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Determinación de la presencia de virus y bacterias en camarones silvestres de la
Laguna Madre, Tamaulipas
Duración del Proyecto: Dos años
Responsable. M. en C. Ivan de la Cruz Hernandez
Colaborador: Dr. Gabriel Aguirre Guzmán
INTRODUCCIÓN
La explotación pesquera de los camarones es uno de los rubros de mayor
relevancia en México; debido a que genera importantes divisas al país. Como por
ejemplo durante la década de 1976 a 1986, México fue el principal abastecedor de
camarón al mercado de los Estados Unidos.
Los agentes patógenos son elementos que pueden alterar la producción de
camarón y ocasionar pérdidas económicas importantes. Dentro de los principales
agentes patógenos que presentan los camarones, se incluyen a los virus y bacterias,
tales como el virus de la Infección Hipodérmica y Hematopoyética Viral (IHHNV), Virus
de la Mancha Blanca del Camarón (WSSV), Parvovirus Hepatopancreatico (HPV) y las
bacterias que causan la Necrosis Hepatopancreatica (NHP) y la Vibriosis (Vibrio spp.).
Para la detección de estos agentes patógenos, se han utilizado algunas técnicas
de diagnostico tales como histopatología, Dot Blot, hibridación in situ, RT-PCR (Tiempo
real de la reacción en cadena de la polimerasa), PCR (Reacción en cadena de la
polimerasa) y bacteriología. Siendo estas dos últimas, las mas empleadas en la
detección e identificación de virus y bacterias.
Debido a que la Laguna Madre, Tamaulipas, genera una gran producción de
camarón en el Golfo de México y el Caribe, es de gran importancia realizar estudios
sobre la presencia de diversos virus (IHHNV, WSSV, HPV) y bacterias (NHP, y Vibrio
spp.), en las poblaciónes de camarones silvestres. Esto a fin de poder establecer
estrategias encaminadas a determinar sus efectos y su posible control. Además, los
camarones silvestres pueden servir como reservorios asintomáticos a estos patógenos,
lo cual puede generar problemas a los camaronicultores.
Justificación
Actualmente la producción y explotación de camarón tiene una gran importancia
comercial, tanto a nivel mundial como nacional, ya que es una fuente de alimento con
alto contenido proteico con una gran demanda en el mercado y una fuente de
importantes divisas.
Desgraciadamente, existen numerosos virus y bacterias que generan
enfermedades en camarones silvestres y cultivados. La presencia de estos patógenos
repercute seriamente en la explotación pesquera y controlada de camarones.
Son escasos los estudios sobre la presencia e impacto de los organismos
patógenos virus y bacterias en el Gofo de México y en la Laguna Madre. Es de suma
importancia conocer la situación actual de los agentes patógenos presentes en la
Laguna Madre y los factibles impactos que puede generar a la producción de camarón
de la pesquería local y de la camaronicultura estatal.
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Objetivo general
Determinar la presencia de virus y bacterias patógenas que afecten a los camarones
silvestres de la Laguna Madre, Tamaulipas.
Objetivos específicos
Determinar la presencia del virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV), del Virus
de la Necrosis Hematopoyética y Hepatopancreatica (IHHNV) y del Parvo Virus
Hepatopancreatico (HPV) en diferentes sitios de muestreo en los camarones silvestres
de la Laguna Madre, Tamaulipas.
Determinar la presencia de las bacterias que causan la Hepatopancreatitis Necrotizante
(NHP) y la Vibriosis (Vibrio spp) en diferentes sitios de muestreo, en camarones
silvestres de la Laguna Madre, Tamaulipas.
Material y Métodos
Área de estudio
Se realizaran estudios en cuatro estaciones de muestreo en la Laguna Madre, dos
de las cuales están en frente del ejido de carbonera y dos en el carrizal. La Laguna
Madre se localiza al norte del estado de Tamaulipas a 24°01´ y 25°58´ N y 097°23’ y
097°54´ W, abarcando los municipios de Matamoros, San Fernando y Soto la Marina.
La Laguna tiene una extensión aproximada de 200,000 hectáreas, una profundidad de
1.5 a 4.5 mt y contribuye con la mayor parte de la captura de camarón, cangrejo, ostión
y lisa del Golfo de México.
Muestreo y Toma de Muestra
Se realizarán muestreos nocturnos desde septiembre del 2010 a octubre del 2011.
Los muestreos consistirán en la obtención de camarones silvestres (sin distinción de
especie, o talla) colectados por los pescadores locales en charangas escogidas al azar.
Los camarones vivos colectados (diez organismos en cada sitio de muestreo) serán
escogidos al azar y tomados manualmente usando guantes de látex para evitar
contaminaciones. Los camarones colectados serán posteriormente depositados en
bolsas estériles y guardados en hielo para su posterior uso en bacteriología. Además,
se colectarán 20 camarones vivos en cada sitio de muestreo, los cuales serán
depositados en frascos con etanol al 75 y 95% (10 org por frasco-1). Los camarones
grandes (> 7 cm) que se encuentren en la muestra deberán inyectarse con etanol para
fijar los tejidos (hepatopáncreas, intestino y músculo) para posteriormente ser
empleados en el área de biología molecular para la detección de virus (IHHNV, HPV y
WSSV) y bacterias (NHP).
Estudios Bacteriológicos
Las muestras para bacteriología serán transportadas al laboratorio de
Patogenicidad Bacteriana ubicado en el Edificio de Diagnostico, Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Tamaulipas. Los camarones serán
diseccionados para extraer el hepatopáncreas, intestino, y branquias con las ayuda de
pinzas y tijeras estériles. Los tejidos se guardarán independientemente para crió
conservación (-80°C) en tubos Eppendorf con medio estéril de LB más Glicerol
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(Triptosa 1%, Extracto de levadura 5%, cloruro de sodio 3% y glicerol 30%) hasta su
uso.
Los tejidos serán macerados a temperatura ambiente con la ayuda de un
homogenizador de pistilo, siendo posteriormente centrifugados por 15 min.
Posteriormente, se tomaran 100 µL del sobrenadante para inocular cajas de Petri con
agar TCBS con NaCl 0.8%. Las cajas Petri inoculadas serán cultivadas a 35ºC durante
24-48 hr, posteriormente serán contabilizadas las colonias que crecieron en el medio y
cuantificadas en Unidades Formadoras de Colonias (UFC).
Las principales colonias detectadas serán cultivadas en agar LB Salino con NaCl
(Triptosa 1%, Extracto de levadura 0.5%, Agar 2%, y NaCl 3%), para su identificación
por medio de bioquímicas y pruebas comerciales API 20 E y 20NE.
Biología molecular
Los camarones silvestres colectados y preservados en etanol al 95% serán
disectados, el hepatopáncreas y los pleopodos serán empleados para la detección de
WSSV, IHHNV, HPV por medio de PCR. El análisis se realizará con la ayuda de una
prueba comercial Multiplex, Primer kit for WSSV, IHHNV y HPV in shrimp conforme al
protocolo de la prueba descrito por los fabricantes.
Extracción del ADN de los tejidos
De los tejidos obtenidos de las muestras se harán macerados de tres camarones
con la ayuda de una navaja de bisturí, depositando el tejido macerado en un tubo
Eppendorf de 1.5 ml para microcentrlifuga. La extracción del ADN viral y bacteriano se
realizará mediante el método de extracción del Kit comercial Wizard® Genomic DNA
Purification System. El protocolo general de esta prueba comercial consiste en agregar
al tejido macerado 600 µL de solución de lisis del núcleo con 17.5 µL de proteinaza K,
esta mezcla será incubada a 55ºC durante toda la noche. Posteriormente, se
adicionaran 3 µL de RNasa y se incubará la mezcla a 37ºC por 15-30 min dejando
enfriar a temperatura ambiente por 5 min. Posteriormente a la mezcla se le añaden 200
µL de solución de precipitación de proteína y se agita todo en un Vortex por 10 min. La
mezcla resultante se enfriara en hielo por 5 min y se centrifugará a 14,000 rpm por 4
min. Finalmente se realizará la precipitación y rehidratación del ADN, para esto se
transferirá el sobrenadante a un tubo fresco con 600 µL de isopropanol a temperatura
ambiente, se mezclará suavemente y se centrifugara a 14,000 rpm por 1 min.
Posteriormente se desechara el sobrenadante y se agregaran 600µL de etanol al 70% a
temperatura ambiente mezclando perfectamente, posteriormente se centrifuga 14,000
rpm por 1 min. Una vez centrifugado se desecha el etanol y la pastilla será secada por
15 min. Finalmente, la pastilla se rehidratara con 100 µL de ADN solución de
rehidratación por una hora a 65ºC o toda la noche a 4ºC Posteriormente la pastilla se
conservara en congelación para su posterior uso.
Amplificación del Material Genético
Todas las amplificaciones se harán en una reacción de 25 µL, la cual contendrá
20.5 µL de agua destilada H2O, 2.5 µL de 10 mM MgCl2, 1 µL de múltiplex primer mix
de WSSV-IHHNV-NHP-HPV y 1 µL de ADN de la muestra. La amplificación se llevará a
cabo en un termociclador. Las muestras serán desnaturalizadas inicialmente en 1 ciclo
a 95ºC por 2 min, posteriormente seguirán 40 ciclos de amplificación que incluirán la
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desnaturalización del ADN a 94ºC por 30 min, seguida por 30 min de alineación a 55ºC
y finalmente una extensión a 72ºC por 90 min Al final de los 40 ciclos, se procederá con
una última extensión de 72ºC por 7 min. Al termino del PCR, los tubos serán
centrifugados brevemente adicionando 5 µL de 6X de buffer y serán recentrifugados.
Posteriormente, se adicionaran de 15-20 µL de PCR del producto amplificado de la
muestra a un gel de agarosa al 1% (1 gr de agarosa por 100 ml de buffer TBE (Tris,
Borato, EDTA, H2O) y se correrá una electroforesis a 100V de 1.5 a 2 hrs.
Posteriormente el gel de agarosa se teñirá en EtBr (Bromuro de Etidio 10mg / ml) por 20
min. Para posteriormente ser observado en un transluminador de rayos UV. Las bandas
positivas serán aquellas que den fragmentos de 255 pb (HPV), 312 pb (NHP), 347 pb
(IHHNV), 401 pb (WSSV) y 506 pb (control interno especifico de camarón). El control
negativo (SPF camarón ADN) debe de tener solamente un fragmento de 506 pb.
La figura 3 nos muestra la laguna de San Andrés en donde se observan las
estaciones de muestreo (5) que se utilizaron para la presente investigación. Las
estaciones comprenden 24 bancos ostrícolas que son utilizados local o comercialmente
(Com. pers. de las sociedades cooperativas). Se tomó en cuenta la distancia y
organización de los bancos ostrícolas para determinar el punto para la toma de
muestra. Se realizaron muestreos semanales desde abril a septiembre del 2000 en
cada una de las estaciones a de determinar el contenido de metales pesados en ostión,
sedimento y agua. Se localizaron las estaciones de muestreo en lancha con ayuda de
las sociedades cooperativas de la región.
Calidad de agua
Las muestras de sedimentos fueron obtenidas con una draga manual de 10 lb y
colocada para su trasporte en frascos de polietileno de 500 ml (250 ml de sedimentos y
250 ml de agua de mar) previamente lavados con ácido nítrico. Por medio de buceo
libre se tomaron las muestras de ostión (10 organismos por estación) de la zona donde
se detecto mayor densidad poblacional, evitando lo mas posible generar algún disturbio
o contaminación. La obtención y conservación del tejido de ostión se realizó conforme
a lo descrito por Moody & Lindstrom (1977), en donde los organismos fueron disectados
y los tejidos se conservaron en frascos de polietileno de 500 ml previamente lavados
con ácido nítrico. Estas muestras se trasportaron en hielera con poca cantidad de hielo
a fin de mantener frescas las muestras. Las muestras de agua fueron obtenidas de las
estaciones de muestreo al sumergir frascos de polietileno (500 ml) previamente lavados
con ácido nítrico. Estas muestras fueron etiquetadas y trasportadas en hielera con poca
cantidad de hielo a fin de mantener frescas las muestras.
ANALISIS DE LAS MUESTRAS
El cadmio y plomo serán determinados a partir de los sedimentos, tejidos de ostión,
y agua por medio de por medio de absorción atómica, bajo la norma NMX-AA-051SCFI-2000, empleando para este fin un espectrofotómetro de absorción atómica Perkin
Elmer 5100 propiedad del laboratorio ambiental Tamaulipas.
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MÉTODO ESTADÍSTICO
Los valores promedios del contenido de metales pesados de cada una de las
estaciones y metales se compararon por medio de análisis de varianza de una vía
(ANOVA) y la prueba de rangos múltiples de Duncan (Broker y Zar 1980) por medio del
software STADISTICA (1995).
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