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HORTICULTURA
Diversidad en secuencias genómicas y evolución del Virus del
desorden amarillo de la judía
!
L. Ruiz, G. Martín, I.M. Cuadrado, D. Janssen
IFAPA Centro “La Mojonera-La Cañada”, Junta de Andalucía, La Mojonera (Almería).
Palabras clave: BnYDV, Crinivirus, variabilidad.
$
Resumen
Bean Yellow Disorder Virus (BnYDV) es un miembro del género Crinivirus
(familia Closteroviridae) descrito recientemente como el primero de estos virus que
infecta a miembros de la familia Fabaceae. Fue identificado por primera vez en el
año 2003 en cultivos de judía de invernadero en la provincia de Almería. En este
trabajo, se analizan las secuencias nucleotídicas del genoma de diez aislados de
BnYDV recogidos de nueve plantas de judía y una de tirabeque entre los años 2003
y 2009, periodo en el que la epidemia causó los daños más severos. Las secuencias
analizadas corresponden a zonas parciales o totales que codifican para las
siguientes supuestas proteínas en los 2 RNAs que componen el genoma: RNA
dependente de RNA polimerasa (RdRp), p26, p6, p5.6, Hsp70h, p6.3, p9 y la
proteína de la cápsida (CP). Además se analizaron zonas correspondientes a la
3´UTR del RNA1 y 5´UTR del ARN2 De las secuencias nucleotídicas que codifican
para proteínas, solo dos, la p9 y la CP presentan una variabilidad nucleotídica que
alcanza valores de 0.000529 y 0.000456 mientras que el resto de las secuencias
posibles codificantes tienen nula variabilidad. La mayor variabilidad nucleotídica
se observa sin embargo en las zonas UTRs del virus que alcanzan valores de
0.00128 para la 3´UTR del RNA1 y 0.001330 para la 5´ del RNA2. En cuanto al
análisis intra e interpoblacional, aunque la mayor variabilidad intrapoblacional se
detecta en el año 2007 (0.00092), la diversidad entre poblaciones es casi nula,
indicando que la población es homogénea genéticamente. Estos datos confirman
que BnYDV es un virus único entre los crinivirus, con una variabilidad genética
ligeramente más baja que la de otros miembros de este grupo. Dicha variabilidad
reducida podría explicar el estrecho rango de plantas huéspedes limitado a algunos
miembros de la familia de Fabaceae.
INTRODUCCIÓN
En general, se sabe que los virus RNA generan altos niveles de variación
genética que les permite evolucionar rápidamente, facilitando así su adaptación a nuevas
condiciones ambientales. La ausencia de un mecanismo de corrección de errores de la
RNA polimerasa viral dependiente de RNA (RdRps), se ha propuesto como la principal
fuente de variación (Steinhauer and Holland, 1986; Castro et al., 2005; Agol, 2006;
Sanjuán et al., 2010). Sin embargo, la composición molecular de las poblaciones virales
no es siempre el resultado directo de la tasa de error de la RdRp. En el caso de virus
plantas, existen otros factores que juegan un mayor papel en la estructura de la
+)($
ACTAS DE HORTICULTURA Nº 60
diversidad genética de las poblaciones de patógenos como son la selección y los cuellos
de botella que ocurren durante la infección sistémica (French and Stenger, 2003; Li and
Roossinck, 2004) y la transmisión horizontal por vectores (Betancourt et al., 2008).
Estos otros factores pueden llevar a una considerable estabilidad genética descrita para
numerosos virus RNA de plantas que han resultado genéticamente más estables que los
animales (García-Arenal et al., 2001; 2003). El conocimiento de la estructura genética y
diversidad de las poblaciones virales es de vital importancia en el desarrollo de
estrategias de control de enfermedades emergentes así como en establecimiento de
resistencias en el hospedador.
Durante el otoño de 2003, se observó una nueva enfermedad en cultivos de
judía (Phaseolus vulgaris L.) cuyo responsable fue identificado como Bean yellow
disorder virus (BnYDV), miembro del género Crinivirus, familia Closteroviridae
(Segundo el al., 2004).
El genoma de BnYDV está compuesto por dos moléculas de RNA (RNA 1 y
RNA 2) de 8.965 y 8530 nucleótidos respectivamente. El RNA 1 codifica posibles
proteínas relacionadas con la replicación: proteasa (L-Pro), metiltransferasa (MT)
helicasa (HEL) y una RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp). El RNA 2 codifica
hasta siete posibles proteínas relacionadas con el ensamblaje, la transmisión del vector
como y típicas del género Crinivirus: Hsp70h y tres copias distintas de la proteína de la
cápsida: (CP, CP mayor y CP menor) además de otras posibles proteínas aún por
determinar (Martín et al., 2008). El virus presenta un rango de huéspedes bastante
reducido, restringido a la familia de las leguminosas. Es transmitido por Bemisia tabaci
de manera semi-persistente y los síntomas que muestran las plantas enfermas son
similares a los producidos por otras especies del género y que se conocen en general
como “amarilleos” consistente en un moteado y amarilleo internervial de las hojas que
aparecen en las partes medias y bajas de la planta (Janssen et al., 2011).
El objetivo de este estudio es investigar la variabilidad de BnYDV en cultivos de
judía de la provincia de Almería y profundizar en la evolución de un virus de reciente
introducción. Estos conocimientos ayudarán a establecer posibles medidas de control.
MATERIAL Y METODOS
Se analizaron 9 aislados de BnYDV de plantas de judía y un aislado de una
planta de guisante tirabeque (Pisum sativum L. var. macrosperma) recogidas en
distintos invernaderos de la zona de El Ejido (Almería). Las muestras se recogieron
entre el 2004 y 2009 y consistieron en 1 aislado de 2004, 1 de 2005, 1 de 2006, 2 de
2007, 2 de 2008 y 2 de 2009. El aislado de guisante es una muestra del 2003. A partir
de estas muestras, se realizaron extractos de RNA según Janssen et al. (2005). La
presencia de BnYDV fue confirmada por RT-PCR (Segundo et al., 2004). Para la
síntesis de la primera cadena de cDNA se utilizaron los siguientes cebadores: Bn43 5´CCCCA-CTTTCATCTT-CATCATTTC-3´
y
Bn36
5´CGCGGGGACCTAGTTTATTTAT-3´ complementarios a los nt 997-1021 y 89438965 del RNA 1 respectivamente y Bn15 5´-ATCCGGCCAAAGAATGAAATAATC3´,
Bn41
5´ATGGCCCTGTATTTTTCTG-C-3´
y
Bn18
5´TGGATTTGGGACATGCGGTAGA-3´ complementarios a las posiciones 1049-1073,
3413-343 y 5640-5662 del RNA2 respectivamente en una reacción estándar de
transcripción reversa (Sambrook and Russell, 2000) para cada uno de los aislados. El
cDNA amplificado se utilizó para una reacción de PCR estándar para la que se usaron
los cebadores: Bn42 5´-CGAAACTAGATTAAGCCACTCACG-3´ y Bn35 5´TCGGATATTATGGAAGATTTGAG-3´, idénticos a los nt 248-272 y 8143-8166 del
RNA 1 respectivamente y Bn14 5´-GATGCCCCTCTCCCACCAA-3´, Bn40 3´+)"$
HORTICULTURA
AATCTGGTGCTCTTTTTGTAG-5´ y Bn17 5´-AATGGGCGAATCTAAGAGGTGA-CA-3´, idénticos a las posiciones 37-56, 2393-2414 y 4591-4615 del RNA 2
respectivamente. Los productos de PCR se visualizaron en gel de agarosa y después de
su elución se secuenciaron en ambas direcciones en un secuenciador automático (ABI
PRISM 377, Applied Biosystems). Las secuencias se alinearon mediante el programa
CLUSTAL X (Thompson et al., 1997). La distancia genética (número de sustituciones
nucleotídicas por sitio entre pares de secuencias) se obtuvieron como describe Li (1993)
y Pamilo and Bianchi (1993) (método PBL) y también por el método de dos parámetros
de Kimura (Kimura 1980). Los valores de confianza estimados para las sustituciones
sinónimas (sin cambio de aminoácido) (dS) y no sinónimas (existe un cambio de
aminoácido) (dNS) se calcularon usando el método bootstrap (Nei and Kumar 2000)
con 1000 replicas. La diversidad nucleotídica intra e interpoblacional se estimó según
Nei
(1987).
El
programa
usado
fue
MEGA
5,
disponible
en
http://www.megasoftware.net.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se generaron, fragmentos de DNA correspondientes a cinco regiones del
genoma de RNA de BnYDV. Las regiones genómicas secuenciadas fueron: región I, nt
261-962 (RNA 1) de ORF1a, región II, nt 8195-8956 (RNA1) correspondiente a la
ORF2 (p26), ORF3 (p6) y 3´UTR, región III (RNA1), nt 86-1004 (RNA 2)
perteneciente a 5´UTR, ORF4 (p6) y ORF5 (p5.6), región IV (RNA2), nt 2438-3410 de
ORF 6 (Hsp70), ORF 7 (p6.3) y ORF 8 (CPh) y región V, nt 4648-5619 nt de la ORF 9
(p9) y ORF 10 (CP) (Figura1). En total hemos secuenciado 4323 nt de cada aislado,
correspondiente a un 24,71% del genoma total del virus. Las secuencias nucleotídicas
correspondientes a las zonas codificantes (RdRp, p26, p6, p6, p5.6, hsp70, p6.3, p9 y
cp) y no codificantes (3´ y 5´ UTRs, zonas intergénicas p6-p5.6 y p9-cp) se alinearon y
se utilizaron para calcular la distancia genética entre cada par de aislados usando el
método de dos parámetros de Kimura (ver material y métodos).
De las 9 regiones codificantes parcialmente analizadas, sólo 2 (P9 y CP),
presentan una diversidad nucleotídica distinta de cero. Los valores son similares entre
las dos ORFs, (0.000529 y 000456 respectivamente) y similares a los descritos para
otros virus transmitidos por mosca blanca (Janssen et al., 2007; Lozano et al., 2009;
Marco and Aranda, 2005) (Tabla 1). La mayor diversidad nucleotídica se observó el las
zonas no codificantes del virus, en nuestro caso se analizaron la zona 3´UTR del RNA1
y 5´UTR del RNA2. Además se descubre también variabilidad en las zonas
intergénicas, concretamente, entre la P6-P5.6 y P9-CP con valores superiores a los
obtenidos para las supuestas ORFs que codifican para la P9 y CP (0.00370 y 0.00166
respectivamente) (Tabla 1). Este alto grado de estabilidad genética podría ser atribuido a
un proceso de selección negativa con el objetivo de mantener intactas las regiones del
genoma que son de mayor importancia para la supervivencia del virus o para su
transmisión por el vector (García –Arenal et al., 2001; Moreno et al., 2004).
Se calculó la distancia genética p usando el método PBL (ver material y
métodos) entre las distintas poblaciones (diversidad interpoblacional) y dentro de la
población (diversidad intrapoblacional). Se consideran aislados de una misma
población que pertenecen al mismo año y, por ende, de distintas poblaciones cuando son
recogidos en años diferentes. El resultado se muestra en la tabla 2 y nos revela una
población extremadamente estable desde el año 2003 al 2009. Dentro de la variabilidad
intrapoblacional, es el año 2007 el que presenta un valor más alto (0,000924), cinco
años después de la introducción del BnYDV en la provincia de Almería, aunque todavía
se consideran valores bajos y que indicarían una estabilidad en la población viral. Estos
+))$
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datos, están en consonancia con los ya existentes referentes al estudio de poblaciones de
Crinvirus, donde sobresale la uniformidad de las poblaciones estudiadas durante
periodos de tiempo similares a los de nuestro estudio (Rubio et al., 2001; Marco et al.,
2005; Lozano et al. 2009).
En una visión general se podría decir que BnYDV se introdujo como un evento
singular en el año 2003 en cultivos de judía y que esta población es la misma que se ha
mantenido hasta nuestros días. Esto podría ser una razón por la que no ha colonizado
otros cultivos y permanece con un estrecho rango de huéspedes restringido a la familia
Fabaceae.
Agradecimientos
Leticia Ruiz tiene un contrato cofinanciado al 80% por el Programa Operativo
FSE de Andalucía 2007-2013. “Andalucía se mueve con Europa”.
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Tabla 1. Diversidad nucleotídica en regiones
codificantes y no codificantes del genoma
$$Región
RdRp
p26
p6
3´UTR
5´UTR
p6
p6-p5.6
p 5.6
hsp70
p6.3
p9
cp
p9-cp
D
0
0
0
0.00128
0.001330
0.0000
0.00370
0
0
0
0.000529
0.000456
0.00166
SE
0.000869
0.000738
0.00208
0.000497
0.000462
0.00161
$$
#*!$
ACTAS DE HORTICULTURA Nº 60
Tabla 2. Diversidad nucleotídica inter e intrapoblacional de todos los aislados desde el 2003 hasta el
2009.
Año
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2003
n/d
2004
0.00036
0
n/d
2005
0.00036
0
0.000
n/d
2006
0.00046
2
0.00038
1
0.00038
1
n/d
2007
0.00041
5
0.00021
6
0.00021
6
0.00044
7
0,00092
4
2008
0.00069
3
0.00017
0
0.00017
0
0.00042
2
0.00029
1
0,00046
2
2009
0.00036
0
0.00000
0
0.00000
0
0.00038
1
0.00021
6
0.00017
0
0
Fig. 1. Esquema general de las zonas genómicas analizadas. Organización
genómica a partir de Martín y col. 2008.
#*+$