Download VACUNA COMBINADA.(ES2058100)

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
ES 2 058 100
kInt. Cl. : A61K 39/295
11 N.◦ de publicación:
5
51
ESPAÑA
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 87200709.1
kFecha de presentación : 15.04.87
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 246 680
kFecha de publicación de la solicitud: 25.11.87
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Vacuna combinada.
k
73 Titular/es: Akzo N.V.
k
72 Inventor/es: Lütticken, Heinrich Dieter;
k
74 Agente: Ungrı́a Goiburu, Bernardo
30 Prioridad: 21.04.86 NL 8601001
Velperweg 76
NL-6824 BM Arnhem, NL
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.11.94
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
01.11.94
Aviso:
k
k
Visser, Nicolaas y
Rijke, Eric Onno
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 058 100 T3
DESCRIPCION
La invención se relaciona con una vacuna combinada y también con un método para la preparación
de dicha vacuna y con la utilización de dicha vacuna.
5
10
15
En la crı́a comercial de ganado, el papel de la vacunación para el mantenimiento de una población de
animales sanos es particularmente importante.
Esto se aplica en particular también a la crı́a de ganado intensiva con altas densidades de población
asociadas, donde una infección vı́rica, bacteriana o parasitaria puede afectar a todo el ganado en un
tiempo breve, frecuentemente con consecuencias desastrosas.
Para evitar la infección se vacuna por lo tanto a los animales, por ejemplo, independientemente frente
a, entre otros, infecciones por Escherichia coli (E. coli) e infecciones por herpes virus, tales como la
pseudorabia (también denominada enfermedad de Aujeszky).
Dicha vacunación es normalmente llevada a cabo administrando material inmunogénico en forma de
patógenos vivos (atenuados o no atenuados) o por medio de patógenos muertos.
20
25
Es obvio que, desde el punto de vista económico, es atractivo preparar material inmunogénico a partir
de varios patógenos combinados en una vacuna y administrarla como tal.
Se vio que no era posible, sin embargo, preparar una vacuna combinada que tenga una actividad inmunizante estable tanto frente a alteraciones debidas a E. coli como frente a alteraciones debidas a herpes
virus simplemente añadiendo material fresco de E. coli y material vı́rico a la vez. Sorprendentemente,
también se ha visto, sin embargo, que de hecho se puede preparar dicha vacuna combinada.
El objeto de la presente invención por lo tanto es proporcionar una vacuna combinada con la que se
pueda realizar una inmunización simultaneamente frente a E. coli y frente a herpes virus.
30
35
40
45
50
55
60
Más concretamente, dicha vacuna contiene material inmunógeno de E. coli y material vı́rico inmunógeno donde la actividad enzimática no deseada está inhibida o está en gran medida ausente.
Sorprendentemente, se ha visto en particular que la actividad inmunógena del material vı́rico presente
en la vacuna combinada es substancialmente mejorada si se suprime o elimina la actividad enzimática
antes de, durante y/o después de la combinación de los dos componentes vacunales.
Probablemente, esto concierne en particular a la actividad de las enzimas presentes en el material de
E. coli. Sin poder adelantar una explicación de ello con certeza, se supone que, en particular, las enzimas
proteolı́ticas del material de E. coli podrı́an afectar de manera adversa a la potencia inmunógena de la
vacuna combinada.
Se puede hacer que el material de E. coli y, si se desea, también el material vı́rico, estén libres o
virtualmente libres de actividad enzimática antes de la preparación de la vacuna combinada. Se puede
hacer esto de forma activa o pasiva.
La actividad enzimática puede ser eliminada pasivamente almacenando el material de E. coli para la
preparación de la vacuna combinada independientemente durante al menos un tiempo suficientemente
larfo. Suficiente es, por ejemplo, aproximadamente dos a cuatro semanas a aproximadamente 4◦ C. A la
luz de la posible explicación adelantada anteriormente podrı́a concluirse que como resultado de esto se
produce un proceso de envejecimiento en el cual se inactivan las enzimas proteolı́ticas. Es posible liberar
de la actividad enzimática de una forma activa, por ejemplo, liberando primeramente en gran medida
los materiales separados de la actividad enzimática, por ejemplo, por precipitación, cromatografı́a (en
columna), centrifugación, electroforesis u otros métodos bioquı́micos o microbiológicos de separación y
purificación o añadiendo inhibidores enzimáticos, manteniendo los materiales durante un tiempo suficientemente largo, añadiendo altas concentraciones de proteı́na extraña (por ejemplo en forma de suero o
proteı́nas séricas) o desnaturalizando las enzimas.
Como alternativa, o además, se puede reducir marcada o completamente la actividad enzimática
durante o inmediatamente después de la preparación de la vacuna combinada, por ejemplo añadiendo
inhibidores enzimáticos o altas concentraciones de proteı́na extraña, o separando la actividad enzimática
de los materiales inmunógenos por medio de métodos de separación bioquı́micos o microbiológicos.
2
ES 2 058 100 T3
La invención se relaciona en particular con vacunas combinadas en las cuales se incorporan herpes
virus tales como el virus de la pseudorabia o el herpes virus bovino.
5
10
15
Son inhibidores enzimáticos adecuados, por ejemplo: N-etilmaleimida, monoyodoacetato, monoyodoacetamida, Trasylol, EDTA, PMSF e inhibidores de la tripsina tales como el ası́ llamado “inhibidor de
tripsina de soja”.
Son proteı́nas adecuadas para añadir a la vacuna o a los componentes vacunales, por ejemplo, las
proteı́nas del suero, ya mencionadas, en forma de suero total o de determinados componentes del mismo
(tales como, por ejemplo, las seroalbúminas) o las proteı́nas de la leche o las proteı́nas del huevo.
En las vacunas según la invención, se emplea la fracción antigénica aislada de E. coli o de variantes
de E. coli (mutantes espontáneos o inducidos, o E. coli modificada por técnicas de ADN recombinante).
Para vacunas de cerdo, esto se refiere, por ejemplo, a una fracción antigénica que contiene el ası́ llamado
antı́geno K88-pili. Por supuesto, pueden utilizarse antı́genos de E. coli preparados por un microorganismo
diferente, cuyo material genético haya sido modificado por medio de técnicas recombinantes de una forma
tal que se puedan producir antı́genos de E. coli si se desea con mayor rendimiento.
20
El material de herpes virus para la vacuna según la invención contiene virus muertos o vivos, si se
desea atenuados, cuya patogenicidad y/o virulencia esté reducida o destruida opcionalmente por mutaciones espontáneas o inducidas o por técnicas de ADN recombinante. Y también es opcionalmente posible
utilizar material vı́rico inmunógeno aislado en la vacuna combinada.
25
Se ve que es posible, por ejemplo, utilizar dicha vacuna combinada según la invención para la inmunización simultánea de cerdos para proteger a sus crı́as frente a las infecciones vı́ricas de la diarrea porcina
y de la pseudorabia.
Una vacuna según la invención puede contener, si se desea, los siguientes componentes además del
material inmunógeno:
30
- Estabilizantes.
35
40
45
- Adyuvantes, tales como sales de aluminio (por ejemplo, Al(OH)3 , AlPO4 , Al2 (SO4 )3 ); Ca3 (PO4 )2 ;
saponina; DDA; Pluronics; avridina; emulsiones aceite- en-agua, si se desea junto con vitamina
E, Pluronics, avridina, sulfato de dextrano o similar; emulsiones agua- en-aceite, si se desea con
Marcol, Polysorbate 80, monooleato de polisorbitán, saponina, migliol, miristato de isopropilo,
palmitato de isopropilo o similar, o en forma de cápsulas de, por ejemplo, gelatina o ftalato de
hidroxipropilmetilcelulosa con o sin saponina.
- Tampones, tales como tampón fosfato, tampón bicarbonato o tampón tris, preferiblemente con una
fuerza de 5-100 mmol/l.
- Conservantes, tales como Thiomersal, m- u o-cresol o formalina (preferiblemente en una cantidad
de 0,2-0,5%) o alcohol bencı́lico (preferiblemente 1-2%).
Se explica la invención haciendo referencia a los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
50
Con objeto de establecer los efectos negativos de antı́genos de E. coli no tratados sobre el virus de
la pseudorabia, se midió la infectividad del virus de la pseudorabia en presencia de un volumen igual de
antı́genos de E. coli.
55
Se prepararon los antı́genos de E. coli como sigue. Se cultivó E. coli en medios de hidrolizado de
caseı́na/sorbitol en condiciones patrón con ajuste continuo de pH, oxı́geno e intensidad de agitación en
un fermentador.
60
A las 40 horas se detuvo el cultivo y se calentó el contenido del fermentador durante 15 minutos a
60-65◦C. Después de enfriar, se centrifugó el material. Se concentraron los antı́genos del sobrenadante
por ultrafiltración. Se incubó el concentrado antı́geno resultante durante 16 horas a 37◦ C en presencia
de un 0,5% de formalina.
3
ES 2 058 100 T3
Después de incubar el antı́geno de E. coli recién preparado con virus de pseudorabia durante 1 hora a
37◦C, se tituló el virus en diluciones 1/10 en placas de microtitulación sobre monocapas de células Vero.
Se calculó el tı́tulo del virus por los ECP (efectos citopatológicos) encontrados.
5
Los resultados de la tabla muestran que el material de E. coli tiene un efecto apreciable sobre la
infectividad del virus de la pseudorabia.
N◦
10
15
1
2
3
4
Virus de pseudorabia (ml)
0,5
0,5
0,5
0,5
Antı́genos E. coli
ml
tipo
–
0,5
0,5
0,5
–
K88ab
K88ac
K99
Tı́tulo
(log10/ml)
∆Tı́tulo comparado
con control
5,27
3,05
2,53
4,79
–
2,22
2,74
0,48
20
Ejemplo 2
25
30
35
em Efecto de la combinación E. coli-pseudorabia sobre el ensayo de protección frente a pseudorabia con
y sin (pre)tratamiento de los antı́genos de E. coli.
Este ejemplo demuestra que sin los tratamientos según la invención la combinación de antı́geno de
pseudorabia y antı́genos de E. coli no da lugar a una combinación vacunal eficiente. La efectividad de los
antı́genos de la pseudorabia fue medida en un ensayo de protección en ratón.
Se vacunó a los ratones (cepa C57 bl10) con una cantidad decreciente de vacuna (100, 25 ó 6,25
µl, respectivamente) y al cabo de 4 semanas se realizó un ensayo de infección con la cepa virulenta del
virus de la pseudorabia, Phylaxia. Re calculó la dosis de ésta que da el 50% de protección (DP50 ). Es
evidente por los experimentos que sin el tratamiento del antı́geno de E. coli la vacuna no satisface los
requerimientos de calidad para la vacuna de pseudorabia (DP50 ≤ 50 µl).
Después del tratamiento según la invención la vacuna combinada satisface de hecho dicho requerimiento de calidad.
40
45
(Ver Tabla en la página siguiente)
50
55
60
4
ES 2 058 100 T3
N◦ Lote
Antı́geno de la
pseudorabia
E. coli
LTK88
Tratamiento
DP50
en µl)
Observaciones
3592
3633
40%
40%
5%
-
ninguno
ninguno
>150
25,0
Rechazado (≥ 50)
Bueno
4508
4509
41%
41%
4%
-
119,0
10,7
Rechazado (≥ 50)
Bueno (≤ 50)
4510
41%
4%
ninguno
10% suero
ternera
10% suero
28,0
Bueno (≤ 50)
5087
5089
25%
25%
12%
12,9
40,7
Bueno (≤ 50)
Bueno (≤ 50)
5091
25%
12%
19,1
Bueno (≤ 50)
5
10
15
20
ternera
ninguno
4% suero
ternera
200 unidades trasylol
25
Ejemplo 3
Utilización de inhibidores enzimáticos en vacuna combinada E. coli-pseudorabia.
30
Se suprimieron las supuestas actividades proteasa endógena por medio de una serie de inhibidores
enzimáticos. La elección dada no excluye otros inhibidores.
Se midió el efecto de los inhibidores en un ELISA patrón para determinar cantidades de antı́geno.
35
Sin tratamiento, la cantidad medible de antı́geno de la pseudorabia se reduce a un 53%. Como resultado de varios tratamientos al menos un 93% de la cantidad de antı́geno permanece medible en este
ensayo.
40
N◦
Antı́geno
pseudorabia
Antı́genos
E. coli
Tratamiento
Resultado de ELISA en
% en comparación con
el control (N)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PMSF
NMI
MIA
TRAS
TI
EDTA
envejecimiento
101,0% ( 5)
0% ( 3)
53,0% ( 3)
92,9% ( 5)
102,9% ( 4)
93,9% ( 3)
94,5% ( 3)
97,5% ( 4)
95,3% ( 3)
102,5% (10)
45
50
55
60
PMSF = fluoruro de fenilmetansulfonilo.
5
ES 2 058 100 T3
NMI = N-etilmaleimida.
MIA = monoyodoacetamida.
5
TI = inhibidor de la tripsina (soja).
TRAS = trasylol.
EDTA = ácido etilendiaminatetraacético.
10
Ejemplo 4
Tratamiento de antı́genos de E. coli según la invención (“Envejecimiento”).
15
20
Se inyectó a ratones de 6-8 semanas (Swiss albinos) por vı́a intramuscular con dosificaciones graduadas
(4, 16 ó 64 µl, respectivamente) de las vacunas especificadas. A las cuatro semanas de la vacunación se
dio a los ratones una infección de ensayo como en el Ejemplo 2.
Se expresa la protección de los ratones como la dosis que da un 50% de protección (DP50 ). El requerimiento de calidad para su aprobación es que la DP50 sea ≤ 50 µl.
Se midieron los anticuerpos para los componentes de E. coli en el suero de los mismos ratones por
medio de un ELISA patrón para la determinación de tı́tulos de anticuerpos. Cada cifra es la media de 6
sueros.
25
Los tı́tulos de anticuerpos para los componentes de E. coli son comparables en la vacuna combinada
con los de la vacuna de E. coli sola. El ensayo de protección frente a la pseudorabia en ratones satisface
los requerimientos de calidad para dicha vacuna combinada.
30
N◦ Lote
Antı́geno
pseudorabia
6704
6705
6706
6707
6708
6709
6710
6711
6712
+
+
+
Antı́geno
E. coli
DP50
Tı́tulos anti-E. coli (dosis de 16 µl)
log2 en ELISA
LT K88ab K88ac K99 987P
35
40
45
+
+
+
5,4
11,9
19,5
+
+
+
+
+
+
16,1
8,9
23,6
50
55
60
6
6,8
6,5
7,3
6,8
7,5
7,2
10,8
10,8
11,7
12,5
12,2
11,8
10,8
10,2
12,3
12,3
12,2
11,7
8,2
8,8
10,0
9,0
9,5
9,0
11,2
11,5
11,7
12,5
12,2
12,2
ES 2 058 100 T3
REIVINDICACIONES
5
1. Método para la preparación de una vacuna combinada con acción inmunizante en animales frente
a la infección por E. coli y herpes virus, caracterizado porque se puede obtener combinando material
inmunógeno de E. coli al que se libera de actividad enzimática y material inmunógeno de herpes virus.
2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque se libera al material de E. coli de actividad enzimática mediante al menos un método seleccionado entre el grupo consistente en:
10
15
a. Almacenar el material de E. coli independientemente durante un tiempo suficientemente largo para
que cualquier enzima proteolı́tica contenida en él se inactive.
b. Separar cualquier enzima proteolı́tica contenida en el material de E. coli de dicho material por
diferencias en el tamaño molecular, en la carga eléctrica o en las caracterı́sticas de enlace.
c. Añadir inhibidores enzimáticos.
d. Desnaturalizar las enzimas.
20
25
e. Añadir material proteico.
3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque se libera a la vacuna de actividad
enzimática añadiendo al menos un inhibidor enzimático seleccionado entre el grupo consistente en Netilmaleimida, monoyodoacetato, monoyodoacetamida Trasylol, ácido etilendiaminatetraacético, fluoruro
de fenilmetansulfonilo e inhibidores de la tripsina.
4. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque se añade a la composición vacunal al
menos un componente común para la preparación de vacunas seleccionado entre el grupo consistente en:
30
a. Estabilizantes.
b. Adyuvantes.
c. Substancias tampón.
35
d. Conservantes.
5. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque se libera al material de E. coli de actividad enzimática antes de combinarlo con el material vı́rico.
40
6. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque se libera al material de E. coli de actividad enzimática durante la combinación con el material vı́rico.
45
7. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque se libera al material de E. coli de actividad enzimática después de combinarlo con el material vı́rico.
8. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el material inmunógeno de E. coli es una
fracción antigénica aislada de E. coli.
50
9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque la fracción antigénica contiene LT.
10. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque la fracción antigénica contiene pili.
55
11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque se utilizan uno o más pili seleccionados
entre el grupo consistente en K88ab, K88ac, K99 y 987P.
60
7
ES 2 058 100 T3
12. Método según las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque se utiliza material inmunógeno de
virus de la pseudorabia o de herpes virus bovino.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
8