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Título: Actividades antibacterianas de extractos de hojas de Ligaria cuneifolia y Jodina
rhombifolia contra bacterias fitopatógenas.
Nomes: M. Rocío Dip Maderuelo1,2,*, J. Rodolfo Soberón2,3,4, Melina A. Sgariglia2,3,4,
Marisol Jimenez 2,3,4, Marta A. Vattuone2,3,4
Filiação: 1Cat. De Metodología de la Investigación Científica. Facultad de Medicina.
Universidad Nacional de Tucumán. Lamadrid 875. 1er piso. San Miguel de Tucumán;
Tucumán; Argentina. 2 Investigadores de la Universidad Nacional de Tucumán.
Ayacucho 491. San Miguel de Tucumán; Tucumán; Argentina. 3Laboratorio de
Biología de Agentes Bioactivos y Fitopatógenos (LABIFITO) Facultad de Bioquímica,
Química y Farmacia. Universidad Nacional de Tucumán. Ayacucho 471. San Miguel de
Tucumán; Tucumán; Argentina. 4Investigadores del Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina. Av. Rivadavia 1917.
Ciudad Autónoma de Buenos Aires; Argentina.
*
Autores para la correspondencia: M.
Rocío Dip Maderuelo: [email protected]; J. Rodolfo Soberón:
[email protected]
RESUMEN
Gran parte de los compuestos químicos sintetizados por plantas tienen acción
antimicrobiana y su actividad es comparable a la de productos comerciales. Se
prepararon seis extractos vegetales a partir de Ligaria cuneifolia y Jodina rhombifolia.
Se utilizaron métodos de bioautografía y microdilución para estudiar la actividad
antibacteriana de las muestras sobre 7 cepas fitopatógenas. Se determinaron las
concentraciones inhibitorias mínimas (CIMs) y concentraciones bactericidas mínimas
(CBMs) de las muestras. Los extractos metanólicos y acuosos de L. cuneifolia
mostraron actividad inhibitoria sobre bacterias fitopatógenas, con CIMs de 2.5 a 156
μg.mL-1 para el extracto metanólico de L. cuneifolia (LCME) y 5 mg.mL-1 para el
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extracto acuoso. Ninguno de los tres extractos de J. rhombifolia mostraron actividad
antibacteriana significativa sobre las cepas fitopatógenas (CIM = 312 μg.mL-1).
Solamente LCME presentó actividad bactericida sobre las cepas fitopatógenas (CBMs =
78 μg.mL-1), y exhibió actividad inhibitoria significativa (p < 0.05) frente a las cepas
clínicas de referencia: Escherichia coli (CIM = 156 mg.mL-1.) Y Staphylococcus
aureus (CIM = 78 mg.mL-1, MBC = 312 mg.mL-1). El aislamiento guiado e
identificación de compuestos activos antibacterianos se llevó a cabo para el extracto
metanólico de L. cuneifolia (LCME). Los compuestos activos de LCME fueron
identificados como mono flavonoles, diglicósidos y ácido gálico. También se evaluó la
actividad antibacteriana de los compuestos purificados. Por lo expuesto, los compuestos
aislados de L. cuneifolia que poseen actividad inhibitoria sobre cepas fitopatógenas
podrían utilizarse como una fuente eficaz de metabolitos contra las enfermedades
bacterianas en vegetales.
INTRODUCCION
El crecimiento explosivo de la población humana generó problemas ambientales
que superaron la capacidad de asimilación de la naturaleza. (Henry& Heinke, 2011). El
consumo per cápita y la complejidad de los centros urbanos impulsaron la expansión de
la agricultura y la intensificación productiva por unidad de superficie, y contribuyeron a
la alteración de los ciclos biogeoquímicos, los usos de la tierra, la biodiversidad y la
dispersión de la biota más allá de los límites geográficos naturales (De la Fuente &
Suarez, 2008). Uno de los problemas con los que se enfrenta la práctica agrícola es el
ataque de bacterias fitopatógenas, que causan diversos trastornos a cultivos, derivando
en importantes pérdidas económicas a nivel mundial. Organismos como Agrobacterium
tumefaciens, Pseudomonas corrugata, Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae y
Xanthomonas campestris se reportaron como fitopatógenos graves, causando daños en
la zanahoria, papa, tomate, verduras de hoja verde, cebolla, pimiento verde, calabaza y
otras cucurbitáceas. Además, estos fitopatógenos pueden causar enfermedades en
diversos tejidos del vegetal que invaden. La aplicación excesiva e indiscriminada de
pesticidas ocasiona importantes problemas de resistencia, daños al medio ambiente y
graves complicaciones a la salud humana; además de que elevan los costos de
producción por la utilización de esta clase de sustancias (Dip Maderuelo, 2011). Por ello
es fundamental la investigación y generación de nuevas herramientas que imiten a la
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naturaleza, favorezcan la biodiversidad y los mecanismos de regulación natural.
Especies vegetales distribuidas en la zona del noroeste argentino, entre ellas Ligaria
cuneifolia y Jodina rhombifolia, son capaces de sintetizar compuestos con valiosas
propiedades medicinales, cobrando relevancia aquellos metabolitos secundarios
bioactivos sobre bacterias fitopatógenas (Soberón et al, 2010). Mientras que L.
cuniefolia es un arbusto endémico que crece espontáneamente en la región árida y
semiárida del noroeste Argentino entre 1800 y 2700 m sobre el nivel del mar, J.
rhombifolia es un pequeño árbol de hojas romboidales que crece de 500 a 1000 m sobre
el nivel del mar. En el presente estudio, se evaluó la potencia antimicrobiana de
extractos obtenidos de L. cuneifolia y J. rhombifolia. Se realizó la detección y
aislamiento de los compuestos activos del extracto de mayor potencia, y se
determinaron las estructuras químicas de dichos metabolitos.
MATERIALES Y METODOS
Material vegetal: La recolección del material vegetal de L. cuneifolia (Ruiz y Pavón) se
realizó en la localidad de Ampimpa (Valles Calchaquies, Tafí del Valle, Tucumán);
mientras que las hojas de J. rhombifolia (Hook. Ex Arn) se recolectaron en la localidad
de San Pedro de Colalao (Trancas, Tucumán). Preparaciones de extractos: El material
vegetal se lavó y se secó en estufa a 37°C, se pulverizó en molinillo. Los extractos
fueron preparados a partir de cada muestra vegetal por lixiviación a temperatura
ambiente con disolventes en un aumento del orden de polaridad: diclorometano,
metanol y agua. Las extracciones se llevaron a cabo de acuerdo a lo descrito en
Farmacopea Argentina VIII Ed. (2011) con ligeras modificaciones. Los tres extractos
obtenidos de cada muestra vegetal se denominaron extracto diclorometánico (DCM),
metanólico (MeOH) y acuoso (W). Cuantificación del material soluble extraído: Se
determinó la cantidad de material soluble extraído (ME). Se calculó el rendimiento
extractivo (RE) y se determinó el contenido de compuestos fenólicos (CF) empleando el
reactivo de Folin-Ciocalteu, de acuerdo a lo establecido por (Singleton et al, 1999).
Antibióticos comerciales: estreptomicina y oxitetraciclina por ser antibióticos de
referencia comercial con alta frecuencia de aplicacion agrícola. Microorganismos: cepas
bacterianas de la American Type Culture Collection (ATCC): Escherichia coli ATCC
25922 (Gram negativa) y Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Gram positiva). Cepas
patógenas de plantas: Erwinia carotovora var carotovora ATCC 15713, ATCC 13951
Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae ATCC 10862, ATCC 29736
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Pseudomonas corrugata y Agrobacterium tumefaciens ATCC 15955. Microdilución en
caldo y recuento de colonias: Se realizaron los ensayos para evaluar la actividad
bacteriostática de las muestras (microdilución de caldo), empleando policubetas de
poliestireno estériles de 96 pocillos; la actividad bactericida se analizó mediante
ensayos de recuento de colonias en cajas de Petri estériles con agar Mueller-Hinton de
acuerdo a técnicas estandarizadas (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI,
2009). Bioautografías: se emplearon para determinar la actividad antibacteriana de los
extractos; la presencia de una zona de inhibición amarilla sobre un fondo azul oscuro
indica actividad positiva. Los diámetros de las zonas de inhibición son proporcionales a
la potencia antibacteriana de las muestras ensayadas. Ensayos de microdilución: la
actividad antibacteriana de los compuestos activos purificados se evaluó mediante
microdilución en policubetas. La CIM se determinó después de 24 h de incubación a
37°C. Análisis estadístico: se realizaron test de t (Student) o ANOVA de una vía,
considerando un nivel de probabilidad inferior a 0.05 como estadísticamente
significativo. Fraccionamiento y purificación biodirigida de los agentes bioactivos: para
esta etapa se seleccionó el extracto LCME. Se utilizó cromatografía columna de
Sephadex LH-20 empleando metanol como fase móvil. Se colectaron 160 alícuotas (de
3 ml cada una), se reunieron en seis grupos (L1-L6) de acuerdo a sus composiciones
químicas. Los grupos L1-L6 se evaluaron por bioautografía, CCF y cromatografía
líquida de alta performace (HPLC) (Soberon et al, 2014).
RESULTADOS Y DISCUSION
L. cuneifolia presentó mayores rendimientos de material extraído (ME) y mayor
contenido de compuestos fenólicos (CFs), en relación a los valores obtenidos con los
extractos de J. rhombifolia. Asimismo los RE son superiores en los extractos MeOH
respecto a DCM y W (Tabla 1).
Tabla 1: Rendimientos extractivos y contenido de compuestos fenólicos de extractos
vegetales de L. cuneifolia y J. rhombifolia
Especie
L.
cuneifolia
J.
Extracto
Diclorometánico
Metanólico
Acuoso
Diclorometánico
ME mg.mL -1
87.6
461.4
83.79
62.2
RE
5.71
27.18
14.71
2.35
CF mg.mL-1
0.32
37.8
5.18
0.03
4
rhombifolia Metanólico
Acuoso
Actividad
114.05
8.76
antibacteriana:
El
11.57
3.59
extracto
LCME
22.67
2.01
presentó
un
amplio
espectro
antimicrobiano, con efectos inhibitorios sobre todas las cepas fitopatógenas ensayadas,
a ≤ 19.5 µg ME.mL-1, y presentó efecto bactericida sobre cinco de las siete cepas
ensayadas. Los extractos de J. rhombifolia no presentaron actividad antibacteriana
significativa sobre las cepas ensayadas (CIMs > 5 mg ME.mL-1). Ningún extracto
DCM presentó actividad antibacteriana sobre las cepas bajo estudio. Los datos
obtenidos muestran concordancia con los valores de rendimientos extractivos y cantidad
de compuestos fenólicos. En la tabla 2 se exponen los resultados.
Tabla 2: Valores de CIM/CBM (µg de ME.mL-1) de los extractos MeOH, W y
antibióticos comerciales
(µg.mL-1) determinados por microdilución y recuento de
colonias.
Muestra
X.
campestri
L. cuneifolia MeOH
19.5/NBE
L. cuneifolia Acuoso
>5000/ENB
J. rhombifolia MeOH
>5000/ENB
J. rhombifolia Acuoso
>5000/ENB
Sreptomicina 100/ENB
Oxytetraciclina
160/640
CIM/CBM
Ps.
A. tumefaciens Ps. corrugata syringae
19.5/78
9.8/78
>5000/ENB
>5000/ENB
>5000/ENB
>5000/ENB
>5000/ENB
100/ENB
>5000/ENB
100/ENB
160/160
320/640
2.5/78
E. carotovora
E. coli
S. aureus
19.5/78
156/ENB
78/312
>5000/ENB >5000/ENB
312/ENB
>5000/ENB >5000/ENB
>5000/ENB
>5000/ENB >5000/ENB
>5000/ENB >5000/ENB
100/ENB
10/160
>5000/ENB >5000/ENB
100/ENB
160/ENB
160/320
160/160
ENI/ENB
320/640
ENB= Efecto no bactericida. ENI= Efecto no inhibidor
Los ensayos de fraccionamiento, purificación biodirigida, y posterior identificación de
los compuestos aislados identificaron que los compuestos activos del extracto LCME
fueron mono flavonoles, diglicósidos y ácido gálico.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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