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k OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS 19 k kInt. Cl. : C12N 15/00 11 Número de publicación: 2 155 099 7 51 ESPAÑA C12N 15/12 C07K 14/47 A01K 67/027 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA 12 kNúmero de solicitud europea: 94931891.9 kFecha de presentación : 18.10.1994 kNúmero de publicación de la solicitud: 0 730 643 kFecha de publicación de la solicitud: 11.09.1996 T3 86 86 87 87 k 54 Tı́tulo: Animales transgénicos que albergan alelos APP que presentan una mutación sueca. k 30 Prioridad: 27.10.1993 US 143697 01.11.1993 US 148211 800 Gateway Boulevard South San Francisco, CA 94080, US ELI LILLY AND COMPANY k 72 Inventor/es: McConlogue, Lisa C.; k 74 Agente: Curell Suñol, Marcelino 45 Fecha de la publicación de la mención BOPI: 01.05.2001 45 Fecha de la publicación del folleto de patente: 01.05.2001 ES 2 155 099 T3 k 73 Titular/es: Elan Pharmaceuticals, Inc. Aviso: k Zhoa, Jun y Sukanto Sinha k En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid 1 ES 2 155 099 T3 DESCRIPCION Animales transgénicos que albergan alelos APP que presentan una mutación sueca. Campo técnico La invención se refiere a animales no humanos transgénicos y a células transgénicas de mamı́fero no humano que albergan un transgén que codifica una proteı́na precursora amiloide (APP) que comprende la mutación sueca [(lisina595 - metionina596) que muta a (asparagina595 - leucina596 )];la invención se refiere también a animales y células no humanos que comprenden un transgén que codifica una APP que comprende la mutación sueca y además loci del gen endógeno APP alterados funcionalmente, a transgenes y constructos dirigidos utilizados para producir tales células y animales transgénicos, y a transgenes que codifican secuencias polipeptı́dicas APP humanas con la mutación sueca. La presente invención proporciona la utilización de animales transgénicos en la investigación farmacéutica y de animales de investigación comercial para la creación de modelos de enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer) y de la bioquı́mica de APP in vivo. Antecedentes de la invención La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad progresiva que se conoce generalmente como demencia senil. Hablando en términos generales, la enfermedad se divide principalmente en dos tipos, es decir, de comienzo tardı́o y de comienzo temprano. El de comienzo tardı́o, que tiene lugar en la ancianidad (más de 65 años), puede estar causada por la atrofia natural del cerebro que se produce a una velocidad más rápida y a un grado más severo que el normal. La AD de comienzo temprano es mucho menos frecuente, pero muestra una demencia patológicamente idéntica, con una atrofia cerebral que se desarrolla bien antes del perı́odo senil, es decir, entre los 35 y los 60 años de edad. La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la presencia de numerosas placas amiloides y ovillos neurofibrilares (agregados proteı́nicos muy insolubles) que se encuentran en los cerebros de los pacientes con AD, particularmente en aquellas regiones implicadas en la memoria y la percepción. Mientras que en épocas pasadas existió un debate cientı́fico significativo respecto a si las placas y los ovillos eran causa o meramente el resultado de la AD, descubrimientos recientes indican que la placa amiloide constituye un precursor o factor causante. En particular, se ha descubierto que la producción del péptido β amiloide, un constituyente principal de la placa amiloide, puede deberse a mutaciones en el gen que codifica la proteı́na precursora amiloide, una proteı́na que cuando se procesa normalmente no producirá el péptido β - amiloide. Se cree ahora que un procesamiento normal (no patogénico) de la proteı́na precursora β - amiloide tiene lugar mediante la fragmentación entre los aminoácidos 16 y 17 de la proteı́na por una “α secretasa” putativa. Se cree además que el procesamiento patológico se realiza a través de una “β secretasa” putativa en el amino terminal del péptido β - amiloide en el interior de la proteı́na precur2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2 sora. Además, el péptido β - amiloide parece ser tóxico para las neuronas cerebrales, y la muerte neuronal se asocia con la enfermedad. El péptido β - amiloide (también denominado A4, βAP, Aβ, o AβP; véase, la patente estadounidense n◦ 4.666.829 y Glenner y Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:1131) se deriva de la proteı́na precursora β - amiloide (βAPP), la cual se expresa en formas de 695, 751 y 770 aminoácidos empalmadas de modo diferente. Véase, Kang et al (1987) Nature 325: 773; Ponte et al (1988) Nature 331: 525; y Kitaguchi et al (1988) Nature 331: 530. El procesamiento normal de la proteı́na precursora amiloide implica la fragmentación proteolı́tica en un sitio entre los residuos Lys16 y Leu 17 (tal como se numeran para la región vAP en la que Asp597 es el residuo 1 en Kang et al (1987)), supra, cerca del dominio transmembranoso, que da lugar a la secreción constitutiva de un dominio extracelular que conserva la porción restante de la secuencia del péptido β - amiloide (Esch et al (1990) Science 248:1122 - 1124). Esta vı́a aparece ampliamente conservada entre las especies y se encuentra en muchos tipos celulares. Véase, Weidemann et al (1989) Cell 57:115 - 126 y Oltersdorf et al (1990) J. Biol. Chem 265:4492 - 4497. En esta vı́a normal, se realiza la fragmentación en el interior de la región de la proteı́na precursora que corresponde al péptido β - amiloide, evitando aparentemente, de este modo, su formación. Se ha tenido en cuenta otra forma de βAPP secretada constitutivamente (Robakis et al Soc. Neurosci, 26 octubre de 1993, Resumen No 15.4, Anaheim, CA) que contiene más secuencia βAP carboxi terminal que la forma descrita por Esch et al supra. Golde et al (1992) Science 255; 728 - 730 preparó diversos mutantes de deleción de la proteı́na precursora amiloide y observó un sitio de fragmentación único en el interior de la región peptı́dica β - amiloide. Basándose en esta observación, se postuló que la formación del péptido β - amiloide no involucra a una vı́a secretoria. Estus et al (1992) Science 255:726 - 728, da a conocer que los dos fragmentos proteolı́ticos terminales carboxı́licos más grandes de la proteı́na precursora amiloide encontrados en las células cerebrales contienen la región peptı́dica β - amiloide entera. Recientes informes muestran que el péptido β - amiloide soluble es convertido por células sanas en medios de cultivo (Haass et al (1992) Nature 359:322 - 325) y en el CSF animal y humano (Seubert et al (1992) Nature 359:325 - 327). Palmert et al (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 165: 182 - 188, describe tres posibles mecanismos de fragmentación para β APP y presenta evidencias de que la fragmentación de β APP no tiene lugar en la metionina596 en la producción de derivados solubles de βAPP. El documento de patente estadounidense n◦ 5.200.339 considera la existencia de cierto o ciertos factores proteolı́ticos que son putativamente capaces de fragmentar βAPP en un sitio cercano al extremo amino de βAPP. Se sabe que el gen APP se localiza en el cromosoma humano 21. Se ha elaborado el mapa en 3 ES 2 155 099 T3 el cromosoma 21 de un locus que se segrega con la enfermedad familiar de Alzheimer (St. George Hyslop et al (1987) Science 235: 885), cercano al gen APP. Anteriormente, se habı́a informado de recombinantes entre el gen APP y el locus AD (Schellenberg et al (1988) Science 241: 1507; Schellenberg et al (1991) Am.J.Hum.Genetics 48:563; Schellenberg et al (1991) Am.J.Hum. Genetics 49:511, que se incorpora en la presente memoria como referencia). La identificación de las mutaciones en el gen de la proteı́na precursora amiloide que causan la enfermedad de Alzheimer familiar de comienzo temprano, evidencia que el metabolismo amiloide es el evento central en el proceso patogénico que subyace en la enfermedad. Se ha informado de 4 mutaciones que causan la enfermedad, que incluyen, respecto a la isoforma 770, valina 717 a isoleucina (Goate et al (1991) Nature 349: 704), valina 717 a glicina (Chartier Harlan et al (1991) Nature 353:844), valina717 a fenilalanina (Murrell et al (1991) Science 254:97); y respecto a la isoforma 695, una mutación doble transforma lisina595 metionina596 a asparagina595 - leucina596 (Mullan et al (1992) Nature Genet 1: 345; Citron et al (1992) Nature 360: 672), a la que se alude como la mutación sueca. Los alelos APP que se correlacionan positivamente con la AD se denominan “alelos asociados con la enfermedad”. Serı́a muy deseable el desarollo de modelos experimentales de la enfermedad de Alzheimer que pudieran utilizarse para definir posteriormente los eventos bioquı́micos subyacentes implicados en su patogénesis. Tales modelos podrı́an emplearse presumiblemente, en una aplicación, para la evaluación de agentes que alteraran el curso degenerativo de la AD. Por ejemplo, un sistema modelo de la enfermedad de Alzheimer podrı́a utilizarse para evaluar los factores del entorno que inducen o aceleran su patogénesis. Contrariamente a esto, podrı́a utilizarse un modelo experimental para evaluar agentes que inhibieran, evitaran, o invirtieran la progresión de la AD. Presumiblemente, tales modelos podrı́an utilizarse para desarrollar fármacos que fueran efectivos en la evitación, la detención o la inversión de la AD. Desafortunadamente, sólo el hombre y los primates no humanos de edad desarrollan cualquiera de las caracterı́sticas patológicas de la AD; el gasto y la dificultad de utilizar primates y la cantidad de tiempo que es necesario para desarrollar la patologı́a de la AD hace que la investigación extensa en tales animales se convierta en prohibitiva. Los roedores no desarrollan la AD, incluso a edad avanzada. Se ha informado que la inyección de la proteı́na β - amiloide (βAP) o los fragmentos βAP citotóxicos en el cerebro del roedor lleva a la pérdida celular e induce un marcador antigénico para los componentes de ovillo neurofibrilar (Kowall et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 88:7247). Los ratones que portan una copia extra del gen APP como resultado de la trisomı́a parcial del cromosoma 16, mueren antes de nacer (Coyle at al (1988) Trends in Neurosci. 11: 390). Desde la clonación del gen APP, han habido varios intentos para producir un modelo murino para la AD utilizando transgenes 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4 que incluyen la totalidad o parte del gen APP, pero desafortunadamente, mucho del trabajo no se ha publicado, todavı́a pues los ratones no fueron viables o no mostraron la patologı́a de tipo AD. Como mı́nimo, dos informes publicados se retiraron a causa de irregularidades en los resultados emitidos (Marx J Science 255: 1200; Wirak et al (1991) Science 253: 323; Kawabata et al (1991) Nature 354: 476; Kawabata et al. Nature 356: 23; Quon et al (1991) Nature 352: 239; Marx Science 259: 457). El documento de patente WO 94/23049 considera la introducción del gen humano APP entero y no adaptado en la progenie germinal de ratones, para utilizarlo en la formación de ratones transgénicos que expresen la proteı́na humana APP completamente entera. El documento WO 91/19810 describe también ratones transgénicos, que expresan proteı́nas relacionadas con la patologı́a de la enfermedad de Alzheimer, es decir, proteı́nas precursoras nucleares β - amiloides, proteı́nas precursoras relacionadas con el β - amiloide e inhibidores de la serı́n proteasa. Esta solicitud de patente describe procedimientos y composiciones para transferir transgenes y constructos homólogos de recombinación a células de mamı́feros, especialmente a células troncales embrionales. Asimismo, describe células no humanas transgénicas y animales no humanos transgénicos que albergan uno o más transgenes APP de la mutación sueca. Un objetivo de la presente invención es la aplicación de tales animales transgénicos como sistemas in vivo para investigar posibles fármacos en cuanto a su capacidad para inhibir o evitar la producción de la placa β - amiloide patogénica. Serı́a deseable proporcionar procedimientos y sistemas para investigar compuestos de prueba en cuanto a su capacidad para inhibir o evitar la conversión de la proteı́na precursora amiloide al péptido β - amiloide patogénico. En particular, serı́a deseable basar tales procedimientos y sistemas en las vı́as metabólicas que se han encontrado implicadas en tal conversión, en la que el compuesto de prueba serı́a capaz de interrumpir o interferir con la vı́a metabólica que lleva a la conversión. Tales procedimientos y animales transgénicos deberı́an ser rápidos, económicos y apropiados para la investigación de grandes cantidades de compuestos de prueba. Sumario de la invención Según el mencionado objetivo, en un aspecto, la presente invención proporciona la utilización de un animal no humano o célula troncal transgénicos que comprende un genoma diploide compuesto de un transgén que codifica un polipéptido APP heterólogo que incluye la mutación sueca, en el que los residuos aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 595 y 596 en la APP685 humana son respectivamente la asparagina y la leucina, para evaluar un agente en cuanto a su actividad para evitar, inhibir o invertir la enfermedad de Alzheimer. En este aspecto, al animal puede ser murino, y el transgén puede no estar integrado homologamente. Opcionalmente, el animal no humano transgénico expresa un polipéptido APP humano que com3 5 ES 2 155 099 T3 prende la mutación sueca tal como se describó anteriormente. El polipéptido APP heterólogo que comprende la mutación sueca puede ser expresado bajo el control transcripcional de un promotor enolasa neuro - especı́fico. Los animales no humanos utilizados en la invención albergan por tanto como mı́nimo, una copia de un transgén que comprende un secuencia polinucleótida que codifica un polipéptido APP heterólogo que comprende la mutación sueca (asparagina595 - leucina596) unida operativamente a una secuencia reguladora transcripcional capaz de producir la expresión del polipéptido APP heterólogo en el animal transgénico no humano. Dicho polipéptido APP heterólogo que comprende la mutación sueca, se expresa generalmente en células que expresan normalmente el gen APP endógeno que se encuentra de forma natural (si se encuentra presente). Tı́picamente, el animal no humano es un ratón y el gen APP heterólogo es un gen APP humano con la mutación sueca. Tales transgénes comprenden generalmente un cassette de expresión del APP con la mutación sueca, en la que un promotor unido y, preferentemente, un potenciador, guı́an la expresión de secuencias estructurales que codifican un polipéptido APP heterólogo que comprende la mutación sueca. En una forma de realización preferida, los animales no humanos y las células transgénicos utilizados en la invención albergan un gen APP asociado a la enfermedad intacto, bien un alelo humano asociado a la enfermedad tal como un polinucleótido que codifique una proteı́na APP humana que comprenda la mutación sueca, o una copia genómica completa (o minigen) del gen APP de la mutación sueca. En otra forma de realización preferida, un alelo de roedor mutado (por ejemplo, murino) que comprende modificaciones secuenciales que corresponden a una secuencia APP humana que comprende la mutación sueca, puede ser sustituı́do. Las cepas y las progenies celulares (por ejemplo, las células astrogliales) derivadas de tales animales transgénicos poseen una amplia aplicación en la técnica como modelos experimentales para el desarrollo de terapéutica para la AD y como una fuente conveniente de proteı́na APP que comprende la mutación sueca. Además, los animales transgénicos no humanos que comprenden un transgén que codifica una proteı́na APP con la mutación sueca, y al que le faltan locis génicos APP endógenos funcionales (esto es, con antecedentes APP “de alcance de objetivo y huı́da”) constituyen un origen conveniente de la proteı́na APP con la mutación sueca cuando faltan otras proteı́nas APP que no incluyen dicha mutación sueca. En otro aspecto, la presente invención proporciona la utilización de un transgén que codifica un polipéptido APP heterólogo que comprende la mutación sueca, en el que los residuos aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 595 y 596 en la APP595 humana son asparagina y leucina, respectivamente, para obtener un animal no humano transgénico con objeto de evaluar un agente en cuanto a su actividad para prevenir, inhibir o invertir la enfermedad de 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6 Alzheimer. Los transgénes que son necesarios para practicar la invención comprenden, por tanto, un gen que codifica una APP con una mutación sueca, estando unido operativamente dicho gen a una secuencia reguladora de la transcripción que es funcional en el animal transgénico huésped (por ejemplo, un promotor especı́fico neural). Tales transgénes están tı́picamente integrados en una localización cromosómica del huésped mediante integración no homóloga. Los transgénes pueden comprenden además un marcador seleccionable, tal como un gen neo o gpt unido operativamente a un promotor constitutivo, tal como un promotor de la fosfoglicerato quinasa (pgk) o un promotor del gen HSV tk unido a un potenciador (por ejemplo, potenciador SV40). En formas de realización preferidas de la invención, cuando se practican utilizando animales transgénicos no humanos, tı́picamente mamı́feros no humanos, como ratones, los animales albergan como mı́nimo una copia de un transgén o constructo dirigido tal como se describe en la presente memoria, integrado bien homóloga o no homólogamente en una localización cromosómica endógena, de forma que codifique un polipéptido APP con una mutación sueca. Tales animales transgénicos se producen habitualmente introduciendo el transgén o el constructo dirigido en un huevo fertilizado o en células troncales embrionales (ES), tı́picamente mediante microinyección, electroporación, lipofección, o biolı́stica. Los animales transgénicos expresan el gen APP de la mutación sueca del transgén (o del constructo dirigido homólogamente recombinado), tı́picamente en el tejido cerebral. Tales animales son apropiados para uso en diversos modelos de enfermedades y en la evaluación de fármacos, ası́ como en otras aplicaciones. También se describen en la presente memoria animales y células no humanas que albergan como mı́nimo un constructo dirigido integrado que altera funcionalmente un locus del gen APP endógeno, suprimiendo o mutando tı́picamente un elemento genético (por ejemplo, secuencia exónica, señal de empalme, promotor, potenciador) que es necesario para la expresión funcional eficiente de un producto génico completo. Se describen asimismo en la presente memoria los animales transgénicos no humanos, tales como un mamı́fero no primate, que poseen como mı́nimo un alelo APP endógeno inactivado, y son preferentemente homocigóticos para los alelos APP inactivados, y que son sustancialmente incapaces de dirigir la expresión eficiente del APP endógeno (es decir, de tipo salvaje). Por ejemplo, un ratón transgénico es homocigótico para los alelos APP endógenos inactivados y es sustancialmente incapaz de producir APP murino codificado mediante un gen APP endógeno (es decir, que se encuentra de modo natural). Tal ratón transgénico, con genes APP endógenos inactivados, constituye un huésped receptor preferido para un transgén que codifica un polipéptido APP heterólogo, preferentemente un polipéptido APP humano con la mutación sueca. Por ejemplo, el APP humano que comprende la mutación sueca puede ser codificado y expresado a partir de un 7 ES 2 155 099 T3 transgén (o transgénes) heterólogo (s) en tal ratón transgénico. Tales transgénes heterólogos pueden integrarse en una localización no homóloga en un cromosoma del animal no humano, o pueden integrarse mediante recombinación homóloga o conversión génica en un locus del gen APP no humano, poniendo de este modo simultánemente “fuera de combate” al gen APP endógeno (o su segmento) y reemplazándolo con el gen APP humano (o su segmento). Descripción breve de las figuras Figura 1, los cuadros A y B son mapas plasmı́dicos de pNSEAPPsw∆3’ y pNSEAPPsw, respectivamente, que se utilizan para producir ratones transgénicos tal como se describe en la presente memoria. Figura 2, es una transferencia Western de fracciones solubles de cerebros de animales control y transgénicos sondeados en cuanto a la presencia de fragmentos βAPP secretados que reaccionan con el anticuerpo sueco 192. Carril 1: marcadores de peso molelcular; carril 2: progenie no transgénica; carril 3: progenie transgénica. Figura 3, los cuadros A y B son transferencias Western de homogenados cerebrales de animales transcripcional (+) y no transgénicos ( - ) vaciados de formas βAPP reactivas con anticuerpos 6C6 sondeadas con el anticuerpo 8E5 (cuadro A) y con el anticuerpo sueco 192 (cuadro B). Fig 4 muestra una inmunotransferencia que demuestra la especificidad del anticuerpo sueco 192. Los carriles 1,3,5 contienen mateiral eluı́do a partir de heparina agarosa. Los carriles 2,4,6 contienen material eluı́do a partir de resina 6C6. Los carriles 1 y 2 se sondearon con el anticuerpo 8E5; los carriles 3 y 4 se sondearon con el anticuerpo sueco 192; los carriles 5 y 6 se sondearon con el anticuerpo 6C6. Definiciones Si no se definen de otro modo, todos los términos cientı́ficos y técnicos utilizados en la presente memoria poseen el mismo significado que el que es entendido habitualmente por los expertos en la materia a la que esta invención pertenece. Aunque pueden utilizarse cualesquiera procedimientos y materiales similares o equivalentes para llevar a la práctica o ensayar la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferidos. Se definen seguidamente los términos siguientes respecto a los objetivos de la presente invención. El término “corresponde a ” se utiliza en la presente memoria para dar a entender que una secuencia polinucleótida es homóloga (es decir, que es idéntica, que no está estrictamente relacionada de modo evolutivo) a la totalidad o a una porción de una secuencia polinucleótida de referencia, o que una secuencia polipéptida es idéntica a una secuencia polipéptida de referencia. En contraste, el término “complementario a” se utiliza en la presente memoria para significar que la secuencia complementaria es homóloga a la totalidad o a una parte de una secuencia polinucleótida de referencia. Como ejemplo, la secuencia nucleótida “TATAC” corresponde a una secuencia “TATAC” de referencia y es complementaria a una secuencia de referencia “GTATA”. Los términos “corresponde sustancialmente 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8 a”, “sustancialmente homólogo” o “identidad sustancial” tal como se utilizan en la presente memoria, aluden a una caracterı́stica de una secuencia ácido nucleica, en la que una secuencia ácido nucleica posee por lo menos una identidad secuencial del 70 % comparada con una secuencia de referencia, tı́picamente, una identidad secuencial del 85 % por lo menos, y preferentemente, por lo menos, una identidad secuencial del 95 %, comparada con una secuencia de referencia. El porcentaje de identidad secuencial se calcula excluyendo pequeñas deleciones o adiciones cuyo total sea menor que el 25 % de la secuencia de referencia. Esta puede constituir un subconjunto de una secuencia más grande, tal como una porción de un gen o secuencia flanqueante, o una porción repetitiva de un cromosoma. Sin embargo, la secuencia de referencia tiene por lo menos 18 nucleótidos de largo, tı́picamente por lo menos 30 nucleótidos de largo, y preferentemente de 50 a 100 nucleótidos, por lo menos, de largo. “Sustancialmente complementario”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia que es complementaria a una secuencia que corresponde sustancialmente a una secuencia de referencia. La hibridación especı́fica se define en la presente memoria como la formación de hı́bridos entre una secuencia transgénica dirigida (por ejemplo, un polinucleótido de la invención que puede incluir sustituciones, deleciones, y/o adiciones) y una secuencia especı́fica del ADN diana (por ejemplo, una secuencia del gen APP humano), en el que una secuencia transgénica dirigida marcada se hibridiza preferentemente a la diana de tal forma que, por ejemplo, una banda única que corresponde a un fragmento de restricción de un gen, puede identificarse en una transferencia Southern de ADN preparado a partir de células que utilizan dicha secuencia transgénica dirigida marcada como una sonda. Es evidente que las condiciones de hibridación óptimas variarán dependiendo de la composición secuencial y de la longitud (o longitudes) del transgén (o transgénes) dirigido(s) y de la diana (o dianas) endógena (s) y del método experimental seleccionado por el médico. Pueden utilizarse directrices diversas para seleccionar las condiciones de hibridación apropiadas (véase, Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1989), 2a¯ edición, Cold Spring Harbor, N.Y. y Berger y Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA., que se incorpora en la presente memoria como referencias. El término “se encuentra de modo natural” tal como se utiliza en la presente memoria aplicado a un objeto, se refiere al hecho de que se le puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptı́dica o polinucleótida que se encuentra en un organismo (incluyendo virus) que puede ser aislada de un origen en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio, se encuentra de modo natural. Tal como se utiliza en la presente memoria, las cepas de laboratorio de los rumiantes que pueden haber sido criados selectivamente según la genética clásica se consideran animales que se encuentran de modo natural. 5 9 ES 2 155 099 T3 El término “similar” tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia génica que está relacionada evolucionaria y funcionalmente entre especies. Por ejemplo pero sin restricción, en el genoma humano, el locus del gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana es el gen similar al locus génico de la cadena pesada de la inmunoglobulina del ratón, ya que las secuencias y estructuras de estos dos genes indican que son homólogos en alto grado y los dos genes codifican una proteı́na que funciona para unir antı́genos especı́ficamente. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “xenogénico” se define respecto a una célula huésped receptora de mamı́fero o de animal no humano, y significa que una secuencia aminoácida o polinucleótida no está codificada por o no se encuentra en, respectivamente, el genoma que se encuentra de modo natural de la célula huésped receptora de mamı́fero o del animal no humano. Las secuencias del ADN xenogénico son secuencias de ADN extraño; por ejemplo, un gen APP humano es xenogénico respecto a las células ES murinas; igualmente, como ejemplo, un alelo CFTR asociado a la fibrosis quı́stica humana es xenogénico respecto a una progenie celular humana que sea homocigótica para los alelos CFTR de tipo salvaje (normal). Ası́, una secuencia ácido nucleica murina clonada que se ha mutado (por ejemplo, mediante mutagénesis puntual dirigida), es xenogénica respecto al genoma murino del cual la secuencia se derivó originariamente, si la secuencia mutada no se encuentra de forma natural en el genoma murino. Tal como se utiliza en la presente memoria, un “gen heterólogo o “secuencia polinucleótida heteróloga” se define respecto al organismo no humano transgénico que produce tal producto génico. Un polipéptido heterólogo, al que también se alude como a un polipéptido xenogénico, se define como un polipéptido que posee una secuencia aminoácida, o una secuencia codificante ADN que corresponde a la de un gen similar encontrado en un organismo que no consiste en el animal transgénico no humano. Ası́, un ratón transgénico que alberga un gen APP humano puede describirse como que alberga un gen APP heterólogo. Un transgén que contenga varios segmentos génicos que codifiquen una secuencia proteı́nica heteróloga, puede identificarse fácilmente, por ejemplo, mediante hibridación o secuenciación del ADN, siendo de una especie distinta del organismo que el animal transgénico. Por ejemplo, la expresión de secuencias aminoácidas del APP humano puede detectarse en los animales no humanos transgénicos de la invención con anticuerpos especı́ficos para los epı́topos APP humanos codificados por los segmentos del gen humano AP. Un gen heterólogo similar se refiere a una gen correspondiente de otra especie; ası́, si la APP murina es la referencia, el APP humano es un gen heterólogo similar (como es la APP porcina, ovina, o de rata, junto con los genes AP de otras especies). Se puede aludir a una secuencia génica endógena mutada como un gen heterólogo; por ejemplo, un transgén que codifique una APP murina que incluya 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10 una mutación sueca (que no se conoce en los genomas murinos que se encuentran de modo natural) es un transgén heterólogo respecto a las especies murinas y no murinas. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “constructo dirigido” se refiere a un polinucleótido que comprende: (1) una región homóloga, por lo menos, que posee una secuencia que es sustancialmente idéntica o substancialmente complementaria a una secuencia que se encuentra en un locus génico endógeno de una célula huésped, y (2) una región dirigida que se integra en un locus génico endógeno de una célula huésped mediante recombinación homóloga entre una región homóloga del constructo dirigido y dicha secuencia del locus génico endógeno. Si el constructo dirigido es un constructo del tipo “alcanza un objetivo y huye” o “de entrar y salir” (Valancius y Smithies (1991) Mol. Cell. Biol 11: 1402; Donehower et al. (1992) Nature 356: 215; (1991) J. NIH Res. 3: 59; Hasty et al. (1991) Nature 350; 243, que se incorporan como referencia en la presente memoria), la región dirigida se incorpora sólo de forma transitoria en el locus génico endógeno y se elimina del genoma del huésped mediante selección. Una región dirigida puede comprender una secuencia que es sustancialmente homóloga a una secuencia génica endógena y/ o puede comprender una secuencia no homóloga, tal como un marcador seleccionable (por ejemplo neo, tk, gpt). El término “constructo dirigido” no indica necesariamente que el polinucleótido comprende un gen que va a integrarse en el genoma del huésped, ni indica que el polinucleótido incluye una secuencia génica estructural completa. Tal como se utiliza en la técnica, el término “constructo dirigido” es sinónimo del término “transgén dirigido” tal como se utilizó en la presente memoria. Los términos “región de homologı́a” y “pinza de homologı́a” tal como se utilizan en la presente memoria, se refieren a un segmento (es decir, una parte) de un constructo dirigido que posee una secuencia que corresponde substancialmente o es complementaria sustancialmente con una secuencia génica endógena predeterminada, que puede incluir secuencias que flanqueen dicho gen. Una región homóloga tiene generalmente como mı́nimo alrededor de 100 nucleótidos de largo, alrededor como mı́nimo preferentemente de 250 a 500 nucleótidos de largo, y tı́picamente, como mı́nimo alrededor de 1000 nucleótidos de largo o más larga. Aunque no se ha demostrado una longitud mı́nima teórica para que una pinza de homologı́a medie la recombinación homóloga, se cree que la eficiencia de ésta aumenta generalmente con la longitud de la pinza de homologı́a. De modo similar, la eficiencia de recombinación aumenta con el grado de homologı́a secuencial entre una región de homologı́a del constructo dirigido y la secuencia diana endógena, con una eficiencia de recombinación óptima que se produce cuando una pinza de homologı́a es isogénica con la secuencia diana endógena. Los términos “pinza de homologı́a” y “región de homologı́a” son intercambiables tal como se utilizan en la presente memoria, y la terminologı́a alternativa se ofrece en aras de la claridad, en vista de la 11 ES 2 155 099 T3 utilización inconsistente de términos similares en la técnica. Una pinza de homologı́a no implica necesariamente la formación de una estructura hı́brida de bases emparejadas con una secuencia endógena. En la presente memoria, a las secuencias génicas endógenas que corresponden substancialmente o son complementarias sustancialmente a una región transgénica de homologı́a se alude como “secuencias diana de entrecruzamiento” o “secuencias diana endógenas”. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “minigen” se refiere a un constructo génico heterólogo en el que uno o más segmentos no esenciales de un gen son suprimidos respecto al gen que se encuentra de forma natural. Tı́picamente, los segmentos suprimidos son secuencias intrónicas de por lo menos de alrededor de 100 pares de bases hasta varias kilobases, y pueden abarcar hasta varias decenas de kilobases o más. El aislamiento y la manipulación de grandes constructos dirigidos (esto es, mayores que alrededor de 50 kilobases) es frecuentemente difı́cil y puede reducir la eficiencia de transferencia del constructo dirigido a una célula huésped. Por tanto, es deseable con frecuencia reducir el tamaño de una constructo dirigido suprimiendo una o más de las partes no esenciales del gen. Tı́picamente, pueden suprimirse las secuencias intrónicas que no abarcan elementos reguladores esenciales. Frecuentemente, si sitios convenientes de restricción se unen a una secuencia intrónica no esencial de una secuencia génica clonada, puede producirse una deleción de la secuencia intrónica mediante: (1) digestión del ADN clonado con los enzimas de restricción apropiados, (2) separación de los fragmentos de restricción (por ejemplo, mediante electroforesis), (3) aislamiento de los fragmentos de restricción que abarcan los exones esenciales y los elementos de regulación, y (4) uniendo los fragmentos que pue de restricción para formar un minigen en el que los exones se encuentran en el mismo orden lineal que hay en la copia de la progenie germinal del gen que se encuentra de forma natural. Para los expertos en la materia se evidenciarán procedimientos alternativos para producir un minigen (por ejemplo, la unión de clones genómicos parciales que abarquen exones esenciales pero a los que faltan partes de secuencias intrónicas). Más tı́picamente, los segmentos génicos que comprenden un minigen se dispondrán en el mismo orden lineal que se encuentra en el gen de la progenie germinal, pero sin embargo, no se tratará siempre de eso. Algunos elementos reguladores deseados (por ejemplo, potenciadores, silenciadores) pueden ser posicionalmente insensibles de modo relativo, de forma que el elemento regulador funcionará correctamente incluso si se posiciona de modo diferente en un minigén que en el correspondiente gen de la progenie germinal. Por ejemplo, un potenciador puede localizarse a una distancia distinta de un promotor, en una orientación diferente, y/o en un orden lineal distinto. Por ejemplo, un potenciador que se sitúe en el extremo 3’ de un promotor en una configuración de progenie germinal, podrı́a localizarse en el extremo 5’ del promotor en un minigén. De modo similar, algunos genes pueden tener exones que se em- 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12 palmen alternativamente al nivel de ARN, y por tanto un minigen puede tener menos exones y/o exones en un orden lineal diferente que el correspondiente gen de la progenie germinal y todavı́a codifica un producto del gen funcional. Un cADN que codifica un producto génico puede utilizarse también para construir un minigen. Sin embargo, ya que a menudo es deseable que el minigen heterólogo sea expresado de modo parecido al gen similar no humano que se encuentra naturalmente, la transcripción de un minigen cADN es gobernada tı́picamente mediante un promotor y potenciador del gen ligados procedentes del gen que se encuentra naturalmente. Frecuentemente, tal minigen puede comprender una secuencia reguladora transcripcional (por ejemplo, promotor y/o potenciador) que confiere la transcripción CNS especı́fica o neuro - especı́fica de las secuencias codificantes del APP minigen. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “unidad transcripcional” o “complejo transcripcional” se refiere a una secuencia polinucleótida que comprende un gen estructural (exones), un promotor unido actuante cis y otras secuencias actuantes cis necesarias para la transcripción eficiente de las secuencias estructurales, elementos reguladores distales necesarios para la apropiada transcripción histo - especı́fica y del desarrollo de las secuencias estructurales, y secuencias cis adicionales importantes para la transcripción y la traducción eficientes (por ejemplo, sitio de poliadenilación, secuencias de control de la estabilidad del ARNm). Tal como se utiliza en la presente memoria, “unido” significa en ligamiento polinucleótido (es decir, ligamiento fosfodiéster). “No unido” significa que no existe ligamiento a otra secuencia polinucléotida; por tanto, dos secuencias no están unidas si cada secuencia posee un extremo 5’ libre y un extremo 3’ libre. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “unido operativamente” se refiere a un ligamiento de elementos polinucleótidos en una relación funcional. Un ácido nucleico está “unido operativamente” cuando se sitúa en una relación funcional con otra secuencia ácido nucleica. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de ésta. Unido operativamente significa que las secuencias del ADN que están unidas son tı́picamente contiguas y, donde es necesario unir dos regiones codificantes proteı́nicas, son contiguas en el marco de lectura. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “constructo dirigido correctamente” se refiere a una parte del constructo dirigido que se integra en el interior o adyacentemente a una secuencia diana endógena de entrecruzamiento, tal como una parte de un locus endógeno del gen APP. Por ejemplo pero sin restricción, una porción de un transgén dirigido que codifica neo y está flanqueado por regiones homólogas que muestran una identidad sustancial con las secuencias endógenas del gen APP que flanquean el primer exón, se dirige correctamente cuando dicha porción transgénica se integra en una localización cromosómica de forma que reemplaza, por ejem7 13 ES 2 155 099 T3 plo, el primer exón del gen PP endógeno. En contraste y asimismo por ejemplo, si el transgén dirigido o una porción del mismo se integra en una región no homóloga y/o en una región que no forma parte de un entorno de 50 kb aproximadamente de una secuencia del gen APP, el producto resultante es un transgén dirigido incorrectamente. Es posible generar células que posean tanto un transgén o transgénes dirigidos correctamente como un transgén o transgénes dirigidos incorrectamente. Las células y los animales que poseen un transgén o transgénes dirigidos correctamente y/o un transgén o transgénes dirigidos incorrectamente pueden identificarse y resolverse mediante PCR y/o análisis de transferencia Southern del ADN genómico. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “región dirigida” se refiere a una porción de un constructo dirigido que se ha llegado a integrar en una localización cromosómica endógena después de recombinación homóloga entre una pinza de homologı́a y una secuencia del gen APP endógeno. Tı́picamente, una región dirigida está flanqueada a cada lado por una pinza de homologı́a, de forma que una recombinación de doble entrecruzamiento entre cada una de las pinzas de homologı́a y sus correspondientes secuencias del gen APP endógeno da lugar al reemplazo de la porción del locus del gen APP endógeno por la región dirigida; en tales constructos dirigidos de reemplazamiento de doble entrecruzamiento del gen, se puede aludir a la región dirigida como “región de reemplazamiento”. Sin embargo, algunos constructos dirigidos pueden utilizar sólo una única pinza de homologı́a (por ejemplo, algunos vectores de tipo “alcance de objetivo y huı́da”, véase, Bradley et al. (1992) Bio/Technology 10: 534, que se incorpora aquı́ como referencia). Tal como se utiliza, el término “región de reemplazamiento” se refiere a una porción de un constructo dirigido flanqueado por regiones de homologı́a. Después de la recombinación homóloga de doble entrecruzamiento entre las regiones homólogas flanqueantes y sus correspondientes secuencias diana de entrecruzamiento del gen APP endógeno, la región de reemplazamiento se integra en el cromosoma de la célula huésped entre las secuencias diana endógenas de entrecruzamiento. Las regiones de reemplazamiento pueden ser homólogas (por ejemplo, tienen una secuencia similar a la secuencia del gen APP endógeno, pero presentan una mutación puntual o una mutación sin sentido), no homóloga (por ejemplo, un cassette de expresión del gen neo), o una combinación de regiones homólogas y no homólogas. La región de reemplazamiento puede convertir el allelo APP endógeno en un alelo APP que comprende una mutación sueca; por ejemplo, la región de reemplazamiento puede abarcar la región del gen APP que codifica los residuos 595 y 596 de la isoforma APP de 695 aminoácidos de longitud (o de su equivalente no humano) y la región de reemplazamiento puede comprender una secuencia que codifica la asparagina595 leucina596 en las posiciones 595 y 596 (según la numeración de Kang et al. (1987) (en el trabajo 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14 citado). Los términos “alteración funcional” o “alterado funcionalmente” tal como se utilizan en la presente memoria, significan que un locus génico comprende al menos una mutación o alteración estructural de forma que el gen alterado funcionalmente es incapaz de dirigir la expresión eficiente del producto génico funcional. Por ejemplo pero sin restricción, un gen APP endógeno que posee un cassette génico neo integrado en un exón (por ejemplo, el tercer exón) de un gen APP, no es capaz de codificar una proteı́na funcional (isoforma) que comprenda el exón inactivado y constituye, por tanto, un locus del gen APP alterado funcionalmente. También, por ejemplo, una mutación dirigida a los exones de un gen APP endógeno puede dar lugar a un gen endógeno mutado que puede expresar una isoforma proteı́nica APP truncada. La alteración funcional puede incluir la sustitución completa de un locus génico APP heterólogo en lugar de un locus APP endógeno, por lo que, por ejemplo, se dice que un transgén dirigido que reemplaza al locus entero del APP de ratón con un alelo APP humano de mutación sueca, que puede ser funcional en el ratón, ha funcionalmente alterado el locus APP murino endógeno al reemplazarlo. Preferentemente, un exón como mı́nimo que se incorpore a los ARNm que codifican la mayorı́a o la totalidad de las isoformas APP, hace que éstas se alteren funcionalmente. La deleción o interrupción de elementos reguladores transcripcionales esenciales, de la señal o señales de poliadenilación, de secuencias de sitio de empalme, producirá también un gen alterado funcionalmente. La alteración funcional de un gen APP endógeno, puede producirse asimismo por otros procedimientos (por ejemplo, supresión génica debida a polinucleótidos antisentido). El término “alterado estructuralmente” se refiere a un gen diana en el que por lo menos una secuencia estructural (es decir, exon) ha sido alterada mediante el direccionamiento de genes homólogos, inserciones, deleciones, mutación(es) puntual(es) y/o reajuste. Tı́picamente, los alelos APP que están alterdados estructuralmente se alteran consecuentemente de forma funcional, pudiendo también, sin embargo, alterarse funcionalmente los alelos APP sin ser alterados estructuralmente de forma concomitante, es decir, mediante la alteración dirigida de una secuencia no exónica, como la ablación de un promotor. A un alelo que posee una alteración dirigida que interfiere con la expresión eficiente de un producto génico funcional suyo, se alude en la técnica como un “alelo nulo” o un alelo “fuera de combate”. El término “agente” se utiliza en la presente memoria para indicar un compuesto quı́mico, una mezcla de compuestos quı́micos, una macromolécula biológica, o un extracto fabricado a partir de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos, o animales (particularmente mamı́feros), células o tejidos. Tal como se utiliza en la presente memoria, “isoforma”, “APP”, e “isoforma APP” se refieren a un polipéptido que es codificado al menos por un exón del gen APP (Kitaguchi et al. (1988) Nature 331: 530; Ponte et al., ibid., p. 525; R.E. 15 ES 2 155 099 T3 Tanzi, ibid., p. 528; de Sauvage y Octave (1989) Science 245: 651; Golde et al. (1990) Neuron 4:253). Una isoforma APP puede ser codificada por un alelo APP (o su exón) que está asociado con una forma de la enfermedad de Alzheimer o que no está asociado con un fenotipo de dicha enfermedad. El término “gen β - amiloide” se utiliza en la presente memoria como sinónimo para el gen APP, puesto que β - amiloide es un producto proteı́nico producido por una fragmentación post - traduccional de un producto del gen APP. Tal como se utiliza en la presente memoria, 00 00 “APP695 ”, “APP751 y “APP770 , se refieren, respectivamente, a los polipéptidos con una longitud de 695, 751 y 770 residuos aminoácidos codificados por el gen APP humano (Ponte et al., en el lugar citado; Kitaguchi et al., en el lugar citado; Tanzi et al., en el lugar citado). Tal como se utiliza en la presente memoria, “codon 595” y “codon 596” se refieren a los codones (es decir, las secuencias trinucleótidas) que codifican las posiciones enésimas aminoácidas 595 y 596 en APP695 , o la posición aminoácida en una isoforma APP o fragmento que corresponde a las posiciones enésimas aminoácidas 595 y 596 en APP695 según la convención numérica en Kang et al. (1987) (en el trabajo citado) Por ejemplo pero sin restricción, un fragmento de 600 residuos de largo que es producido truncando APP695 , eliminando los 95 aminoácidos N - terminales, posee las posiciones aminoácidas 500 y 501 que corresponden con los codones 595 y 596 de APP695 . De hecho, tal como se utiliza en la presente invención, la mutación sueca se caracteriza por residuos asparagina y leucina, respectivamente, en las posiciones aminoácidas 595 y 596 en APP695 que corresponden a las posiciones aminoácidas 670 y 671 en APP770 . Descripción detallada Generalmente, la nomenclatura que se utiliza de ahora en adelante y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genética molecular y quı́mica de ácidos nucleicos e hibridación que se describen seguidamente son los que se conocen bien y se utilizan habitualmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para procedimientos recombinantes de ácidos nucleicos, sı́ntesis de polinucleótidos, cultivos celulares, e incorporación de transgénes (por ejemplo, electroporación, microinyección, lipofección). Generalmente, las reacciones enzimáticas, la sı́ntesis de oligonucleótidos y las etapas de purificación, se llevan a cabo según las especificaciones del fabricante. Las técnicas y procedimientos se realizan generalmente según procedimientos convencionales en la técnica y diversas referencias generales que se proporcionan mediante este documento. Se cree que estos procedimientos son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para comodidad del lector. Toda la información que está contenida en la presente memoria se incorpora como referencia. Se derivan ratones quiméricos diana según Hogan, et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora- 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 16 tory (1988) y Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Roberston, editor, IRL Press, Washington, D.C., (1987), que se incorporan en la presente memoria como referencia. Las células troncales embrionales se manipulan según procedimientos publicados (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Roberston, ed., IRL Press, Washington, D.C. (1987); Zjilstra et al., Nature 342: 435 - 438 (1989); y Schwartzberg et al., Science 246:799 - 803 (1989), cada de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia). Los oligonucleótidos pueden sintetizarse en un sintetizador oligonucleótido de Applied Bio Systems según las especificaciones proporcionadas por el fabricante. En general, de ahora en adelante se describen procedimientos y constructos polinucleótidos que se utilizan para generar animales transgénicos no humanos que expresan un polipéptido APP que comprende la mutación sueca. Algunos animales transgénicos no humanos que expresan una mutación sueca APP pueden también tener alterado funcionalmente el locus del gen APP endógeno. Ventajosamente, la mutación sueca da lugar a una expresión potenciada de Aβ, expresando generalmente los animales o las células la mutación Aβ sueca codificada por el transgén, a un nivel significativamente más alto que la Aβ normal. Se cree que la Met596 a Leu596 posee una importancia particular en la expresión preferente de la Aβ sueca cuando se compara con la Aβ normal (tipo salvaje). Fragmentos que se secretan, identificados nuevamente, comprenden la porción amino terminal de βAPP (Aβ) que permanece después de la fragmentación y a la que se aludirá de ahora en adelante como forma del fragmento amino - terminal de βAPP (ATF - βAPP). Se cree que ATF βAPP es el producto de una vı́a de procesamiento secretorio alternativo para Aβ, la cual vı́a se encuentra incluso en las células normales (no enfermas). Se cree además, sin embargo, que la vı́a secretora alternativa puede ser responsable de un suceso esencial en la producción de Aβ en las células enfermas en los pacientes, y que la producción anormal de ATF - βAPP puede estar implicada en enfermedades relacionadas con la placa Aβ, particularmente la enfermedad de Alzheimer y el sı́ndrome de Down. Modelos animales particularmente preferidos para la fragmentación mediante la β - secretasa de Aβ son animales transgénicos que expresan la mutación sueca del gen Aβ, tal como se describió anteriormente. Se ha encontrado que tales animales transgénicos, particularmente los ratones transgénicos, producen grandes cantidades de ATF - βAPP que puede detectarse según los procedimientos de la presente invención. En particular, se ha encontrado que la mutación sueca de Aβ produce cantidades de ATF - βAPP que son habitualmente, por lo menos, dos veces superiores a la βAPP humana de tipo salvaje que se expresa en los animales. Habitualmente, la producción será significativamente más alta, tı́picamente, por lo menos, de dos veces superior. Con tales elevados niveles de producción de ATF - βAPP, se faci9 17 ES 2 155 099 T3 lita mucho la monitorización de la actividad de la β - secretasa bajo distintas condiciones. En particular, la investigación de medicamentos y otras terapias para inhibir la actividad de la β - secretasa (y por tanto de la inhibición de la producción de βAPP), se simplifican mucho en los modelos animales que expresan la mutación sueca de la βAPP humana. Se administran agentes a los animales de prueba tales como ratones de ensayo, que son transgénicos y que expresan la mutación sueca de la βAPP humana. Se describen de aquı́ en adelante, técnicas particulares para la producción de ratones transgénicos que expresan la forma sueca de βAPP. Se observará que pueden prepararse fácilmente otros animales transgénicos que expresen la βAPP humana sueca, incluyendo ratas, hamsters, cobayas, conejos y análogos. El efecto de los compuestos de prueba sobre la producción de ATF - βAPP en los animales de ensayo puede medirse en varias muestras de éstos. El efecto de los agentes de prueba sobre la producción de ATF - βAPP en los animales de ensayo puede medirse en varias muestras a partir de éstos. En todos los casos, será necesario obtener un valor de control que es caracterı́stico del nivel de producción de ATF - βAPP en el animal de ensayo en ausencia del compuesto o compuestos de prueba. En los casos en que el animal se sacrifica, será necesario basar tales valores de control en un promedio o valor tı́pico de otros animales de ensayo que se hayan modificado transgénicamente para expresar el mutante sueco de la βAPP humana, pero que no hayan recibido la administración de cualquier compuesto de prueba o de cualquier otra sustancia que se espera afecte el nivel de producción de ATF - βAPP. Una vez tal nivel de control se ha determinado, los compuestos de prueba pueden administrarse a animales de ensayo adicionales, en los que la desviación del valor del control promedio indica que el compuesto de prueba tenı́a un efecto sobre la actividad β secretasa en el animal. Las sustancias de prueba que se consideran positivas, es decir, susceptibles de ser beneficiosas en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o de otras condiciones relacionadas con el β - amiloide, serán aquéllas que sean capaces de reducir el nivel de producción de ATF - βAPP, preferentemente en un 20 % por lo menos, más preferentemente en un 50 % por lo menos, y más preferentemente en un 80 % por lo menos. Los agentes de prueba pueden ser cualquier molécula, compuesto, u otra sustancia que pueda añadirse al cultivo celular o administrarse al animal de ensayo, sin interferir sustancialmente con la viabilidad celular o del animal. Agentes de prueba apropiados pueden ser pequeñas moléculas, polı́meros biológicos, tales como polipéptidos, polisacáridos, polinucleótidos, y análogos. Los compuestos de prueba se administrarán tı́picamente a los animales transgénicos a una dosis de entre 1 ng/kg a 10 mg/kg, habitualmente de entre 10 µg/kg a 1 mg/kg. Los compuestos de prueba que son capaces de inhibir la secreción o la producción animal de ATF - βAPP se consideran candidatos para determinaciones ulteriores de la capacidad para blo10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18 quear la producción de β - amiloide en los animales y en el hombre. La inhibición de la secreción o de la producción, indica que la fragmentación de βAPP en el amino terminal de βAP se ha bloqueado posiblemente al menos de forma parcial, reduciendo la cantidad de un intermediario del procesamiento disponible para la conversión al péptido β - amiloide. La presente invención permite composiciones farmacéuticas que incorporen un compuesto seleccionado mediante el procedimiento anteriormente descrito y que se incluye en un vehı́culo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas deberı́an contener una cantidad terapéutica o profiláctica de por lo menos un compuesto identificado por el procedimiento anteriormente descrito. El vehı́culo farmacéuticamente aceptable puede ser cualquier sustancia compatible y no tóxica, apropiada para suministrar los compuestos a un huésped deliberado. Pueden utilizarse como el vehı́culo agua estéril, alcohol, grasas, ceras, y sólidos inertes. Pueden también incorporarse a las composiciones farmacéuticas adyuvantes farmacéuticamente aceptables, tampones, agentes dispersantes, y análogos. La preparación de condiciones farmacéuticas que incorporen agentes activos está bien descrita en la literatura médica y cientı́fica. Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 16a ¯ edición, 1982. Las composiciones farmacéuticas recién descritas son apropiadas para la administración sistémica al huésped, incluyendo la administración parenteral, tópica, y oral. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse parenteralmente, es decir, subcutánea, intramuscular o intravenosamente. Ası́, la presente invención permite composiciones para la administración a un huésped, en las que se incluya una solución farmacéuticamente aceptable del compuesto identificado en un vehı́culo aceptable, tal como se describió anteriormente. Transgenes que codifican proteı́nas APP heterólogas con la mutación sueca En un procedimiento preferido, un transgén que codifica una proteı́na APP heteróloga que incluye la mutación sueca (asparagina595 - leucina 596 ) se transfiere a un embrión fertilizado o a una célula ES para producir un animal transgénico no humano que expresa el polipéptido o los polipéptidos APP que incluye(n) la mutación sueca. Un transgén que codifica una proteı́na APP heteróloga con la mutación sueca comprende secuencias estructurales que codifican una proteı́na APP heteróloga con la mutación sueca y también generalmente elementos reguladores unidos que gobiernan la expresión de la proteı́na APP heteróloga con la mutación sueca en el huésped no humano. Sin embargo, los elementos reguladores endógenos en el genoma del huésped no humano pueden aprovecharse integrando las secuencias transgénicas en una localización cromosómica que contiene elementos reguladores endógenos funcionales que son apropiados para la expresión de las secuencias estructurales heterólogas. Tal integración dirigida se lleva a cabo habitualmente 19 ES 2 155 099 T3 mediante las secuencias diana del gen homólogo tal como se describió antes supra, en la que el transgén heterólogo comprenderı́a al menos una pinza de homologı́a. Cuando un transgén heterólogo depende de sus propios elementos reguladores, se incluyen elementos apropiados de transcripción y secuencia o secuencias de poliadenilación. Por encima de la primera secuencia estructural, se une, al menos, un promotor, con una orientación tal que gobierna la transcripción de las secuencias estructurales heterólogas. A veces se utiliza el promotor del gen heterólogo que se encuentra naturalmente (por ejemplo, un promotor APP humano se utiliza para gobernar la expresión de un transgén APP humano con la mutación sueca). Alternativamente, puede utilizarse el promotor del gen APP similar endógeno (por ejemplo, se utiliza el promotor APP murino para gobernar la expresión de un transgén APP humano con la mutación sueca). Alternativamente, puede utilizarse un elemento regulador transcripcional heterogéneo, tanto respecto a las secuencias codificantes del transgén como a los animales huéspedes no humanos (por ejemplo, un promotor y/o un potenciador de rata unido operativamente a una secuencia nucleótida que codifica la APP humana con la mutación sueca, en el que se introduce el transgén en los ratones). En algunas formas de realización, es preferible que las secuencias transgénicas que codifican el polipéptido APP con la mutación sueca, estén bajo el control transcripcional de los promotores y/o de los potenciadores (y/o silenciadores) que no están unidos operativamente en los genes APP que se encuentran de forma natural (es decir, promotores y/o potenciadores no - APP). Por ejemplo, algunas formas de realización utilizarán secuencias reguladoras transcripcionales que confieren un alto nivel de expresión y/o un patrón de expresión especı́fico de un tipo celular (por ejemplo, un promotor neuro - especı́fico). El promotor enolasa especı́fico neural de la rata (NSE) (Forss - Petter (1990) Neuron 5; 187) constituye un elemento regulador transcripcional preferido para la unión operativa a una secuencia nucleótida que codifica un polipéptido APP con la mutación sueca. Son preferidos generalmente otros promotores y/o potenciadores que confieren una expresión eficiente a la secuencia APP codificada por el transgén en el tejido cerebral. Varios promotores que muestran diversas intensidades de potencia (por ejemplo, pgk, tk, dhfr) pueden sustituirse según criterio facultativo, siendo esencial, sin embargo que el promotor funcione en el huésped no humano; y en algunas formas de realización, es deseable que el promotor gobierne la expresión en un patrón de desarrollo o en un patrón especı́fico de tipo celular (y a niveles de expresión) similar a un gen APP que se encuentra de forma natural, en un animal huésped paralelo al que le falte el transgén. Un transgén heterólogo codifica generalmente como mı́nimo una isoforma APP de longitud completa (por ejemplo, una isoforma 695 aa). El transgén heterólogo puede comprender un polinucleótido que abarca el gen APP genómico completo o una porción del mismo, puede com- 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20 prender un minigén, puede comprender un segmento codificante contiguo único (por ejemplo, cADN) o puede comprender una combinación de los mismos. Frecuentemente, el transgén codifica una secuencia polipeptı́dica APP humana que incluye la mutación sueca, pudiéndose utilizar también, sin embargo, transgénes que codifiquen polipéptidos APP no humanos que incluyan la mutación sueca. Generalmente, el transgén codificará una isoforma APP, de longitud completa, que se encuentra de modo natural (por ejemplo, APP695 , APP751 , o APP770 ) que comprende además la mutación sueca. Los transgénes que codifican los polipéptido APP que incluyen la mutación sueca comprendrán asimismo frecuentemente uno o más marcadores seleccionables unidos (infra). Los transgénes que codifican polipéptidos APP heterólogos que incluyen las moléculas de la mutación sueca pueden transferirse al genoma del huésped no humano de varias formas. Un transgén heterólogo puede dirigirse a una localización cromosómica predeterminada especı́fica mediante las secuencias diana del gen homólogo, tal como se describe supra para la diana génica. Los transgénes heterólogos pueden transferirse a un huésped en porciones, dirigiéndolos secuencialmente a una diana homóloga, para reconstituir un gen heterólogo completo en una localización cromosómica endógena del huésped. En contraste, un transgén heterólogo puede integrarse separadamente al azar utilizando o no un constructo dirigido del gen APP. Un transgén heterólogo puede ser co - transferido con un constructo dirigido del gen APP y, si se desea, ser seleccionado con un marcador seleccionable, distinguible y separado y/o ser evaluado mediante PCR o análisis por transferencia Southern de las células seleccionadas. Alternativamente, un transgén heterólogo puede ser introducido en las células ES antes o después de introducir un constructo dirigido del gen APP y la selección del mismo. Más convenientemente, un transgén heterólogo se introduce en la progenie germinal de un animal no humano mediante integración transgénica no homóloga mediante inyección pronuclear, y las progenies transgénicas resultantes se crian en un medio homocigótico que “deja fuera de combate”, con un gen APP endógeno similar alterado funcionalmente. Los ratones homocigóticos “fuera de combate” pueden también ser criados, y el transgén APP heterólogo con la mutación sueca, puede ser introducido en los embriones de éstos directamente mediante inyección pronuclear estándar u otros medios conocidos en la técnica. El direccionamiento de genes Los alelos APP endógenos no humanos pueden alterarse funcionalmente, de forma que la expresión de la APP codificada endógenamente sea suprimida o eliminada, de modo que no interfiere o contamina la APP que incluye la mutación sueca, codificada por el transgén. En una variante, un alelo APP endógeno es convertido para incluir la mutación sueca, mediante el direccionamiento de genes homólogos. El direccionamiento de genes, que es un procedimiento de utilizar la recombinación homóloga para modificar un genoma de mamı́fero, puede 11 21 ES 2 155 099 T3 utilizarse para introducir cambios en células cultivadas. Dirigiendo un gen de interés a células troncales embrionales (ES), pueden introducirse estos cambios en las progenies germinales de animales de laboratorio para estudiar los efectos de las modificaciones en los organismos enteros, entre otras utilizaciones. El procedimiento de direccionamiento de genes se lleva a cabo introduciendo en células de cultivo hı́stico un constructo dirigido del ADN, que posee un segmento homólogo respecto a un locus diana y que incluye también una modificación secuencial proyectada (por ejemplo, inserción, deleción, mutación puntual). Las células tratadas se evalúan entonces en cuanto al direccionamiento preciso de la diana, para identificar y aislar aquéllas en las que el direccionamiento ha tenido éxito. Una estrategia habitual para alterar la función génica mediante el direccionamiento de genes en las células ES es construir un constructo dirigido que se diseña para experimentar una recombinación homóloga con su complemento cromosómico en el genoma de las células ES. Los constructos dirigidos se organizan tı́picamente de forma que insertan secuencias adicionales, tales como marcadores de selección positiva, en los elementos codificantes del gen diana, alterándolo por tanto, funcionalmente. Los constructos dirigidos son habitualmente de tipo de inserción o de reemplazamiento (Hasty et al. (1991) Mol. Cell. Biol.11:4509). El direccionamiento al gen APP endógeno Los animales no humanos (por ejemplo, los mamı́feros no primates) que poseen el gen APP endógeno inactivado por el direccionamiento de dianas con un constructo dirigido de recombinación homóloga, pueden producirse mediante el procedimiento general siguiente. Tı́picamente, una secuencia del gen APP no humano se utiliza como base para producir iniciadores PCR que flanquean una región que se utilizará com un pinza de homologı́a en un constructo dirigido. Los iniciadores PCR se utilizan entonces para amplificar, mediante amplificación PCR de alta fidelidad, (Mattila et al. (1991) Nucleic acids Res. 19:4967; Eckert, K.A. y Kunkel, T.A. (1991) PCR Methods and Applications 1;17; patente estadounidense n◦ 4, 683.202) una secuencia genómica a partir de una biblioteca de clones genómicos o a partir de una preparación de ADN genómico, preferentemente de la cepa de animal no humano que es diana del constructo dirigido. El ADN amplificado se utiliza entonces como una pinza de homologı́a y/o una región dirigida. Ası́, las pinzas de homologı́a para dirigir un gen APP no humano pueden producirse fácilmente basándose en la información secuencial nucleótida disponible en la técnica y/o mediante la clonación de rutina. Los principios generales respecto a la construcción de constructos dirigidos y procedimientos de selección se revisan en Bradle et al. (1992) Bio/Technology 10: 534. Los genes APP endógenos no humanos pueden alterarse funcionalmente y, opcionalmente, reemplazarse mediante transgénes que codifiquen APP que incluya la mutación sueca. Los constructos dirigidos pueden ser transferidos a células troncales pluripotentes, tales como células troncales embrionales murinas, en 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 22 las que los constructos dirigidos se recombinan homólogamente con una porción de un locus del gen APP endógeno y crean una mutación o mutaciones (es decir, inserciones, deleciones, reajustes, reemplazamientos secuenciales y/o mutaciones puntuales) que evitan la expresión funcional del gen APP endógeno. Un procedimiento preferido es suprimir, mediante recombinación homóloga dirigida, elementos estructurales esenciales del gen APP endógeno. Por ejemplo, un constructo dirigido puede recombinarse homólogamente con un gen APP endógeno y suprimir una porción que abarca sustancialmente la totalidad de uno o más de los exones para crear un alelo vacı́o de éstos, insertando tı́picamente una región de reemplazamiento a la que le falta el exón o exones correspondientes. Los animales transgénicos homocigóticos para el alelo vaciado del exón (por ejemplo, mediante el criado de heterocigotos entre ellos) producen células que son esencialmente incapaces de expresar un polipéptido APP endógeno funcional (preferentemente incapaces de expresar cualquiera de las isoformas que se encuentran de modo natural). De forma similar, puede utilizarse el direccionamiento de genes homólogos, si se desea, para alterar funcionalmente un gen APP suprimiendo sólo una porción de un exón. Los constructos dirigidos pueden utilizarse asimismo para suprimir elementos reguladores esenciales de un gen APP endógeno, tales como promotores, potenciadores, sitios de corte y empalme, sitios de poliadenilación, y otras secuencias reguladoras, que incluyen secuencias actuantes cis que se situan por encima o por debajo del gen estructural APP pero que participan en la expresión del gen APP endógeno. La deleción de elementos reguladores se realiza tı́picamente insertando, mediante recombinación homóloga de doble entrecruzamiento, una región de reemplazamiento a la que le falta el elemento o los elementos reguladores correspondientes. Un procedimiento alternativo preferido es interrumpir elementos reguladores y/o estructurales esenciales de un gen APP endógeno mediante la inserción dirigida de una secuencia polinucleótida, y por tanto, alterar funcionalmente el gen APP endógeno. Por ejemplo, un constructo dirigido puede recombinarse homólogamente con un gen APP endógeno e insertar una secuencia no homóloga, tal como un cassette de expresión neo, en un elemento estructural (por ejemplo, un exón) y/o regulador (por ejemplo, un potenciador, un promotor, un sitio de corte y empalme, un sitio de poliadenilación) para dar lugar a un alelo APP convertido en diana que posee una interrupción insercional. La secuencia insertada puede tener un tamaño del orden de entre 1 nucleótido aproximadamente (por ejemplo, para dar lugar a un desplazamiento del marco de lectura en una secuencia exónica) a varias kilobases o más, estando limitado por la eficiencia de direccionamiento de genes homólogos con constructos dirigidos que posean una larga región de reemplazamiento no homóloga. Los constructos dirigidos pueden también utilizarse para reemplazar una porción de un gen APP endógeno con un secuencia exógena (es de- 23 ES 2 155 099 T3 cir, una porción de un transgén dirigido); por ejemplo, el primer exón de un gen APP puede ser reemplazado con una porción sustancialmente idéntica que contiene una mutación sin sentido o que lo ha perdido. La inactivación de un locus APP endógeno del ratón se obtiene mediante la alteración dirigida del gen apropiado mediante la recombinación homóloga en las células troncales embrionales del ratón. Para la inactivación, puede utilizarse cualquier constructo dirigido que produzca una alteración genética en el locus del gen APP diana, que evite la expresión efectiva de un producto génico funcional de ese locus. Si han constituı́do la diana sólo elementos reguladores, puede tener lugar algún tipo de expresión de bajo nivel del gen (es decir, el alelo diana “hace agua”), pudiendo ser el nivel de expresión suficientemente bajo como para que el alelo diana “que hace agua” se altere funcionalmente. Generación de alelos APP nulos y ratones “fuera de combate” Un gen APP endógeno en un huésped no humano puede alterarse funcionalmente mediante la recombinación homóloga con un constructo dirigido que no incluya un segmento similar del gen APP heterólogo que comprenda la mutación sueca. En este procedimiento, una porción del constructo dirigido se integra en un elemento estructural o regulador esencial del locus del gen APP endógeno, alterándolo por lo tanto funcionalmente, para generar un alelo nulo. Tı́picamente, los alelos nulos se producen mediante la integración de una secuencia no homóloga que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, un cassette de expresión del gen neo) en una secuencia estructural esencial y/o reguladora de un gen APP mediante la recombinación homóloga de las pinzas de homologı́a del constructo dirigido con las secuencias del gen APP endógeno, aunque pueden utilizarse otras estrategias (véase seguidamente). Más habitualmente, un constructo dirigido es transferido mediante electroporación o microinyección a una progenie celular troncal embrional (ES) totipotente, tal como las progenies murinas AB - 1 o CCE. El constructo dirigido se recombina homólogamente con las secuencias endógenas que se encuentran en o flanquean un locus del gen APP y altera funcionalmente un alelo, por lo menos, del gen APP. Tı́picamente, la recombinación homóloga del constructo dirigido con las secuencias del locus APP endógeno da lugar a la integración de una secuencia no homóloga que codifica y expresa un marcador seleccionable, tal como neo, en forma habitualmente de una cassette de selección positiva (infra). El alelo alterado funcionalmente se denomina un alelo APP nulo. Las células ES que poseen al menos un alelo APP nulo son seleccionadas para propagarse en un medio que permita la propagación preferente de células que expresen el marcador seleccionable. Las células ES seleccionadas son examinadas mediante análisis PCR y/o análisis de transferencia Southern, para comprobar la presencia de un alelo APP convertido correctamente en diana. Puede llevarse a cabo la crı́a de animales no humanos que son heterocigóticos para 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 24 un alelo nulo, para producir animales no humanos homocigóticos para dicho alelo nulo, denominándose animales “fuera de combate” (Donehower et al. (1992) Nature 256: 215; Science 256: 1392. Alternativamente, pueden producirse en cultivo células ES homocigóticas para un alelo nulo, que posean un marcador seleccionable integrado, seleccionándolas en un medio que contenga niveles altos del agente de selección (por ejemplo, G418 o higromicina). La heterocigosidad y/o la homocigosidad para un alelo nulo convertido correctamente en diana, puede comprobarse con análisis PCR y/o análisis de transferencia Southern del ADN aislado de una alı́cuota de un clon seleccionado de células ES y/o de las biopsias de la cola (del animal). Si se desea, un transgén que codifica un polipéptido APP heterólogo que comprende la mutación sueca puede ser transferido a un huésped no humano que posea un alelo nulo APP, preferentemente a una célula ES no humana que sea homocigótica para el alelo nulo APP. Es generalmente ventajoso que el transgén incluya un promotor y un potenciador que gobiernen la expresión de las secuencias estructurales que codifican un producto heterólogo funcional del gen APP que contiene la mutación sueca. Ası́, por ejemplo y sin restricción, un ratón “fuera de combate” homocigótico para los alelos nulos en el locus APP, es preferentemente un huésped para un transgén que codifica y expresa una proteı́na APP funcional humana que comprende la mutación sueca. Los transgénes APP con la mutación sueca comprenden secuencias estructurales APP heterólogas que codifican polipéptidos APP que incluyen la mutación sueca, bien en forma de exones que presentan secuencias de unión de corte y empalme, como un segmento codificante contiguo (por ejemplo, un cADN), o como una combinación de estas. Más habitualmente, los transgénes APP con la mutación sueca codifican polipéptidos APP de longitud completa, aunque los transgénes pueden codificar isoformas APP truncadas, polipéptidos APP quiméricos (por ejemplo, parte humana/parte de ratón), y/o variantes de APP aminosustituı́das (es decir, muteı́nas) que comprenden además la mutación sueca. Tı́picamente, los transgénes comprenden también elementos reguladores, tal como un promotor y, para la expresión óptima, un potenciador. Reemplazamiento del gen APP homólogo Alternativamente, un gen APP endógeno en un huésped no humano puede ser alterado funcionalmente mediante integración homóloga de un gen APP heterólogo similar que comprende la mutación sueca, de forma que el gen APP heterólogo similar reemplaza sustancialmente al gen APP endógeno, abarcando por lo menos las posiciones aminoácidas 595 - 596 según el convenio de numeración en el trabajo antes citado Kang et al. (1987), y preferentemente, reemplaza completamente las secuencias codificantes del gen APP endógeno. Preferentemente, el gen APP heterólogo con la mutación sueca se une, como consecuencia de integración homóloga, a secuencias reguladoras (por ejemplo, un potenciador) del gen APP endógeno, de forma que el gen heterólogo 13 25 ES 2 155 099 T3 con la mutación sueca se expresa bajo el control transcripcional de elementos reguladores del locus del gen APP endógeno. Los huéspedes no humanos que son homocigóticos para tales alelos de reemplazamiento (es decir, un locus APP cromosómico del huésped que codifica un producto del gen APP heterólogo similar con la mutación sueca) pueden producirse según los procedimientos descritos en la presente memoria. Tales huéspedes no humanos homocigóticos expresarán generalmente una proteı́na APP heteróloga con la mutación sueca pero no expresarán la proteı́na APP endógena. Más habitualmente, el patrón de expresión del gen APP heterólogo con la mutación sueca imitará sustancialmente el patrón de expresión del gen APP endógeno en el huésped no humano que se encuentra de forma natural (no transgénico). Por ejemplo pero sin restricción, un ratón transgénico que posea las secuencias del gen APP humano con la mutación sueca, que reemplacen a las secuencias del gen APP murino endógeno y que estén controladas transcripcionalmente por las secuencias reguladoras murinas endógenas, se expresará de modo similar al APP murino en ratones no transgénicos que se encuentran de modo natural. Generalmente, se utiliza un constructo dirigido de tipo reemplazamiento para el reemplazamiento génico homólogo. La recombinación homóloga de doble entrecruzamiento entre las secuencias del gen APP endógeno y las pinzas de homologı́a que flanquean la región de reemplazamiento (es decir, la región codificante de la mutación sueca del APP heterólogo) del constructo dirigido, dan lugar a la integración dirigida de los segmentos del gen APP heterólogo con la mutación sueca. Habitualmente, las pinzas de homologı́a del transgén comprenden secuencias que flanquean a los segmentos del gen APP endógeno, de forma que la recombinación homóloga da lugar a la deleción concomitante de los segmentos del gen APP endógeno y a la integración homóloga de los segmentos del gen heterólogo. Un gen APP endógeno entero puede ser reemplazado sustancialmente con un gen APP heterólogo que comprende la mutación sueca, mediante un único o un múltiple evento de direccionamiento de genes (por ejemplo, reemplazamiento secuencial de exones individuales). Uno o más marcadores seleccionables, habitualmente en forma de cassettes de expresión de selección negativa o positiva, pueden situarse en la región de reemplazamiento del constructo dirigido; se prefiere habitualmente que los marcadores seleccionados se localicen en regiones intrónicas de la región heteróloga de reemplazamiento. Las células ES que albergan un gen APP heterólogo con la mutación sueca, tal como un alelo de reemplazamiento, pueden seleccionarse de diversas maneras. En primer lugar, un marcador seleccionado (neo, gpt, tk), puede unirse al gen APP heterólogo con la mutación sueca (por ejemplo, en un intrón o secuencia flanqueante) en el constructo dirigido, de forma que las células que poseen un alelo de reemplazamiento, pueden ser seleccionadas. Muy habitualmente, un constructo dirigido del gen APP heterólogo incluirá tanto un cassette de expresión de selección positiva como 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 26 un cassette de expresión de selección negativa, de manera que las células dirigidas homologamente puedan seleccionarse mediante un esquema de selección positivo - negativo (Mansour et al. (1988), en el trabajo antes citado). Generalmente, un cassette de expresión de selección positiva se sitúa en una región intrónica de la región de reemplazamiento del gen APP heterólogo con la mutación sueca, mientras que un cassette de expresión de selección negativa se sitı́a distalmente respecto a una pinza de homologı́a, de modo que la recombinación homóloga de doble entrecruzamiento dará lugar a la integración del cassette de selección positiva y a la pérdida del cassette de selección negativa. Constructos dirigidos Se han descrito diversas técnicas de direccionamiento de genes, que incluyen pero no se limitan a: co - electroporación, “alcance de objetivo y huı́da”, integración de entrecruzamiento único, y recombinación de entrecruzamiento doble (Bradley et al. (1992) Bio/Technology 10:534). La invención puede llevarse a la práctica utilizando esencialmente cualquier estrategia de direccionamiento de un gen homólogo aplicable, que se conozca en la técnica. La configuración de un constructo dirigido depende de la técnica de direccionamiento especı́fica que se seleccione. Por ejemplo, un constructo dirigido para la integración de entrecruzamiento único o el constructo dirigido para el “alcance de objetivo y huı́da”, necesita sólo tener una pinza única de homologı́a unida a la región dirigida, mientras que un constructo dirigido de tipo reemplazamiento de doble entrecruzamiento, requiere dos pinzas de homologı́a, cada una flanqueando cada lado de la región de reemplazamiento. Por ejemplo y sin restricción, un constructo dirigido preferido comprende, en este orden: (1) una primera pinza de homologı́a que posea una secuencia sustancialmente idéntica a una secuencia dentro de aproximadamente 3 kilobases aproximadamente por encima (esto es, en el sentido opuesto al marco de lectura traduccional de los exones) de un exón de un gen APP endógeno, (2) una región de reemplazamiento que comprende un cassette de selección positiva que tiene un promotor pgk que gobierna la transcipción de un gen neo, (3) una segunda pinza de homologı́a que tiene una secuencia sustancialmente idéntica a una secuencia dentro de aproximadamente 3 kilobases por debajo de dicho exón de dicho gen APP endógeno, y (4) un cassette de selección negativa, que comprende un promotor HSVtk que gobierna la transcripción de un gen HSVtk. Tal constructo dirigido es apropiado para la recombinación de reemplazamiento de doble entrecruzamiento que suprime una porción del locus APP endógeno que abarca dicho exón y lo reemplaza con la región de reemplazamiento que posee el cassette de selección positiva. Si el exón suprimido es esencial para la expresión de un producto funcional del gen APP, el alelo resultante vaciado del exón está funcionalmente alterado y se denomina alelo nulo. Los constructos dirigidos útiles para la práctica de la invención pueden comprender al menos una pinza de homologı́a APP unida en ligamiento polinucleótido (es decir, mediante 27 ES 2 155 099 T3 enlaces fosfodiéster) a una región dirigida. Una pinza de homologı́a posee una secuencia que corresponde a, o es sustancialmente complementaria a una secuencia del gen APP endógeno de un animal huésped no humano, y puede incluir secuencias que flanqueen al gen APP. Aunque en la técnica no se han determinado de manera concluyente lı́mites de tamaño más grande o más pequeño para las pinzas de homologı́a recombinogénica, se cree que lo mejor para las pinzas de homologı́a es que tengan del orden de entre 50 pares de bases y varias decenas de kilobases. Consecuentemente, los constructos dirigidos tienen generalmente, al menos, de 50 a 100 nucleótidos de largo aproximadamente, preferentemente, al menos, entre 250 y 500 nucleótidos de largo, más preferentemente, al menos, entre 1000 y 2000 nucleótidos de largo aproximadamente, o son más largos. Las regiones de homologı́a de los constructos (pinzas de homologı́a) tienen generalmente, al menos, de aproximadamente 50 a 100 bases de largo, preferentemente, al menos, aproximadamente entre 100 y 500 bases de largo, y más preferentemente, al menos, entre aproximadamente 750 y 2000 bases de largo. Se cree que son preferidas las regiones de homologı́a de aproximadamente 7 a 8 kilobases de largo, con una forma de realización preferida que posee una primera región de homologı́a de 7 kilobases aproximadamente que flanquea un lado de una región de reemplazamiento y una segunda región de homologı́a de 1 kilobase aproximadamente que flanquea el otro lado de dicha región de reemplazamiento. La longitud de la homologı́a (es decir, de identidad sustancial) para una región de homologı́a puede seleccionarse según criterio facultativo, basándose en la composición secuencial y en la complejidad de la secuencia o secuencias diana del gen APP endógeno y en la orientación proporcionada en la técnica (Hasty et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11: 5586; Shulman et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 4466). Los constructos dirigidos tienen por lo menos una región de homologı́a que posee una secuencia que corresponde substancialmente a, o es complementaria sustancialmente a una secuencia del gen APP endógeno (por ejemplo, una secuencia exónica, un potenciador, un promotor, una secuencia intrónica, o una secuencia flanqueante dentro de de alrededor de 3 a 20 kb de un gen APP). Tal región de homologı́a del transgén dirigido sirve como matriz para el apareamiento y la recombinación homólogos con una secuencia o secuencias sustancialmente idénticas del gen APP endógeno. En los constructos dirigidos, tales regiones de homologı́a flanquean tı́picamente la región de reemplazamiento, que es una región del constructo dirigido que va a experimentar un reemplazamiento con la secuencia diana del gen APP endógeno (Berinstein et al. (1992) Mol. Cell. Biol 12:360). De este modo, un segmento del constructo dirigido flanqueado por las regiones de homologı́a puede reemplazar a un segmento de una secuencia del gen APP endógeno mediante recombinación homóloga de doble entrecruzamiento. Las regiones de homologı́a y las regiones dirigidas se unen conjuntamente en un ligamiento polinucleótido lineal convencional (estructura fosfodiéster extremos 5’ a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 28 extremos 3’). Los constructos dirigidos son generalmente moléculas de ADN bicatenarias, más habitualmente lineales. Sin querer limitarse a ninguna teorı́a particular de la recombinación homóloga o de la conversión génica, se cree que en tal recombinación de reemplazamiento de doble entrecruzamiento, una primera recombinación homóloga (por ejemplo, cambio, emparejamiento, escisión y unión de las cadenas) entre una primera región de homologı́a del constructo dirigido y una primera secuencia del gen APP endógeno, se acompaña por una segunda recombinación homóloga entre una segunda región de homologı́a del constructo dirigido y una segunda secuencia del gen APP endógeno, dando lugar por tanto a la porción del constructo dirigido que se situó entre las dos regiones de homologı́a, reemplazando la porción del gen APP endógeno que se situó entre la primera y segunda secuencias del gen APP endógeno. Por esta razón, las regiones homólogas se utilizan generalmente en la misma orientación (es decir, la dirección “corriente arriba” es la misma para cada región homóloga de un transgén, para evitar reorganizaciones). La recombinación de reemplazamiento de doble entrecruzamiento puede utilizarse, de este modo, para suprimir una porción de un gen APP endógeno y transferir concomitantemente una porción no homóloga (por ejemplo, un cassette de expresión del gen neo) a la correspondiente localización cromosómica. La recombinación de doble entrecruzamiento puede asimismo utilizarse para añadir una porción no homóloga a un gen APP endógeno sin suprimir las porciones cromosómicas endógenas. Sin embargo, la recombinación de doble entrecruzamiento puede también utilizarse simplemente para suprimir una porción de una secuencia del gen APP endógeno sin transferir una porción no homóloga al gen APP endógeno (véase Jasin et al. (1988) Genes Devel 2:1353). La porción “corriente arriba” y/o “corriente abajo” de porción no homóloga, puede ser un gen que identifica si una recombinación homóloga de doble entrecruzamiento ha tenido lugar; tal gen es tı́picamente el gen HSV tk que puede utilizarse para la selección negativa. Tı́picamente, los constructos dirigidos de la invención se utilizan para alterar funcionalmente los genes APP endógenos y comprenden, al menos, dos regiones de homologı́a separadas por una secuencia no homóloga que contiene un cassette de expresión que codifica una marcador seleccionable, tal como neo(Smith y Berg (1984) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 49:171; Sedivy y Sharp (1989) Proc. Natl. Acad. Sci; (U.S.A.) 86:227; Thomas y Capecchi (1987) en el trabajo antes citado). Sin embargo, algunos transgénes dirigidos de la invención pueden tener la región o regiones homólogas flanqueando sólo un lado de una secuencia no homóloga. Los transgénes dirigidos de la invención pueden ser también del tipo al que se alude en la técnica como transgénes de “alcanza un objetivo y huye” y “ entrar y salir” (Valancius y Smithies (1991) Mol. Cell. Biol 11: 1402; Donehower et al. (1992) Nature 356: 215; (1991) J.NIH Res 3: 59. El cassette de selección positiva codifica un marcador seleccionable que proporciona medios 15 29 ES 2 155 099 T3 para seleccionar las células que presentan secuencias del transgén dirigido integradas que abarcan el cassette de expresión de selección positiva. El cassette de expresión de selección negativa codifica un marcador seleccionable que proporciona medios para seleccionar células que no poseen una copia integrada del cassette de expresión de selección negativa. Por tanto, mediante un protocolo combinado de selección positiva - negativa, es posible seleccionar células que han experimentado una recombinación de reemplazamiento homóloga y que han incorporado la porción del transgén situada entre las regiones homólogas (es decir, la región de reemplazamiento) en una localización cromosómica, seleccionando la presencia del marcador positivo y la ausencia del marcador negativo. Los cassettes de expresión preferidos para inclusión en los constructos dirigidos codifican y expresan un marcador seleccionable de resistencia a las drogas y/o un enzima HSV timidı́n - quinasa. Los genes apropiados de resistencia a las drogas incluyen, por ejemplo: gpt (xantina - guanina fosforibosiltransferasa), que puede ser seleccionada con ácido micofenólico; neo (neomicinfosfotransferasa), que puede ser seleccionada con G418 o higromicina; y DFHR (dihidrofolato reductasa), que puede ser seleccionada con metotrexato (Mulligan y Berg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78: 2072; Southern y Berg (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 327. La selección para los recombinantes convertidos correctamente en diana, utilizará generalmente, al menos, la selección positiva, en la que una cassette de expresión no homóloga codifica y expresa una proteı́na funcional (por ejemplo, neo o gpt) que confiere un fenotipo seleccionable a las células diana que albergan el casette de expresión integrada endógenamente, de forma que, añadiendo un agente de selección (por ejemplo, G418 o ácido micofenólico), tales células diana presentan ventajas de desarrollo o de supervivencia respecto a las células que no poseen un cassette de expresión integrado. Es preferible que la selección para los recombinantes homólogos convertidos correctamente en diana utilice también la selección negativa, de forma que las células que albergan sólo la integración no homóloga del transgén sean seleccionadas otra vez. Tı́picamente, tal selección negativa emplea un cassette de expresión que codifica el gen timidina quinasa del virus del herpex simplex (HSVtk) que se sitúa en el transgén de forma que se integrará solamente mediante recombinación no homóloga. Tal posicionamiento tiene lugar generalmente uniendo el cassette de expresión HSV tk (u otro cassette de selección negativa) de forma distal a las regiones homólogas recombinogénicas, de manera que la recombinación de reemplazamiento de doble entrecruzamiento de éstas transfiera el cassette de expresión de selección positiva, pero no el gen HSVtk (u otro cassette de selección negativa), a una localización cromosómica. Un análogo de nucleósido, ganciclovir, que es preferentemente tóxico para las células que expresan HSVtk, puede utilizarse como el agente de selección negativo, pues selecciona las células que no poseen un cassette de expresión HSV tk inte16 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 30 grado. Asimismo, puede utilizarse FIAU como un agente selectivo para seleccionar las células a las que les falta HSV tk. Con objeto de reducir el ruı́do de fondo de las células que poseen secuencias del constructo dirigido incorrectamente integradas, se utiliza tı́picamente un esquema de selección de combinaciones positivas - negativas (Mansour et al. (1988) (en el trabajo antes citado). Generalmente, los constructos dirigidos incluyen preferentemente: (1) un cassette de expresión de selección positiva flanqueado por dos regiones homólogas que son sustancialmente idénticas a las secuencias del gen APP endógeno de la célula huésped, y (2) un cassette de expresión de selección negativa situado distalmente. Sin embargo, pueden asimismo utilizarse constructos dirigidos que incluyen sólo un cassette de expresión de selección positiva. Tı́picamente, un constructo dirigido contendrá un cassette de expresión de selección positiva que incluye un genneo unido “corriente abajo” (es decir, hacia el carboxilo del polipéptido codificado en el sentido del marco de lectura de la traducción) de un promotor tal como el promotor HSV tk o el pgk. Más tı́picamente, el transgén dirigido contendrá también una cassette de expresión de selección negativa que incluye un gen HSV tk unido “corriente abajo” de un promotor HSV tk. Es preferible que los constructos dirigidos posean regiones de homologı́a que sean muy homólogas respecto a la secuencia o secuencias diana predeterminadas del ADN endógeno, preferentemente isogénicas (esto es, secuencias idénticas). Pueden obtenerse secuencias isogénicas o casi isogénicas mediante la clonación genómica o la amplificación PCR de alta fidelidad del ADN genómico procedente de la cepa de animales no humanos que constituyen el origen de las células ES utilizadas en el procedimiento de direccionamiento de los genes. Para alterar el gen APP murino, puede utilizarse un constructo dirigido basado en el diseño utilizado por Jaenisch y colaboradores (Zjilstra et al. (1989) en el trabajo antes citado) para alterar con éxito el gen de la β2 - microglobulina del ratón. El gen de resistencia a la neomicina (neo), se inserta, a partir del plásmido pMC1NEO en la región codificante del gen APP diana. La inserción pMC1NEO utiliza una secuencia promotora/potenciadora vı́rica hı́brida para gobernar la expresión neo. Este promotor es activo en las células troncales embrionales. Por tanto, neo puede utilizarse como un marcador seleccionable para la integración del constructo “fuera de combate”. El gen HSV timidina quinasa (tk) se añade al extremo del constructo como un marcador de selección negativa contra los eventos de inserción al azar (Zjilstra, et al., en trabajo antes citado). Los vectores que contienen un constructo dirigido se desarrollan tı́picamente en E.coli y se aislan entonces utilizando procedimientos estándares de biologı́a molecular, o pueden sintetizarse como oligonucleótidos. Puede también llevarse a cabo la inactivación dirigida directa que no necesita vectores procarióticos o eucarióticos. Los transgénes dirigidos pueden ser transferidos a células huésped mediante cualquier técnica 31 ES 2 155 099 T3 apropiada, que incluye microinyección, electroporación, lipofección, biolı́stica, precipitación con fosfato de calcio, y vectores sustentados en virus, entre otras. Otros procedimientos utilizados para transformar las células de los mamı́feros incluyen la utilización de Polybreno, fusión protoplástica, y otros (véase, generalmente, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a¯ edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y). Para obtener animales no humanos transgénicos (que incluyen animales no humanos convertidos homólogamente en diana), se prefieren células troncales enbrionales (células ES). Las células ES murinas, tales como la progenie AB 1 desarrollada sobre capas celulares proveedoras SNL76/7 mitóticamente inactivas (McMahon y Bradley (1990) Cell 62: 1073) tal como se describe esencialmente (Robertson, E.J. (1987) en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E.J. Roberston, ed. (Oxford: IRL Press), p. 71 - 112) pueden utilizarse para el direccionamiento de genes homólogos. Otras progenies ES apropiadas incluyen, pero no se limitan a la progenie E14 (Hooper et al. (1987) Nature 326:292 - 295), la progenie D3 (Doetschman et al. (1985) J.Embryol. Exp. Morph. 87: 27 - 45) y la progenie CCE (Robertson et al. (1986) Nature 323:445 - 448). El éxito de generar una progenie murina a partir de las células ES que albergan una mutación diana especı́fica depende de la pluripotencia de las células ES (es decir, de su capacidad, una vez inyectadas en un blastocisto huésped, para participar en la embriogénesis y contribuir a las células germinales del animal resultante). Se permite que los blastocistos que contienen las células ES inyectadas se desarrollen en los úteros de las hembras no humanas pseudoembarazadas y nacen como ratones quiméricos. Los ratones transgénicos resultantes son quiméricos para las células que tienen loci APP endógenos inactivados, y se retrocruzan y se evalúan en cuanto a la presencia del transgén o transgénes convertidos correctamente en diana mediante análisis PCR o de transferencia Southern sobre el ADN biópsico de la cola de la descendencia, de forma que se identifiquen los ratones transgénicos heterocigóticos para el locus APP inactivado. Realizando los cruces apropiados, es posible producir un animal no humano transgénico homocigótico para los alelos APP funcionalmente alterados, y que albergue también opcionalmente un transgén que codifique un polipéptido APP heterólogo que incluya la mutación sueca. Tales animales transgénicos son sustancialmente incapaces de producir un producto del gen APP endógeno, pero expresan la APP heteróloga con la mutación sueca. Investigación comercial y utilizaciones de la evaluación Los animales no humanos que comprenden transgénes que codifican la APP con la mutación sueca (y por tanto la mutación sueca Aβ), pueden utilizarse comercialmente para evaluar agentes que posean el efecto de disminuir la producción y/o acumulación de Aβ. Tales agentes pueden desarrollarse como medicamentos para tratar el procesamiento anormal de APP y/o la enfermedad de Alzheimer, entre otras condiciones neuro- 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 32 degenerativas. Por ejemplo, los ratones “fuera de combate” p53 de Donehower et al. (1992) Nature 356: 215 han encontrado una amplia aceptación como productos comerciales para la evaluación carcinogénica y similares. Los animales transgénicos que se describen en la presente memoria, exhiben un procesamiento y expresión de APP anormales, y pueden utilizarse para la evaluación farmacéutica y como modelos patológicos para las enfermedades neurodegenerativas y la bioquı́mica del APP. Tales animales tienen muchos usos, que incluyen pero no se limitan a identificar compuestos que realicen o afecten al procesamiento de Aβ; en una variante, los agentes son identificados de este modo como agentes farmacéuticos candidatos. Los animales transgénicos pueden utilizarse asimismo para desarrollar agentes que modulen la expresión y/o la estabilidad de APP (o de Aβ); tales agentes pueden servir como agentes terapéuticos para tratar enfermedades neurodegenerativas. Los animales “fuera de combate” de la invención pueden también servir como modelos de enfermedad para la investigación de las condiciones patológicas relacionadas con APP (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer y análogas). Tales animales transgénicos pueden comercializarse para los investigadores, entre otros usos. Anticuerpos para la APP con la mutación sueca Utilizando polipéptidos APP que comprendan la mutación sueca, es posible entonces preparar antisueros y anticuerpos monoclonales, utilizando,por ejemplo,el procedimiento de Kohler y Milstein ((1975) Nature 256: 495). Tales anticuerpos monoclonales podrı́an entonces constituir la base para un ensayo diagnóstico que detecte la presencia de la mutación sueca, entre otros usos. Los polipéptidos APP con la mutación sueca pueden utilizarse para inmunizar a un animal con el objeto de producir anticuerpos especı́ficos. Estos anticuerpos pueden comprender un antisuero policlonal o un anticuerpo monoclonal producido por células de hibridoma. Para los procedimientos generales de preparación de anticuerpos, véase Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) E. Harlow y D.Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. Por ejemplo pero sin restricción, un fragmento polipéptido APP695 con la mutación sueca producido de forma recombinante puede inyectarse en un ratón junto con un adyuvante, de forma que se genere una respuesta inmunitaria. Las inmunoglobulinas murinas que se unen al fragmento recombinante con una afinidad de unión de por lo menos 1 x 107 M − 1 pueden recuperarse del ratón inmunizado como un antisuero, y pueden purificarse ulteriormente mediante cromatografı́a de afinidad u otros medios. Además, células del bazo se recuperan del ratón y se fusionan con las celulas de mieloma para producir un banco de células de hibridoma que secretan anticuerpos. El banco de hibridomas puede evaluarse en cuanto a los clones que secretan las inmunoglobulinas, las cuales se unen al fragmento producido de modo recombinante con una afinidad de, como mı́nimo, 1 x 106 M − 1 . Más especı́ficamente, las inmunoglobulinas que se unen al polipéptido APP con la mutación sueca pero presentan una reactividad 17 33 ES 2 155 099 T3 cruzada limitada con un polipéptido APP de tipo salvaje, son seleccionadas, bien mediante preabsorción con el APP de tipo salvaje o mediante evaluación de las progenies celulares de hibridoma para idiotipos especı́ficos que se unen preferentemente a la variante de la mutación sueca, cuando se comparan a la del tipo salvaje. Los ejemplos que siguen se proporcionan como ilustración, y no tienen la intención de limitar la invención al ejemplo especı́fico que se adjunta. Ejemplos Experimentales El anticuerpo 6C6 reconoce un epı́topo en el interior de los residuos 1 - 16 de βAP. Ratones transgénicos que expresan la APP con la muatación sueca Se generaron ratones transgénicos utilizando los plásmidos que se muestran en la Fig 1 (NSEAPPsw y NSEAPPsw∆3’). Estos plásmidos contienen la forma 751 de βAPP que contiene la mutación sueca (KM a NL a la posición 595 y 596 de la forma 695). El promotor enolasa especı́fico neural gobierna la expresión y proporciona una secuencia de corte y empalme. El promotor NSE de la rata y las secuencias de corte y empalme se derivaron de pNSE6 (Forss - Petter et al. (1990) Neuron 5: 187). Este vector contiene el fragmento BglII de 4,2 kb de la región promotora NSE de la rata (que empieza a partir del sitio BglII corriente arriba y continua hasta el sitio BglII en el segundo intrón) clonado en el sitio BamHI del vector pSP65 (Promega). El sitio XbaI derivado del vector en el extremo 5’ del promotor utilizado y el ATG de iniciación de la traducción NSE, contenido en el interior del segundo intrón, se fusionó con el ATG que iniciaba βAPP. NSEAPPsw contiene asimismo una secuencia de corte y empalme del SV40 en la región del extremo 3’ del gen. La secuencia de corte y empalme se derivó del vector pL1 de Okayama/Berg, y constituye una fusión de las últimas secuencias de corte y empalme mensajeras 16s y 19s. La poliadenilación está proporcionada por secuencias SV40. Los ratones transgénicos que incorporan estas secuencias plasmı́dicas se generaron utilizando técnicas estándar. El fragmento NotI que contiene el cassette de expresión anteriormente descrito se purificó e inyectó en óvulos obtenidos a partir del ratón hı́brido C57B1/DBA. Los óvulos se implantaron en ratones hembra pseudoembarazadas y la descendencia se evaluó en cuanto a la expresión de la βAPP humana mediante análisis de su descendencia F1 transgénica. Los cerebros de los animales F1 se homogenizaron con un homogenizador manual (Polytron PT122B, Kinematica AG) bien en un tampón SDS (SDS al 2 %, 20 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA) u homogenizado en tampón NP 40 (NP40 al 1 %, 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA, y una mezcla de inhibidores de la proteasa que contenı́an 5 - 10 µg/ml leupeptina, 2 - 4 µg/ml de Pepstatina A, 5 - 10 µg/ml Aprotinina, y 1 - 2 mM PMSF). Los lisados SDS se cargaron directamente en geles para análisis Western. Los homogenados NP40 se centrifugaron a 44.000 rpm durante 10 minutos en una ultracentrı́fuga Beckman (rotor Tl100.3) y los sobrenadantes se cargaron en geles para análisis Western. Este se 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 34 llevó a cabo mediante procedimientos estándar utilizando bien anticuerpos anti - 5 (0,4 µg/ml) o 8E5 (5 µg/ml) para detectar la βAPP especı́fica humana. Aquellas progenies que expresaron niveles relativamente altos de βAPP se escogieron para análisis ulterior. Este incluı́a las progenies Hillary 14, Chelsea 32 y Chelsea 58. Los experimentos que se describen se llevaron a cabo en animales heterocigóticos de estas progenies derivados mediante cruzamientos de animales que contenı́an transgénes con animales de tipo salvaje y realizando una evaluación de la descendencia en cuanto a la presencia de un transgén. De modo similar, pueden utilizarse animales homocigóticos a partir de diversas progenies seleccionadas. Las fracciones solubles de los cerebros animales transgénicos se sondearon en cuanto a la presencia de la forma “92” de la APP secretada (Fig 2). Esta forma se produce como producto de desecho de la producción de βAP y la inhibición de la producción de esta forma en células cultivadas acompaña a la inhibición de la fragmentación del extremo N - terminal de βAP, el sitio fragmentado por la β - secretasa. Cerebros de ratones transgénicos (Sueco Hillary 14) o no transgénicos, se homogenizaron en 50 mM Tris, 10 mM EDTA más la mezcla de inhibidores proteásicos anteriormente descrita, centrifugándose a 55K rpm durante 10 minutos, tal como se describió antes. El sobrenadante se analizó mediante Western, utilizando el anticuerpo sueco “192” que reacciona sólo con la forma secretada de APP producida por la β - secretasa. Para el análisis Western, las proteı́nas se separaron en un gel SDS PAGE al 6 % (de Novex), transfiriéndose entonces a inmobilon P mediante técnicas estándar. El filtro se incubó con 2 µg/ml del anticuerpo sueco “192” utilizando otra vez técnicas estándar y visualizándose el anticuerpo unido utilizando el equipo de AmershamECL. Tal como se muestra en la Fig 2, carril 3, existió un material reactivo “92” fuertemente detectable en el sobrenadante del animal transgénico. Los homogenados cerebrales de los animales no transgénicos contenı́an una cantidad escasa de material inmunoreactivo que se mostró ligeramente más rápida al moverse en el gel que el material especı́fico para el animal transgénico (carril 1). Este material no se relaciona probablemente con βAPP, ya que no se hibridiza con otros anticuerpos βAPP (por ejemplo, anti - 5). En los sistemas de cultivo de tejidos, el anticuerpo sueco 192 (infra) no reacciona cruzadamente con la βAPP secretada que es fragmentada en el sitio alfa - secretasa en la posición 17 en medio de la secuencia del β - péptido. Para comprobar que esto es también cierto en los homogenados cerebrales, éstos se vaciaron de las formas secretadas más largas de βAPP utilizando resina unida al anticuerpo 6C6, el cual es especı́fico para los primeros 16 aminoácidos de βAP, y por tanto reacciona con la βAPP secretada y fragmentada por la alfa - secretasa, pero no con la βAPP más corta secretada y fragmentada por la beta secretasa. La resina se produjo utilizando Actigel ALS acoplado en suspensión, tal como se describe por el fabricante (Sterogene). Se incubó un exceso de resina - anticuerpo con los homogena- 35 ES 2 155 099 T3 dos cerebrales de los animales que contenı́an o no contenı́an el transgén para una incubación inicial de 3 horas a 4◦ C con agitación, separándose material unido y no unido mediante centrifugación a 14000 durante 1 minuto. El sobrenadante se incubó otra vez con un exceso de resina acoplada al 6C6 durante 16 horas a 4◦ C, y se centrifugó otra vez para separar el material no unido. El material que se unió durante la primera incubación y el material que no se unió a la resina acoplada al 6C6, se analizó mediante Western utilizando anticuerpos anti - 5 y sueco 192 (Fig 3). Se sondearon con 8E5 (cuadro A) o el Sueco 192 (cuadro B) homogenados de ratones transgénicos (+) o no transgénicos ( - ). Los carriles 1 se refieren al homogenado total, los carriles 2 a la fracción que no se unió a la resina 6C6 y los carriles 3 a la fracción que se unió a la resina acoplada al 6C6. Ninguna de las βAPP unidas, identificadas por su reactividad al anticuerpo anti - 5, reaccionaron cruzadamente con el anticuerpo sueco 192. Material no unido, identificado por su reactividad al anti - 5, reaccionó con el anticuerpo sueco 192. Esto demuestra que el ratón transgénico con la mutación sueca proporciona un modelo animal viable para la evaluación de inhibidores directos o indirectos de la actividad β - secretasa o de medicamentos que modulen a ésta. Tales agentes pueden desarrollarse como medicamentos para tratar enfermedades asociadas con la expresión y/o el metabolismo anormal de APP (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer). Anticuerpos que reaccionan especı́ficamente con la APP con la mutación sueca El anticuerpo monoclonal 6C6 se produjo y evaluar de la misma forma que el anticuerpo 10D5 (Hyman et al. (1992) J.Neuropath.Exp.Neurol. 51:76) utilizando un péptido sintético que contenı́a los residuos 1 - 28 de βAP conjugados con la albúmina sérica de conejo, como inmunógeno. Ambos 10D5 y 6C6 reconocen un epı́topo en el interior de los primeros 16 aminoácidos de la secuencia βAP. 6C6 fue más eficiente que 10D5 en inmunoprecipitación y se utilizó como un anticuerpo de captura. Para preparar la resina 6C6, se lavaron 4 mls de AffigelR 10 (Bio - Rad Laboratories, Hercules, CA) con agua fria y se combinaron con 3 mls de 6C6 (12,5 mg/ml en PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2 PO4 , 8,1 mM Na2 HPO4 , 137 mM NaCl, pH 7,5) 0,5 M NaCl. El acoplamiento tuvo lugar durante la noche a 4◦ C con agitación suave. 400 µl de 1M Tris, pH 8,0, se añadieron entonces, y se continuó la agitación durante 40 minutos. La resina se lavó exhaustivamente con TTBS antes de usarla (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM Tris, TweenR 20 al 0,5 %,pH 7,5). El anticuerpo 7H5 se describe también en Hyman et al. (1992), supra. Los anticuerpos anti - 5 se produjeron contra βAPP 444 - 592. Se produjeron anticuerpos (denominados anticuerpos 92) contra un péptido sintético que incluı́a los residuos 591 - 596 de βAPP (tal como se numera en Kang et al. (1987), supra). El péptido (N - acetil - CISEVKM) se conjugó a albúmina sérica de conejo que se habı́a activado con el éster de sulfo - maleimido benzoil - N hidroxisuccinimida para formar un inmunógeno. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 36 Se produjeron anticuerpos contra el inmunógeno en los conejos mediante metodologı́a estándar. Durante cada inoculación, los conejos recibieron 5 µg de inmunógeno en inyecciones subcutáneas de 0,1 ml, en aproximadamente 10 sitios (50 µg/revacunación). El mismo péptido se acopló al gel Sulfo - linkT M (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) para la purificación por afinidad de los anticuerpos de la fracción IgG. Una descripción más detallada de la preparación del anticuerpo 92 es la siguiente. Se incubó albúmina sérica de conejo (12,3 mg) con 13 mg de éster sulfo - maleimido benzoil - N - hidroxisuccinimida en 1,25 mls de 0,05 M KH2 PO4 , pH 7,0, durante 20 minutos a 0◦ C. La mezcla se sometió entonces inmediatamente a filtración en gel en una columna Sephadex G - 10 de 1 x 75 cm equilibrada con el tampón fosfato. La proteı́na eluyente en el volumen excluido se agrupó y se combinó inmediatamente con 30 mg del péptido N - acetil - CISEVKM que se sintetizó mediante metodologı́as estándares automatizadas de fase sólida. Se dejó que la reacción de acoplamiento (volumen de 20 ml) se realizara por la noche y se envió entonces a unas instalaciones comerciales para la generación de los anticuerpos. El protocolo de inyección consistió en la emulsificación del antı́geno en un volumen igual del adyuvante completo de Freund y en inyectar subcutáneamente un total de 50 µg del antı́geno en alı́cuotas de 0,1 ml en 10 sitios aproximadamente. Después, cada tres semanas, se administró una inyección de recuerdo mediante un protocolo idéntico, excepto en que el adyuvante incompleto de Freund se utilizó como emulsificador. Los conejos se sangraron una semanas después de cada inyección y se tituló el suero mediante reacción con los péptidos en ELISA. La IgG se purificó a partir de los sueros reaccionantes positivos mediante precipitación con (NH4 )2 SO4 al 50 %, (2 x’s) y se dializó contra PBS. El péptido N - acetil - CISEVKM se conjugó al gel Sulfo - linkT M (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) utilizando las recomendaciones del fabricante para generar una resina de afinidad para purificar los anticuerpos especı́ficos del péptido. La fracción IgG se aplicó a la columna y, después de lavar a través de material unido no especı́ficamente con PBS, los anticuerpos se eluyeron con 0,1 M glicina pH 2,5, 0,5 NaCl y se dializaron entonces contra PBS antes de congelación. El anticuerpo sueco 192 se produjo contra un péptido sintético compuesto de los residuos 590 596 de la secuencia sueca de βAPP. Además de la secuencia βAPP, se añadieron dos glicinas y una cisteı́na como espaciador, y además un enlazador, dando lugar a la secuencia siguiente:CGGEISEVNL. El péptido se conjugó a una albúmina sérica bovina cationizada activada con maleimida disponible comercialmente (Pierce Imject Supercarrier Immune Modulator, al que se alude seguidamente como cBSA). El antisuero se produjo siguiendo el esquema de la inyección descrito anteriormente para el anticuerpo 92. El anticuerpo sueco 192 se produjo contra un péptido sintético compuesto de los residuos 590 - 596 de la secuencia Sueca de βAPP. 19 37 ES 2 155 099 T3 Además de la secuencia βAPP, se añadieron dos glicinas y una cisteı́na como espaciador, y además un engarce, dando lugar a la secuencia siguiente:CGGEISEVNK. El péptido se conjugó a una albúmina sérica bovina cationizada activada con maleimida disponible comercialmente (Pierce Imject Supercarrier Immune Modulator, al que se alude seguidamente como cBSA). El antisuero se produjo siguiendo un esquema estándar de la inyección. En general, cBSA se volvió a suspender en agua desionizada a una concentración de 10 mg/ml. Se añadió al vehı́culo una cantidad idéntica de miligramos del péptido, y se mezcló durante cuatro horas a temperatura ambiente. El conjugado se dializó entonces extensamente contra una solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio. El conjugado se comparó al cBSA de partida sobre un gel Novex al 6 % de Tris - glicina que se habı́a vertido anteriormente. El éxito en la conjugación fue indicado por un cambio visible a un peso molecular más alto. Se recuperó medio condicionado a partir de las células renales 293, que se han transfectado establemente para sobreexpresar la proteı́na βAPP sueca. Se añadieron alı́cuotas de un mililitro a 100 µl de resina con afinidad por 6C6, inmovilizada, o a 100 µl de heparina agarosa (Sigma). La reacción con la resina 6C6 se realizó durante 5 horas a 4◦ C; la heparina - agarosa reaccionó durante 30 minutos a 42 C. Después de la incubación, las resinas se lavaron con TTBS y entonces se añadieron a cada muestra 100 µl de un tampón muestra 2 X SDS - PAGE, hirviéndose las muestras (5 minutos) y centrifugándolas brevemente. Veinte µl de las muestras se cargaron en geles de SDS - poliacrilamida al 6 % y se sometieron a electroforesis. Las proteı́nas se transfirieron a membranas ProBlotR tal como se describió anteriormente. Las muestras se sondearon con los anticuerpos si- 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20 38 guientes: 6C6, Sueco 192, o 8ES (un anticuerpo monoclonal que reconoce un epı́topo de βAPP en la región de los aminoácidos 444 - 592, utilizando la numeración de la forma 695). Todos los anticuerpos se utilizaron a 2 µg/ml durante el sondeo de la inmunotransferencia. La visualización del material inmunoreactivo se obtuvo utilizando el sistema ECLR de Amersham según las recomendaciones del fabricante. El bloqueo y las diluciones del anticuerpo se realizaron utilizando leche seca sin grasa al 5 % (Carnation) en TTBS. La Figura 4 muestra una inmunotransferencia que demuestra la especificidad del anticuerpo sueco 192. Los carriles 1,3,5 contienen material eluı́do a partir de la heparina agarosa. Los carriles 2,4,6 contienen material eluı́do a partir de la resina 6C6. Los carriles 1 y 2 se sondearon con el anticuerpo 8E5; Los carriles 3 y 4 se sondearon con el anticuerpo sueco 192; los carriles 5 y 6 se sonderaron con el anticuerpo 6C6. Como puede apreciarse en la Figura 4, carril 4, el anticuerpo sueco 192 no reconoce apreciablemente la forma reactiva 6C6 de βAPP, a pesar del hecho de que se encuentra más βAPP total en el carril 4 comparado con el carril 3 (compárense los carriles 1 y 2). La falta de reactividad con las formas βAPP que contienen la secuencia βAP parcial (reactiva con 6C6) sugiere que el anticuerpo sueco 192 reconoce βAPP fragmentado en o cerca del extremo amino de Aβ. La descripción anterior de las formas de realización preferidas de la presente invención se ha presentado con el propósito de ilustrar y describir. No tienen el propósito de ser exhaustivas o de limitar la invención a la forma precisa que se muestra, siendo posibles muchas modificaciones y variaciones a la luz de las enseñanzas anteriores. Tales modificaciones y variaciones que pueden ser evidentes para el experto, tienen el propósito de formar parte del alcance de la presente invención. 39 ES 2 155 099 T3 REIVINDICACIONES 1. Utilización de un animal transgénico no humano o de una célula troncal que comprende un genoma diploide que comprende un transgén que codifica un polipéptido APP heterólogo que incluye la mutación sueca, en el que los residuos aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 595 y 596 en la APP695 humana, son asparagina y leucina, respectivamente, para evaluar un agente en cuanto a su actividad para evitar, inhibir o invertir la enfermedad de Alzheimer. 2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el animal es murino. 3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el transgén no se integra homólogamente. 4. Utilización de un animal transgénico no humano según la reivindicación 1, en la que di- 5 10 15 40 cho animal transgénico no humano expresa un polipéptido APP humano que comprende la mutación sueca de la revindicación 1. 5. Utilización de un animal transgénico no humano según la reivindicación 1, en el que el polipéptido APP heterólogo que comprende la mutación sueca de la reivindicación 1 se expresa bajo el control transcripcional de un promotor enolasa especı́fico neural. 6. Utilización de un transgén que codifica un polipéptido APP heterólogo que comprende la mutación sueca en el que los residuos aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 595 y 596 en la APP695 humana son asparagina y leucina, respectivamente, para hacer que un animal transgénico no humano para evaluar un agente en cuanto a su actividad para evitar, inhibir o invertir la enfermedad de Alzheimer. 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales. 65 Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada reserva. 21 ES 2 155 099 T3 22 ES 2 155 099 T3 23 ES 2 155 099 T3 24 ES 2 155 099 T3 25