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Actividades antibacterianas de extractos de hojas de Ligariacuneifolia y
Jodinarhombifolia contra bacterias fitopatógenas.
M. Rocío Dip Maderuelo1,2,*, J. Rodolfo Soberón2,3,4, Melina A. Sgariglia2,3,4, Marisol Jimenez2,3,4,
Marta A. Vattuone2,3,4
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Cat. De Metodología de la Investigación Científica. Facultad de Medicina. Universidad Nacional de
Tucumán. Lamadrid 875. 1er piso. San Miguel de Tucumán; Tucumán; Argentina. 2Investigadores de la
Universidad Nacional de Tucumán. Ayacucho 491. San Miguel de Tucumán; Tucumán; Argentina.
3
Laboratorio de Biología de Agentes Bioactivos y Fitopatógenos (LABIFITO) Facultad de Bioquímica,
Química y Farmacia. Universidad Nacional de Tucumán. Ayacucho 471. San Miguel de Tucumán;
Tucumán; Argentina. 4Investigadores del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
(CONICET), Argentina. Av. Rivadavia 1917. Ciudad Autónoma de Buenos Aires; Argentina. * Autores
para la correspondencia: M. Rocío DipMaderuelo: [email protected]; J. Rodolfo Soberón:
[email protected]
RESUMEN
Gran parte de los compuestos químicos sintetizados por plantas tienen acción antimicrobiana y
su actividad es comparable a la de productos comerciales. Se prepararon seis extractos vegetales
a partir de Ligariacuneifolia y Jodinarhombifolia. Se utilizaron métodos de bioautografía y
microdilución para estudiar la actividad antibacteriana de las muestras sobre 7 cepas
fitopatógenas. Se determinaron las concentraciones inhibitorias mínimas (CIMs) y
concentraciones bactericidas mínimas (CBMs) de las muestras. Los extractos metanólicos y
acuosos de L. cuneifolia mostraron actividad inhibitoria sobre bacterias fitopatógenas, con CIMs
de 2.5 a 156 μg.mL-1 para el extracto metanólico de L. cuneifolia (LCME) y 5 mg.mL-1 para el
extracto acuoso. Ninguno de los tres extractos de J. rhombifolia mostraron actividad
antibacteriana significativa sobre las cepas fitopatógenas (CIM = 312 μg.mL-1). Solamente
LCME presentó actividad bactericida sobre las cepas fitopatógenas (CBMs = 78 μg.mL-1), y
exhibió actividad inhibitoria significativa (p < 0.05) frente a las cepas clínicas de referencia:
Escherichia coli (CIM = 156 mg.mL-1.) y Staphylococcus aureus (CIM = 78 mg.mL-1, MBC =
312 mg.mL-1). El aislamiento guiado e identificación de compuestos activos antibacterianos se
llevó a cabo para el extracto metanólico de L. cuneifolia (LCME). Los compuestos activos de
LCME fueron identificados como mono flavonoles, diglicósidos y ácido gálico. También se
evaluó la actividad antibacteriana de los compuestos purificados. Por lo expuesto, los
compuestos aislados de L. cuneifolia que poseen actividad inhibitoria sobre cepas fitopatógenas
podrían utilizarse como una fuente eficaz de metabolitos contra las enfermedades bacterianas en
vegetales.
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INTRODUCCION
El crecimiento explosivo de la población humana generó problemas ambientales
que superaron la capacidad de asimilación de la naturaleza. (Henry&Heinke, 2011). El
consumo per cápita y la complejidad de los centros urbanos impulsaron la expansión de
la agricultura y la intensificación productiva por unidad de superficie, y contribuyeron a
la alteración de los ciclos biogeoquímicos, los usos de la tierra, la biodiversidad y la
dispersión de la biota más allá de los límites geográficos naturales (De la
Fuente&Suarez, 2008). Uno de los problemas con los que se enfrenta la práctica
agrícola es el ataque de bacterias fitopatógenas, que causan diversos trastornos a
cultivos, derivando en importantes pérdidas económicas a nivel mundial. Organismos
como Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas corrugata, Erwinia carotovora,
Pseudomonas syringae y Xanthomonas campestris se reportaron como fitopatógenos
graves, causando daños en la zanahoria, papa, tomate, verduras de hoja verde, cebolla,
pimiento verde, calabaza y otras cucurbitáceas. Además, estos fitopatógenos pueden
causar enfermedades en diversos tejidos del vegetal que invaden. La aplicación excesiva
e indiscriminada de pesticidas ocasiona importantes problemas de resistencia, daños al
medio ambiente y graves complicaciones a la salud humana; además de que elevan los
costos de producción por la utilización de esta clase de sustancias (Dip Maderuelo,
2011). Por ello es fundamental la investigación y generación de nuevas herramientas
que imiten a la naturaleza, favorezcan la biodiversidad y los mecanismos de regulación
natural. Especies vegetales distribuidas en la zona del noroeste argentino, entre ellas
Ligaria cuneifolia y Jodina hombifolia, son capaces de sintetizar compuestos con
valiosas propiedades medicinales, cobrando relevancia aquellos metabolitos secundarios
bioactivos sobre bacterias fitopatógenas (Soberónet al, 2010). Mientras que L.
cuniefolia es un arbusto endémico que crece espontáneamente en la región árida y
semiárida del noroeste Argentino entre 1800 y 2700 m sobre el nivel del mar, J.
rhombifolia es un pequeño árbol de hojas romboidales que crece de 500 a 1000 m sobre
el nivel del mar. En el presente estudio, se evaluó la potencia antimicrobiana de
extractos obtenidos de L. cuneifolia y J. rhombifolia. Se realizó la detección y
aislamientode los compuestos activos del extracto de mayor potencia, y se determinaron
las estructuras químicas de dichos metabolitos.
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MATERIALES Y METODOS
Material vegetal: La recolección del material vegetal de L. cuneifolia (Ruiz y Pavón) se
realizó en la localidad de Ampimpa (Valles Calchaquies, Tafí del Valle, Tucumán);
mientras que las hojas de J. rhombifolia (Hook. Ex Arn) se recolectaron en la localidad
de San Pedro de Colalao (Trancas, Tucumán). Preparaciones de extractos: El material
vegetal se lavó y se secó en estufa a 37°C, se pulverizó en molinillo. Los extractos
fueron preparados a partir de cada muestra vegetal por lixiviación a temperatura
ambiente con disolventes en un aumento del orden de polaridad: diclorometano,
metanol y agua. Las extracciones se llevaron a cabo de acuerdo a lo descrito en
Farmacopea Argentina VIII Ed. (2011) con ligeras modificaciones. Los tres extractos
obtenidos de cada muestra vegetalse denominaronextracto diclorometánico (DCM),
metanólico (MeOH) y acuoso (W). Cuantificación del material soluble extraído: Se
determinó la cantidad de material soluble extraído (ME). Se calculó el rendimiento
extractivo (RE) y se determinó el contenido de compuestos fenólicos (CF)empleando el
reactivo de Folin-Ciocalteu, de acuerdo a lo establecido por (Singletonet al, 1999).
Antibióticos comerciales: estreptomicina y oxitetraciclina por ser antibióticos de
referencia comercial con alta frecuencia deaplicacion agrícola. Microorganismos: cepas
bacterianas de la American Type Culture Collection (ATCC): Escherichia coliATCC
25922 (Gram negativa) y Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Gram positiva). Cepas
patógenas de plantas:Erwinia carotovora var carotovora ATCC 15713, ATCC 13951
Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae ATCC 10862, ATCC 29736
Pseudomonas corrugata y Agrobacterium tumefaciens ATCC 15955. Microdilución en
caldo y recuento de colonias: Se realizaron los ensayos para evaluar la actividad
bacteriostáticade las muestras (microdilución de caldo), empleando policubetas de
poliestireno estériles de 96 pocillos; la actividad bactericida se analizó mediante
ensayos de recuento de colonias en cajas de Petri estériles con agar Mueller-Hintonde
acuerdo a técnicas estandarizadas (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI,
2009). Bioautografías: se emplearon para determinar la actividad antibacteriana de los
extractos; la presencia de una zona de inhibición amarillasobre un fondo azul oscuro
indica actividad positiva. Los diámetros de las zonas de inhibición son proporcionales a
la potencia antibacteriana de las muestras ensayadas. Ensayos de microdilución:la
actividad antibacteriana de los compuestos activos purificados se evaluó mediante
microdiluciónen policubetas. La CIM se determinó después de 24 h de incubación a
37°C. Análisis estadístico: se realizaron test de t (Student) o ANOVA de una vía,
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considerando unnivel de probabilidad inferior a 0.05 como estadísticamente
significativo. Fraccionamiento y purificación biodirigida de los agentes bioactivos: para
esta etapa se seleccionó el extracto LCME.Se utilizó cromatografía columna de
Sephadex LH-20 empleando metanol como fase móvil. Se colectaron 160 alícuotas (de
3 ml cada una), se reunieron en seis grupos (L1-L6) de acuerdo a sus composiciones
químicas. Los grupos L1-L6 se evaluaron por bioautografía,CCF y cromatografía
líquida de alta performace (HPLC) (Soberonet al,2014).
RESULTADOS Y DISCUSION
L. cuneifolia presentó mayores rendimientos de material extraído (ME) y mayor
contenido de compuestos fenólicos (CFs), en relación a los valores obtenidos con los
extractos de J. rhombifolia. Asimismo los RE son superiores en los extractos
MeOHrespecto a DCMy W (Tabla 1).
Tabla 1: Rendimientos extractivos y contenido de compuestos fenólicos de extractos
vegetales de L. cuneifolia y J. rhombifolia
Especie
Extracto
Diclorometánico
L.
cuneifolia Metanólico
Acuoso
Diclorometánico
J.
rhombifolia Metanólico
Acuoso
ME mg.mL -1
87.6
461.4
83.79
62.2
114.05
8.76
RE
5.71
27.18
14.71
2.35
11.57
3.59
CF mg.mL-1
0.32
37.8
5.18
0.03
22.67
2.01
Actividad antibacteriana: El extracto LCME presentó un amplio espectro
antimicrobiano, con efectos inhibitorios sobre todas las cepas fitopatógenas ensayadas,
a ≤ 19.5µg ME.mL-1, y presentó efecto bactericida sobre cinco de las siete cepas
ensayadas. Los extractos de J. rhombifolia no presentaron actividad antibacteriana
significativa sobre las cepas ensayadas (CIMs>5 mg ME.mL-1). Ningún extracto DCM
presentó actividad antibacteriana sobre las cepas bajo estudio. Los datos obtenidos
muestran concordancia con los valores de rendimientos extractivos y cantidad de
compuestos fenólicos. En la tabla 2 se exponen los resultados.
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Tabla 2: Valores de CIM/CBM (µg de ME.mL-1) de los extractosMeOH, W y
antibióticos comerciales (µg.mL-1) determinados por microdilución y recuento de
colonias.
Muestra
X.
campestri
L. cuneifolia MeOH
19.5/NBE
L. cuneifolia Acuoso
>5000/ENB
J. rhombifolia MeOH
>5000/ENB
J. rhombifolia Acuoso
>5000/ENB
Sreptomicina 100/ENB
Oxytetraciclina
160/640
CIM/CBM
Ps.
A. tumefaciens Ps. corrugata syringae
19.5/78
9.8/78
>5000/ENB
>5000/ENB
>5000/ENB
>5000/ENB
>5000/ENB
100/ENB
>5000/ENB
100/ENB
160/160
320/640
2.5/78
E. carotovora
E. coli
S. aureus
19.5/78
156/ENB
78/312
>5000/ENB >5000/ENB
312/ENB
>5000/ENB >5000/ENB
>5000/ENB
>5000/ENB >5000/ENB
>5000/ENB >5000/ENB
100/ENB
10/160
>5000/ENB >5000/ENB
100/ENB
160/ENB
160/320
160/160
ENI/ENB
320/640
ENB= Efecto no bactericida. ENI= Efecto no inhibidor
Los ensayos de fraccionamiento, purificación biodirigida, y posterior identificación de
los compuestos aislados identificaron que los compuestos activos del extracto LCME
fueron mono flavonoles, diglicósidos y ácido gálico.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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