA
TRADUCCIÓN
NH 2
M
Splicing o ayuxtamiento
S
3’
5’
3’
5’
t RNA
G
mRNA
mRNA
RNA
Ribosomal
¿Qué significa clonar?
OBJETIVOS
Clon: una colección de moleculas o células, todos idénticos a una molécula o
célula original
1. CLONAR
•
“Clonar un gen” es hacer copias del mismo, por ejemplo en una población
bacteriana
•
Gen puede ser una copia de un gen original o natural
•
Gen puede ser una versión alterada del mismo
•
Tecnología del DNA recombinante lo hace posible en el laboratorio
GEN
CLON = multiples copias de la misma cosa
intron 1
5’
exon 1
intron 2
exon 2
exon 3
3’
Por tanto – si clonamos un gen, significa:
restricción
•Cortarlo (RESTRICCIÓN) del resto del genoma
•Unirlo covalentemente (LIGARLO) dentro de algo que se
propague (un VECTOR).
•Situar el vector dentro (TRANSFORMARLO) de una
célula (HUESPED) que va a propagar el vector por nosotros
ligar
VECTOR
Por ejemplo plasmid
Vector recombinante
2
PROPAGACIÓN DEL VECTOR
Vector recombinante
Cromosoma del
huesped
•Incremento del
número de copias
del plásmido
TRANSFORMAR
•Proliferación
celular
bacteria
Recuerda – DNA procariota no tiene intrones!
3’
5’
mRNA
Si queremos trabajar con un gen y su producto –
necesitamos un versión “sin intrones” del gen:
Necesitamos hacer una versión en DNA del mRNA
3’
RNApol
5’
3’
5’
Pre-mRNA
Su nombre es cDNA
splicing
Esto es:
equivalente al
RNA
3’
Cuando por ejemplo decimos que hemos clonado y expresado
el gen para (por ejemplo hormona de crecimiento humana)
queremos decir que hemos clonado el cDNA de la hormona de
crecimiento humana
5’
mRNA
Figure 9.1.1
Figure 9.1.2
3
Enzimas usadas en tecnología del DNA recombinante
Objetivos
1. Clonación
1. DNA polimerasas
2. Enzimas empleados en tecnología del DNA
recombinante
Reacción general:
(dNMP)n + dNTP
(dNMP)n+1 + PPi
Todas las DNA polimerasas:
N
5’
N
N
5’
P
+
P
N
P
N
P
DNApol
N
P
Necesitan un cebador con un 3’OH libre
El DNA sintetizado en la nueva hebra SIEMPRE
va en dirección 5’ 3’
P
N
P
P
OH
5’
OH
P
N
P
3’
3’OH
5’
Equivalente a nuestra hebra –
para nuestro gen ejemplo
OH
P.e. DNA polimerasa I de E. coli.
P.e. DNA polimerasa I de E. coli.
DNA polimerasa dependiente de DNA
DNA polimerasa dependiente de DNA
4
P.e. DNA polimerasa I de E. coli.
P.e. DNA polimerasa I de E. coli.
DNA polimerasa dependiente de DNA
DNA polimerasa dependiente de DNA
Pero también tiene otras actividades asociadas
Pero también tiene otras actividades asociadas
p.e. 5’ → 3’ exonucleasa (eliminar los cebadores RNA
primers en la replicación del DNA)
p.e. 5’ → 3’ exonucleasa (eliminar los cebadores RNA
primers en la replicación del DNA)
P.e. DNA polimerasa I de E. coli.
P.e. DNA polimerasa I de E. coli.
DNA polimerasa dependiente de DNA
DNA polimerasa dependiente de DNA
Pero también tiene otras actividades asociadas
Pero también tiene otras actividades asociadas
p.e. 5’ → 3’ exonucleasa (eliminar los cebadores RNA
primers en la replicación del DNA)
p.e. 3’ → 5’ exonucleasa (corrige errores cometidos por la
polimerasa)
reacción general:
2. RNA polimerasas
(NMP)n + NTP
(NMP) n+1 + PP i
En el lab - del Bacteriofago - RNA polimerasa dependiente de DNA
3’
Alta especificidad para promotores
RNApol
5’
3’
No requiere un cebador
5’
PROMOTOR
GEN
promotor
5’
3’
3’
5’
(Pre)mRNA
RNA se sintetiza en dirección 5’
3’
5
3. Transcriptasas reversas
3. Transcriptasas reversas
•
DNA polimerasa dependiente de RNA – se encuentran en virus
(AMW – avian myeloblastosis virus / MMLV – moloney murine
leukemia virus.
•
DNA polimerasa dependiente de RNA – se encuentran en virus
(AMW – avian myeloblastosis virus / MMLV – moloney murine
leukemia virus.
•
Algunas transcriptasas reversas también tienen 3’ y/o 5’ actividad
exoRNase (degrada RNA después de la transcripción reversa)
•
Algunas transcriptasas reversas también tienen 3’ y/o 5’ actividad
exoRNase (degrada RNA después de la transcripción reversa)
•
Requieren un cebador
•
Requieren un cebador
5’
RNA
3’
5’
RNA
3’
4. Endonucleasas de restricción
3. Transcriptasas reversas
•
cebador
5’
DNA polimerasa dependiente de RNA – se encuentran en virus
(AMW – avian myeloblastosis virus / MMLV – moloney murine
leukemia virus.
•
Algunas transcriptasas reversas también tienen 3’ y/o 5’ actividad
exoRNase (degrada RNA después de la transcripción reversa)
•
Requieren un cebador
Sólo se usan tipo 2 en DNA recombinante
Reconoce secuencias palíndromes
Cortan dentro – endo - DNA
cebador
5’
5’
RNA
3’
DNA (de nuevo) se sintetiza en dirección 5’
3’
5. Ligasa
4. Endonucleasas de restricción
Sólo se usan tipo 2 en DNA recombinante
Reconoce secuencias palíndromes
Cortan dentro – endo - DNA
Corrige a la endonucleasa de restricción y requiere ATP
Recuerda – se requieren extremos compatibles
Funciona mejor en extremos cohesivos que en romos
6
DNA Ligasa
G
P-AATTC
|
+
|
CTTAA-P
G
GAATTC
||||||
CTTAAG
ATP /Mg 2+
Ligación de extremos romos
usando T4 DNA ligasa, que
cataliza la unión dependiente
de ATP de moléculas de
DNA
6. Quinasas / Fosfatasas
Como se hace un cDNA?
P
_
•Transcriptasa reversa:
A
P
N
5’
P
encontrada en virus
requiere un cebador
P
HO
OH
N
5’
mRNA tiene una cola “poliA”
OH
P
P
DNA o RNA
ATP
AAAAAAAAAA
5’
•Fosfatasa (elimina grupos P) p.e. fosfatasa de tracto intestinal
3’
P
mRNA
N
5’
HO
P
DNA
or RNA
TTTTTTT
5’
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
5’
3’
5’
mRNA
Transcriptasa reversa + dNTPs
Oligo dT I.e (TTTTTTTTT)
TTTTTTT
5’
TTTTTTT
5’
AAAAAAAAAA
5’
3’
3’
5’
AAAAAAAAAA
3’
3’
7
1era cadena del cDNA
TTTTTTT
5’
5’
AAAAAAAAAA
3’
3’
DNA de Doble Cadena,
con una cadena
equivalente al mRNA
TTTTTTT
AAAAAA
3’
3’
5’
DNA polimerasa + dNTPs
1ra
cadena del cDNA
TTTTTTT
AAAAAA
3’
5’
3’
ligar
2nda cadena de cDNA
5’
VECTOR
Por ejemplo plasmido
cebador
= secuencia de reconocimiento de la
endonucleasa de restricción
Endonucleasas de restricción (EN DETALLE)
•Se encuentran en bacterias.
•P.e. BamHI
Bacillus amyloliquefaciens cepa H
Por ejemplo:
bacteriófago_
Cromosola propio
•En naturaleza – funciona para digerir DNA extraño en la bacteria
Me
•Reconoce (secuencias palíndromes) secuencias inversas repetidas
(tiene la misma secuencia 5’-3’ en cada cadena)
Me
Me
•“restringe” la existencia en la bacteria
•Para evitar daño del DNA endógeno, los sitios de restricción están
metilados
Me
Me
Me
Tipos de endonucleasas
Tipo I: Dependiente de ATP
Endonucleasas de restricción hidroliza entre el 3’OH y 5’P
para dejar un grupo P en el final 5’:
5’
NNNGAATTCNNN
N
Endonucleasa y metilasa
Digiere DNA en sitios al azar
Hasta 1 kb del sitio de reconocimiento
Tipo II:
Independiente de ATP
NNNCTTAAGNNN
G
C
P
EcoR1
+
H2O
T
A
Digiere DNA en el sitio de reconocimiento
dependiente de ATP
Endonucleasa y metilasa
Digiere DNA ~ 25nts de secuencia de reconocimiento
5’NNNG-OH
A
P
Endonucleasa
Type III:
EcoRI + H 2O
T
A
P
P-
AATTCNNN
NNNCTTAA -P
T
OH-
GNNN 5’
A
P
T
G
P
C
P
Cadena -
N
P
P
Cadena +
8
Enzimas de restricción
Hay varios cientos de endonucleasas de restricción
disponibles que producen varios “finales”:
5’ protuberantes
P.e. EcoRI
3’ protuberantes
P.e. HhaI
Romos
P.e. SmaI
GAATTC
||||||
CTTAAG
G
P-AATTC
|
|
CTTAA-P
G
GCGC
||||
CGCG
GCG
|
C-P
CCCGGG
||||||
GGGCCC
CCC
P-GGG
|||
|||
GGG-P
CCC
reconoce una secuencia de DNA
de doble cadena específica y corta
dentro de esa secuencia
romo
Se llama el sitio de reconocimiento
normalmente 4-8 nucleó
nucleótidos
Corta fragmentos largos de DNA en
piezas
Llamada digestió
digestión de restricció
restricción
P-C
|
GCG
Los cortes producidos por las enzimas de
restricció
restricción tienen simetrí
simetría
Corta de manera reproducible
Se encuentran en bacteria
Producen dos tipos de finales
cohesivos o romos
Enzimas de restricció
restricción
• hace cortes que se superponen
porque reconocen normalmente
secuencias simétricas
• Llamadas Palí
Palíndromes
Inverted Palindrome:
Palíndrome: la lectura de bases
en una cadena en 5’ → 3’ is la
misma que la secuencia 5’ → 3’
de la secuencia complementaria
Extremos cohesivos:
cohesivos:
• cada fragmento de DNA (independientemente de la fuente del DNA) generado al
cortar un DNA con el mismo E.R. tiene la misma secuencia de bases en los dos finales
digeridos (leídos en dirección 5’ a 3’).
El nú
número de pares de bases
en el sitio del enzima de
restricció
restricción determina la
distancia media entre sitios
de restricció
restricción
Los dos fragmentos de DNA distintos se pueden unir por complementareidad
de bases para formar una molécula de DNA recombinante
Molé
Molécula de DNA recombinante:
recombinante creación de una nueva combinación de
DNA no encontrada en la naturaleza
GTAC
Es decir la distancia media
entre sitios producidos por
E.R. = 4 n donde n =
número de bases en el
sitio
kb or kilobase = 1000 pares
de bases
9
Se pueden usar algunos “trucos” para crear sitios de restricción
De manera práctica – digestión con endonucleasas de
restricción del DNA del fago lambda
Lambda – un virus que infecta bacteria
Genoma linear de DNA de doble cadena de ~ 49Kb
Sitio RE
lamda genome
plasmid
Electroforesis en gel de agarosa
lamda genome
lambda
lambda
plasmid
plasmid
+RE
+RE
plasmid
RE
RE
Tamaño
del DNA
Con el fin de introducir DNA en un vector necesitamos
extremos compatibles
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI
BamHI
EcoRI + BamHI
BamHI
EcoRI
VECTOR
P.e. plasmido
Usar 2 (no-compatibles) enzimas de restricción:
EcoRI
BamHI
VECTOR
EcoRI
EcoRI
P.e. plasmido
EcoRI
Problema: Autoligación del vector >> recombinantes
ligar
EcoRI + BamHI
EcoRI
BamHI
ligar
EcoRI
BamHI
10