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MÉTODOS DE DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES EN CAMARONES PENEIDOS
Actualmente se han desarrollado varios métodos para el diagnóstico de virus, los cuales incluyen: histología,
potenciación o desarrollo de la enfermedad bajo condiciones estresantes, bioensayos induciendo la
enfermedad en otros organismos sanos, microscopía electrónica, pruebas de anticuerpos, pruebas de
censores de genes (gene probé). Aunque, de todos estos los métodos mas comunes de diagnostico de
enfermedades generalmente están basados en la histología, en las cuales se utilizan técnicas de tinción con
Hematoxilina & Eosina (H & E) y también mediante estudios bacteriológicos para inducción de la
enfermedad, aislamiento de bacteria patógenas, antibiogramas y uso de probióticos para contrarrestar la
presencia de organismos patógenos.
Para el diagnostico de enfermedades mediante método histológico se puede usar técnicas de fijación de
tejidos en solución Davidson, Pruebas de Potenciación de la enfermedad y Pruebas de Bioensayo.
La detección de virus de camarón utilizando probadores de genes implica técnicas de hibridación de dot blot
(puntos o manchas oscuras) o hibridación in situ; anticuerpos (monoclonales o policlonales), pruebas de
anticuerpo fluorescentes, pruebas de ELISA, pruebas de inmunoblot; y amplificación del ADN (ácido
dexosiribonucleico) mediante la técnica de reacción de cadena polimerasa (PCR).
Cada método ofrece sus ventajas y desventajas en cuanto a tiempo de obtención de resultados, sensibilidad
de detección, costo de equipos utilizados y costo de las pruebas o métodos utilizados en sí.
PROBADORES DE GENES O GENE PROBE
Se han desarrollado probadores de genes de virus de las familias siguientes: Parvoviviridae, IHHNV y HPV;
Baculoviridae, MBV, BP y WSSV; Picornaviridae, TSV; además para organismos NHP.
El método de probadores de genes o dot blot (puntos o manchas oscuras) consiste en purificar el virus,
luego la extracción del ácido nucleico, digestión o trascripción de un monofilamento del ADN para
aprovechar la capacidad de clonaje mediante enzima de los fragmentos de ADN plaqueados y ya sea
mediante la inserción de otros fragmentos virales en los probadores o coloraciones, poder detectar los virus.
El uso de probadores de genes está dirigido para Pruebas de diagnóstico; Investigación de virus para
caracterización viral, Interacciones virus-huésped (transmisión, patogénesis), Detección de transportadores;
Efectos de terapéuticos y Desarrollo de lotes SPF/SPR.
La aplicaciones de los probadores de genes incluyen: pruebas de hibridación dot blot
(= puntos o
manchas oscuras) y pruebas de hibridación in situ.
Para las pruebas de hibridación mediante dot blot se utilizan (a) Membranas de nylon o nitrocelulosa; (b)
Muestras a probarse, las que pueden ser homogeneizados crudos de camarón o hemolinfa; (c)
Homogeneizados semipurificados de camarón; (d) Virus purificados o preparación de ADN viral; (e)
Probador con codificación ADN; y (f) Sistema de detección.
En las pruebas de hibridación in situ se utilizan: (a) portaobjetos de microscopios positivamente cargados;
(b) Muestras a probarse (tejido de camarón fijado con solución Davidson AFA); (c) Probador con codificación
ADN; y (d) sistema de detección.
CADENA DE REACCIÓN POLIMERASA (PCR)
El método de PCR se utiliza para la detección de patógenos virales del IHHNV, WSSV y TSV. Mediante este
método se amplifica el ADN con eficiencia remarcable; se identifica regiones objetivos especificas del ADN
presentes en el virion; permite la amplificación del ADN a partir de una molécula objetivo en una sola célula;
y puede ser empleado en pruebas de diagnóstico de rutina. El método conlleva la selección del elemento
principal mediante el aislamiento del virus, extracción del DNA viral, clonacion de ADN con doble filamento o
fragmentos de restricción, selección de clones, secuenciar las terminaciones de clones, escoger los
polimeros (elementos principales) basados en la secuencia de los datos, optimizar las condiciones de las
pruebas de PCR y probar los polimeros principales contra los clones, virus purificado, tejido infectado o
hemolinfa.
Para la aplicación del método de PCR se deben tener en cuenta las consideraciones siguientes: (a)
publicación de la secuencia de los elementos principales; (b) Costo de las pruebas contra la necesidad por
Edición Tumpis
Editores: Víctor Talavera
[email protected]
Luis Miguel Zapata [email protected]
Dagoberto Sánchez [email protected]
Volumen 2 – Edición 03 – Junio 1997
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la sensibilidad; (c) Necesidad por información secuencial; (d) licenciamiento o patente de los resultados; (e)
interpretación de resultados; y (e) usuarios potenciales.
A nivel de laboratorios de reproducción de camarón la aplicación de PCR en la selección de lotes SPF
presenta ventajas por su alta sensibilidad, detección no-letal de los camarones, se usan muestras de
volúmenes pequeños, detección rápida y resultados permanentes. Entre las desventajas que presenta es
que es una técnica costosa, constantemente hay que optimizar la prueba, la interpretación de resultados y
tecnología patentada.
ANTICUERPOS = INMUNOGLOBULINAS
Son moléculas de proteínas producidas por células linfocitos tipo B en mamíferos o algunos peces; estas
son preparadas en respuesta a una sustancia extraña (antigeno = Ag) que ingresa al organismo. Los
anticuerpos reaccionan específicamente con los antígenos y su presencia puede ser medida in vitro. Por
otro lado es conocido que los camarones no fabrican sus propios anticuerpos y para las pruebas tienen que
usarse otros elaborados generalmente a partir de ratones, conejos y pollos.
Los anticuerpos producidos por las células B son de tipo monoclonal o policlonal. El diagnostico de
enfermedades mediante pruebas de anticuerpos puede realizarse mediante pruebas de anticuerpos
fluorescentes, pruebas de ELISA (Prueba inmunoabsorbente de enzima ligada) o pruebas de inmunoblot (=
puntos inmunes). Estas pruebas implican la conjugación del anticuerpo a una enzima la que generalmente
es fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa picante en el caso de las pruebas ELISA; para posteriormente utilizar
en la detección el substrato de enzimas y cromogenos o grupo fosfato colorimetrico o quimioluminiscente.
Los métodos de detección pueden ser directos o indirectos y se pueden utilizar en la detección de virus de
camarón mediante probadores de genes ya sea a través de hibridación con dot blot o hibridación in situ;
anticuerpos monoclonales o policlonales, pruebas de anticuerpos fluorescentes, pruebas de ELISA, ensayos
de immunoblot y amplificación del DNA mediante PCR.
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Volumen 2 – Edición 03 – Junio 1997
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