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Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 2000, 19 (1), 55-63 Cuasiespecies y evolución molecular de virus E. Domingo, E. Baranowski, J.I. Nunez, C.M. Ruiz-Jarabo, S. Sierra, N. Molina & F. Sobrino Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa", Universidad Autónoma de Madrid, Cantoblanco, 28049 Madrid, España; Centro de Investigación en Sanidad Animal, Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias, Ctra. Algete-Alcasar, Km. 6,5, 28130 Valdeolmos, España Resumen Los virus con ácido ribonucleico (RNA) evolucionan como distribuciones complejas de variantes distintos pero estrechamente relacionados genéticamente, que se denominan cuasiespecies víricas. En las cuasiespecies no existe un genoma definido de modo preciso, ya que el genoma consenso es un promedio de variantes. La dinámica de cuasiespecies tiene un considerable número de implicaciones para entender la adaptabilidad de virus, su poder patogénico y de persistencia, así como para el diseño de estrategias para la prevención y control de las enfermedades que ocasionan. Los autores resumen el estado actual de conocimientos sobre la estructura en cuasiespecies y sus implicaciones biológicas. Palabras clave Aptitud biológica - Competición - Cuasiespecies - Enfermedades emergentes - Escape viral - Mutación - Selección - Virus - Zoonosis. Origen del concepto de cuasiespecies e impacto de esta estructura poblacional de los virus RNA Los virus c o n ácido ribonucleico (RNA) c o m o material genético s o n los m á s abundantes e n la biosfera y están asociados a u n importante n ú m e r o d e e n f e r m e d a d e s d e l h o m b r e , d e animales y d e plantas. Su material genético p u e d e ser u n RNA d e c a d e n a sencilla o d e d o b l e h e b r a , d e una sola cadena o s e g m e n t a d o e n varios fragmentos. Su complejidad, medida p o r la longitud d e su g e n o m a , está c o m p r e n d i d a entre 3 y 30 kilobases ( k b ) . E n la d é c a d a d e 1970 se obtuvo el primer indicio d e q u e l o s virus RNA p o d r í a n tener una estructura poblacional distinta d e l o q u e se creía hasta entonces. El indicio tuvo u n origen teórico y otro experimental, totalmente independientes. E n 1 9 7 1 , Eigen publicó u n articulo acerca d e la evolución d e m a c r o m o l é c u l a s simples c o n capacidad replicativa q u e posteriormente fueron denominadas "replicones". Este tratamiento teórico fusionó conceptos d e e v o l u c i ó n darwiniana, e n particular el d e mutación y selección entre formas variantes del replicón inicial, c o n c o n c e p t o s d e teoría d e la información (15). Su objetivo fue entender las bases moleculares d e la adaptación d e m a c r o m o l é c u l a s sencillas q u e p r o b a b l e m e n t e fueron las precursoras d e formas m á s complejas d e vida e n la Tierra, h a c e u n o s 4 . 0 0 0 millones d e años. Al profundizar e n el origen y cuantificación d e las mutaciones, Eigen y Schuster (16) desarrollaron el c o n c e p t o d e cuasiespecies para describir una distribución o r d e n a d a y estable d e mutantes d o m i n a d o s p o r u n g e n o m a principal, d e n o m i n a d o secuencia maestra. Ésta p u e d e ser minoritaria e n una p o b l a c i ó n d e replicones, e n cuyo caso la p o b l a c i ó n está formada esencialmente p o r una n u b e d e mutantes. El origen experimental del c o n c e p t o d e cuasiespecies p r o c e d i ó d e los estudios d e W e i s s m a n n y sus c o l a b o r a d o r e s c o n u n bacteriófago q u e infecta algunas estirpes d e Escherichia coli, d e n o m i n a d o fago Qß, t a m b i é n desarrollados durante la d é c a d a d e 1970. C o n este virus RNA sencillo se realizaron d o s observaciones q u e e n años posteriores resultaron d e gran relevancia para virus RNA p a t ó g e n o s d e organismos diferenciados: a) Una mutación específica del RNA g e n ó m i c o ocurría c o n una tasa d e 10-4 incorporaciones erróneas p o r nucleótido c o p i a d o y r o n d a d e copia ( 2 , 8 ) . b) Las p o b l a c i o n e s del fago eran genéticamente heterogéneas e n el sentido d e q u e la secuencia d e nucleótidos de cada g e n o m a d e la p o b l a c i ó n difería d e los restantes g e n o m a s e n 56 una o d o s posiciones; d e h e c h o , el g e n o m a m á s abundante e n las p o b l a c i o n e s analizadas representaba tan solo el 15% del total (9). Estas d o s observaciones establecían q u e las tasas d e error durante la replicación del fago alcanzaban valores q u e eran unas cien mil v e c e s mayores q u e los estimados para la replicación d e células y virus c o n ácido desoxiribonucleico (DNA) c o m o material genético (12, 13) y, a d e m á s , q u e la p o b l a c i o n e s d e fago contenían una distribución d e mutantes del m i s m o tipo que las predichas p o r el c o n c e p t o teórico d e cuasiespecies (Fig. 1). L o s orígenes del c o n c e p t o d e cuasiespecies e n sus vertientes teórica y experimental h a n sido revisados e n algunos artículos e n los q u e el lector encontrará m á s información y bibliografía complementaria (7, 11). El c o n c e p t o d e cuasiespecies adquirió una nueva dimensión c o n la demostración, obtenida m u y p o c o s años después d e los estudios c o n el fago Qß, d e q u e d o s virus animales patógenos Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 19 (1) t a m b i é n d e b í a n ser descritos c o m o distribuciones d e mutantes e n vez d e g e n o m a s c o n una información genética definida. Se trata del virus d e la fiebre aftosa (VFA, o virus d e la g l o s o p e d a ) y el virus d e la estomatitis vesicular (VEV), d o s virus d e la m a y o r importancia e n m e d i c i n a veterinaria. C o n el VFA se estableció q u e virus aislados durante u n b r o t e d e enfermedad, aún perteneciendo al m i s m o subtipo y siendo serológicamente indistinguibles c o n los m é t o d o s d e diagnóstico al uso, eran genéticamente distintos u n o s d e otros; a d e m á s se d e m o s t r ó q u e dentro d e u n m i s m o animal infectado replicaban virus ligeramente distintos, l o q u e h i z o p r o p o n e r una estructura e n cuasiespecies in vivo para este importante patógeno (10). Estas observaciones se c o m p l e m e n t a r o n c o n otras s o b r e la continua aparición d e mutantes durante la multiplicación d e clones d e VFA e n cultivos celulares (38). C o n el VEV se o b s e r v ó una dinámica de p r o d u c c i ó n y selección d e mutantes durante infecciones persistentes e n cultivos celulares p r o m o v i d a s p o r partículas defectivas interferentes ( 2 1 , 2 2 ) . C u a n d o células e n cultivo se * —*— it —1— 'ÍC if—O •fr *** A" • Ar • —ic— •fe 11 —A"— # 1 ic • • i * •# Distribución de secuencias Ar # ir it A* it i 1 i A* it l it 1 • it —h~ *A" i I • it 1 1 I w t- Ai A * — ~#— A* it * ° * Secuencia promedio * 1 1 1 A. A' *V f A* ir A?— A V •fe • —A— • ir ic ir • —ie~ ir it it A • it it 1 it it II *—o Tf—* • ir it it it it ie • A* - -Ar ir Ar 1 A* A. "A* 1•1 "A" 1 1 "A" .A •fr I 1 *—O ic -A- it it it it it it it —*- * A A A r A 1 A A A' A ic • A — ~A A -A- A tos genomas individuales se representan por rayas horizontales y los símbolos sobre las rayas representan mutaciones. La distribución de la izquierda es genéticamente homogénea mientras que la del centro y la de la derecha son distribuciones genéticamente heterogéneas tal como se hallan en las cuasiespecies víricas, tas tres líneas inferiores, algo separadas del resto de la distribución, representan la secuencia consenso o promedio de la población, aquella que se obtiene al asignar a cada posición el residuo (nucleótido o aminoácido) más frecuente en esa posición en la distribución. Obsérvese que, a pesar de su elevada heterogeneidad, la distribución del centro tiene la misma secuencia consenso que la de la izquierda. Al conjunto de mutantes se le denomina espectro de mutantes de la cuasiespecie. t a flecha indica la replicación de una sola molécula de la distribución central que da lugar a una nueva cuasiespecie con una secuencia consenso distinta, debido a las mutaciones arrastradas del genoma parental. La flecha puede representar un muestreo aleatorio de un genoma (como acontece probablemente en muchos casos de transmisión de un virus) o un proceso selectivo en el que replica un genoma con preferencia a los demás. Fig. 1 Representación esquemática de cuasiespecies víricas 57 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 19 (1) infectan c o n VEV a altas multiplicidades d e infección (varias partículas víricas p o r c a d a célula), se p r o d u c e una acumulación d e RNAs defectivos q u e requieren VEV infeccioso para su multiplicación. Estos defectivos interfieren con la replicación del VEV infeccioso y p r o m u e v e n la selección d e VEV mutantes resistentes a la acción inhibidora de los defectivos. Así se establece una dominancia cíclica de sucesivas ondas d e VEV mutantes y sus correspondientes defectivos, lo q u e J. Holland expresó c o n el ilustrativo título de uno d e sus trabajos d e revisión s o b r e el tema: "Un continuo de variación e n g e n o m a s RNA víricos" (20). A estos estudios siguieron otros m u c h o s c o n virus RNA humanos, d e animales y plantas q u e h a n establecido d e m o d o firme la estructura e n cuasiespecies para virus RNA. T o m a n d o c o m o criterio d e c o m p o r t a m i e n t o d e una cuasiespecie la presencia d e u n espectro d e mutantes y c a m b i o s e n la secuencia consenso e n función d e la replicación viral (Fig. 1), se ha demostrado adherencia a una dinámica d e cuasiespecies en unos cincuenta virus distintos, entre ellos varios d e interés veterinario (Cuadro I). Hasta ahora n o se h a descartado una dinámica d e cuasiespecies para ningún virus RNA estudiado desde u n punto d e vista poblacional. Para q u e u n virus n o siguiera una dinámica d e cuasiespecies, las frecuencias d e error deberían ser ó r d e n e s d e magnitud inferiores a las determinadas hasta ahora o, alternativamente, el virus debería mostrar una intolerancia casi c o m p l e t a a las mutaciones surgidas durante su replicación. Ninguna d e estas d o s condiciones h a p o d i d o ser demostrada para ningún virus RNA. La conclusión es q u e la dinámica d e cuasiespecies tiene una amplia aplicación e n las p o b l a c i o n e s d e virus RNA. Cuadro I Algunas enfermedades de interés veterinario causadas por virus RNA para los que se ha demostrado una dinámica de cuasiespecies Virus Enfermedades Virus RNA de polaridad positiva Fiebre aftosa Infección par calicivirus felino Encefalomielitis equina Arteritis equina Hepatitis murina Gastroenteritis transmisible del cerdo Virus RNA de polaridad negativa Gripe Rabia Coriomeningitis linfocitaria Estomatitis vesicular Septicemia hemorrágica de peces Retrovirus Visna Anemia infecciosa equina Inmunodeficiencia de simio Leucemia felina Definición actualizada de cuasiespecie vírica El c o n c e p t o teórico d e cuasiespecie, e n su formulación inicial, suponía una distribución estacionaria d e mutantes, q u e alcanzaba u n tamaño ilimitado (infinito) (16). E n el transcurso d e una infección d e u n organismo, u n virus RNA encuentra multitud d e ambientes diferentes c o m o s o n distintos tipos d e células, tejidos, respuestas inmunes d e intensidad variable, entre otros factores perturbadores. N o es posible, e n estas circunstancias, mantener distribuciones estacionarias d e mutantes e n equilibrio. Las distribuciones genómicas e n p o b l a c i o n e s reales d e virus s o n s u m a m e n t e variables y l o s g e n o m a s dominantes tienen una existencia efímera. Las cuasiespecies víricas reales q u e evolucionan e n organismos infectados p u e d e n considerarse sucesiones d e distribuciones estacionarias d e duración infinitesimal. Las sucesivas distribuciones estacionarias varían respecto a las q u e les p r e c e d i e r o n y a las q u e van a seguir, constituyendo u n conjunto extraordinariamente c o m p l e j o d e enjambres d e g e n o m a s fluctuantes e n el espacio y en el t i e m p o . Ha sido necesario formular u n a definición a m p l i a d a d e cuasiespecies víricas, q u e h a sido recogida e n la última e d i c i ó n d e la Encyclopaedia of virology (6): "Se d e n o m i n a n cuasiespecies víricas las distribuciones dinámicas d e g e n o m a s víricos n o idénticos p e r o estrechamente relacionados entre sí s o m e t i d o s a u n p r o c e s o continuo d e variación genética, c o m p e t i c i ó n y selección y q u e actúan c o m o una unidad d e selección". Esta definición n o se separa d e l c o n c e p t o germinal d e Eigen, Schuster y sus asociados y c o n t e m p l a la situación real d e los virus e n el p r o c e s o d e infección d e organismos o cultivos celulares (Fig. 1). Implicaciones biológicas de la dinámica de cuasiespecies de los virus RNA El c o m p o r t a m i e n t o d e los virus RNA c o m o cuasiespecies tiene u n n ú m e r o considerable d e implicaciones q u e abarcan d e s d e la descripción poblacional d e los virus hasta la interpretación d e su respuesta a factores selectivos durante p r o c e s o s infecciosos, su adaptabilidad a ambientes cambiantes y el origen d e nuevas e n f e r m e d a d e s víricas (Cuadro II). Estructura poblacional N o resulta o b v i o d e m o d o inmediato q u e u n espectro d e mutantes c o m o e l representado e n la Figura 1 i m p l i q u e u n a importante indeterminación respecto a describir c o n precisión una p o b l a c i ó n viral. L o s m é t o d o s d e secuenciación de nucleótidos n o permiten la determinación d e una secuencia d e nucleótidos d e "una" molécula d e RNA g e n ó m i c o , sino d e una multitud d e g e n o m a s q u e definirá u n consenso (Fig. 1). Tan s ó l o mediante p r o c e d i m i e n t o s d e clonaje biológico o molecular (flecha e n la Figura 1) se p u e d e revelar el carácter h e t e r o g é n e o d e la distribución. Ante esta situación se plantea la cuestión d e saber a q u é g e n o m a e n particular d e b e asignarse u n c o m p o r t a m i e n t o b i o l ó g i c o q u e estamos o b s e r v a n d o . En parte, este p r o b l e m a se resuelve c o n la definición biológica d e cuasiespecies c o m o "unidad d e selección" ( 1 1 , 1 6 ) . Ante una presión selectiva q u e perturba la cuasiespecie, es el conjunto d e g e n o m a s el q u e r e s p o n d e a la 58 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 19 (1) Cuadro II Algunas implicaciones de la dinàmica de cuasiespecies de virus RNA Tipo de implicaciones Descripción Relativas a su estructura poblacional Un genoma viral está definido como promedio estadístico de muchos genomas ligeramente distintos El genoma promedio o consenso puede no tener una realidad física en el espectro de mutantes Relativas al espectro de mutantes El espectro de mutantes es una reserva de mutantes g e n o t i p o s y fenotípicos Relativas a la adaptación viral Una cuasiespecie vírica explora aceleradamente espacias de secuencias asequibles al virus La optimización de una cuasiespecie a su ambiente es rápida y se refleja en ganancia de eficacia biológica Relativas al control de enfermedades víricas Las vacunas deben ser multivalentes (múltiples epítopos B y T) Las terapias con agentes antivíricos deben ser terapias de combinación Deben explorarse nuevas estrategias antivirales, como la inducción de entrada en catástrofe de error Relativas a ecología evolutiva y emergencia de enfermedades Un virus RNA tiene un potencial para infectar nuevas especies de hospedadores No es recomendable el uso de virus RNA para el control de plagas perturbación, m o d i f i c a n d o la distribución anterior. Quizás e l ejemplo m á s significativo respecto al significado d e u n espectro d e mutantes es que para frecuencias d e mutación del o r d e n d e 1 0 - sustituciones p o r nucleótido o mayores, la secuencia consenso o p r o m e d i o d e nucleótidos, q u e es la q u e se determina p o r los m é t o d o s actuales d e secuenciación, p u e d e n o corresponder a ningún g e n o m a presente e n el espectro d e mutantes. Llegamos a la sorprendente conclusión de q u e las p o b l a c i o n e s virales p u e d e n ser m u y complejas genéticamente, d e m o d o q u e la secuencia consenso q u e define a la p o b l a c i ó n n o está representada e n el espectro d e mutantes. 3 El espectro de mutantes como reserva de variantes fenotípicos Un creciente n ú m e r o d e e j e m p l o s h a n d e m o s t r a d o q u e los variantes presentes e n el espectro d e mutantes permiten al virus flexibilidad d e c o m p o r t a m i e n t o b i o l ó g i c o y e l e s c a p e a presiones selectivas q u e tienden a limitar su replicación. Así, la presencia d e mutantes resistentes a anticuerpos neutralizantes o d e mutantes capaces d e escapar a células T citotóxicas parece contribuir a la persistencia e n organismos de virus tan significativos c o m o el virus d e la inmunodeficiencia h u m a n a o el virus d e la hepatitis C (3, 26). En un estudio m u y interesante s o b r e c o m p o s i c i ó n clonal d e aislados naturales del VEV, Marcus y col. (28) demostraron q u e aislados virales incapaces d e inducir interferon ocultaban en su espectro d e mutantes clones individuales capaces d e una fuerte inducción de interferon. Asimismo, e n n u m e r o s o s laboratorios se h a establecido q u e el espectro d e mutantes del virus d e la inmunodeficiencia h u m a n a tipo 1 contiene mutaciones q u e confieren resistencia a inhibidores d e la proteasa o d e la retrotranscriptasa, e n pacientes q u e n u n c a h a b í a n sido tratados c o n los inhibidores (31). Datos e p i d e m i o l ó g i c o s y d e distribución d e los inhibidores descartaron totalmente q u e los pacientes pudieran h a b e r sido infectados p o r virus q u e previamente h u b i e s e n sido seleccionados e n pacientes tratados. Otros e j e m p l o s q u e demuestran q u e los espectros d e mutantes constituyen reservas d e variantes fenotípicas p u e d e n hallarse e n revisiones anteriores (6, 7, 1 1 , 2 2 , 2 6 , 2 9 ) . Eficacia biológica y adaptación viral Una d e las implicaciones d e cuasiespecies q u e actualmente recibe m u c h a atención es la continua variación d e eficacia biológica q u e caracteriza a los virus. Se d e n o m i n a eficacia biológica la capacidad replicativa q u e muestra u n virus e n unas condiciones ambientales determinadas. Es u n valor necesariamente relativo q u e suele m e d i r s e mediante experimentos d e infección competitiva e n cultivos celulares o in vivo (24). N u m e r o s o s estudios h a n establecido una gran influencia del tamaño poblacional d e l virus e n el mantenimiento, pérdida o ganancia d e eficacia biológica (5, 6, 11, 14, 18, 3 2 , 33). Así, los cuellos d e botella poblacionales, e n los q u e u n solo g e n o m a inicia la infección d e m o d o repetitivo, suelen provocar pérdidas d e eficacia biológica. Ello h a sido d e m o s t r a d o mediante pases seriados d e viras placa a placa e m p l e a n d o el bacteriófago Ø6, VEV, VFA y el virus d e la inmunodeficiencia h u m a n a (5, 14, 18, 4 2 ) . Por el contrario, si e n un ambiente constante se permite la multiplicación del virus c o n tamaños poblacionales altos, suele producirse u n aumento d e eficacia d e la p o b l a c i ó n (32, 3 8 ) . Así, si u n virus se halla inicialmente m u y debilitado, incluso tamaños p e q u e ñ o s d e p o b l a c i ó n s o n suficientes para mantener o incrementar su eficacia biológica. E n c a m b i o , si la eficacia inicial es alta, el tamaño poblacional necesario para mantenerla es t a m b i é n m u y alto (33). Un reciente estudio d e infección d e c e r d o s c o n VFA in vivo h a sido revelador d e las variaciones d e eficacia biológica d e u n virus in vivo (4). Se aisló u n c l o n d e VFA mutante e n la etapa temprana d e viremia durante la infección d e l c e r d o . Este c l o n produjo e n los animales u n ciclo d e infección adelantado respecto a la infección d e s e n c a d e n a d a p o r el c l o n parental. E n experimentos d e c o m p e t i c i ó n e n los q u e c e r d o s fueron infectados c o n mezclas d e clones, las lesiones contenían mezclas d e g e n o m a s parentales y d e clones tempranos. E n c a m b i o , c u a n d o la c o m p e t i c i ó n se estableció entre el virus parental y clones tardíos, el virus parental d o m i n ó s i e m p r e la p o b l a c i ó n encontrada e n las lesiones (4). Durante las infecciones virales se p r o d u c e n c a m b i o s d e eficacia biológica c o m o reflejo d e la dinámica d e una continua p r o d u c c i ó n d e mutantes y c o m p e t i c i ó n entre ellos, e n respuesta a perturbaciones tanto d e tipo ambiental c o m o d e tamaño poblacional (3-7, 9 - 1 1 , 14, 17, 18, 2 0 - 2 4 ) . Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 19 (1) 59 Estrategias para el control de enfermedades víricas Por lo descrito hasta a h o r a p o d r í a parecer q u e cuasiespecies e s un c o n c e p t o c o n interés a c a d é m i c o , algo así c o m o un refinamiento e n el m o d o d e entender p o b l a c i o n e s víricas, pero c o n p o c a relevancia para la práctica m é d i c a o veterinaria; nada m á s lejos d e la realidad. Si n o se diera una estructura poblacional d e l o s virus RNA c o m o la descrita e n párrafos anteriores, bastaría una elevada intensidad inhibitoria d e la replicación viral, sea e n forma d e anticuerpos o d e inhibidores, para detener la infección d e m o d o eficiente y permitir al sistema inmune la resolución d e la misma. Si la diana d e l inhibidor potente es susceptible d e variación d e m o d o q u e los variantes víricos muestren una m e n o r afinidad por el inhibidor, e n t o n c e s se producirá el e s c a p e del virus PPPP PPPP PPPP A Un inhibidor Virus homogéneo PÛPP POPP PP0P d e b i d o a la h e t e r o g e n e i d a d poblacional (Fig. 2). Si, p o r el contrario, se e m p l e a n d o s inhibidores dirigidos a dianas independientes, la p r o b a b i l i d a d d e e s c a p e es m e n o r ya q u e el e s c a p e está c o n d i c i o n a d o a la variación simultánea d e las d o s dianas. Obviamente, durante las infecciones víricas reales la situación e s m á s c o m p l e j a d e l o q u e refleja la Figura 2 , ya q u e el n ú m e r o d e partículas víricas implicadas es m u c h í s i m o m a y o r (a v e c e s hasta u n total d e 1 0 ) y existen varias formas variantes d e las dianas d e u n i ó n a i n h i b i d o r e s q u e m o d i f i c a n su sensibilidad a los m i s m o s e n distinto grado. El gran potencial d e variación y adaptación d e las cuasiespecies virales, c o n d i c i o n a t a m b i é n las estrategias d e vacunación frente a diferentes e n f e r m e d a d e s causadas p o r virus RNA. D e esta manera, las vacunas atenuadas p o r acumulación d e c a m b i o s genéticos presentan una p r o b a b i l i d a d d e reversión a 1 2 0000 * 0000 0000 ->• No hay escape de virus Virus inactivado A Un inhibidor Virus heterogéneo 0000 0000 0000 ->- 3 0 0 . Hay escape de virus Virus parcialmente inactivado P0PP A O 31 PPPP PP0P Virus heterogéneo 0000 . 0000 0000 Dos inhibidores No hay escape de virus Virus inactivado Arriba a la izquierda se representa una población homogénea de virus (círculos grandes) con dos dianas (triángulo blanco y punto negro) idénticas en cada partícula. En este caso un inhibidor potente puede ser suficiente para inactivar el virus y evitar su replicación (escape). En la fila del medio el virus es heterogéneo y cada diana tiene dos formas posibles. En este caso un solo inhibidor no puede inactivar todas las partículas y se produce escape de virus. La última fila ¡lustra que la misma distribución puede ser inactivada completamente por dos inhibidores administrados de modo simultáneo. Ello justifica el empleo de vacunas polivalentes y terapias de combinación con múltiples inhibidores para la prevención y control de enfermedades causadas por virus que siguen una dinámica de cuasiespecies. En el texto se dan referencias bibliográficas relevantes a este problema. Fig. 2 Representación esquemática del efecto de la heterogeneidad viral en la supervivencia de un virus sometido a la acción de un inhibidor, sea una droga o un anticuerpo neutralizante 60 formas patógenas, q u e p u e d e variar e n función del sistema viral y del n ú m e r o d e mutaciones implicadas e n la atenuación. Este riesgo h a q u e d a d o patente a l o largo d e los años e n q u e la vacuna atenuada d e poliovirus h a sido utilizada, h a b i é n d o s e o b s e r v a d o , aunque m u y infrecuentemente, casos d e aparición de la e n f e r m e d a d asociados a vacunación (35). Por otra parte, la eficacia d e vacunas sintéticas basadas e n subunidades virales, q u e presentan una serie d e ventajas potenciales importantes frente a las convencionales, se v e también afectada p o r las características d e las cuasiespecies virales. Recientes estudios h a n puesto e n evidencia q u e la selección d e variantes antigénicos virales, capaces d e escapar a la neutralización p o r los anticuerpos o al reconocimiento p o r linfocitos citotóxicos, p u e d e contribuir a la limitada p r o t e c c i ó n conferida p o r estas vacunas (3, 3 9 ) . Este e s c a p e viral se da c o n m u c h a m e n o r frecuencia cuando se e m p l e a virus c o m p l e t o c o m o vacuna, d e b i d o , p r o b a b l e m e n t e , a q u e la respuesta inducida p o r los p é p t i d o s e i n m u n ó g e n o s sencillos estimula u n repertorio considerablemente m á s restringido d e m e c a n i s m o s inmunes e n el h o s p e d a d o r , lo q u e h a c e m á s p r o b a b l e la selección d e variantes virales dentro d e la cuasiespecie. Dada la heterogeneidad y continua p r o d u c c i ó n d e variantes durante la multiplicación d e virus RNA, las vacunas d e b e n ser multivalentes y las terapias c o n agentes antivirales d e b e n ser terapias d e c o m b i n a c i ó n . De nuevo, este aspecto práctico derivado d e la dinámica d e cuasiespecies, fue subrayado e n artículos anteriores (6, 7). El m o d e l o d e cuasiespecies p r e d i c e la existencia d e u n valor umbral d e tasas d e error p o r encima del cual n o p u e d e mantenerse la información genética del virus (17). Esta predicción teórica h a encontrado a p o y o experimental e n resultados obtenidos c o n poliovirus, VEV (23) y virus d e la inmunodefiencia h u m a n a (25). C o n t o d o s estos virus se observó q u e la presencia d e mutágenos q u í m i c o s q u e incrementaban las tasas d e error p o r encima d e las basales durante la replicación viral, producía una p é r d i d a acusada d e infectividad q u e se interpretó c o m o resultado d e violación del umbral d e error y entrada del virus e n catástrofe d e error. E n conclusión, la dinámica d e cuasiespecies i m p o n e estrategias para la prevención y tratamiento d e e n f e r m e d a d e s víricas q u e n o s o n las e m p l e a d a s d e m o d o general, y también abre la posibilidad d e ensayar nuevas estrategias antivirales, c o m o la entrada d e virus e n catástrofe d e error, actualmente e n curso de investigación. Aspectos ecológicos y evolutivos Las emergencias y reemergencias d e e n f e r m e d a d e s víricas tienen c o m ú n m e n t e u n origen multifactorial e n el q u e p u e d e n intervenir influencias ecológicas, ambientales y demográficas (27, 2 9 , 30, 36, 37). E n los últimos 15 años se h a n descrito 40 virus h u m a n o s emergentes, varios d e ellos c o n u n origen zoonótico, a d e m á s d e un, n ú m e r o parecido d e virus emergentes q u e afectan a animales y plantas. Existe creciente evidencia d e q u e la dinámica evolutiva d e l o s virus p u e d e jugar u n p a p e l importante e n estas emergencias, e n conjunción c o n los factores ambientales q u e p u e d e n facilitar Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 19 (1) contactos entre organismos infectados y nuevas especies d e h o s p e d a d o r e s potenciales. Hay varios e j e m p l o s q u e ilustran el efecto d e la variación genética viral e n la emergencia d e una enfermedad. Una es la aparición d e la encefalitis equina epizoótica e n algunas regiones d e América del Sur. Estudios genéticos recientes c o n el alfavirus causal sugieren q u e u n n ú m e r o limitado d e sustituciones d e a m i n o á c i d o e n d o s proteínas víricas p u e d e desencadenar la aparición d e u n virus e p i z o ó t i c o a partir d e una reserva enzoótica n o patogénica (40). La aparición d e varios brotes d e gripe h u m a n a tipo A h a sido asociada a alteraciones del virus e n forma d e reordenamientos genéticos p o r los q u e virus h u m a n o s circulantes adquirieron los segmentos codificantes d e la hemaglutinina y neuraminidasa, provenientes d e virus d e gripe animales (41). Así u n virus H1N1 pasó a H 2 N 2 y originó la gripe asiática d e 1957, y u n salto d e H 2 N 2 a H 3 N 2 originó la gripe d e H o n g K o n g d e 1968. Estas sustituciones p r o d u c e n u n "salto" antigénico e n estas glicoproteínas d e superficie q u e s o n clave para la respuesta d e anticuerpos anti-virus, p o r lo q u e el n u e v o virus halla una p o b l a c i ó n h u m a n a sin anticuerpos protectores e n la q u e p u e d e expandirse d e forma p a n d é m i c a . Otro e j e m p l o b i e n d o c u m e n t a d o d e emergencia vírica d e b i d a a u n c a m b i o genético e n u n virus circulante l o constituye la aparición d e l parvovirus canino (34). Ello ocurrió e n los años 1970 c o m o resultado d e unas p o c a s sustituciones d e aminoácidos e n la cápsida d e u n parvovirus felino, sin q u e e n este caso m e d i a s e n , aparentemente, circunstancias externas especiales de tipo ambiental u otras. Esos ejemplos n o s llevan a una serie d e consideraciones acerca de la capacidad adaptativa d e los virus, e n particular l o s virus RNA o los virus DNA d e p o c a complejidad genética, e n relación c o n el peligro d e emergencia d e nuevas e n f e r m e d a d e s víricas p o r expansión del rango d e h o s p e d a d o r . Una d e ellas es q u e si b i e n e n m u c h o s casos la variación genética del virus n o p u e d e demostrarse c o m o causa d e una emergencia viral, t a m p o c o p u e d e excluirse. Para ello debería aislarse u n virus parental e n u n h o s p e d a d o r , el emergente e n el n u e v o h o s p e d a d o r y demostrarse q u e la secuencia c o n s e n s o d e nucleótidos d e a m b o s virus es idéntica e n t o d o el g e n o m a . Por razones obvias resulta altamente i m p r o b a b l e q u e dichas circunstancias p u e d a n darse. Pero l o q u e sí s a b e m o s es q u e los virus están diseñados c o m o máquinas replicativas q u e esperan su oportunidad para explotar su capacidad d e adaptación. Aunque las probabilidades d e q u e u n espectro d e mutantes encuentre u n n u e v o h o s p e d a d o r e n el q u e u n mutante e n particular p u e d a multiplicarse s o n bajas, n o s o n nulas. Existe una larga tradición d e emplear virus p a t ó g e n o s para el control d e plagas, c o m o los baculovirus para aniquilar ciertas especies d e insectos o el virus d e la mixomatosis para controlar las p o b l a c i o n e s d e conejos e n Australia (19). Recientemente esta práctica se h a extendido al virus d e la 61 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 19(1) enfermedad hemorrágica del c o n e j o para disminuir las poblaciones d e este m a m í f e r o e n Australia y Nueva Zelanda. T o d o l o q u e s a b e m o s s o b r e dinámica poblacional y capacidad adaptativa d e virus RNA desaconseja la liberación d e virus virulentos, incluso si t o d a la evidencia experimental disponible sugiere q u e se trata d e virus c o n una acusada especificidad d e h o s p e d a d o r . Recientemente, h e m o s observado q u e la p r o p a g a c i ó n del VFA e n cultivos celulares ocasiona una ampliación d e los tipos d e células q u e p u e d e n ser infectadas p o r el VFA e n cultivos in vitro (1). Si ello ocurre en u n ambiente b i o l ó g i c o relativamente constante c o m o es el p r o p o r c i o n a d o p o r u n cultivo d e una línea celular establecida, n o p u e d e descartarse una variación e n el rango d e h o s p e d a d o r durante la multiplicación d e u n virus e n su h o s p e d a d o r natural. L o s c a m b i o s d e h o s p e d a d o r s o n acontecimientos aleatorios e i m p r e d e c i b l e s . Por l o tanto, n o p a r e c e aconsejable limitar el tamaño poblacional d e una e s p e c i e animal presente c o m o plaga e n una zona geográfica e m p l e a n d o para ello u n virus RNA p a t ó g e n o q u e se multiplica extensamente e n c a d a uno d e los animales p o r eliminar. Perspectivas La c o m p l e j i d a d p o b l a c i o n a l d e los virus RNA, i n s o s p e c h a d a hace tan solo d o s décadas, h a abierto una serie d e interrogantes q u e actualmente se hallan sin resolver: ¿hasta qué p u n t o los m é t o d o s actuales d e clonaje molecular y secuenciación p e r m i t e n definir una p o b l a c i ó n viral altamente heterogénea? ¿Qué determina las grandes variaciones e n niveles d e h e t e r o g e n e i d a d genética entre u n o s virus y otros? ¿Qué relevancia tiene la variabilidad genética e n patogenia viral? ¿Será p o s i b l e , aún c o n vacunas polivalentes, lograr una vacuna realmente eficaz contra virus altamente variables? ¿No d e b e r í a n supervisarse m á s estrechamente las infecciones d e animales e n previsión d e u n p o s i b l e salto a otras especies, incluida la humana? Estas s o n algunas preguntas amplísimas q u e n o d e b e n h a c e r olvidar otras m á s concretas q u e se están a b o r d a n d o e n m u c h o s laboratorios tanto al e m p l e a r virus h u m a n o s c o m o virus animales d e interés veterinario. Por e j e m p l o , ¿qué c a m b i o s d e a m i n o á c i d o e n las proteínas d e la superficie d e las partículas víricas propician u n c a m b i o d e r e c o n o c i m i e n t o d e receptores celulares? ¿Qué c a m b i o s genéticos e n l o s virus p u e d e n propiciar aumentos d e eficacia biológica y q u é c a m b i o s propician su pérdida? ¿Qué c a m b i o s d e a m i n o á c i d o p u e d e n conferir resistencia a anticuerpos neutralizantes o a células T citotóxicas? Estas y otras m u c h a s cuestiones, todas ellas relacionadas c o n variabilidad genética de virus RNA, t a m b i é n inciden e n nuestra capacidad para p o d e r algún día controlar mejor las e n f e r m e d a d e s virales. N o d e b e m o s olvidar q u e h a c e tan solo tres d é c a d a s existía una profunda convicción e n los estamentos científicos d e q u e las e n f e r m e d a d e s bacterianas se hallaban m u y cerca d e la erradicación total y d e q u e las e n f e r m e d a d e s virales precisaban tan s ó l o del desarrollo d e algunos agentes antivirales. La realidad actual es c o m p l e t a m e n t e distinta y, al m e n o s e n parte, ello se d e b e a la dinámica evolutiva d e l mundo microbiano. Agradecimientos Este trabajo h a sido s u b v e n c i o n a d o p o r la PM97-0060-C02-01, CICYT B I O 9 - 0 4 0 0 0 , UE PL97-3665 y la F u n d a c i ó n R a m ó n Areces. DGES FAIR5 • Quasispecies and molecular evolution of viruses E. Domingo, E. Baranowski, J.I. Nuñez, CM. Ruiz-Jarabo, S. Sierra, N. Molina & F. Sobrino Summary Ribonucleic acid (RNA) viruses evolve as complex distributions of genetically different but closely related variants termed viral quasispecies. The precise genome of a quasispecies cannot be defined, since the consensus genome is an average of many variants. The dynamics of quasispecies has considerable implications for the understanding of the adaptability and pathogenic potential of viruses, and in addition, for the design of preventive and therapeutic measures for the diseases caused by these viruses. The authors summarise current knowledge on the structure of quasispecies, and the biological implications of this structure. Keywords Biological aptitude - Competition - Emerging diseases - Mutation - Quasispecies Selection - Viral escape - Viruses - Zoonoses. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 19 (1) 62 Les quasi-espèces et l'évolution moléculaire des virus E. Domingo, E. Baranowski, J.I. Nuñez, CM. Ruiz-Jarabo, S. Sierra, N. Molina & F. Sobrino Résumé Les virus à ARN évoluent comme des distributions complexes de variants différents entre eux mais étroitement liés génétiquement, que l'on appelle des quasi-espèces virales. Chez les quasi-espèces, il n'existe pas de génome que l'on puisse définir de manière précise, parce que le génome consensus est une moyenne de variants. La dynamique des quasi-espèces a un nombre considérable de conséquences pour la compréhension de l'adaptabilité des virus, de leur pouvoir pathogène et de leur persistance, ainsi que pour la mise en œuvre de stratégies de prévention et de contrôle des maladies virales. Les auteurs résument l'état actuel des connaissances sur la structure des quasi-espèces et sur leurs conséquences biologiques. Mots-clés Aptitude biologique - Compétition - Échappement viral - Maladies émergentes Mutation - Quasi-espèces - Sélection - Virus - Zoonoses. m References 1. Baranowski E., Ruiz-Jarabo C.M., Sevilla N., Andreu D., Beck E. & Domingo E. (2000). - Cell recognition by foot-and-mouth disease virus that lacks the RGD integrin-binding motif: flexibility in aphthovirus receptor usage. J. Virol. (en prensa). 2. Batschelet E., Domingo E. & Weissmann C. 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