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VIII CAIQ2015 y 3 JASP
MÉTODOS DE ROMPIMIENTO CELULAR Y PURIFICACION
PARCIAL PARA EXTRACCION Y CONCENTRACION DE LA
ENZIMA TIROSINASA DE AGARICUS BISPORUS
V. P.S dos Santos, C. H. Mendonça, F.C.S.S Mihos, A. G. Torres, K. S. Pereira, A. M.
Salgado
Escola de Química - EQ
(Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ)
Av. Horácio Macedo, 2030, Edifício do Centro de Tecnologia, Bloco E.
Cidade Universitária - CEP: 21941-909) Rio de Janeiro – RJ – Brasil
[email protected]
Resumen. La enzima tirosinasa cataliza reacciones que son ampliamente
usadas en procesos biotecnológicos, como en bioremediación, biosensores.
Siendo abundantemente encontrada en plantas y microrganismos, la
extracción de la enzima a partir de fuentes alternativas constituye una
opción económicamente ventajosa frente a las enzimas comerciales
purificadas que son aún de alto costo. El macro hongo Agaricus bisporus es
una de las principales fuentes de la enzima tirosinasa intracelular. El
presente trabajo tuvo como objetivos comparar métodos de rompimiento
celular combinados para la extracción de la enzima tirosinasa y métodos de
purificación parcial buscando la concentración del extracto enzimático del
macro hongo Agaricus bisporus. Fueron probados y comparados métodos
combinados de rompimiento celular parcial con solvente acetona, detergente
triton X-100
y congelamiento/descongelamiento
y el método de
rompimiento celular total utilizando el congelamiento/descongelamiento con
nitrógeno líquido.
La purificación parcial fue realizada por medio de
métodos de precipitación secuencial de proteínas utilizando sal sulfato de
amonio (en los rangos de 0-20%, 20-40%, 40-60% de saturación (w/v)) y
acetona (entre el 20% -125% (v/v) de saturación). La estabilidad de los
extractos bruto y parcialmente purificado fue evaluada durante 96h (25°C,
4°C y -6°C). La permeabilización con acetona resultó en los extractos con
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menores volúmenes y mayor actividad enzimática, en cuanto a la
precipitación con sulfato de amonio confirió la mayor eficiencia de
recuperación de la actividad enzimática. La mejor temperatura de
almacenamiento fue de -6°C.
Palabras clave: tirosinasa, enzima, intracelular
1. Introducción
El uso de extractos como fuente de enzimas para aplicación en processos
biotecnológicos y una alternativa económicamente ventajosa frente a las enzimas
comerciales (Nagodawithana & Reed 2013). La enzima tirosinase de Agaricus bisporus
es extensamente aplicada en el desarrollo de procesos biotecnológicos, principalmente
en la construcción de biosensores (Faria et al. 2007). Estando ampliamente distribuída
en plantas, animales y microrganismos, la tirosinasa fúngica es intracelular, necesitando,
por lo tanto de un proceso de rompimiento celular total o parcial (permeabilización)
para su extracción (Bridge et al. 2004).
Métodos
físicos
(sonicación,
homogenización,
prensado,
congelamiento-
descongelamiento), químicos (permeabilización con solventes orgánicos o detergentes)
o combinados acostumbran ser utilizados para la extracción de productos intracelulares.
El extracto crudo contiene diversos contaminantes y fragmentos celulares que pueden
ser removidos por medio de métodos de precipitación de proteínas utilizando sales,
solventes o polímeros. Esta etapa de purificación parcial reduce el volumen de extracto
enzimático, posibilitando el control de la concentración de la enzima de acuerdo con la
aplicación (Harrison et al. 2015).
El objetivo de este trabajo es comparar métodos de rompimiento celular para la
extracción de la enzima tirosinasa y de purificación parcial para la concentración y
estabilización del extracto enzimático del macrohongo Agaricus bisporus, así como la
estabilidad de almacenamiento en diferentes temperaturas.
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2. Métodos
2.1. Preparación de las muestras de Agaricus bisporus
Los lotes de setas destinados a los ensayos de rompimiento celular, pasaran por un
proceso de disminución de tamaño de los cuerpos fructíferos, por medio de un
procesamiento manual seguido de la homogeneización de las partículas. Este proceso
busca minimizar la heterogenicidad de los lotes de setas y posibilitar la comparación de
la eficiencia entre los métodos probados. Muestras de masas iguales (500 g) fueron
retiradas aleatoriamente de la muestra principal, para ser utilizadas en todas las
metodologías de rompimiento celular.
2.2. Rompimiento celular a partir de métodos combinados
Permeabilización celular química
con solvente (acetona) seguido de
congelamiento e descongelamiento: procedimiento modificado de (Kameda et al.
2006). En una licuadora industrial, fueron triturados 500 g de cuerpos fructíferos de
Agaricus bisporus com 1 L acetona helada. La mezcla fue filtrada a vacío con papel de
filtro Watman n°1. El residuo de seta fue congelado por 24 horas. El residuo de seta fue
resuspenso con 80 mL de tampón fosfato 0,1 M pH 6 y congelado por otras 24 horas. El
residuo fue centrifugado a 4000 rpm por 10 minutos, dos veces consecutivas. El
material flotante obtenido constituye el primer extracto enzimático. Las etapas de resuspensión y centrifugación fueron repetidas con el residuo de la primera centrifugación
para la obtención del segundo extracto enzimático. Los extractos fueron mesclados y
almacenados en frascos oscuros en congelador de refrigerador doméstico, a temperatura
abajo de - 6 °C.
Permeabilización con detergente (Triton X-100) seguido de congelamiento y
descongelamiento: 500 g de cuerpos frutificación de Agaricus bisporus, fueron
triturados con solución de Triton X-100 5% (v/v) en tampón fosfato de sódio pH 6.
Posterior a la filtración a vacío el resíduo de seta fue sometido a los mismos
procedimientos de la permeabilización con acetona.
Congelamiento/descongelamiento con nitrógeno líquido: En una caja de unicel de
10 L fueron colocados 500 g de setas y nitrógeno líquido en cantidad suficiente para
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cubrir las setas, siendo estos, dejados por 10 minutos. El exceso de nitrógeno líquido fue
retirado y las setas fueron dejadas a temperatura ambiente hasta el total
descongelamiento. Posterior al descongelamiento la masa de setas fue homogeneizada
usando una licuadora industrial y el homogeneizado obtenido, sometido a
centrifugación refrigerada a 4 °C a 4000 rpm durante 10 minutos, siendo este proceso
realizado 2 x. El extracto fue almacenado en frasco obscuro en congelador doméstico a
temperatura abajo de -6°C.
2.3. Métodos de precipitación de proteínas para concentración de los extractos
enzimáticos
Precipitación con sal sulfato de amonio: muestras de extracto enzimático de 50 mL
(558 U/mL) fueron sometidas a precipitación secuencial en los intervalos de 0-20%, 2040%, 40-60%, de saturación. La muestra permaneció en baño de hielo, a 0 °C, bajo
agitación por 60-90 minutos. Después fueron centrifugados a 9000 rpm a 2 °C durante
30 minutos. Los precipitados de cada intervalo fueron resuspendidos en 5 mL de
tampón fosfato de sódio pH 6 a temperatura de -6°C.
Precipitación con solvente acetona: muestras del extracto enzimático fueron
sometidas a precipitación secuencial en los intervalos de 20%-125% (v/v) de saturación.
La muestra permaneció en baño de hielo, a 0 °C, sobre agitación por 20 minutos.
Después fue centrífugada a 9000 rpm a 2 °C durante 30 minutos. Los precipitados de
cada intervalo fueron resuspendidos en 5 mL de tampón fosfato de sódio pH 6 a
temperatura de -6°C.
La eficiencia de la precipitación en relación a la concentración de los extractos
enzimáticos, el factor de recuperación, dados fue calculado por la ecuación:
(1)
Donde, FR: factor de recuperación
UTr: actividad total recuperada
Uti : actividad total inicial
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2.4. Determinación de la actividad enzimática
La medición de la actividad enzimática de la tirosinasa fue realizada por
determinación espectrofotométrica según el procedimiento adaptado de Campos et al.
(1996). Los extractos fueron diluídos en la proporción de 1:10, en solución tampón de
fosfato de sódio 0.1 M pH 6. En tubos de ensayo de 20 cm fueron agregados 5.5 mL de
la solución del tampón fosfato de sódio 0.2M a pH 6, 1.5 mL de solución de L-tirosina
2.4 mM y 1 mL del extracto enzimático previamente diluído. La mezcla fue agitada en
un agitador vortex por 3s e inmediatamente vertida en cubeta y llevada al
espectrofotometro para análisis, donde la variación de la absorbencia resultante de la
reacción de la enzima del extracto enzimatico con el substrato L-tirosina, fue leida en
280 nm en intervalos de 30 segundos durante 870 s.
Una unidad de actividad enzimática fue definida como siendo la cantidad de enzima
que provoca el aumento de 0.001 en la absorbencia a 280 nm por minuto.
Para el cálculo de la actividad total (U/mL), la siguiente fórmula fue utilizada:
Ecuación (2)
Dónde, Abs1: absorbencia inicial
Abs2: absorbencia final
T1 : tiempo inicial
T2 : tiempo final
DE : Volúmen de solución enzimática
VE : factor de dilución de la solución enzimática
2.5. Determinación de proteínas totales
La concentración de proteínas totales fue determinada mediante el método de
Bradford (1976). La curva de calibración y análisis de las muestras de los extractos
siguieron el protocolo de método de reactivo de Bradford (Sigma-Aldrich)(Sigma-
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Aldrich 2013). A partir de soluciones padrón de BSA (albumina de suero bovino) (0.11.4 mg/mL), se construyó una curva analítica sumándose 3 mL del reactivo de Bradford
(Sigma-Aldrich) a 0.1 mL de las soluciones padrón de proteína en tubos de ensayo que
fueron agitados en un vórtex. Pasados 10 minutos de reacción las muestras padrón
fueron llevadas a lectura en espectrofotómetro a 595 nm (Fentom X 800).
Después de la construcción de la curva analítica, una alícuota de 0.1 mL de los
extractos enzimáticos, previamente diluída 1:10, en tampón fosfato de sódio pH 6, fue
adicionada a un tubo de ensayo conteniendo 3 mL do reactivo de Bradford y llevada a
lectura en espectrofotómetro después de 10 minutos de reacción.
El cálculo do concentración de proteínas fue hecho en base a la ecuación de la
reta de la curva de calibración linear:
Ecuación (3)
Donde, [P]: concentración de proteínas
Abs: absorbencia
FD: factor de dilución
a e b: constantes da ecuación de la recta
2.6. Estabilidad de almacenamiento en relación a temperatura
La actividad enzimática de los extractos bruto y parcialmente purificados fue
evaluada en 3 temperaturas de almacenamiento: 25°C, 4°C e -6°C, durante 96 horas a
cada 24 horas.
3 Resultados y discusión
3.1. Rompimiento celular: actividad enzimática y concentración de proteínas de los
extractos
La tabla 1 presenta las actividades enzimáticas y las concentraciones de proteínas de
los extractos, resultantes de las extracciones utilizando los métodos de rompimiento
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celular, químicos con solventes acetona y el detergente Triton-X100, ambos seguidos de
congelamiento/descongelamiento
y
físico,
con
congelamiento/descongelamiento
utilizando nitrógeno líquido.
Tabla 1 – Actividad enzimática y concentración de proteínas de los extractos de los
métodos de rompimiento celular.
Método
rompimiento celular
Permeabilización con
acetona/congelamientodescongelamiento
Permeabilización con
Trito X100/congelamientodescongelamiento
Congelamientodescongelamiento con
N2 líquido
Volúmen (mL)
Actividad total (U/mL)
Proteínas totales
(mg/mL)
90 ±7,1
2363 ± 64,4
0,51 ±0,01
410 ±14,1
169 ± 22,9
0,11 ±0,01
230 ±28,3
63 ± 8,8
0,69 ±0,02
La permeabilización con acetona combinada al congelamiento/descongelamiento
en congelador doméstico, produjo los extractos con mayores actividades enzimáticas y
menores concentraciones de proteínas debido, probablemente al rompimiento celular
parcial ocasionado por la acetona. La permeabilización con detergente Triton X-100
seguida del congelamiento/descongelamiento resultó en extractos con actividades
enzimáticas y concentraciones de proteínas menores que con la acetona, siendo por lo
tanto, menos eficiente.
La extracción por congelamiento/descongelamiento con nitrógeno líquido originó
extractos con actividades enzimáticas menores que con la permeabilización con acetona.
Sin embargo, la concentración de proteínas de esos extractos fue mayor, posiblemente
debido a la presencia de una mayor concentración de fragmentos celulares originados
por el rompimiento celular total debido al drástico congelamiento con nitrógeno líquido.
La permeabilización con acetona permitió el control sobre el volumen y
concentración del extracto producido, una vez que estos están condicionados al volumen
de tampón adicionado en las etapas de resuspensión. Al contrário de la extracción por
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congelamiento/descongelamiento con nitrógeno líquido donde el volumen de extracto
depende del agua contenida en los cuerpos fructíferos del macro hongo Agaricus
bisporus, lo que produjo volúmenes de extractos cerca de 2.5x mayores que en la
extracción con acetona, conforme a los resultados de la Tabla 1.
De este modo, la extracción con acetona se mostró más ventajosa, debido a la
producción de extractos con concentraciones menores de fragmentos celulares en
función de un rompimiento celular parcial y por tanto, más selectivo, más allá de la
producción de volúmenes menores de extracto, lo que lleva a una mayor relación de
costo-benefício de la etapa de purificación parcial.
3.2 Purificación parcial: actividad enzimática, concentración de proteínas y
eficiencia de concentración
Los resultados de los métodos de purificación parcial con sulfato de amonio y acetona
están sumarizados en la Tabla 2:
Tabla 2 – Resultados de los métodos de purificación parcial de los extractos enzimáticos
Extracto
Bruto
Parcialmente
purificado con
sulfato de
amonio
Parcialmente
purificado con
acetona
Actividad total (U/mL)
Proteínas totales (mg/mL)
FR (%)
558
2,27
100
5286 ±75,6
4,5 ±0,06
94,73
4812 ±149,8
3,8 ±0,08
86,25
Ambos resultados de purificación parcial con acetona y sulfato de amonio fueron
satisfactorios, teniendo que este último presentó un porcentual mayor de recuperación
de la actividad enzimática con 94,73% de actividad recuperada, además de remover
proteínas contaminantes de alto peso molecular (Scopes 1994).
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3.3 Estabilidad de almacenamiento
Los resultados de la estabilidad de los extractos bruto y parcialmente purificado en las
temperaturas de 25°C, 4°C e -6°C, durante 96 horas, pueden ser verificados en los
gráficos 1 y 2.
Gráfico 1- Estabilidad del extracto bruto en período de 96 h.
Gráfico 2 – Estabilidad del extracto parcialmente purificado en período de 96 h.
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A temperatura de 25 °C los extractos brutos y parcialmente purificados tuvieron
perdida de cerca de 50% de la actividad pasadas 24h y pérdida total de la actividad en
48 h. A 4 °C los extractos se mantuvieron estables en su actividad por hasta 24h. La
mayor estabilidad de los extractos fue con almacenamiento a -6°C. En temperaturas más
altas, en general, enzimas tienden a sufrir desnutrición debido al desequilibrio entre las
diversas interacciones en su estructura, tales como,
puentes de hidrógeno ,
interacciones hidrofóbicas, fuerzas de Van der Vaals y pariamento de íons. En elevadas
concentraciones de sal y bajas temperaturas enzimas pueden ser estabilizadas debido a
inhibición de la acción de proteasas y de la acción bacteriana en consecuencia de la
reducción de la actividad de agua (Gomes et al. 2007).
4. Conclusión
De entre los métodos de extracción de la enzima tirosinasa a partir del macro hongo
Agaricus bisporus, probados, la permeabilización con acetona fue el más eficiente,
resultando en extractos con las mayores actividades enzimáticas, con menor volumen de
extracto, lo que resulta en mejor relación costo benefício para la etapa de precipitación
de proteínas. Los ensayos de purificación parcial indicaron la mayor eficiencia en
términos de actividad recuperada para el método con la sal sulfato de amonio. La mejor
temperatura de almacenamiento fue a -6 °C con poca variación de la actividad total a lo
largo de 96h.
Agradecimientos: Los autores agradecen al CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico) por el apoyo y las becas concedidas.
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