Download Cultivo embrionario in vitro en la especie porcina (I)

García-Vázquez,
F. A.; Matás, C.
Bovino
Cultivo embrionario in vitro
en la especie porcina (I)
Francisco A. García-Vázquez y Carmen Matás
Departamento de Fisiología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia
E-mail: [email protected], [email protected]. www.um.es/grupo-fisiovet.
kIntroducción
Actualmente la biotecnología reproductiva en las diferentes especies domésticas se encuentra en pleno apogeo, y dichas
tecnologías requieren, en la mayoría de
los casos, de la producción in vitro de
embriones (PIV), en áreas como la transgénesis, recuperación de razas en peligro de
extinción, células madre, en el tratamiento
de la infertilidad humana…es decir que el
progreso de las nuevas biotecnologías en
parte está limitado o depende del desarrollo de la PIV embrionaria.
Vajta et al. (2010) postularon que “…
algunos de los logros conseguidos en
esta década incluyen el uso militar de
bombas de hidrógeno y atómicas, vuelos
espaciales, submarinos nucleares, descifrar
el código genético,…mientras que en la
ciencia biológica la producción de blastocitos en una placa de Petri es todavía un
sueño inalcanzable para la mayoría de los
embriólogos…”.
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La PIV es un proceso que comprende
la obtención y maduración in vitro (MIV)
de los ovocitos, la capacitación in vitro de
los espermatozoides, el cocultivo de ambos
gametos o fecundación in vitro (FIV), y el
cultivo in vitro de los embriones resultantes (CE) hasta alcanzar el estadio de
blastocisto. Aunque se han hecho grandes
progresos en el desarrollo de las técnicas
de MIV, FIV y CE, aún son necesarias nuevas mejoras para maximizar la producción
de embriones.
En este trabajo pretendemos proporcionar una visión general, con especial
hincapié en la especie porcina, del estado
actual del cultivo embrionario in vitro
incluyendo las condiciones (nivel de oxígeno, número de embriones…) y métodos
de cultivo, composición de los medios,
así como la dinámica de cultivo y sus
alternativas. Para ello, en primer lugar,
describiremos la cronología del desarrollo
embrionario temprano hasta estadio de
blastocisto y las condiciones fisiológicas
que se encuentran los embriones a nivel
del oviducto y del útero, así como las
diferencias fisiológicas entre el estadio de
cigoto y blastocisto.
k Cronología y desarrollo
embrionario temprano
La fecundación tiene lugar en el oviducto, en la unión ampular-ístmica. La
primera división se produce de 17 a 19
horas tras la ovulación (Hunter, 1974). Los
embriones se mantienen en el estadio de
2 células únicamente de 6 a 8 horas; sin
embargo el estadio de 4 células se prolonga durante 20-24 horas (Flint, 1981), por
tanto la mayoría de los embriones entran
en el útero en este estadio. El útero va a
ser el compartimento en el que se desarrollarán los embriones porcinos desde el
estadio de 4 células hasta el nacimiento.
Cuando el embrión alcanza entre 8 y 16
células, alrededor del día 4, las blastomeras (células del embrión) comienzan a
formar uniones estrechas adoptando una
forma lobular denominada mórula.
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Tabla I. Diferencias en la fisiología de los embriones de mamíferos desde el etsadio de cigoto al de blastocito (Lane y Gradner, 2007).
Cuando la mórula está formada, las
blastómeras empiezan a separarse en 2
poblaciones distintas: las células internas
y las externas. Las células de la posición
interna desarrollan uniones que por un
lado permiten la comunicación intercelular
y, por otro, van a mantener agrupado a
este conjunto celular. Las células externas
van a desarrollar uniones estrechas, que se
producen para modificar las características
de permeabilidad. Después de que se hayan
formado las uniones estrechas, los fluidos
empiezan a acumularse en el interior del
embrión. Este acúmulo de fluido se debe
a la acción de la bomba de sodio, la cual
introduce iones al interior de la mórula;
al aumentar la concentración de éstos, el
agua difunde hacia el interior y comienza
a formarse la cavidad o blastocele en la
masa de células. Esta etapa, en la que el
embrión aún se encuentra rodeado por la
zona pelúcida (ZP), recibe el nombre de
blastocisto y en él se diferencian según su
posición dos poblaciones de células: una
interna (masa celular interna) que dará origen al embrión propiamente dicho, y otra,
la situada periféricamente, que origina el
trofoectodermo o trofoblasto, que interviene en la ingestión selectiva de nutrientes y
formará posteriormente la placenta (Hafez,
2000). Las células del trofoblasto tienen
permeabilidad selectiva, lo cual favorece el
transporte de agua y sodio que contribuye
a la formación del blastocele (revisado por
García-Roselló 2005); momento a partir del
cual el embrión alcanza el estadio de blastocisto. El estadio de blastocisto se alcanza
en el día 5-6 (Figura 1).
que causan la lisis de la ZP, pero podrían
estar involucrados fenómenos mecánicos,
enzimas embrionarias o factores uterinos.
Tras la eclosión (blastocisto eclosionado),
los blastocistos porcinos permanecen en
la luz del útero hasta el día 13. Entre la
eclosión y la implantación, el desarrollo
embrionario es peor soportado por los
sistemas in vitro que en estadios más
tempranos. Por ejemplo, la elongación y
expansión de los blastocistos eclosionados,
al ser dependiente de factores uterinos, no
tiene lugar in vitro. Por tanto, el desarrollo
embrionario in vitro se da por concluido
tras la eclosión del blastocisto.
kFisiología dinámica en el
embrión pre-implantacional
El embrión pre-implantacional es un
periodo altamente dinámico durante el
cual el embrión en estadio pronuclear se
desarrolla desde una relativa quiescencia
ovocitaria bajo el control genético materno hasta un grupo de células metabólica
y bioquímicamente activas bajo su propio
control genético en el estadio de blastocisto (Lane y Gardner, 2007). Como resultado de estos cambios, existen diferentes
demandas y requerimientos, para el desarrollo y diferenciación embrionarios, el
cual requiere de una precisa regulación de
la homeostasis, metabolismo y expresión
génica. (Tabla 1).
k Diferencias fisiológicas
en el oviducto y útero
Diversos estudios en embriones de
mamíferos han determinado que los cambios morfológicos que ocurren durante
el desarrollo desde cigoto hasta estadio
de blastocisto ocurren concomitantemente junto con cambios en el metabolismo
del embrión. Los nutrientes disponibles
en el tracto reproductivo de la hembra se
encuentran en estrecha relación con el
estadio de desarrollo embrionario (Tabla 2).
Por ejemplo, en el estadio de precompac-
Figura 1. Blastocisto porcino de 6 días cultivado in Vitro, eclosionando.
El blastocisto sigue creciendo hasta
el momento de la eclosión, donde la
zona pelúcida (ZP) desempeña una importante función en la regulación osmótica
(Bronson y McLaren, 1970), la contención de los blastómeros en el embrión
(Modlinski, 1970) y la mejora de la supervivencia del ovocito y el embrión en el oviducto y en el útero (Dumont y Brummett,
1985). La rotura de la ZP en los embriones
porcinos se produce en el día 6-7. No
se conocen con exactitud los factores
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Bovino
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Tabla II. Diferencias fisiológicas entre el oviducto y el útero durante el desarrollo embrionario de los mamíferos (Lane y Gradner, 2007).
tación, es decir cuando el embrión reside
en el oviducto, el fluido se caracteriza por
una alta concentración de piruvato y de
lactato, y una relativa baja concentración
de glucosa. Por el contrario, el fluido uterino está caracterizado por unos relativamente bajos niveles de piruvato y lactato,
y una alta concentración de glucosa.
Pero el mantenimiento de bajos niveles de oxígeno en un incubador grande
es costoso ya que hay que usar grandes
niveles de N2 que desplacen el oxígeno.
Por ello, se han diseñado alternativas
como el uso de mini-incubadores (Karja
et al. 2004), que también han sido exitosamente usados en FIV y en clonación.
el desarrollo a blastocisto, así como el
número de células de los blastocistos en
varias especies (murina, humana, bovina
y ovina) (revisado por Martínez, 2002).
Según Stokes et al. (2005), los embriones porcinos deben cultivarse en grupos
10-20 embriones/20 μl de medio. Otros
autores en cambio han obtenido bue-
Figura 2. Componentes de un sistema de cultivo embrionario.
kCultivo embrionario
in vitro
Como hemos mencionado anteriormente el CE in vitro comprende la fase
desde que tiene lugar la fecundación
hasta el estadio de blastocisto. Para realizar este cultivo existen diferentes alternativas tanto en el sistema de cultivo
utilizado (mezcla de gases, aceite mineral,
número de embriones…), o en la composición del medio, así como la dinámica
de cultivo (sistema estático o dinámico,
tranquilidad o estrés, simple o secuencial…) (Figura 2). A continuación vamos
a desglosar cada uno de estos apartados.
Co-cultivo
tejidos/suplementos
Sistema cultivo
Gases
Medio cultivo
Aceite
- Agua
- Iones
- Carbohidratos
- Aminoácidos
- Vitaminas
- Quelantes
- Antioxidantes
- Antibioticos
- Proteínas/macromoléculas
- Hormonas/factores crecimiento
- Buffer
Sistema de cultivo embrionario
Sistema Cultivo
(WOW; tubos...)
Números embriones y
volumen medio
Tranquilidad-estrés
Tal y como hemos descrito en el
apartado anterior las condiciones de cultivo in vitro difieren de las situaciones in
vivo en muchos aspectos, y uno de estos
pasos críticos es la tensión de oxígeno
(Karja et al. 2004). Está claro que la concentración de oxígeno en el oviducto y en
el útero es más baja que en la atmósfera.
El nivel de oxígeno utilizado en cultivo
normalmente ha sido del 20%, pero es
conocido que estos niveles de oxígeno
son perjudiciales en el cultivo embrionario in vitro debido probablemente a la
formación de radicales libres de oxígeno
que puede dar lugar a la necrosis o apoptosis celular. Macháty et al. (2001) han
observado un incremento en el desarrollo
a blastocisto y en el número de células
al cultivar mórulas MIV/FIV bajo tensión
reducida (5%) de O2.
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Renovación medio
Dinámica cultivo
Otro aspecto a tener en cuenta en el
CE in vitro es el número de embriones
y el volumen de medio de cultivo. Los
embriones en el útero se encuentran entre
los pliegues del mismo rodeado por un
pequeño volumen de medio. En el útero
se han observado cantidades únicamente
de 1.5-2.0 nl rodeando al embrión (y en
el oviducto probablemente cantidades
de picolitros). Teniendo en cuenta este
hecho, se han publicado diversos trabajos
donde el cultivo de embriones se realizó
en volúmenes reducidos de medio y/o en
grupos incrementando significativamente
Simple secuencial
nos resultados utilizando 40-50 embriones/500 μl de medio (Matás et al. 2003).
No obstante, lo que si parece estar claro
es que bajo las condiciones actuales, si
lo embriones se cultivan individualmente
sufren un arresto y no avanzan a estadio
blastocisto.
Según han descrito diversos autores
el efecto beneficioso del cultivo en grupo
y/o en pequeño volumen de medio es la
producción de factores autocrinos y/o
paracrinos por parte del embrión en cultivo (Paria y Dey, 1990; O’Neill, 1998), esti-
Cultivo embrionario in vitro en la especie porcina (I)
mulando su propio desarrollo y el de los
embriones vecinos. Según esto, el cultivo
en volúmenes grandes daría lugar a la
dilución de los factores beneficiosos producidos por el embrión, de tal modo que
la concentración presente en el medio de
cultivo no sería suficiente para ejercer
dicho efecto (Gardner, 1994).
El desarrollo embrionario también se
encuentra influenciado por la distancia a
la cual se encuentren los embriones entre
si al ser cultivados. Recientemente, Stokes
et al. (2005) publicaron un estudio donde
cultivaban los embriones porcinos con
una distancia determinada entre ellos. En
este estudio los embriones no se movían
ya que la placa de petri estaba cubierta
con extractos de proteína polifenólicas.
Concluyeron que la distancia óptima de
cultivo entre embriones se encontraba
entre 60 y 180 μm. En los embriones cultivados en distancias más cortas
posiblemente dichos efectos beneficiosos
se neutralicen debido a concentraciones
altas y localizadas de metabolitos tóxicos
como el amonio. Y con distancias superiores a 180 μm los factores beneficiosos
quedan diluidos.
• La higiene en el laboratorio es también
importante en la producción embrionaria (Schiewe, 1998). La producción
de embriones in vitro debe tener lugar
en un ambiente limpio. Comer y beber
está totalmente prohibido, las manos
deben lavarse periódicamente con
agua y jabón, y enjuagarse con alcohol
(por ejemplo, etanol), pero teniendo
en cuenta que los vapores del alcohol
pueden perjudicar el desarrollo embrionario.
Métodos de cultivo embrionario
Históricamente el cultivo embrionario se ha realizado en placas de cultivo (de
4 pocillos, placas de 20 mm de diámetro…),
en diferentes condiciones de volumen de
medio y densidad embrionaria, como ya
hemos mencionado anteriormente. Pero
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lizando volúmenes de 400 μl de medio.
Beneficios similares también han sido
demostrados en otras especies como la
especie porcina, humana y murina (Taka
et al. 2005; Vajta et al. 2008).
• Tubos
Recientemente, Roh et al. (2008), cultivaron embriones de ratón en microtubos
normalmente usados en PCR. Como ya
hemos descrito anteriormente, el aceite
que se usa en cultivos embrionarios
puede ser perjudicial, con este sistema se pretende reducir o eliminar por
completo el contacto entre el aceite y
el medio de cultivo. Además, otra de
las ventajas de usar estos microtubos
es que los embriones van a estar unos
más cerca de otros que en una placa o
microgota; y aunque según otros estudios, tienen que tener cierta separación
Además de lo descrito anteriormente
debemos tener en cuenta otros factores
que pueden influir en el desarrollo embrionario in vitro. A continuación detallamos
algunos de ellos:
• La mayoría de las placas de cultivo que
se utilizan son esterilizadas mediante
óxido de etileno, compuesto que puede
tener un efecto adverso en el desarrollo embrionario (Schiewe et al. 1985;
Holyoak et al. 1996). Sin embargo, añadiendo quelantes al medio de cultivo,
como el EDTA, se pueden reducir estos
efectos adversos.
• Benzotiazoles tóxicos procedentes del
émbolo de jeringuillas (utilizadas para
el filtrado y esterilización del medio)
también podría influir negativamente
en el desarrollo embrionario (Vanroose
et al. 2001).
• También debemos tener en cuenta que
los embriones desarrollados in vivo no
están en ningún momento expuestos
a la luz ultravioleta o luz visible, pero si
en condiciones in vitro, por lo que en la
medida de los posible deberíamos reducir dicha exposición, para evitar efectos
adversos sobre los embriones.
• El aceite mineral se usa para evitar que el
medio se evapore, ya que si esto ocurre
cambia la osmolaridad del medio con el
consiguiente perjuicio en el desarrollo
embrionario. También evita cambios de
temperatura y pH cuando se están
manipulando. Sin embargo, diversos
factores lipofílicos pueden pasar al
medio y ser tóxicos para el embrión.
desde el punto de vista fisiológico estos
sistemas no son ideales, ya que en condiciones in vivo, los embriones se encuentran
rodeados de un volumen muy pequeño de
medio. Por esta razón, se están desarrollando nuevos métodos de cultivo intentando
mimetizar, en la medida de lo posible, las
condiciones in vivo para optimizar el desarrollo embrionario. A continuación vamos a
describir algunos de ellos.
• Micropocillos
En el año 2000 Vajta et al. desarrollaron un
novedoso y sencillo sistema de desarrollo embrionario in vitro basado en el
cultivo de los embriones en micropocillos, reduciendo de esta manera el volumen de medio que rodea a los embriones, debido a la importancia que tiene
como ya hemos mencionado anteriormente. Este trabajo fue realizado en la
especie bovina obteniendo resultados
de más de un 60% de desarrollo hasta
estadio de blastocisto en comparación
con los sistemas tradicionales de cultivo
embrionario en placas de 4 pocillos uti-
entre embriones, puede ser que en los
tubos la eliminación de los productos
tóxicos sea más rápida y haya un mejor
aprovechamiento de los nutrientes y de
los factores auto- y para-crinos (Roh et
al. 2008). Otro factor a tener en cuenta
en este estudio es la diferencia de
toxicidad entre los dos tipos de plástico
utilizados en la placa (poliestireno) y
en el tubo (polipropileno), pudiendo
influir en el CE. Los resultados obtenidos demostraron un mayor desarrollo
en blastocistos comparados con el cultivo en microgotas (Roh et al. 2008).
En la especie porcina todavía no se ha
realizado ningún estudio utilizando este
sistema de microtubos.
• Capilares de vidrio
Otro sistema de cultivo que se está implementando es el uso microcapilares. Ya
en 1965 Mulnard describió el cultivo de
embriones de ratón en un microcapilar
con un diámetro interno de 1-2 mm,
que fue cultivado horizontalmente en
placas de petri cubiertas de aceite. Este
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Bovino
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sistema se quedó en el olvido hasta el
año 2003, donde Thouas et al. cultivaron
embriones de ratón en microcapilares de
vidrio (también denominados oviductos
de vidrio), cultivados verticalmente en
imitara, en la medida de lo posible, las
condiciones ambientales a las que está
sometido el embrión in vivo. De esta manera vamos a promover una actividad metabólica normal y un desarrollo máximo del
de ósmosis reversa. En estos equipos, el
grado de pureza del agua puede ser controlado mediante la determinación de su
resistencia al paso de la corriente eléctrica
(cuanto mayor sea ésta, mayor será su
Figura 3. Esquema de los movimientos del embrión in vivo en el aparato reproductor femenino y sistema de microcanales in vitro del
cultivo embrionario (Kim et al. 2009).
IN VIVO
Aceite mineral
Embrión
Entrada
Reserva aceite
Área constricción
Lámina cristal
Medio
Dirección
movimiento embrión
1 μl de medio, obteniendo blastocistos
con un mayor número de células en
comparación con el cultivo en microgotas. Hasta el momento este sistema
no ha sido desarrollado en la especie
porcina, aunque podría proporcionar
una buena herramienta y alternativa a
los métodos tradicionales.
• Microfluidos y microcanales
Otra alternativa para el desarrollo embrionario es el uso de microfluidos en
microcanales donde se sitúan los
embriones. El éxito inicial del uso de
microcanales en el cultivo embrionario
en ratones (Raty et al. 2001) ha dado
lugar al cultivo de embriones de otras
especies incluida el cerdo. Walters et al.
(2003) cultivaron embriones de 4 células hasta el estadio de blastocisto en
microcanales dando lugar finalmente a
la producción de lechones vivos. Kim et
al. (2009), desarrollaron un novedoso
sistema de microfluidos basado en la
estimulación mecánica derivada de la
peristalsis. Para investigar los efectos de la estimulación mecánica en el
desarrollo embrionario en canales de
microfluidos, los embriones de bovino
fueron cultivados en canales rectos en
comparación con canales con aéreas
de estrechez. Además se acopló un
maquina agitadora para crear un flujo
por gravedad. Este trabajo representa
un intento de mimetizar la constricción
peristáltica que ocurre in vivo en el
útero (Figura 3).
Composición medios CE
El diseño del medio de cultivo óptimo debería ser, en principio, aquél que
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embrión in vitro. En términos generales,
un medio de cultivo embrionario debe de
estar compuesto por agua, sales inorgánicas, compuestos energéticos, proteínas,
aminoácidos, quelantes, hormonas del crecimiento o vitaminas, antibióticos, etc. Una
vez preparados, los medios de cultivo se
esterilizan por filtración, haciéndolos pasar
a través de una membrana con un diámetro de poro de 0’22 μm. Debemos de tener
en cuenta que algunos de los componentes
se pueden degradar espontáneamente por
lo que se adicionan inmediatamente antes
de su utilización.
En cualquier medio de cultivo hay que
tener presente la osmolaridad que necesitan las células a cultivar y el mantenimiento del pH. En cuanto a la osmolaridad, se
ha determinado que los valores observados
en las secreciones uterinas oscilan entre
los 280 ± 20 mOsm/Kg. Sin embargo, existen evidencias que indican que valores de
alrededor de 245 mOsm/Kg favorecen el
desarrollo embrionario (Duque y col 2003).
En lo referente al pH, la mayoría de los
embriones de mamíferos cultivados in vitro
se desarrollan en pH neutro o ligeramente
alcalino, encontrándose los mejores resultados entre 7,2 y 7,6.
• Agua:
El componente que participa en
mayor proporción en la formulación de
cualquier medio de cultivo es el agua, por
ello su grado de pureza está fuertemente
relacionado con el desarrollo embrionario
(Marquant-Leguienne y Humblot 1998).
El agua que se utiliza para la elaboración
de los medios de cultivo debe ser ultrapura y libre de pirógenos. Los sistemas de
purificación del agua utilizan el principio
Embriones
pureza). La mayor resistencia ofrecida es
18,3 megaohms-cm a 25°C.
• Sales inorgánicas:
Normalmente la composición de
sales inorgánicas de un medio de cultivo
pretende imitar los componentes analizados in vivo. Se ha determinado que el fluido oviductal bovino y ovino se caracteriza
por tener por bajos niveles de Na+ y altos
niveles de K+ si se comparan con los niveles plasmáticos, por ello, estos dos elementos son cuidadosamente balanceados
al formular los medios de cultivo. Entre
otros elementos inorgánicos importantes
en la composición de los medios encontramos: magnesio, calcio, bicarbonato,
sulfatos y fosfatos. Son muchas las funciones de estas sales, a modo de ejemplo
podemos citar el papel del cloruro sódico
que participa en la regulación osmótica o
el calcio y el potasio que son esenciales
para un desarrollo embrionario adecuado
(Palasz, 1996). No obstante, en cualquier
medio de cultivo embrionario hay dos elementos constantes: una fuente energética
y una fuente proteica.
• Fuente energética:
La glucosa es el principal substrato
energético que consumen las células; sin
embargo para embriones de porcino parece ser perjudicial en los primeros estadios
de desarrollo preimplantacional (Bavister,
1995). Durante esta etapa del desarrollo
se presenta una falta de utilización de
glucosa debido a la falta de actividad de la
enzima fosfofructoquinasa cuya función
es acelerar la glucólisis catalizando la formación de fructosa 1-6 bifosfato a partir
de fructosa 6 fosfato, lo que se encuentra
Cultivo embrionario in vitro en la especie porcina (I)
controlada alostéricamente por el cociente
ATP-ADP, siendo particularmente alto en
este período (Gardner, 1998). Además, la
presencia de glucosa puede inhibir la fosforilación oxidativa cuando en este estadio
los embriones dependen de esta vía para
generar energía (Thompson, 2000). El piruvato y el lactato son las principales fuentes
de energía en el embrión temprano durante
el desarrollo in vitro (Pinyopummintr y
Bavister, 1996). Sin embargo, tras la compactación (estadio 8-16 células) el embrión
utiliza la glucosa como fuente energética y
es metabolizada principalmente a lactato
(Sinclair et al. 2003). La explicación a este
hecho se basa en que en el embrión en este
estadio y en respuesta a una alta demanda
de energía necesaria para la compactación
y la formación y expansión del blastocele (Gardner, 1998), el cociente ATP-ADP
podría disminuir, y con ello, la inhibición
ejercida sobre la enzima mencionada, con
lo cual aumentaría el consumo de glucosa.
Este metabolito también participa en la
síntesis de precursores de ácidos nucleicos
y de lípidos (Gardner y Lane, 1998) y su
disponibilidad sería importante durante la
eclosión fuera de la zona pelúcida (Menezo
y Khatchadourian, 1990). Por esta razón,
aunque se ha logrado cultivar embriones
hasta el estado de blastocisto en medios
sin glucosa, éstos son de menor calidad y
viabilidad cuando se comparan con los cultivados en medios con glucosa. Por tanto
la propuesta de Kikuchi (2004) en cuanto
a la utilización de un cultivo secuencial,
piruvato y lactato como sustratos energéticos durante las primeras 72 h de cultivo y
glucosa a partir de ese momento, sería una
opción de mejora.
Con respecto a los lípidos, poco se
sabe acerca de la importancia que tendrían en la producción de energía durante el desarrollo embrionario temprano
(Thompson, 2000), aunque podría tener
cierto papel en relación al grado de fluidez
de la membrana plasmática (Imai et al.
1997; Hochi et al. 1999).
• Fuente proteica:
Aminoácidos
Se ha determinado que tanto el fluido
oviductal como el uterino contienen altos
niveles de aminoácidos libres. Por otro
lado, los ovocitos y embriones poseen
transportes específicos de aminoácidos
para mantener un pool endógeno. Hasta
el estadio de 8 células, aquellos aminoácidos presentes en niveles altos en el fluido
oviductal (aminoácidos no esenciales y
glutamina) incrementan la división celular y viabilidad. Tras la compactación, los
aminoácidos no esenciales y la glutamina
favorecen la formación del blastocele y
los aminoácidos esenciales son requeridos para el desarrollo y viabilidad de la
masa celular interna. Estudios sobre cultivo de embriones han demostrado que la
inclusión de aminoácidos en el medio de
cultivo aumenta el desarrollo embrionario
y aumenta la viabilidad del blastocisto.
Además, estos elementos son utilizados
como fuente de energía, como buffer intracelular (Edwars et al. 1998) y para la síntesis de proteínas. Su incorporación a las
células se ve facilitada por transportadores
de membrana específicos los cuales están
regulados en función del grado de desarrollo o en respuesta a señales externas (Van
Winkle, 2001). Otras funciones propuestas
son reguladores de presión osmótica, de
pH, precursores biosintéticos, antioxidantes, quelantes… (Gardner, 2008).
Macromoléculas
Varios son los sustratos que se han
utilizado como fuente de proteínas en los
medios de cultivo embrionario entre los
que destacan el suero fetal bovino (SFB) y
la albúmina sérica bovina (BSA) (Wang et
al. 1997).
El suero constituye la fracción líquida
resultante del proceso de coagulación sanguínea y su composición presenta pequeñas variaciones dependiendo del animal.
Una molécula que siempre encontramos
en el suero es la albúmina. Esta proteína
tiene carácter ácido, es soluble en agua y
tiene un peso molecular aproximado de
69.000 kDa. La albúmina además de ser
uno de los componentes más importantes
del suero sanguíneo también es la proteína más abundante en el fluido oviductal
(Leese, 1988).
Algunos de los efectos benéficos que
justifican la utilización del suero y la albúmina son (revisado por Mucci et al. 2006):
i Proteger a los embriones en cultivo de
sustancias tóxicas (ej. metales pesados).
i Aportar factores de crecimiento y ciertas
hormonas.
i Reducir la tensión superficial del medio
(lo que evita que los embriones se
adhieran al instrumental como placas
de cultivo, pipetas, tubos, etc.).
Tanto el suero como la BSA tienen un
papel similar como suplemento proteico.
Sin embargo, la posible presencia de elementos no identificados formando parte
de su composición determinan que algunos
aspectos de su función aún no sean completamente conocidos (Mucci et al. 2006).
En los últimos años, el suero ha sido objeto
de numerosos estudios para determinar
si su adición es definitivamente necesaria
para mejorar los resultados de producción
in vitro, en función de la cantidad y calidad
de los embriones obtenidos. Los resultados de estos trabajos son muy variables e
incluso contradictorios y el motivo podría
encontrarse en la diferente composición
del suero, ya que éste depende del estado
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nº 13
fisiológico en que se encuentre el animal
del cual proceda (Palasz, 1996). Por otro
lado, también habría que determinar en
que momento del cultivo embrionario se
debería suplementar el medio. Se ha determinado que la adición de suero inhibe los
primeros estadios de desarrollo aunque
estimula el desarrollo de mórulas y blastocistos (Pinyopummintr y Bavister, 1994;
Thompson et al. 1998), acelera el desarrollo
embrionario (Gómez y Diez, 2000; Holm et
al. 2002) incrementa el número de células
embrionarias (Fouladi-Nashta et al. 2005)
y favorece la eclosión (Wang et al. 1997;
Gómez y Diez, 2000).
Con el fin de evitar la variabilidad
debida a la diferente composición de
estas dos sustancias, suero y BSA, se ha
estudiado el uso de polímeros sintéticos
como sustitutos de ellas en la producción
de embriones in vitro. Entre los polímeros
más estudiados se encuentra el alcohol
polivinílico y la polivinilpirrolidona (Ectors
et al. 1992; Gardner y Lane, 1998). Estos
compuestos han demostrado proveer una
buena actividad surfactante y previenen la
adhesión entre gametos o con las superficies de contacto. No obstante, algunos
autores han encontrado una menor tasa
de producción de embriones así como
diferencias metabólicas importantes entre
embriones cultivados con o sin estos
componentes (Thompson, 2000; Orsi y
Leese, 2004).
• Otros componentes:
Otros componentes que se utilizan
para suplementar el medio de cultivo son
factores de crecimiento y hormonas como
la insulina que ayudan al transporte de
glucosa al blastocisto (Gardner y Kaye,
1991), o agentes quelantes como el EDTA
que mejora el desarrollo en los primeros
estadios del embrión (revisado por Lane y
Gardner, 2007).
En porcino se han utilizado gran
cantidad de medios de cultivo para el
desarrollo embrionario in vitro desde el
estadio de cigoto hasta el de blastocisto.
Entre ellos destacan el medio Whitten
(Beckmann y Day, 1993), NCSU 23 (Petters
y Wells, 1993), Bavister (Polard et al.
1995), BECM-3 (Dobrinsky et al. 1996) o
PZM 5 (Yoshioka et al. 2008). De todos
ellos, tal vez el más utilizado por los
buenos resultados obtenidos, ha sido el
NCSU 23. Yoshioka et al., (2002) realizó
un estudio sobre medios basado en la
composición del fluido oviductal porcino
en el que no suplementaba con glucosa
y lo comparó con el NCSU23. Aunque
los resultados obtenidos fueron similares en cuanto a calidad embrionaria, lo
novedoso de este medio fue que estaba
químicamente definido, lo cual permite
la reproducibilidad de las experiencias al
eliminar los preparados proteicos de los
protocolos.
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