Download (D. PARODI) BURK. (Fabaceae)

Boletín Latinoamericano y del Caribe de
Plantas Medicinales y Aromáticas
ISSN: 0717-7917
[email protected]
Universidad de Santiago de Chile
Chile
Sgariglia, Melina A.; Soberón, José R.; Sampietro, Diego A.; Quiroga, Emma N.; Vattuone, Marta A.
ACTIVIDAD INHIBITORIA DE HIALURONIDASA EN EXTRACTOS DE Caesalpinia paraguariensis (D.
PARODI) BURK. (Fabaceae)
Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, vol. 6, núm. 5, 2007, pp.
274-275
Universidad de Santiago de Chile
Santiago, Chile
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=85617508071
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IX Simposio Argentino y XII Simposio Latinoamericano de Farmacobotánica
Sección Farmacognosia y Fitoquímica
47- ACTIVIDAD INHIBITORIA DE HIALURONIDASA EN EXTRACTOS DE Caesalpinia
paraguariensis (D. PARODI) BURK. (Fabaceae)
[Hyaluronidase inhibiting activity in Caesalpinia paraguariensis (D. Parodi) Burk. (Fabaceae) extracts]
Melina A. Sgariglia, José R. Soberón, Diego A. Sampietro, Emma N. Quiroga & Marta A. Vattuone
Instituto de Estudios Vegetales “Dr. Antonio R. Sampietro”, Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de
Tucumán. Ayacucho 471 (4000) Tucumán. Argentina
[email protected]
RESUMEN Las hialuronidasas son enzimas que degradan Acido Hialurónico (AH), polisacárido integrante de la matriz extracelular en tejidos animales.
Exhiben una elevada actividad en procesos inflamatorios crónicos tales como Artritis Reumatoidea, donde la degradación de AH está implicada en la
progresión de la enfermedad. Inhibidores selectivos de esta enzima podrían tener aplicación terapéutica. En medicina popular se emplean extractos de
corteza de C. paraguarienses (guayacán), para curar heridas y úlceras varicosas. En un trabajo anterior se investigó la actividad antiinflamatoria de sus
extractos acuosos según su actividad inhibitoria de Hialuronidasa. El objetivo en este trabajo es conocer la naturaleza química de el/los inhibidor/es,
mediante purificaciones y análisis bio-dirigidos. Para ello se fraccionó el extracto metanólico (A) por CC (Sephadex LH-20/ Metanol 100 %), las
fracciones se analizaron por TLC y se reunieron en 12 grupos (B). Se realizó hidrólisis ácida de A con fines exploratorios, para separar las antocianidinas
(D) de otras agliconas (C). La inhibición enzimática fue evaluada por un método colorimétrico basado en la reacción de Morgan-Elson, empleando
concentraciones constantes de extractos (54,05 μg/ ml). Ácido Gálico (AG) y Aspirina (Asp.) fueron usados sustancias referentes. Los resultados se
expresaron en porcentajes de inhibición (% I). Las antocianidinas serían solo parcialmente responsables de la inhibición (A: 79,3 %, C: 51,0 % y D: 31,7
%). Las fracciones B10, B11 y B12 fueron mas activas (>80 %) que C y D (agliconas), sugiriendo que los glicósidos son mas activos y/o que podría haber
varios compuestos activos. Estos resultados nos orientarán en la selección de los procedimientos mas adecuados para aislar el/los compuesto/s de las
fracciones B activas.
PALABRAS CLAVES Caesalpinia paraguariensis, Hialuronidasa, antiinflamatoria.
ABSTRACT Hyaluronidases are enzymes that degrade Hyaluronic Acid (HA), a polysaccharide that integrate the extra-cellular matrix in animal tissues.
Hyaluronidases exhibit a high activity in chronic inflammatory processes such as Rheumatoid Arthritis, where the degradation of HA is implicated in the
progress of the disease. Selective inhibitors of this enzyme could have therapeutic application. The popular medicine employs C. paraguariensis bark
extracts in order to heal wounds and varicose veins. In a previous work it was investigated the anti-inflammatory activity of aqueous extracts of this species
according to its hyaluronidase inhibitory activity. The objective in this work is to know the chemical nature of inhibitors, by means of bio-guided
purifications and analysis. Methanolic extract (A) was fractionated by Sephadex LH-20/Metanol CC, the fractions were analyzed by TLC and 12 groups
were made (B). The acid hydrolysis of A was carried out, and the anthocyanidins (D) were separated from other polyphenolic aglycones (C). The
enzymatic inhibition was evaluated by a colorimetric method based on Morgan-Elson reaction. Constant concentrations of extracts were used (54,05
μg/ml). Gallic Acid (AG) and Aspirin (Asp.) were used as reference drugs. Results were expressed as percentage of inhibition (%I). Anthocyanidins (D)
are partly responsible for the inhibition (A: 79,3 %; C: 51,0 % y D: 31,7%). The fractions B10, B11 and B12 were most inhibitory (>80 %) than C and D
fractions (aglycones), suggesting that the glycosides are most active, and/or could have several inhibitory compounds. These results will orient us in the
selection of the most suitable procedures to isolate the compound/s from the active fractions (B).
KEYWORDS Caesalpinia paraguariensis; Hyaluronidase, antiinflammatory.
INTRODUCCIÓN
El ácido hialurónico, glucosaminoglicano (GAG) componente de la matriz extracelular (MEC) en tejidos animales, existe en
su forma nativa como un polímero de alto peso molecular (PM), bajo condiciones inflamatorias es degradado por
Hialuronidasas a fragmentos de bajo PM. Cambios en los niveles o en la naturaleza molecular de GAGs están asociados con
algunas enfermedades del tejido conectivo, tal como Artritis Reumatoidea (Wang et al, 2002). Las funciones efectoras de
macrófagos inflamatorios están influenciadas por interacciones con la MEC (Noble et al, 1996), los fragmentos GAGs de
bajo PM inducen la liberación de citoquinas, las que activan otras enzimas degradantes de MEC, dando paso a la progresión
de la enfermedad. La inhibición de Hialuronidasa es un posible blanco terapéutico en este complejo proceso patológico.
En un trabajo anterior se estudió la actividad inhibitoria de Hialuronidasa de extractos acuosos de ritidoma de C.
paraguariensis, se demostró que son ricos en polifenoles y que la actividad inhibitoria no se debe a taninos presentes en el
extracto (Sgariglia, et al, 2006). En este trabajo investigamos la naturaleza química de el/los inhibidor/es, mediante
purificaciones y análisis bio-dirigidos.
MATERIALES Y MÉTODOS
El extracto metanólico (A) (Sgariglia, et al, 2006) se fraccionó por cromatografía en columna (CC, Sephadex LH20/Metanol 100 %). Se midió la absorbancia de las fracciones a 280 nm, se analizaron por TLC en sílica (Tolueno/ Acetato
de Etilo/ Ac. Fórmico (4:5:1) y celulosa (n-Butanol/Ac.Acético/Agua (6:1:2), empleando como reveladores: Vainillínsulfúrico (V/S), NP/ PEG y UV366. Luego se agruparon en 12 grupos (B). Bibliografía relacionada indica que ciertos
compuestos polifenólicos como antocianidinas, flavonas, flavonoles presentan actividad inhibitoria sobre la enzima en
cuestión (Lee, G. et al., 1993; Middleton, E. Jr. et al., 2000). Se realizó hidrólisis ácida de A con fines exploratorios, para
separar las antocianidinas (D) de otras agliconas (C) (Harborne, 1998). Se determinó material extraído en A, B, C y D por
pesadas de los extractos secos, luego se re-disolvieron en metanol (A y B) y en HCl 0.01% en metanol (C y D) y se
conservaron a -20 ºC. La actividad inhibitoria de Hialuronidasa se evaluó mediante un método colorimétrico basado en la
reacción de Morgan-Elson. Se empleó enzima bovina (HTB) activada con calcio (CaCl2) y Hialuronato de Sodio como
sustrato. Se probaron concentraciones fijas de extractos (54,05 μg/ ml), Aspirina (1.348,78 μg/ ml), Ac. Gálico (135,13 μg/
ml). Se incluyeron los controles necesarios y se calcularon los porcentajes de inhibición (%I) respecto del control.
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RESULTADOS
% I en las distintas fracciones fueron: B1 (0,0), B2 (4.8), B3 (9,52), B4 (3.6), B5 (15,5), B6 (35,7), B7 (53,6), B8 (47,6), B9
(71,4), B10 (83,3), B11(90,5) y B12 (91,1). A (79,3), C (51,0) y D (31,7). Asp. (34,30), AG (10,20).
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
De los resultados expuestos se desprende que 7 de 12 fracciones B superan el 30 % I (≥ 30 % I: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12), el
análisis en TLC de las mismas corroboró la presencia de bandas correspondientes a polifenoles. Según los % I obtenidos
para C y D, las antocianidinas serían sólo parcialmente responsables de la actividad inhibitoria. Las fracciones B10, B11 y
B12 fueron las más activas (>80 %) superando los % I de C y D, lo que sugiere que los glicósidos serían mas activos y/o
que podría haber varios compuestos activos. Las fracciones B demostraron ser inhibidores más potentes que las sustancias
usadas como referentes.
Estos resultados nos orientarán en la selección de los procedimientos mas adecuados para aislar el/los compuesto/s de las
fracciones B activas y aportarán información útil para la ulterior identificación de los metabolitos bioactivos.
AGRADECIMIENTOS SECYT, CONICET.
REFERENCIAS
Harborne, JB. (1998) Phenolic compounds In: Phytochemical methods 3th Ed. Published by Champman & Hall, Thompson
Science SE1 8HN, UK. ISBN 0412572605(HB).
Lee, G; Lee, SH; Rak Min, K; Lee, KS; Ro, JS; Ryu, JC; Kim, Y. (1993) Planta Med 59: 381-382.
Middleton, EJ; Kandaswami, C. (2000) Pharmacol Rev 52:673-751.
Noble, PW; McKee, CM; Cowmanfl, M; Shin, HS. (1996) J. Exp. Med.183: 2373-2378.
Sgariglia, MA; Soberón, JR; Sampietro, DA; Quiroga, EN; Vattuone, MA. (2006) 42th Annual Meeting Argentine Society
for Biochemistry and Molecular Biology. EN-P22: 141.
Wang, JY and Roehrl, MH. (2002) PNAS 99 (22): 14362-14367.
Wettasinghe, M; Shahidi, F; Amarowicz, R. (2002). J. Agric. Food Chem 50(5): 1267-1271.
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