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CURSO DE PRIMAVERA
PATOLOGÍA MOLECULAR DEL CÁNCER
Conceptos básicos sobre ADN y ARN
Técnicas de amplificación (PCR y variantes)
Aplicaciones principales
Dr. Juan C. Cigudosa
Madrid
29 y 30 de mayo, 2014
SEAP- IAP
Material hereditario: ADN
• Nuestra información genética está codificada en una
macromolécula: el ADN (ácido dexoxirribonucléico).
• El ADN con proteínas forma los cromosomas. El material
básico de los cromosomas es la cromatina.
• 46 cromosomas que se agrupan en parejas de
cromosomas homólogos (uno heredado del padre y
el otro de la madre)
2 metros de ADN en un núcleo de 0,005 mm diámetro
Nucleosoma: 8 Histonas+147 pb
Cromatina=(ADN+proteinas)
El ADN como material genético
Características del material genético
•Capacidad de almacenamiento
de la información
•Capacidad de replicación
•Capacidad de expresión de la
información
•Capacidad de variación por
mutación
El ADN como material genético
Características del material genético
•Capacidad de almacenamiento
de la información
•Capacidad de replicación
•Capacidad de expresión de la
información
•Capacidad de variación por
mutación
ADN
1. Acido Desoxiribonucleico:
información genética.
2. Polímero formado por
subunidades: nucleótidos.
3. Nucleótido está constituído:
azúcar
pentosa(desoxiribosa)+base
nitrogenada (A,T,C,G)+
grupo fosfato.
4. T y C pirimidinas; A y G
purinas.
5. T es complementaria a A
C es complementaria a G
6. Estructura de doble hebra
¿Qué es una secuencia de ADN?
• ADN: 4 caracteres
A (adenina), C (citosina), G (guanina), T (timina).
• Las moléculas de ADN están compuestas por una secuencia de
millones de estos caracteres, de la misma manera que si
tuviéramos un collar en los cuales cada perla es de un color de
cuatro posibles.
• El orden de las bases en la secuencia es la manera de almacenar
la información: el ADN es la memoria química de los organismos
vivos.
• La lectura de esta secuencia de bases
secuenciación.
es lo que denominamos
GENOMA/GEN
•
GENOMA: todo el ADN contenido en el núcleo
que hay ADN en mitocondrias).
(no olvidar
•
La unidad de información en el ADN es el GEN (formado por
nucleótidos) que es una secuencia de ADN que contiene la
información para la producción de proteínas, así como las
instrucciones regulatorias para determinar cuándo y en qué
cantidad se producirán esas proteínas.
• 20000 genes aproximadamente
• 20-30 kb tamaño medio de un gen (nº exones muy variable
(media de 7-8)
Estructura de un GEN
Región codificante
EXOMA
Región no codificante
El ADN como material genético
Características del material genético
•Capacidad de almacenamiento
de la información
•Capacidad de replicación
•Capacidad de expresión de la
información
•Capacidad de variación por
mutación
Replicación del ADN
DEFINICION: una molécula original de ADN de doble cadena es convertida en
dos moléculas hijas de ADN idénticas.
El ADN como material genético
Características del material genético
•Capacidad de almacenamiento
de la información
•Capacidad de replicación
•Capacidad de expresión de la
información
•Capacidad de variación por
mutación
DOGMA DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
Complementariedad de bases nitrogenadas
ARN
1. Acido Ribonucleico.
2. Polímero formado por
subunidades: nucleótidos.
3. Nucleótido está constituído:
azúcar (ribosa)+base
nitrogenada (A,U,C,G)+
grupo fosfato.
4. U y C pirimidinas; A y G
purinas.
5. U es complementaria a A
C es complementaria a G
6. Estructura monocatenaria
Severo Ochoa ganó el Premio Nobel de Medicina en 1959 tras descubrir cómo se
sintetizaba el ARN
CODIGO GENÉTICO
43 = 64
codones
20 Aa
1er Aa
SIEMPRE
ATG/ Met
Codones
STOP
TAA/TAG/
TGA
Splicing alternativo
Modificaciones post-traduccionales
Los GENES se anotan en mayúscula y cursiva
P53, BCR-ABL, EGFR, etc
Las PROTEINAS se anotan en minúscula
p53, Bcr-Abl, Egfr, etc
El ADN como material genético
Características del material genético
•Capacidad de almacenamiento
de la información
•Capacidad de replicación
•Capacidad de expresión de la
información
•Capacidad de variación por
mutación
El ADN como material genético
• El material genético debe ser capaz de proporcionar una
fuente de variabilidad a través del proceso de
mutación.
• Mutación: cambio que afecta
a la composición del ADN que
tendrá su reflejo final en la
proteína resultante.
• Mutación línea germinal: afecta a los gametos, pasará
a la descendencia.
• Mutación somática: Alteración o cambio en la
información genética (ADN) que ocurre después de la
concepción.
• Este cambio podrá ser beneficioso, neutral o perjudicial.
Tipos de mutaciones
Mutaciones indel: Cambio de la secuencia de codones que debe ser leída durante
la traducción, resultando en una proteína completamente diferente, que no suele
ser funcional.
Tipos de mutaciones
Tipos de mutaciones
• Mutaciones no sinónimas: sustituciones nucleotídicas que cambian un
aminoácido por otro (MISSENSE).
• Mutación sinónima: mutación que altera la base situada en la tercera
posición del codón pero no causa sustitución aminoacídica (SILENT)
• Mutación sin sentido: mutación por la cual un codón que especifica un
aminoácido es cambiado a un codón de terminación, dando lugar a una proteína
truncada (NONSENSE).
Polimorfismos
Definición: variación en la secuencia de un lugar determinado del
DNA entre los individuos de una población. Debe aparecer por lo
menos en el 1% de la población.
La mayor contribución a la variación genética son los SNP (85%)
Cada 1000 b un SNP
SNPs
•Alrededor de 8 millones de SNPs en todo el genoma.
•Algunos pueden producir cambios en proteína:
- susceptibilidad a padecer enfermedades
- resistencia a tratamientos específico
PREPARACION DE MUESTRAS,
EXTRACCION ACIDOS
NUCLEICOS Y CONSERVACION
DE MUESTRAS
Muestras Biológicas
1.- Tejido
– Biopsa en fresco
- Biopsia enparafina
2.- Fluidos:
- Médula ósea
- Sangre Periférica
- Saliva
Heparina
EDTA
- Líquido Cefalorraquídeo
- Líquido Pleural
- Líquido Pericárdico
- Líquido Ascítico
- Líquido Sinovial
Citrato
Sódico
Muestras Biológicas
1) Citogenética Convencional
CARIOTIPO
2) Citogenética Molecular
FISH
3) BIOLOGIA MOLECULAR
Mínimo 5 ml MO/SP
Para RQ-PCRm, 10 ml
de SP
3 ml de MO/SP
HEPARINA
Corte OCT o
Parafina
EDTA
OBTENCIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
METODOS DE EXTRACCION DE ARN
1)
2)
3)
4)
Extracción con Tiocianato de Guanidinio-Fenol-Cloroformo
Trizol: reactivo comercial
Columnas de silicagel (Rneasy Mini Kit-Qiagen)
Purificación por afinidad con Oligo-dT (para mRNA)
Métodos Extracción de ADN
1) Extracción con Fenol-Cloroformo-Isoamílico
2) Columnas de silicagel (DNAmp Mini Kit- Qiagen)
Métodos automatizados
AC.
NUCLEICO
[AC. NUCLEICO]
(mg/ml)
PUREZA (Valor
óptimo)
ADN
A260 x 50 x dilución
A260/A280 (1,80)
ARN
A260 x 40 x dilución
A260/A280 (2,00)
Extracción ADN, ARN y proteína
LISAR Y
HOMOGENEIZAR
LAVAR
PRECIPITAR
ELUIR
PRECIPITAR
DISOLVER
LAVAR
ELUIR
CURSO DE PRIMAVERA
PATOLOGÍA MOLECULAR DEL CÁNCER
Conceptos básicos sobre ADN y ARN
Técnicas de amplificación (PCR y variantes)
Aplicaciones principales
Dr. Juan C. Cigudosa
Madrid
29 y 30 de mayo, 2014
SEAP- IAP
Tipos de PCR
PCR Sencilla: RFLP
PCR Anidada (Nested): Amplificación de una secuencia dentro de
otra previamente amplificada
RT-PCR
PCR Múltiple: Varios targets diferentes en forma simultánea
Real Time PCR (RQ-PCR): PCR Cuantitativa
PCR MSP: metilación
PCR Digital (2011)
Variantes de PCR: secuenciación y pirosecuenciación
Tipos de PCR: PCR sencilla
Primers externos para amplificación de una secuencia
Fragmento de amplificación
Tipos de PCR: PCR anidada
Dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers
Reacción 1
Primers externos
para amplificación
de una secuencia
extensa
Reacción 2
Primers internos
para amplificación
de una región
especifica
SEGUNDA PCR
Aumentar ESPECIFICIDAD
Aumentar SENSIBILIDAD (10-6)
Tipos de PCR: RT-PCR
Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA
mRNA
Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa
cDNA
PCR
Enzima Taq polimerasa
Tipos de PCR: PCR Múltiple
• Reacciones que consiguen amplificar simultáneamente y en
un único tubo diferentes secuencias diana.
• Aplicación.
1) Multiplex-PCR control calidad de una muestra:
amplificación de 4 genes constitutivos distintos.
2) Multiplex-PCR LAL-B infantil: amplificación de una
de las 4 posibles translocaciones que estudiamos.
3) ARMS-PCR: Amplificación por PCR de Alelos
Específicos.
Tipos de PCR: PCR Múltiple
Amplificación 4 genes simultáneamente
BCR (377 pb)
b2MG (287 pb)
ABL (193 pb)
PBGD (128 pb)
Tipos de PCR: PCR Múltiple
Amplificación 4 translocaciones simultáneamente LAL-B infantil
t(4;11) MLL-AF4
t(1;19) E2A-PBX1
t(12;21) TEL-AML1
Controles Positivos
t(9;22) BCR-ABL
ADNc individuo con la
t(9;22) e1a2
POSITIVO
Tipos de PCR: Real Time PCR (RQ-PCR): PCR Cuantitativa
- CUANTIFICACIÓN de la expresión de genes o
reordenamientos.
- Más rápida y menos laboriosa.
Tipos de PCR: RQ-PCR
Medida de señal de fluorescencia en la fase exponencial del
proceso de PCR a tiempo real
Fundamento
1.Detección y cuantificación de la señal, emitida por un
reporter fluorescente, que aumenta en proporción directa a la
cantidad de producto de PCR
2.Termociclador con sistema de detección capaz de cuantificar
la señal emitida por el reporter
Tipos de PCR: RQ-PCR
CUANTIFICACION RELATIVA
Expresión de un gen en una muestra problema
en relación a la expresión de dicho gen en controles
normales.
CUANTIFICACION ABSOLUTA
Detección del Nº Copias “exacto” de un gen o
de un gen de fusión mediante la comparación con
estándares de concentración conocida.
Tipos de PCR: RQ-PCR
• Química de la Reacción.
Bufer, MgCl2, dNTP´s, Taq-Polimerasa (enzima), cebadores o
primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde
ADN.
• Ciclos Térmicos.
– Desnaturalización: Separación de las cadenas de ADN
molde y activación de la Taq-Polimerasa (95º C).
– Hibridación y Extensión: Reconocimiento de los primers
con su secuencia complementaria y actividad de la TaqPolimerasa (60ºC).
Tipos de PCR: RQ-PCR
• Química de la Reacción.
Bufer, MgCl2, dNTP´s, Taq-Polimerasa (enzima), cebadores o
primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde ADN.
• Ciclos Térmicos.
– Desnaturalización: Separación de las cadenas de ADN
molde y activación de la Taq-Polimerasa (95º C).
– Hibridación y Extensión: Reconocimiento de los primers
con su secuencia complementariay actividad de la TaqPolimerasa (60ºC).
Tipos de PCR: RQ-PCR
Fundamento
QUIMICO
Ag. Intercalantes (SYBR Green)
REACTIVOS
FLUORESCENTES
Sondas de Hidrólisis
(TaqMan)
Sondas de Hibridación
Sondas de Horquilla (Molecular Beacons)
Tipos de PCR: RQ-PCR
Fundamento
QUIMICO
SYBR Green
Fase annealing
Fase extensión (I)
Fase extensión (II)
Fin del ciclo de PCR
Tipos de PCR: RQ-PCR
Fundamento
QUIMICO
SYBR Green
Ventajas
- simple y económico
- fácil de usar
- sensible (10-6)
- versátil (no se necesitan sondas específicas)
Desventajas
- sobrestimación de la cantidad de molde por la unión del SYBR
Green a dímeros de primer y a otros productos inespecíficos
- necesario hacer una curva de melting
Tipos de PCR: RQ-PCR
Fundamento
QUIMICO
Sondas de Hidrólisis (Sondas TaqMan)
Fase annealing
Fase extensión (I)
Fase extensión (II)
Fin del ciclo de PCR
Tipos de PCR: RQ-PCR
Sondas de Hidrólisis (Sondas TaqMan)
Ventajas
-especificidad
-librerías de cebadores y sondas en las casas
comerciales
Desventaja
- diseño de cebadores y sonda para genes que
no se han
estudiado (Primer Express)
Tipos de PCR: RQ-PCR
• Química de la Reacción.
Bufer, MgCl2, dNTP´s, Taq-Polimerasa (enzima), cebadores o
primers, reactivo fluorescente, agua ultrapura, molde ADN.
• Ciclos Térmicos.
– Desnaturalización: Separación de las cadenas de ADN
molde y activación de la Taq-Polimerasa (95º C).
– Hibridación y Extensión: Reconocimiento de los primers
con su secuencia complementaria y actividad de la TaqPolimerasa (60ºC).
Tipos de PCR: RQ-PCR
FUNDAMENTO TERMICO RQ-PCR
Tipos de PCR: RQ-PCR
Producto de amplificación
Fase de plateau o saturación
Fase exponencial
Ciclo umbral (CT)
Ruido de fondo
CT (ciclo umbral):ciclo en el que la intensidad de emisión del fluorocromo
aumenta significativamente con respecto al ruido de fondo
Tipos de PCR: RQ-PCR
INTERPRETACION RESULTADOS RQ-PCR (I)
PRESENCIA (Nº COPIAS)/AUSENCIA
CT muestra
Log dilución
Tipos de PCR: RQ-PCR
-Amplificación robusta y fiable
-Alta especificidad y sensibilidad
-Alta precisión y exactitud
-Cuantifica producto de PCR en cada ciclo
-Capacidad de realizar mayor número de reacciones al día
-No requiere análisis posterior a la PCR (electroforesis)
-Mayor control de contaminación
-Amplio rango de aplicación: reordenamientos IgH o TCR
fusión de genes a nivel DNA
fusión de genes a nivel cDNA
genotipado
expresión génica
Tipos de PCR: PCR Digital (ddPCR)
2ª
1ª
3ª
“X” target
copies
Hacer gotas
PCR
Cualitativa
PCR gotas
Leer gotas
Real-time PCR
Cuantificación relativa
Cuantificación
Droplet Digital PCR
Cuantificación absoluta
Droplet Digital PCR (ddPCR™) – 3ª
Generación
Tipos de PCR: PCR Digital (ddPCR)
Ventajas
 Aumento de señal / ruido. DNA de alto número de copias y background
se diluyen, enriqueciendo los DNA escasos y permite un ± 10 % de
precisión
 Eliminación de los sesgos de la PCR. Las tasas de error se reducen
mediante la eliminación de la dependencia de amplificación de la
eficiencia, permitiendo detección de pequeñas diferencias (1,2 X)
 Simplificación de la cuantificación. Con ddPCR no necesitamos
estándares para la cuantificación absoluta ó relativa.
 Reducción del coste del reactivo. reacción son picolitros-nanolitros en
volumen, reduciendo muestra reactivo y entrada
Desventajas
 Precio de la plataforma
SENSIBILIDAD 10-7
Secuenciación (PCR modificada)
• ¿Qué es la secuenciación?
• Metodología
 Terminadores/Sanger
 Pirosecuenciación
 Nueva generación de secuenciadores
• Análisis de secuencias
• Ejemplos de secuenciación
Sanger F et al. J Mol Biol. 1975 (3):441–448
Maxam AM, Gilbert W. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 ;74(2):560-4
M Ronaghi et al. Analytical Biochemistry. 1996;242:84-85
Shenduret et al. Nat Biotecnology. 2008: 26
Secuenciación (PCR modificada)
1) Reacción de Secuenciación: Método de Sanger
(marcaje fluorescente de las moléculas de ADN
amplificadas por PCR)
2) Separación de moléculas marcadas:
- electroforesis en gel de acrilamida
desnaturalizante
- electroforesis capilar
Secuenciación (PCR modificada)
La fluorescencia emitida por cada fragmento de ADN,
corresponde a la emisión de fluorescencia del nucleótido
incorporado en 3´
Secuenciación (PCR modificada)
1) Reacción de Secuenciación: Método de Sanger
(marcaje fluorescente de las moléculas de ADN
amplificadas por PCR)
2) Separación de moléculas marcadas:
- electroforesis en gel de acrilamida
desnaturalizante
- electroforesis capilar
Secuenciación (PCR modificada)
Cada uno de los carriles corresponde con una muestra, y cada una
de las bandas de colores con una de las bases del ADN . El
ordenador identifica color con base y dibuja un cromatograma con
los picos de colores y su correspondiente base.
Secuenciación (PCR modificada)
Método enzimático/Teminadores/Sanger
Purificación de los productos de secuenciación
Secuencia correcta
CROMATOGRAMA
Terminadores
Secuenciación (PCR modificada)
Método enzimático/Teminadores/Sanger
Revisión visual de los electroferogramas.
Longitud de secuencia adecuada
Valores de calidad mínimos
Uso de programas informáticos para el análisis.
Comparar secuencias en ambas direcciones.
Comparar las muestras con una secuencia de
referencia (sin mutaciones)
Secuenciación (PCR modificada)
Tipos de discrepancias con la secuencia de referencia:
1.Polimorfismos
- Mutaciones Puntuales
- Deleciones
- Inserciones
- Translocaciones
- Inversiones
2. Artefactos de la secuenciación
Secuenciación (PCR modificada)
Método enzimático/Teminadores/Sanger
Ventajas
Desventajas
Experiencia
Baja capacidad
Gold estándar
Sensibilidad baja
“Único Método”??
No es cuantitativo
Coste por base
Secuenciación Masiva (PCR modificada)
Tipos de PCR: RT-PCR
• oligo(dT)n Primer
(n = 10 – 20)
poly(A) tail
mRNA
TTTTTTTTTTTTTTT
cDNA
• Random Primer p(dN)x
(x = 6 -9)
poly(A) tail
mRNA
cDNA
NNNNNN
NNNNNN
NNNNNN
• Gene-specific Primer
– Unión específica a la secuencia homóloga
– for 1-step RT-PCR
Tipos de PCR: PCR Múltiple
ARMS-PCR (Amplificación por PCR de Alelos Específicos)
C3
C1
G
1849G>T
T
C4
C2
Control 463 pb
Mutante 279 pb
Normal 229 pb
C3+C2: Amplificación del alelo normal
C1+C4: Amplificación del alelo mutado
C1+C2: Amplificación Control Interno
Tipos de PCR: PCR Múltiple
C3
C1
JAK2 Mutación V617F
G
1849G>T
T
C4
Control 463 pb
Mutante 279 pb
C2
ADN de pacientes con la
mutación
Normal 229 pb
Control Interno
Alelo Mutado
Alelo Normal
ADN pacientes sin la
mutación
Mutación en homocigosis o heterocigosis: no se conoce la implicación clínica
Tipos de PCR: PCR MSP