Download EFECTO DE LAS CITOCINAS IL-1 , IL-6 Y TNF

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
EFECTO DE LAS CITOCINAS IL-1, IL-6 Y TNF-α SOBRE EL
DESARROLLO EMBRIONARIO MURINO Y LA PRODUCCIÓN DE
ROS IN VITRO.
Trabajo de Grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por
Vanesa Sofía Zambrano Hernández
Como requisito parcial para optar al grado de
Magíster en Ciencias Biológicas
Realizado con la tutoría de la profesora María Isabel Camejo Bermúdez
Febrero, 2009
ii
iii
AGRADECIMIENTOS
La realización de este trabajo de grado, fue lograda gracias al apoyo de las personas e
instituciones nombradas a continuación.
A mis padres, pilares fundamentales en mi vida, cuyo apoyo incondicional permitió el
desarrollo y culminación de mis estudios de postgrado.
A mi esposo, Ángel, por su compañía, ayuda y apoyo en todo momento.
A la Dra. María Isabel Camejo, profesora del departamento de Biología de Organismos de
la Universidad Simón Bolívar, Tutora y amiga; tu confianza y apoyo hizo posible este
logro.
Al Dr. Freddy Sifontes, Jefe de la División de Servicios Técnicos Auxiliares del Instituto
Nacional de Higiene ¨Rafael Rangel¨, quien fue fundamental en la fase experimental de la
tesis.
Al Bioterio del Instituto Nacional de Higiene ¨Rafael Rangel¨ y a todo su personal,
principalmente al Dr. Moya, el Dr. Albornoz y a la Dra. Carmen González, quienes
colaboraron enormemente proporcionando los ratones para la ejecución de los
experimentos.
Al Fonacit, por la beca concedida durante el desarrollo de esta tesis.
iv
RESUMEN
El proceso de transporte de los gametos, la fecundación y el desarrollo embrionario
temprano se llevan a cabo en el oviducto. Procesos como la endometriosis, las infecciones y
el hidrosalpinx pueden perjudicar el desarrollo embrionario pre-implantación. El fluido
peritoneal y tubárico de las mujeres con procesos inflamatorios presentan concentraciones
elevadas de IL-1β, IL-6 y TNF-α. Adicionalmente, informes recientes indican que ciertas
citocinas inducen producción de ROS en diversas células. El objetivo de este trabajo fue
evaluar el efecto de citocinas pro-inflamatorias en diferentes concentraciones, de
fisiológicas hasta las observadas durante procesos de inflamación del tracto reproductor
femenino, sobre el desarrollo embrionario temprano murino, la producción de especies
reactivas de oxígeno (ROS) y apoptosis. Embriones de ratón de dos a cuatro células fueron
recolectados por lavado del oviducto y cultivados por 96 horas en condiciones control y a
diferentes concentraciones de IL-1 (1, 10, 100 pg/ml), IL-6 (50, 500, 1000 pg/ml) y TNF (10, 100, 1000 pg/ml) simulando condiciones fisiológicas y patológicas. En todas las
condiciones se evaluó el desarrollo embrionario, la producción intracelular de H2O2
(DCHFDA) y O2- (NBT), liberación de nitritos (reacción Griess) en el medio de cultivo y el
daño al ADN (TUNEL). Se observó que las citocinas estudiadas afectan adversamente el
desarrollo embrionario e inducen la producción intracelular de H2O2. La IL-1β, y TNF-α
estimulan la producción de O2- solo en las concentraciones de 1 y 10 pg/mL
respectivamente, mientras que IL-6 en todas las concentraciones patológicas. Solo TNF-α
induce la producción de oxido nítrico en embriones de ratón en cultivo. La IL-1β, IL-6 y
TNF- en concentraciones patológicas inducen la apoptosis en el embrión murino. Estos
resultados indican que las citocinas en el tracto reproductor femenino en concentraciones
elevadas eventualmente pueden provocar un incremento en los ROS que puede afectar el
desarrollo embrionario y provocar la muerte celular.
Palabras claves: embrión, ROS, citocinas, desarrollo embrionario, apoptosis.
v
ÍNDICE GENERAL
AGRADECIMIENTOS
Pág.
iii
RESUMEN
iv
ÍNDICE GENERAL
v
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS
vi
I- INTRODUCCIÓN
II- INFERTILIDAD HUMANA
1
4
III- PROCESOS INFLAMATORIOS DEL TRACTO REPRODUCTOR
FEMENINO
6
IV- DESARROLLO EMBRIONARIO PRE-IMPLANTACIÓN
8
4.1-Generalidades
4.2-Control génico durante el desarrollo embrionario
4.3-Desarrollo embrionario in vitro
4.4-Metabolismo embrionario
8
12
13
15
V- ESTRÉS OXIDATIVO
VI- ESTRÉS OXIDATIVO Y SU EFECTO SOBRE EL EMBRIÓN
VII- OBJETIVOS
VIII- MATERIALES Y MÉTODOS
IX- RESULTADOS
X- DISCUSIÓN
XI- CONCLUSIONES
XII- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
18
23
26
27
38
52
66
67
vi
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS
Figura 1
Trayectoria de los gametos en la trompa de Falopio
Pág
8
Figura 2
Desarrollo embrionario pre-implantación
10
Figura 3
Generación de ROS en las células. Principales fuentes de ROS y
metabolismo.
19
Tabla 1
Concentraciones de las citocinas: IL-1β, IL-6 y TNF-α en
condiciones fisiológicas y patológicas tanto en fluido peritoneal (FP)
como en fluido hidrosalpingeal (FH) reportadas en la literatura.
30
Tabla 2
Concentraciones de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α empleadas en
las diferentes condiciones experimentales de esta investigación.
31
Figura 4
Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio óptico
luego de evaluar el desarrollo embrionario murino alcanzado al 4to
día de cultivo en presencia de IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL y IL-6 (50,
500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia
de las mismas (grupo control).
40
Tabla 3
Porcentaje de blastocistos obtenido, índice de blastulación, arresto y
retraso en el desarrollo y defectos morfológicos en embriones
murino cultivados en presencia de IL-1 β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6
(50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en
ausencia de las mismas (grupo control).
41
Figura 5
Porcentaje de embriones que alcanzaron el estadio de blastocisto al
ser cultivados en presencia de IL-1 β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50,
500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia
de las mismas (grupo control).
42
Figura 6
Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio de
fluorescencia luego de realizar la prueba para determinar la
producción intracelular de H2O2 (DCHFDA) durante el desarrollo
embrionario murino en presencia de IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6
(50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en
ausencia de las mismas (grupo control).
43
Tabla 4
Semi-cuantificación de la producción intracelular de H2O2
(DCHFDA) durante el desarrollo embrionario murino en embriones
incubados en presencia de IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500
y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia de las
44
vii
mismas (grupo control).
Figura 7
Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio
óptico luego de realizar la prueba para determinar la producción
intracelular O2- (NBT) durante el desarrollo embrionario murino en
presencia de IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000)
pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia de las mismas
(grupo control).
46
Tabla 5
Semi-cuantificación de la producción intracelular de O2- (NBT)
durante el desarrollo embrionario murino en embriones incubados
en presencia de IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000)
pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia de las mismas
(grupo control).
47
Tabla 6
Efecto de la IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000)
pg/mL y TNF-α (10, 100 y 1000) pg/mL sobre la producción y
liberación de óxido nítrico al medio de cultivo por embriones de
ratón.
48
Figura 8
Concentraciones promedio de óxido nítrico liberadas al medio de
cultivo por embriones de ratón cultivados en presencia de IL-1β (1,
10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y
1000) pg/mL y en ausencia de las mismas (grupo control).
49
Figura 9
Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio de
fluorescencia luego de realizar la técnica para evaluar apoptosis
(TUNEL) durante el desarrollo embrionario murino en presencia de
IL-1β (1, 10 y 100) pg/mL, IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α
(10, 100 y 1000) pg/mL y en ausencia de las mismas (grupo
control).
50
I- INTRODUCCIÓN
La infertilidad se define como la carencia de concepción luego de un año de relaciones
sexuales no protegidas y afecta aproximadamente de un 10 a 15% de las parejas (Remohi,
2005). Se estima que la mujer contribuye a la infertilidad de la pareja en un 55% y el factor
masculino con un 45%, mientras que aproximadamente un tercio de las parejas tienen una
causa mixta (Agarwal, 2005).
Entre las causas femeninas asociadas a infertilidad
se pueden mencionar: el factor
ovulatorio (30 a 35%), el factor tubárico (30 a 35%), causas inexplicadas (20 a 30%) y el
resto está representado por factores inmunológicos, cervicales, entre otros (Chukwuemeka
y col, 2002).
Es conocido que los procesos inflamatorios del tracto reproductor femenino pueden
comprometer la fertilidad de la mujer causando infertilidad tubo-peritoneal y que son
capaces de originar en el tracto reproductor femenino una respuesta inmunológica que
conlleva a la secreción de citocinas pro-inflamatorias y agentes quimiotácticos para
conducir a la inflamación como mecanismo de defensa del organismo (Dube y col, 2001).
Se ha demostrado que tanto el fluido peritoneal de mujeres con endometriosis (Taketani y
col, 1992) como el fluido de hidrosalpinx (Singh y col, 2000; Carrasca y col, 2000) tienen
un efecto embriotóxico en embriones de ratón en cultivos in vitro (Strandell y col, 1998),
sin embargo, hasta la fecha no se conoce con exactitud cual factor presente en estas
secreciones es el responsable de esta toxicidad sobre el desarrollo embrionario preimplantación.
2
Los ambientes del fluido peritoneal y del oviducto son muy importantes ya que es allí
donde ocurre la interacción entre los gametos, la formación del cigoto y el clivaje del
embrión hasta llegar a blastocisto (Agarwal, 2003).
Se ha propuesto que cualquier anormalidad en la composición química de estos fluidos o el
desequilibrio en sus componentes podría tener un efecto perjudicial sobre el desarrollo del
embrión pre-implantación, en el proceso de implantación, o ambos, conduciendo al fracaso
reproductivo (Agarwal, 2005). Se ha observado que en fluidos provenientes de mujeres con
procesos patológicos puede haber variaciones en las concentraciones de electrolitos,
proteínas, factores de crecimiento y algunas citocinas como IL-1 (Bedaiwy y col, 2005),
TNF- (Bedaiwy y col, 2005; Barmat y col, 1999; Bedaiwy y col, 2001), IL-8 (Bedaiwy y
col, 2001) y IL-6 (Brawn y col, 1996; Koga y col, 2005) encontrándose un incremento de
citocinas pro-inflamatorias.
Adicionalmente, se ha propuesto que el estrés oxidativo podría estar involucrado en la
embriotoxicidad de estos fluidos. El estrés oxidativo se origina por el desequilibrio entre la
formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y los mecanismos antioxidantes propios
del organismo, donde se genera un aumento de ROS (Agarwal y col, 2003).
Las especies reactivas de oxígeno a concentraciones bajas, son fundamentales en algunos
eventos del proceso reproductivo (Taylor y col, 2001; Miesel y col, 1993; Salas-Vidal y
col, 1998); sin embargo, cuando ocurre un desequilibrio, los niveles aumentados de ROS
pueden perjudicar este proceso.
Es conocido que los ROS en exceso tienen un efecto citotóxico, originando peroxidación de
los fosfolípidos de membrana (lo que causa un aumento en la permeabilidad de membrana
y pérdida de su integridad), inactivación enzimática, daño estructural de ADN y muerte
celular (Guerin y col, 2001; Agarwal y col, 2003; Wells y col, 2005).
Las especies reactivas de oxígeno tienen la capacidad de regular la actividad de las
proteínas y la expresión de genes (Van Langendonckt y col, 2002). En particular participan
3
en la trascripción de los factores NF-kB y AP-1, los cuales controlan los genes
involucrados en la respuesta inmunológica, defensa celular y expresión de citocinas y
moléculas de adhesión celular. La activación de NF-kB involucra la liberación de su
subunidad IkB, la cual es inducida por citocinas como IL-1 y TNF-α (Van Langendonckt y
col, 2002).
Adicionalmente, estudios in vitro han aportado datos concernientes a la capacidad de
ciertas citocinas para inducir la producción de ROS en diversas células (Volk y col, 2000;
Ben-Shlomo y col, 1994; Sugino y col, 2002).
En resumen durante diferentes patologías como la endometriosis, el hidrosalpinx y las
infecciones, el fluido tubárico, puede variar en composición, incrementando la
concentración de citocinas pro-inflamatorias y posiblemente los ROS, pudiendo perjudicar
los procesos de fecundación y el desarrollo embrionario temprano.
Sin embargo, la forma como este fluido tubárico presente durante estos procesos
inflamatorios e infecciones ejerce un efecto deletéreo sobre el embrión y la implantación es
desconocida.
En el presente trabajo de investigación se cultivaron embriones de ratón en estadio de preimplantación en condiciones que asemejen un ambiente inflamatorio, caracterizado por la
presencia de niveles elevados de IL-1, IL-6 y TNF- en el medio de cultivo, para evaluar
el efecto de estas citocinas sobre el desarrollo embrionario y su posible efecto
embriotóxico, la producción de ROS y potencial daño al ADN.
4
II-INFERTILIDAD HUMANA
La infertilidad es un problema que afecta a una de cada seis parejas. La infertilidad puede
ser definida como la carencia de concepción luego de un año de relaciones sexuales no
protegidas y afecta aproximadamente de un 10 a 15% de las parejas (Remohi, 2005). Se
estima que la mujer contribuye a la infertilidad de la pareja en un 55% y el factor masculino
con un 45%, mientras que aproximadamente un tercio de las parejas tienen una causa mixta
(Agarwal, 2005).
Entre los factores asociados a la infertilidad se pueden mencionar: el factor ovulatorio
(presente en alrededor del 20% de las parejas), el factor útero-tubario-peritoneal
(aproximadamente en 30% de las parejas), el factor de migración de semen (10% de las
parejas), el factor masculino (30% de las parejas) y el resto está representado por causas
inexplicables (Chukwuemeka y col, 2002).
En cuanto al factor ovulatorio, involucra el desarrollo, la maduración y la ruptura adecuada
del folículo; el factor útero-tubario-peritoneal incluye el estudio de la integridad tubárica, la
cavidad uterina y la presencia de adherencias pélvicas que comprometan la anatomía del
aparato genital femenino.
El factor de migración espermática incluye el estudio de la relación entre el mucus cervical
y los espermatozoides. Las alteraciones en esta interacción provocan la reducción en el
número y la motilidad de los espermatozoides y su desplazamiento dentro del mucus
cervical, perjudicando la llegada de los mismos a las trompas y fertilización del óvulo.
5
Una de las pruebas para evaluar la fertilidad masculina es el estudio del semen. Es conocido
que algunas afecciones provocan alteraciones en la calidad y cantidad de los
espermatozoides, como el varicocele, infecciones genitales, traumatismos, sustancias
tóxicas entre otras.
Finalmente cuando se han considerado todos los factores mencionados y no se ha
encontrado ninguna alteración objetiva que lleve a un diagnóstico definido se considera
que la infertilidad es inexplicada.
La infertilidad es una condición que afecta entre un quinto y un sexto de las parejas en edad
reproductiva. En el campo de la salud reproductiva, la infertilidad implica una deficiencia
que aunque no compromete la integridad física del individuo puede provocar frustración.
Comparado con otras especies, el ser humano es altamente ineficiente en términos de
reproducción. La tasa de fertilidad por ciclo es de alrededor de 20% y la tasa de embarazos
acumulados en las parejas con fertilidad probada es aproximadamente 90% después de doce
meses y 94% después de dos años (Remohi, 2005).
6
III-PROCESOS INFLAMATORIOS DEL TRACTO REPRODUCTOR
FEMENINO
Es conocido que los procesos inflamatorios del tracto reproductor femenino pueden
comprometer la fertilidad de la mujer causando infertilidad tuboperitoneal. Entre estos
procesos se pueden mencionar: las infecciones recurrentes y asintomáticas originadas por
bacterias como Neisseria gonorreae (Maisey y col, 2003),
Chlamydia trachomatis
(Carmona, 1998; Rasmussen y col, 1997) y Ureoplasma urealyticum, microorganismos que
pueden provocar una enfermedad inflamatoria pélvica, la endometriosis pélvica (Taketami
y col, 1992) y el hidrosalpinx (Chang y col, 2004), entre otros.
La endometriosis es una enfermedad crónica y recurrente caracterizada por la presencia de
tejido endometrial fuera de la cavidad uterina (Van Langendonckt y col, 2002; Lebovic y
col, 2001). Es una enfermedad casi exclusiva de mujeres en edad reproductiva,
caracterizada por una respuesta inflamatoria general en la cavidad peritoneal (Agarwal y
col, 2005) con síntomas como: dismenorrea, sangrado intermenstrual, disuria y dolor
pélvico.
El hidrosalpinx se conoce como la acumulación de líquido en las trompas de Falopio y su
posterior dilatación, ocasionada por una obstrucción tubárica distal con reflujo hacia la
cavidad endometrial y es conocido que puede originarse tanto por procesos infecciosos
como por patologías como la endometriosis (Spandorfer y col, 1999).
Tanto las infecciones, como la endometriosis y el hidrosalpinx son capaces de originar en el
tracto reproductor femenino una respuesta inmunológica que conlleva a la secreción de
7
citocinas pro-inflamatorias y agentes quimiotácticos para conducir a la inflamación como
mecanismo de defensa del organismo (Dube y col, 2001).
No está claro como los procesos inflamatorios en el tracto reproductor femenino
comprometen la fertilidad de la mujer, sin embargo es conocido que las infecciones pueden
ocasionar un daño tisular de las trompas de Falopio. Durante la endometriosis severa
pueden formarse adherencias, mientras que el hidrosalpinx puede provocar la obstrucción
tubárica de forma unilateral o bilateral, sin embargo, se propone que otros mecanismos
deben estar involucrados en los casos de endometriosis de bajo grado los cuales están
vinculados a estados de subfertilidad, con índices de fecundidad mensual de 0,02 a 0,1
(cuando normalmente está entre 0,15 y 0,20) de difícil explicación (Wang y col, 1997; Mio
y col, 1992).
Se ha demostrado que tanto del fluido peritoneal de mujeres con endometriosis (Taketani y
col, 1992) como del fluido de hidrosalpinx (Singh y col, 2000; Carrasca y col, 2000) tienen
un efecto embriotóxico en embriones de ratón en cultivos in vitro (Strandell y col, 1998),
sin embargo, existen controversias en los resultados (Koong y col, 1998), además, el
mecanismo por el cual estos fluidos producen embriotoxicidad es desconocido hasta la
fecha.
Diversos estudios han tratado de determinar cuales de los factores presentes en estas
secreciones son los responsables de la toxicidad de estos fluidos sobre el desarrollo
embrionario pre-implantación, así se ha investigado la presencia de diversas citocinas y
factores de crecimiento (Barmat y col, 1999), así como sus concentraciones (Bedaiwy y col,
2001).
8
IV-DESARROLLO EMBRIONARIO PRE-IMPLANTACIÓN
4.1-Generalidades:
Los ovocitos humanos en condiciones normales in vivo son captados por las fimbrias
tubáricas unas horas después de la ovulación y avanzan a lo largo de la trompa gracias a la
actividad muscular y ciliar para que se lleve a cabo la fertilización en el ámpula (Remohi,
2005).
Figura 1: Trayectoria de los gametos en la trompa de Falopio (Vitrolife, Closer to Nature,
2002).
9
El proceso de fertilización es un fenómeno de múltiples pasos que se inicia con la
interacción y posterior fusión de los gametos (Wassarman, 2005; Nixon y col, 2005) la cual
desencadena una cascada de señalización que resulta en la transformación del ovocito
fecundado a un embrión diploide capaz de formar un nuevo organismo, que poseerá
características genéticas de ambos progenitores (Evans, 2002).
El desarrollo embrionario de los mamíferos en fase pre-implantación es marcadamente
similar. Tras la fusión de los gametos, los cigotos comienzan una serie de repetidas mitosis,
dividiéndose en intervalos de 16-24 horas en los estadios tempranos, siendo estas primeras
divisiones habitualmente asincrónicas.
Al alcanzar un número de 16-32 células o blastómeras es considerado una mórula,
momento en el cual llega al útero para continuar su desarrollo (Ben-Yosef y col 2004;
Remohi y col, 2005). Posteriormente sus blastómeras se van compactando y es llamada
mórula compactada.
Cabe destacar que el desarrollo desde la fecundación hasta el estadio de mórula tiene lugar
mientras el embrión desciende por la trompa gracias a la acción ciliar y peristáltica y que a
lo largo de su recorrido se encuentra englobado en la zona pelúcida que mantiene un
microambiente adecuado.
Las blastómeras de los embriones tempranos tienen una fisiología análoga a los organismos
unicelulares y solo después que sufren la compactación de las blastómeras y se genera el
primer epitelio de transporte, es cuando las células de la nueva mórula presentan una
fisiología similar al de la células somáticas (Gardner y col, 1998; Lane, 2001).
La dinámica de desarrollo de las blastómeras se caracteriza por una diferenciación de las
uniones intercelulares que se van modificando a lo largo del desarrollo embrionario. Al
principio, hasta el estadio de 4 células, las blastómeras se comunican entre sí con uniones
tipo gap, semejantes a los desmosomas primarios y por microvellosidades en los espacios
intercelulares. En el estadio de 6 a 8 células aparecen uniones estrechas y se diferencian los
desmosomas. Las blastómeras comienzan a formar una red sincitial e inician un proceso de
10
compactación, durante el cual pierden su identidad y se convierten en una masa celular
compacta, formándose el blastocisto (Remohi, 2005).
Aproximadamente en el día 5 empieza a formarse una cavidad denominada blastocele y se
produce la diferenciación celular, en este momento es denominado blastocisto y puede ser
clasificado como temprano o cavitado. Luego el blastocisto se expande, en este momento se
observa el blastocele rodeado de una monocapa celular o trofoectodermo (TE) que formará
la placenta y una masa celular interna (ICM) que dará lugar al embrión. Posteriormente el
blastocisto eclosiona de la zona pelúcida para que ocurra la implantación en el endometrio
aproximadamente al día sexto tras la fecundación (Remohi, 2005).
Figura 2: Desarrollo embrionario pre-implantación (Mercader y col, 2000).
11
La formación de la cavidad del blastocisto (blastocele) representa el comienzo del
transporte de fluido por las células del trofoectodermo, así como la diferenciación física de
las células en un compartimiento interno (masa celular interna) y otro externo
(trofoectodermo), que engloba la masa celular y retiene el fluido del blastocele.
Dentro del estadio de blastocisto podemos diferenciar cuatro tipos: el blastocisto temprano
(Bt), cuando comienza a formarse la cavidad y empieza la diferenciación celular; el
blastocisto cavitado (Bc), donde el blastocele ocupa mas del 50% del volumen del embrión;
el blastocisto expandido (Be), cuando se observa el blastocele rodeado por una monocapa
celular o trofoectodermo, que formará la placenta y una masa celular interna, que dará lugar
al embrión. Con la expansión del embrión se produce un aumento del volumen y una
disminución del grosor de la zona pelúcida y por último, el blastocisto eclosionando o
“hatching” (BHi), cuando el blastocisto está saliendo de la zona pelúcida y el eclosionado o
“hatched” (BH), cuando el blastocisto ha salido completamente de la zona pelúcida
(Remohi, 2005).
Después de la formación del blastocisto, en su superficie celular aparecen glicoproteínas,
glicolípidos y enzimas de transporte. Los organelos celulares también se diferencian, se
elongan las mitocondrias y se yuxtaponen al retículo endoplasmático durante las divisiones
embrionarias. También se modifica el aparato de golgi y los lisosomas primarios se
diferencian en lisosomas secundarios.
En este momento, el embrión comienza a ser sensible a nuevos estímulos. El
trofoectodermo y la masa celular interna se comunican además de por uniones estrechas,
por interacciones entre moléculas de superficie y por señales autocrinas y paracrinas. Todos
estos sistemas están también involucrados en la reparación de los daños que puedan haber
sufrido los embriones a lo largo de su desarrollo (Remohi, 2005).
El embrión en periodo de pre-implantación tiene características únicas ya que evoluciona
en ausencia de contacto celular directo con el tracto reproductor materno, durante
aproximadamente una semana (en el caso de humanos) antes de implantarse en el útero.
Durante este periodo, el embrión sufre divisiones celulares, apoptosis y diferenciación y es
dependiente de las secreciones luminales del oviducto y del útero para su nutrición.
12
El embrión en su recorrido desde el oviducto hasta el útero pasa por condiciones específicas
de pH (Dale y col, 1998) y de oxígeno (Dumoulin y col, 1999). El pH del fluido folicular
humano es de 7.2-7.3, el del fluido oviductal es de 7.6-7.9, mientras que el pH del útero es
más ácido que el del oviducto, lo que indica que los embriones de mamífero encuentran tres
ambientes en su travesía desde el folículo hasta el útero (Dale y col, 1998). Además es
conocido que las condiciones de oxígeno entre el oviducto y el útero varían entre 1.5 y 9%
(Dumoulin y col, 1999), aspecto que explica que investigadores hayan demostrado que
condiciones bajas de oxígeno favorecen el desarrollo de embriones pre-implantación in
vitro en algunas especies como ratón (Gardner y Lane, 1996) y hámster (Mckiernan y col,
1990).
En el desarrollo embrionario pre-implantación in vivo, un alto porcentaje de embriones se
bloquean o detienen naturalmente en estadios pre-implantación y aproximadamente un 15%
lo hace luego de la implantación, antes de la semana 10 de embarazo (Remohi, 2005).
4.2-Control genético durante el desarrollo embrionario:
Los procesos de síntesis proteica en el ovocito una vez éste es activado por el
espermatozoide, se pueden considerar como el resultado de dos programas de desarrollo:
uno de ellos comienza durante la oogénesis y el otro se inicia en el momento de la
fecundación. La transición de un programa a otro viene definida por dos periodos, uno
controlado por factores acumulados en el ovocito, que constituyen la herencia materna y
otro regulado por la actividad del genoma embrionario procedente de ambos progenitores
(Kawamura y col, 2001)
Este periodo que transcurre desde la fecundación hasta la implantación, es crítico a nivel
genético, ya que representa la transición desde un programa de gametogénesis a otro de
proliferación rápida y diversificación. Así pues, la información génica que contiene un
embrión procede de dos fuentes: el ácido ribonucleico mensajero (ARNm) materno que
proviene del ovocito y el ARNm embrionario que comienza a sintetizarse en estadios
posteriores, después de la fecundación, aproximadamente cuando el embrión tiene 8
blastómeras en el caso del humano, este fenómeno se llama activación del genoma
embrionario. Este ARNm participa en la transcripción de factores nucleares, elementos del
13
citoesqueleto, proteínas de membrana y secretadas al medio (incluyendo factores de
crecimiento y sus receptores), así como en los componentes de la maquinaria metabólica de
estos embriones (Remohi, 2005).
La activación de los genes en los estadios mas tempranos del desarrollo embrionario preimplantatorio dependen del genoma materno, periodo cuando se codifican muchos factores
que incluyen precursores de complejos de unión y algunos otros factores que se relacionan
con el crecimiento y no con funciones especializadas.
Por otro lado, la activación del genoma embrionario varía con la especie: en humanos,
comienza en fases muy tempranas, habitualmente cuando el embrión alcanza entre 4 y 8
células, mientras que en el ratón ocurre en el estadio de 2 células (Lawitts y col, 1991;
Gardner y Lane, 1993). Esta expresión de genes por parte del embrión, como por ejemplo
factores de crecimiento, es muy importante ya que sin ellos no se iniciarían los procesos de
compactación y desarrollo del blastocisto que permiten la diferenciación de las células
especializadas necesarias para el crecimiento intrauterino.
En resumen, la activación del genoma embrionario es el momento de transición de la
síntesis de proteínas ya no a partir de material contenido en el ovocito materno sino a partir
de la transcripción del genoma embrionario (Larson y col, 1992), lo que indica una clara
transición del control materno al embrionario.
4.3-Desarrollo embrionario in vitro:
En los procesos de fertilización in vitro, se obtienen ovocitos de una mujer que ha sido
estimulada hormonalmente para lograr un número mayor de ovocitos y luego se incuban
con espermatozoides en un medio específico para la fertilización (IVF), o se les introduce
un espermatozoide, por la técnica de inyección intra-citoplasmática de espermatozoides
(ICSI), los ovocitos fecundados continúan su desarrollo embrionario en cultivo, sin
embargo, solo un 50% progresa hasta estadio de blastocisto (Kably y col, 2001).
En estos procedimientos de reproducción asistida no todo óvulo será fertilizado y no todo
óvulo es fertilizado correctamente, esto dependerá en parte de la calidad de los gametos
14
(Lonergan y col, 2001; Kably y col, 2001), siempre que se garanticen las condiciones de
cultivo adecuadas. La tasa promedio de fertilización es de 75%, es decir que de cada 10
óvulos que se colocan con los espermatozoides van a fertilizar aproximadamente 7 y
cuando se trabaja con parejas con problemas en los gametos, la tasa de fertilización suele
ser menor (Remohi, 2005).
También es importante destacar que no todo óvulo fertilizado avanza en su desarrollo,
muchos sufrirán un descarte natural, que no tendrá que ver con la técnica realizada, sino
con las características intrínsecas de cada embrión que estarán determinadas por el óvulo y
el espermatozoide (Kably y col, 2001).
En embriones humanos el 70% de ovocitos fertilizados experimentan las tres primeras
divisiones durante los tres primeros días de cultivo, solo la mitad llega a cavitación al día 5
(Gardner y col, 1998) y solo 1/3 forma blastocistos morfológicamente óptimos con una
masa celular interna bien definida y una expansión apropiada (Alikami y col, 2000).
A diferencia del embrión humano que tarda de 5 a 6 días en cultivo post fertilización para
llegar a estadio de blastocisto, el embrión de ratón toma entre 3 y 3 ½ días para
desarrollarse hasta el mismo estadio conteniendo 32 o mas células (Remohi, 2005).
Por otra parte, se ha demostrado una correlación directa entre el tiempo de la primera
división celular del embrión post fecundación in vitro, la competencia de desarrollo
(Lonergan y col, 2001; Bos-Mikich y col, 2001) y las tasas de embarazo (Sakkas y col,
1998; Lundin y col, 2001).
Se ha demostrado que embriones que inician sus divisiones tempranamente progresan con
mejor calidad al compararlos con aquellos con clivaje tardío (Lundin y col, 2001), este
fenómeno podría deberse a que los embriones con divisiones tempranas provinieron de
ovocitos en los cuales hubo una mejor sincronización entre la maduración citoplasmática y
nuclear (Mikkelsen y col, 2001), o sus embriones hayan tenido una mayor actividad
metabólica o tal vez a una mejor calidad del espermatozoide (Lundin y col, 2001).
15
Por otra parte, Alkami y col, 2000, demostraron que un clivaje anormal al día 2 o 3 de
cultivo (<5 células para el día 3 de cultivo) conlleva a una reducción en la formación de
blastocistos al día 5 de cultivo. Se ha observado que los embriones que compactaron y
formaron ICM exitosamente tuvieron un número mayor de células para los días 2 y 3, al
compararlas con los que fracasaron en su desarrollo. Interesantemente, los embriones con
clivaje más acelerado, con 9 o 10 células para el día 3 de cultivo, mostraron disminución en
la formación de blastocistos normales, lo que sugiere que cuando el clivaje es demasiado
rápido podría haber aberración cromosómica (Alkami y col, 2000).
Debido a lo discutido anteriormente, el momento de la primera división celular o clivaje
forma parte de los criterios de selección de los embriones más óptimos para transferir, junto
a las características morfológicas del mismo, como tamaño y forma de las blastómeras,
características del citoplasma y presencia o ausencia de fragmentación (Ben-Yosef y col,
2004).
Es conocido que algunas especies de mamíferos experimentan bloqueo en su desarrollo in
vitro (Devreker y col, 1999; Lawitts y col, 1991), como el observado en embriones de ratón
de algunas cepas en el estadio de 2 células. Este bloqueo en el desarrollo ha sido
relacionado con varios factores: fracaso en la activación del genoma embrionario,
desbalance en la concentración de ciertos constituyentes de medios de cultivo (Lawitts y
col, 1991) y con concentraciones de glucosa inadecuadas en cultivo (Leppens y col, 1997;
Sakkas y col, 1993), aumento de especies reactivas al oxígeno (ROS), entre otros.
4.4-Metabolismo del embrión pre-implantación:
Los embriones obtienen la energía necesaria para su desarrollo mediante la síntesis de ATP,
a partir del metabolismo de los monosacáridos. Los sustratos energéticos requeridos por el
embrión varían secuencialmente a lo largo de su curso por el tracto reproductivo, siendo los
principales sustratos utilizados: piruvato, lactato y glucosa (Sakkas y col, 1993).
Durante el desarrollo del cigoto al estadio de blastocisto, el embrión experimenta varios
eventos importantes para su desarrollo, tales como la activación del genoma embrionario, la
16
formación de uniones entre células, la diferenciación del TE y ICM y las formación de la
cavidad del blastocele.
Todos estos eventos tienen requerimientos metabólicos diferentes por parte del embrión
(Sakkas y col, 1993).
1-Utilización de la glucosa:
Antes de la activación del genoma embrionario, el metabolismo del embrión es bajo y
depende principalmente de la trascripción materna, en este estadio el piruvato es la mayor
fuente de energía y el embrión tiene una baja capacidad para metabolizar glucosa. Después
de la activación del genoma embrionario, la replicación del ADN y la síntesis de proteínas
aumentan drásticamente y el embrión es capaz de metabolizar la glucosa, así la utilización
de glucosa y piruvato aumenta para satisfacer las demandas extras de energía (Sakkas y col,
1993). Adicionalmente el embrión en estadio tardío también requiere una amplia variedad
de nutrientes, incluyendo aminoácidos y vitaminas para soportar las diferentes rutas
biosintéticas (Sakkas y col, 2003; Devreker y col, 2001).
Este cambio dramático en la utilización de glucosa es necesario para cumplir con las
diferentes exigencias metabólicas que surgen a medida que se desarrolla el embrión.
Durante el desarrollo del embrión la glucosa es usada en estadios y rutas diferentes
(Leppens y col, 1997). La glucosa puede ser almacenada como glucógeno, ser usada vía la
ruta pentosa fosfato o entrar en la ruta glucolítica. La selección de la ruta depende de la
actividad de ciertas enzimas.
Se han evaluado cinco factores que podrían ser clave para la generación de este cambio
metabólico, estos son: edad del embrión (horas post hCG), estadio de desarrollo,
citocinesis, número celular y activación del genoma embrionario. Se ha encontrado que la
activación del genoma embrionario es pre-requisito para el cambio de requerimientos
metabólicos y que el tiempo de cambio está asociado con el estadio de desarrollo de
compactación y/o cavitación, mientras que el número celular, citocinesis y edad del
17
embrión parecen no estar relacionados con el tiempo del cambio. Estas conclusiones se
pueden extrapolar a otras especies (Remohi, 2005).
2-Utilización de los aminoácidos (aas):
Los aminoácidos están presentes en altas concentraciones en el tracto reproductor femenino
y parecen estar involucrados en el desarrollo de embriones de mamíferos pre-implantación
por eso son incluidos en medios de cultivo embrionario. Se ha demostrado que al cultivar
embriones de ratón en medios que carecen de los aas presentes en el tracto reproductivo de
ratón, se observa una disminución en la viabilidad de los embriones (Devreker y col, 2001).
Se han realizado muchos estudios para determinar la función de los aas en embriones preimplantación en diversas especies como ratón, vaca, oveja, hámster y humanos y han
concluido que algunos estimulan el desarrollo de los embriones, mientras que otros parecen
inhibirlo (Devreker y col, 1999; Gardner y Lane, 1993; Devreker y col, 2001).
En general diversos estudios han identificado que ciertos aas actúan como estimulatorios
para el desarrollo embrionario (GLY, CYS, LYS), mientras que otros como inhibidores
(PHE, VAL, ILE, TYR, TRP, ARG) o neutrales (PRO, SER, THR, HIS, ALA, LEU, ASP,
MET) (Devreker y col, 2001).
El mecanismo por el cual los aas promueven el desarrollo de embriones pre-implantación
es desconocido. Sin embargo, en ratón se ha vinculado a las siguientes funciones: a la
síntesis de proteínas y nucleótidos, como fuente de energía, como reguladores de la
osmolaridad, como antioxidantes, reguladores de pH y como precursores de moléculas de
señalización como el óxido nítrico (Gardner y Lane, 2001).
Así pues, el embrión está expuesto a un conjunto de metabolitos variables a lo largo de su
desarrollo. En sus primeros estadios consume piruvato y lactato y en estadios posteriores
aprovecha la glucosa como sustrato energético. Por lo tanto, el cultivo in vitro requiere un
cambio secuencial de los medios de cultivo a medida que el embrión evoluciona.
18
V-ESTRÉS OXIDATIVO
La mayoría de las células requieren vivir en condiciones aeróbicas, debido a que el oxígeno
es necesario para la vida, sin embargo su metabolismo oxidativo puede ser tóxico, por ser el
responsable de la formación de las especies reactivas de oxígeno (ROS) que pueden alterar
la función y viabilidad celular (Agarwal y col, 2003).
Todas las células aeróbicas están sometidas a estrés oxidativo, el cual es desencadenado por
compuestos químicos denominados radicales libres. Un radical libre es una molécula o
fragmento de ella que contiene uno o más electrones desapareados en su orbital más
externo, producto de la ganancia o pérdida de electrones.
Los ROS son formados durante los pasos intermediarios de la reducción del oxígeno: el
radical anión superóxido (O2-), el radical peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical
hidroxilo (OH·), correspondientes a los pasos de la reducción por uno, dos y tres electrones
respectivamente (Guerin y col, 2001).
La reducción univalente del oxígeno resulta en la producción del anión superóxido. La
dismutación de dos aniones superóxidos, catalizada por la superóxido dismutasa conduce a
la formación del peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno es destoxificado por la
glutatión peroxidada o inactivado a agua y oxígeno por la catalasa. El óptimo balance se da
solo cuando hay un balance apropiado entre las concentraciones de superóxido dismutasa,
glutatión peroxidada y catalasa.
19
Alternativamente, en presencia de metales de transición como el hierro, el peróxido de
hidrógeno genera el radical hidroxilo que es altamente reactivo. El radical hidroxilo es
altamente tóxico para las células porque reacciona instantáneamente con todos los
componentes celulares (Packhan y col, 1995).
Figura 3: Generación de ROS en las células. Las principales fuentes de ROS y su
metabolismo (Packham y col, 1995).
El óxido nítrico (ON) es otro radical que contiene oxígeno y es sintetizado por la enzima
óxido nítrico sintasa y por ser un radical libre con un electrón desapareado es capaz de
reaccionar con una gran variedad de moléculas celulares. En condiciones patológicas el ON
puede ser sobre-producido y junto con el superóxido originar el peroxinitrito que es un
radical altamente tóxico el cual se acumula, este es considerado un radical fuertemente prooxidante similar al radical hidroxilo (Van Langendonckt y col, 2002).
El estrés oxidativo se origina por el desequilibrio entre la formación de especies reactivas
de oxígeno (ROS) y los mecanismos antioxidantes propios del organismo, donde se genera
un aumento de ROS (Agarwal y col, 2003).
20
En diferentes tipos de células los ROS pueden incrementar o reducir el porcentaje de
proliferación, inducir apoptosis o necrosis, modular la expresión de genes y actuar
estimulando o inhibiendo componentes de señalización bien caracterizados; estas
capacidades son muy relevantes en la fertilización, desarrollo embrionario temprano e
implantación (Taylor y col, 2001).
Las especies reactivas de oxígeno a concentraciones bajas, son fundamentales en algunos
procesos reproductivos como, la capacitación e hiperactivación espermática, reacción
acrosómica (Taylor y col, 2001), la activación del ovocito, la interacción entre las
membranas de los gametos (Miesel y col, 1993) y en el proceso de apoptosis necesario en
el desarrollo pre-implantacional del embrión, para el descarte natural de embriones con
anormalidades genéticas y morfológicas (Salas-Vidal y col, 1998); sin embargo, cuando
ocurre un desequilibrio, los niveles aumentados de ROS pueden perjudicar el proceso
reproductivo.
El metabolismo del oxígeno molecular es importante para los embriones y es conocido que
ellos producen ROS en tres formas principales: O2-, H2O2 y OH·.
Los ROS pueden ser producidos por varias rutas metabólicas y enzimáticas, incluyendo
principalmente: fosforilación oxidativa (OXPHOS), NADPH oxidasa y xantina oxidasa. Es
conocido que los embriones pre-implantación generan adenosin trifosfato (ATP) vía
OXPHOS y glicólisis. Se ha descrito que en embriones murino el 70% del oxígeno es
metabolizado vía OXPHOS en el estadio de blastocisto, mientras que en estadios de dos y
cuatro células menos del 30% del oxígeno es metabolizado por esta ruta.
La actividad de las oxidasas está presente en embriones pre-implantación y
fundamentalmente representada por la NADPH oxidasa y la xantina oxidasa (Guerin y col,
2001).
Las células poseen mecanismos de defensa para contrarrestar el efecto tóxico que genera la
reducción del oxígeno, estos mecanismos se dividen en enzimáticos y no enzimáticos.
21
Entre los mecanismos enzimáticos, se encuentran la superóxido dismutasa (SOD),
responsable de la dismutación del anión superóxido (O2-) intracelular hasta peróxido de
hidrógeno (H2O2) más oxígeno (O2). Adicionalmente, la catalasa y la glutatión peroxidada
(GP) catalizan el peróxido de hidrógeno; cuando este está en bajas concentraciones, la
glutatión peroxidada (GP) en presencia de glutatión reducido (GSH), es oxidado para
producir glutatión oxidado (GSSG) más agua, mientras que en concentraciones elevadas de
peróxido de hidrógeno, la catalasa interviene en la remoción del peróxido produciendo
oxígeno más agua (Guerin y col, 2001).
Entre los mecanismos no enzimáticos se encuentran la vitamina E o alfatocoferol, que actúa
como donador de un átomo de hidrógeno al radical oxígeno, haciéndolo menos reactivo y el
ácido ascórbico o vitamina C, que actúa como donador de hidrogeniones al radical libre de
oxígeno (Guerin y col, 2001).
Es conocido que los ROS en exceso tienen un efecto citotóxico, originando peroxidación de
los fosfolípidos de membrana (lo que causa un aumento en la permeabilidad de membrana
y pérdida de su integridad), inactivación enzimática, daño estructural de ADN y muerte
celular (Guerin y col, 2001; Agarwal y col, 2003).
Adicionalmente estudios in vitro han aportado datos concernientes a la capacidad de ciertas
citocinas para inducir la producción de ROS en diversas células.
Se ha demostrado que algunas citocinas tales como IL-1, TNF- y IFN-gamma pueden
inducir la producción de ROS por las células endoteliales conllevando a peroxidación
lipídica y daño al ADN (Volk y col, 2000).
Otras publicaciones indican que la IL-1 causa producción y acumulación de nitritos en
ovario de rata (Ben-Shlomo y col, 1994), la IL-1 junto con el TNF- y IFN-gamma tienen
efectos estimulatorios en la producción de nitritos en líneas celulares osteoblásticas
(Hukkanen y col, 1995), la IL-1 y el TNF- estimulan la producción de nitritos en células
22
de cerebro de rata (Romero y col, 1996) y que el TNF- estimula la producción de
superóxido dismutasa en el endometrio in vitro (Sugino y col, 2002) y en hepatocitos de
ratón in vitro (Adamson y col, 1993).
23
VI- ESTRÉS OXIDATIVO Y SU EFECTO SOBRE EL EMBRIÓN
El estrés oxidativo es responsable de muchas alteraciones en el embrión. Los ROS como el
anión superóxido (O2-) son capaces de difundir y pasar a través de la membrana celular
causando alteraciones en la mayoría de las moléculas celulares como lípidos proteínas y
ácidos nucleicos. Las consecuencias son variadas, incluyendo alteraciones mitocondriales,
bloqueo celular, depleción de ATP y apoptosis.
6.1-Lípidos:
Los ROS inducen peroxidación lipídica afectando la división celular, transporte de
metabolitos y disfunción mitocondrial. El bloqueo de 2 células en embriones de ratón ha
sido relacionado con peróxidos lipídicos (Nasr-Esfahani y col, 1990).
6.2-Proteínas:
Los ROS pueden inducir la oxidación de los grupos sulfidrilo en las proteínas y la
formación de disulfuros. Con el estrés oxidativo, los porcentajes de puentes disulfuro y la
formación de mezclas disulfuro incrementan dentro de la célula, pudiendo causar
inactivación de enzimas como la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) (Guerin
y col, 2001).
6.3-ADN:
Se conoce que las ROS atacan al ADN, produciendo rupturas de las cadenas de ácidos
nucleicos y daño en el contenido genómico de la célula. Se ha encontrado una relación
24
entre el arresto en el desarrollo embrionario in vitro y lesiones al ADN (Guerin y col,
2001).
6.4-Alteraciones mitocondriales:
El estrés oxidativo produce daño mitocondrial. El ADN mitocondrial (ADNm) es
especialmente susceptible a la mutación debido que carece de histonas que son las que
normalmente capturan los ROS. Durante el estrés oxidativo, las mutaciones del ADNm son
cuatro veces más frecuentes que las mutaciones del ADN nuclear. El ADNm codifica
enzimas esenciales de la maquinaria OXPHOS (Guerin y col, 2001).
Embriones con ADNm defectuoso pueden inducir disfunciones metabólicas y como
consecuencia, alteraciones en el desarrollo embrionario.
Las consecuencias de estas alteraciones son múltiples e incluyen, arresto y retraso en el
desarrollo embrionario, disfunciones metabólicas y posiblemente también apoptosis
(Guerin y col, 2001).
6.5-Utilización de ATP:
La utilización de ATP ocurre en las células vía inactivación de las rutas G3PDH, glicolítica
y mitocondrial. El estrés oxidativo induce el consumo de equivalentes reducidos como
GSH. La actividad de la glutatión reductasa (GR) permite el mantenimiento del GSH
endógeno. La glutatión reductasa (GR) es dependiente de NADPH y la principal fuente de
NADPH en el desvío monofosfato (ruta de las pentosa fosfato).
Por lo tanto, el estrés oxidativo, vía consumo competitivo de equivalentes reducidos, puede
interferir con importantes funciones metabólicas y desviar glucosa desde otras rutas por
inducción del desvío monofosfato (Guerin y col, 2001).
6.6-Apoptosis y fragmentación de embriones:
25
La acumulación de radicales superóxidos y la disminución en los niveles de SOD están
involucrados en la muerte celular apoptótica. Se ha descrito que antioxidantes como la SOD
pueden inhibir la apoptosis.
El peróxido de hidrógeno es un mediador de apoptosis en los blastocistos (Yang y col,
1998).
Se ha demostrado una relación directa entre el incremento en las concentraciones de H2O2 y
la apoptosis en embriones humanos fragmentados (Yang y col, 1998), como en embriones
de otras especies (Velez-Pardo y col, 2007).
La fragmentación ocurre en embriones humanos y de ratón justo antes del bloqueo en el
desarrollo in vitro, por lo cual, la fragmentación podría ser un mecanismo que regula la
relación núcleo/citoplasma en blastómeras o un mecanismo protector contra el daño
inducido por el estrés oxidativo (Guerin y col, 2001).
26
VII- OBJETIVO
-Evaluar el efecto de citocinas pro-inflamatorias sobre el desarrollo embrionario temprano
murino, la producción de ROS y daño al ADN.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
1-Eevaluar el efecto de IL-1, IL-6 y TNF- sobre el desarrollo de embriones de ratón in
vitro.
2- Determinar el efecto de la IL-1, IL-6 y TNF- sobre la producción de peróxido de
hidrógeno (H2O2), anión superóxido (O2-) y nitritos en embriones.
3-Determinar el efecto de la IL-1, IL-6 y TNF- sobre el daño al ADN evaluado por
apoptosis en embriones.
27
VIII- MATERIALES Y MÉTODOS
1-Población:
Se utilizaron ratones hembras maduras de la cepa NIH (n=349), no consanguíneas de 20 a
25 gramos, provenientes del Bioterio del Instituto Nacional de Higiene ¨Rafael Rangel¨.
2-Recolección de embriones:
Para la recolección de los embriones se utilizaron pinzas y tijeras quirúrgicas, pipetas
Pasteur de vidrio, pipetas volumétricas, pipetas automáticas, puntas descartables,
inyectadora de vidrio con aguja n0 30, placas de cultivo (NUNC), placas de cuatro pozos
(NUNC), medio de cultivo embrionario IVF (Vitrolife, Sweden), medio de colecta PBS
suplementado con HSA al 10%,
lupa estereoscópica (Wild Herrbrugg M5A) y una
boquilla acoplada a una pipeta Pasteur de fabricación artesanal (a base de mangueras de
plástico conectadas a filtros millipore de 0,22 um).
Los embriones fueron recolectados 24 h luego de que las hembras presentaron el tapón
vaginal. Se sacrificaron los animales por dislocación cervical y luego realizando un
procedimiento quirúrgico se extrajeron los oviductos. Posteriormente se realizó un lavado a
los oviductos inyectándoles PBS suplementado con HSA desde el ámpula (con la ayuda de
la inyectadora de vidrio y la aguja n° 30), para así obtener los embriones encontrados en su
interior.
Luego de la recuperación de los embriones, los mismos fueron tomados con la boquilla
acoplada a la pipeta Pasteur para lavarlos en el medio de colecta PBS (previamente
28
preparado y equilibrado en CO2) en placas de cultivo de cuatro pozos, trasladándolos de un
pozo a otro, en orden secuencial.
3-Cultivo embrionario:
Los embriones en estadio de 2-4 células fueron colocados en placas que contenían medio de
cultivo simple IVF (previamente preparadas y equilibradas en CO2), fueron lavados en las
gotas dispuestas en la placa para este fin y luego, se colocaron en las gotas donde fueron
cultivados bajo una cubierta de aceite mineral.
Cabe destacar que solo fueron seleccionados para este estudio embriones en estadio de 2-4
células con una morfología óptima (blastómeras simétricas y sin presencia de
fragmentación citoplasmática).
4- Citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α a diferentes concentraciones:
Para la realización de este trabajo empleamos las siguientes citocinas: IL-1β humana
recombinante (R&D Systems, código 201-LB), IL-6 humana recombinante (R&D Systems,
código 206-IL) y TNF-α humana recombinante (R&D Systems, código 206-IL). Todas las
citocinas fueron obtenidas por la expresión de una secuencia de ADN de la proteína madura
en E. coli., y con una pureza mayor del 97% determinada por SDS-PAGE. Sus pesos
moleculares fueron 17, 20,3 y 17,5 KDa respectivamente y para lograr las concentraciones
deseadas con cada citocina preparamos una solución madre para cada citocina de la
siguiente forma: para la IL-1β de10 μg, para la IL-6 de 10 μg y para el TNF-α de 100 μg en
todos los casos diluidas con agua destilada.
Se realizó una revisión bibliográfica para determinar la concentración de las diferentes
citocinas en fluido peritoneal en condiciones fisiológicas, es decir, las observadas en
29
mujeres sanas y adicionalmente se evaluó los niveles de citocinas presentes durante
procesos inflamatorios del tracto reproductor femenino como endometriosis e hidrosalpinx.
En el presente estudio se utilizó un intervalo de concentración de las diferentes citocinas
tomando en cuenta diversas publicaciones que hacen referencia a los valores determinados
tanto en condiciones fisiológicas como inflamatorias (patológicas).
30
Tabla 1: Concentraciones de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α en condiciones fisiológicas
y patológicas tanto en fluido peritoneal (FP) como fluido hidrosalpingeal (FH) reportadas
en la literatura:
Citocina
Fluido
Conc. Fisiológica
(pg/ml)
- IL-1β:
-IL-6:
-TNF-α:
Conc. Patológica
Referencias
(pg/ml)
FP
5
3
Taketami y col, 1992
FP
13.9
24.3
Sokolov y col, 2005
FP
0
3.71±1.5
Bedaiwy y col, 2007
FH
-------
0.9±0.8
Bedaiwy col, 2005
FP
800± 6
1280±160
Buyalos y col, 1992
FP
27.9
1869.4
Sokolov y col, 2005
FP
5
FP
21.94±21
FH
--------
FP
---------
20.65
Kalu y col, 2007
31±35
Bedaiwy y col, 2007
204.8±1 32
Bedaiwy y col, 2005
1.69
Noriega y col, 2003
FP
60
300
Taketami y col, 1992
FP
1.4
3.1
Podgaec y col, 2007
FP
0.82+/- 2.77
FP
0
54±50
FH
---------
6.2 ±3.6
Barmat y col, 1999
FH
---------
12 ±12.8
Bedaiwy y col, 2005
FH
---------
12
46.9±18.9
Bedaiwy y col, 2001
Bedaiwy y col, 2007
Chen y col, 2002
31
Tabla 2: Concentraciones de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α empleadas en las diferentes
condiciones experimentales de esta investigación:
Citocinas
Concentración (pg/ml)
IL-1 β
1, 10 y 100
IL-6
50, 500 y 1000
TNF- α
10, 100 y 1000
5-Condiciones experimentales:
Después de la recolección y lavado de los embriones, los mismos fueron distribuidos y
transferidos al medio de cultivo control (sin citocinas) o al medio de cultivo experimental
suplementado con diferentes concentraciones de cada una de las citocinas a evaluar.
Todos los embriones fueron cultivados por 4 días (96 h) en grupos de 6-8 embriones por
gota de 40 l, bajo aceite mineral Ovoil-100 (Vitrolife, Sweden) en placas de cultivo
(NUNC) a temperatura de 37 °C, a 5% de atmósfera de CO2 y entre 5-8% de atmósfera de
O2.
El desarrollo de los embriones se evaluó en gotas de medio de cultivo con concentraciones
de IL-1, IL-6 y TNF- (RD systems) que incluyeron valores observados en fluido
peritoneal de mujeres sanas o aquellos presentes en condiciones patológicas como
endometriosis (Taketani y col, 1992; Buyalos y col, 1992; Noriega y col, 2003; Bedaiwy y
col, 2001 y Podgaec y col, 2007; Bedaiwy y col, 2007; Sokolov y col, 2005 y Kalu y col,
2007) y en fluido hidrosalpingeal de mujeres con hidrosalpinx (Bedaiwy y col, 2005;
Barmat y col, 1999 y Chen y col, 2002) respectivamente.
32
A los embriones se les evaluó el desarrollo en cultivo, la producción de peróxido de
hidrógeno (diacetato del 2´,7´-diclorodihidrofluoresceina; DCHFDA), la producción de
aniones superóxidos (azul de nitro tetrazolio; NBT) y apoptosis (marcaje final de
fragmentos de ADN mediado por deoxinucleotidil transferasa; TUNEL), por otra parte el
medio de cultivo fue congelado a –200C para la posterior determinación de nitritos
(reacción de Griess).
6-Evaluación morfológica de los embriones:
Los embriones recolectados se evaluaron con la ayuda de un microscopio ZEISS MC80. Se
determinó el estadio embrionario tanto al momento de la recolección como al día 4 de
cultivo. Se evaluó el porcentaje de embriones que progresaron hasta estadio de blastocisto.
Además, con el fin de definir el efecto de las citocinas estudiadas sobre el desarrollo
embrionario temprano, se calculó el índice de blastulación de la siguiente manera: Índice
de blastulación= % de blastocisto obtenido en condición experimental/ % de blastocisto
obtenido en condición control. Un índice de blastulación  0,5 fue considerado
potencialmente embriotóxico, un índice  1,0 fue considerado embriotrópico y los índices
entre 0,5 y 1,0 representaron un efecto inhibitorio o adverso sobre el desarrollo embrionario
(Chen y col, 2002).
Adicionalmente, se consideraron los cambios morfológicos que conforman el criterio de
muerte celular: la fragmentación celular y arresto en el desarrollo (Hao y col, 2003) para la
futura correlación de datos.
Cabe señalar que el término “arresto o bloqueo en el desarrollo” fue usado en el caso de
embriones que al día 4 de cultivo presentaron un estadio de 2-4 células (Faveta y col,
2007); el término “retraso en el desarrollo” fue usado en el caso de embriones que al día 4
de cultivo no alcanzaron el estadio de blastocisto, teniendo sin embargo, más de 4 células o
blastómeras (Favetta y col, 2007) y el término “embriones con defectos morfológicos”, en
33
el caso de embriones con un espacio intercelular aumentado entre blastómeras, con
blastómeras de tamaño y forma irregular, con fragmentación o con una calidad embrionaria
subóptima (Hao y col; 2003)
7-Determinación de peróxido de hidrógeno (H2O2) intracelular:
El nivel de H2O2 en cada embrión fue medido por el método de 2’7’diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCHFDA, Molecular Probes Inc, Eugene, OR, USA).
El principio de esta técnica se basa en que el DCHFDA no ionizado difunde rápidamente
dentro de la célula, donde los grupos acetato son hidrolizados por la actividad de la
estereasa intracelular, formando 2’7’-diclorodihidrofluoresceina (DCHF) que por ser polar
es atrapado dentro de la célula. Después el DCHF es oxidado por el H2O2 o por peróxidos
lipídicos a 2’7’-diclorofluoresceina (DCF).
El nivel de DCF producido dentro de la célula es relativamente lineal a los peróxidos
presentes, por lo que la emisión fluorescente aporta una medida de los niveles de peróxido.
Los embriones fueron transferidos a una placa de cultivo con medio IVF conteniendo
DCHFDA. Después de 15-20 minutos de cultivo a 37°C, los embriones se lavaron con PBS
para eliminar la fluorescencia superficial y se colocaron sobre una lámina y se cubrieron
con una laminilla.
La emisión de fluorescencia de los embriones fue evaluada con un microscopio de
fluorescencia con filtros entre 405 y 435 nm por exitación y 515 nm por emisión posterior
de su calibración a cero usando una lámpara xenon (100w) y filtros de
isiotiocyanatofluoresceina.
El DCHFDA fue preparado en dimetil sulfóxido (DMSO) a 1x10-3 M antes de empezar
cada experimento y colocado en la oscuridad y usado en un periodo máximo de 48 horas.
34
En cada experimento la concentración fue ajustada a 1x10-5 M diluyendo con IVF (Yang y
col, 1998).
Como control negativo usamos embriones que habían sido cultivados por 96 horas en
ausencia de citocinas (control) y como control positivo, embriones igualmente cultivados
en ausencia de citocinas pero tratados con H2O2 (SIGMA) a una concentración de 100 μM.
La fluorescencia (producción intracelular de H2O2) fue semi-cuantificada por medio de un
sistema de cruces tomando como negativo los embriones control, donde los rangos
establecidos indican el porcentaje de la célula en el que se observa la fluorescencia. Los
rangos establecidos fueron los siguientes: (0-20%)= 0; (21-40%)=+; (41-60%)=++; (6180%)=+++ y (81-100%)= ++++
8-Determinación de anión superóxido intracelular (O2-):
Los aniones superóxidos fueron determinados como un marcador de producción de
especies reactivas de oxígeno (ROS) por un ensayo cualitativo basado en la reducción del
tetrazolium nitroblue (NBT) a formazan por los aniones superóxidos (O2-) (NBT,
Molecular Probes Inc, Eugene, OR, USA).
Este es un ensayo microscópico convencional basado en el ensayo de NBT, que permite
determinar la localización de los aniones superóxidos en embriones in vitro.
Inmediatamente de los 4 días de cultivo los embriones intactos fueron lavados en solución
salina balanceada de Hanks (HBSS) suplementada con HSA y luego incubados por 30
minutos en HBSS conteniendo 2 mg/ml de NBT en un baño de maría de agitación a 37°C
(en placas de cultivo).
Posteriormente, los embriones fueron lavados en HBSS y examinados por microscopía de
luz para observar la tinción azul-violeta que indica la reducción de NBT a formazan por
aniones superóxidos (Hawk y col, 2003).
35
Como control negativo se usaron embriones que fueron cultivados en ausencia de citocinas
y que posteriormente fueron incubados con 30μg/ml de SOD (un potente catalizador de la
dismutación de O2- a H2O2 y O2).
La coloración azul-violeta fue semi-cuantificada mediante un sistema de cruces tomando en
cuenta el control negativo, donde los rangos establecidos indican el porcentaje de la célula
en el que se observa la coloración violeta. Los rangos establecidos fueron los siguientes: (05%)=0; (6-25%)=+; (26-50%)=++; (51-75%)=+++ y (76-100%)=++++.
9-Determinación de las concentraciones de óxido nítrico (ON) mediante la reacción de
Griess:
Los niveles de óxido nítrico en el medio de cultivo se determinaron mediante un test
colorimétrico basado en la determinación de nitritos utilizando la metodología de Griess
(Moshage y col, 1995).
Las concentraciones de nitritos son los metabolitos estables de la síntesis del óxido nítrico
(ON) y se utilizaron como indicadores de la formación de radicales de óxido nítrico. De
esta forma los niveles de nitritos son proporcionales a las concentraciones de ON.
Se realizó un ensayo con los medios de cultivo almacenados previamente conservados a 20°C donde habían sido cultivados los embriones control y aquellos sometidos a la
incubación con las citocinas empleadas en este estudio. Se realizaron cinco réplicas en cada
condición y cada réplica con un pool de 2 gotas de medio de cultivo (cada gota con 40 μL
de medio y entre 6 y 8 embriones que mantuvieron un desarrollo homogéneo en cada
condición).
Para la determinación de las concentraciones de ON se empleó un ensayo de micro-plato,
adicionando 5 l/pozo del reactivo de Griess (Molecular Probes, Inc, Eugene, OR, USA)
en una placa de ELISA, 37.5 l/pozo de la muestra o del estándar y 32.5l/pozo de agua
36
destilada. Posteriormente la placa se incubó por 30 minutos a temperatura ambiente. Por
último se leyó la absorbancia a 540 nm. Como blanco se usó medio de cultivo IVF (en el
cual no se habían cultivado embriones).
Se preparó una curva de calibración a partir de una solución estándar de NaNO2 (14,5 nm)
diluida en agua, desde 0 hasta 200 M y posteriormente se llevó a cabo la determinación de
la absorbancia respectiva de las muestras con un lector de ELISA (Bioteck). A partir de
esta curva de calibración se determinaron las concentraciones de nitritos en las muestras
con la utilización del programa KC Junior.
Este ensayo determinó la liberación espontánea de nitritos por los embriones al medio de
cultivo.
10-Determinación de apoptosis en embriones de ratón (TUNEL):
El marcaje final de fragmentos de uridina mediado por deoxinucleotidiltransferasa
(TUNEL) es una adición enzimática de nucleótidos marcados con fluoresceína a los finales
3’ de ADN que quedan libres como consecuencia de la fragmentación del ADN típica de la
muerte celular programada o apoptosis.
En orden de visualizar las células apoptóticas, los embriones luego de 72 horas de cultivo
en presencia de las diferentes citocinas en las concentraciones pre-establecidas y en
ausencia de ellas (control) fueron lavados cuatro veces en búfer fosfato salino (PBS)
suplementado con 1 mg de poli-vinil pirrolidona (PVP) por cada mL (PBS-PVP) en placas
de cuatro pozos (NUNC). Luego, los embriones, fueron fijados en micro-gotas con
paraformaldehído al 4% (w/v) en PBS (pH 7.4). Después de la fijación, los embriones
fueron lavados dos veces en PBS-PVP y colocados en grupos de 10 sobre láminas
portaobjeto de vidrio recubiertas con Poly L-Lisina, donde se dejaron secar al aire por 12
horas a temperatura ambiente. Posteriormente las láminas fueron lavadas dos veces por dos
minutos en PBS-PVP.
37
Los embriones fueron permeabilizados por una hora a temperatura ambiente en tritón X100 al 0,5% (v/v) en citrato de sodio al 0,1% (w/v). Después de la permeabilización, los
embriones fueron lavados una vez en PBS-PVP para la realización del procedimiento
TUNEL.
Posteriormente, se les adicionó a los embriones (ya fijados en las láminas), el reactivo de
mezcla TUNEL, preparado siguiendo las especificaciones del Kit comercial (In Situ Cell
Death Detection Kit; Roche; Mannheim, Germany) en gotas de 50μL que cubrieran
completamente los embriones. Las láminas fueron incubadas en cámara húmeda en
oscuridad a 37°C por una hora. Los embriones control negativo fueron expuestos solo a la
solución de nucleótidos marcados (no enzima TdT), mientras que los control positivo a
DNAsa I, grado I (Sigma).
Luego, las láminas fueron lavadas cuatro veces por dos minutos en PBS-PVP y el exceso
de líquido fue removido de las láminas y las laminillas fueron montadas sobre las láminas
usando glicerol. Los embriones fueron visualizados con un microscopio de fluorescencia
(Nikon, Tokyo, Japan).
Los embriones que presentaron fluorescencia verde brillante fueron considerados TUNELpositivo, al ser comparados con los embriones controles negativos.
11-Análisis Estadístico:
Los resultados obtenidos del desarrollo embrionario en diferentes condiciones fueron
evaluados por el test de X2. Valores de p<0,05 fueron considerados estadísticamente
significativos.
Los resultados obtenidos de los test cuantitativos fueron analizados por el Test de Student´s
(ON).
38
Las correlaciones entre variables fueron realizadas por el test de Pearson. Para ambos
análisis se utilizó el programa de estadística “Statistica¨ (Versión 1999).
39
IX- RESULTADOS
Una muestra de 349 embriones en estadio de 2-4 células, provenientes de ratones hembras
de la cepa NIH, fueron utilizados en cultivos extendidos hasta el día 4. Embriones que
presentaron alteraciones morfológicas al momento de la recolección, fueron excluidos del
estudio.
Los resultados serán presentados de la siguiente forma: la primera tabla y las dos primeras
figuras, mostrando el efecto de las citocinas a las concentraciones consideradas como
fisiológicas y patológicas sobre el desarrollo embrionario murino pre-implantacional.
La segunda tabla y tercera figura, mostrando el efecto de la presencia de las citocinas a las
concentraciones ya mencionadas sobre la producción intracelular de peróxido de hidrógeno
(H2O2) por los embriones murino; y la tercera tabla y cuarta figura, sobre la producción
intracelular de anión superóxido (O2-).
La cuarta tabla y quinta figura, presentarán la liberación al medio de cultivo de óxido
nítrico por los embriones cuando han sido incubados con citocinas en un intervalo de
concentraciones que incluyen tanto la condición fisiológica como la patológica.
La última figura mostrará la apoptosis evaluada en los embriones empleaos como control
negativo, positivo, así como en aquellos que fueron incubados con citocinas en las
diferentes condiciones experimentales.
40
1-Efecto de la IL-1β, IL-6 y TNF-α sobre el desarrollo embrionario murino:
Las figuras 4 y 5 y la tabla 3 muestran el efecto de la IL-1β, IL-6 y el TNF-α a
concentraciones consideradas como fisiológicas y patológicas sobre el desarrollo
embrionario pre-implantacional murino.
Es conocido que los embriones de ratón en cultivo tardan aproximadamente tres días y
medio en alcanzar el estadio de blastocisto, y como era de esperar los embriones cultivados
en ausencia de citocinas (grupo control) alcanzaron al día 4 de cultivo estadios de
blastocistos y en muchos casos se observaron eclosionando o ya habiendo eclosionado.
En la figura 4, se evidencia que la incubación de los embriones murino con IL-1β y TNF-α
a la concentración más baja (1 y 10 pg/mL) respectivamente, permite un desarrollo
embrionario óptimo, mientras que a las concentraciones siguientes se evidencia un arresto y
retraso en el desarrollo embrionario.
Los embriones incubados con IL-6 a la concentración más baja (50 pg/mL) alcanzaron los
estadios de blastocisto, sin embargo en la mayoría de los embriones la calidad fue
subóptima, mostrando a las siguientes concentraciones un desarrollo embrionario con
importantes defectos morfológicos (predominando la fragmentación).
En la tabla 3 y figura 5 puede observarse, que existe una diferencia estadísticamente
significativa con respecto al número de blastocistos obtenidos en embriones incubados con
IL-1β (P=0,01; P<0,001 y P<0,001), IL-6 (P<0,01; P<0,001 y P<0,001) y TNF-α
(P=0,003; P<0,001 y P<0,001).
Al comparar el grupo control con aquellos grupos
incubados con las citocinas a concentraciones crecientes, se observaron los siguientes
índices de blastulación IL-1β (0,77; 0 y 0%), IL-6 (0,69; 0,42 y 0,05%) y TNF-α (0,77; 0,47
y 0%).
41
Control (-)
IL-1β [1pg/mL]
IL-6 [50 pg/mL]
IL-1β [10pg/mL]
IL-6 [500 pg/mL]
IL-1β [100pg/mL]
IL-6 [1000 pg/mL]
TNF-α [10 pg/mL] TNF-α [100 pg/mL] TNF-α [1000 pg/mL]
Figura 4: Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio óptico luego de
evaluar el desarrollo embrionario murino alcanzado al 4to día de cultivo en presencia de IL1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000) pg/mL, TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en
ausencia de las mismas (grupo control).
La incubación de los embriones con IL-1β y TNF-α a las concentraciones de 10 y 100
pg/mL y 10, 100 y 1000 pg/mL respectivamente, provocaron un aumento significativo en el
número de embriones que presentaron bloqueo en el desarrollo (P<0,001 y P<0,001) y
defectos morfológicos (P<0,001 y P<0,001), mientras que al referirnos al número de
embriones que presentaron retraso en el desarrollo, no se encontró diferencia significativa
42
al comparar con el grupo control en embriones en presencia de IL-1β, sin embargo si se
encontró diferencia significativa en las concentraciones de 10 (P<0,007) y 100 (P<0,001)
pg/mL en los incubados con TNF-α.
La incubación con IL-6 a las concentraciones de 500 y 1000 pg/mL mostró un aumento
significativo en el número de embriones que presentaron retraso en el desarrollo (P=0,007)
(P<0,001) y defectos morfológicos (P<0,001) (P<0,001) respectivamente; mientras que en
cuanto al número de embriones que presentaron arresto en el desarrollo, se encontró
diferencia estadísticamente significativa al comparar el grupo control con aquellos
incubados con IL-6 a concentraciones crecientes P=0,001; P<0,001 y P<0,001
respectivamente.
Tabla 3: Porcentaje de blastocistos obtenido, índice de blastulación, arresto y retraso en el
desarrollo y defectos morfológicos en embriones murino cultivados en presencia de IL-1β
(1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL) y TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en
ausencia de las mismas (control).
43
Datos analizados por X2 *P<0,05; **P<0,001
% Blastocisto
44
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
*
**
**
**
0
1
10
**
**
100
IL-1B [pg/mL]
**
50
500 1000
IL-6 [pg/mL]
**
10 100
1000
TNF-alfa [pg/mL]
Figura 5: Porcentaje de embriones que alcanzaron el estadio de blastocisto al ser cultivados
en presencia de IL-1 β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL) y TNF-α (10, 100
y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control). Datos analizados por X2 *P<0,05;
**
P<0,001.
Estos resultados indican que el desarrollo pre-implantacional murino se ve afectado
negativamente por la presencia de IL-1-β, IL-6 y TNF-α a las concentraciones consideradas
como patológicas, fundamentalmente, causando un arresto significativo en el desarrollo y
la presencia de defectos morfológicos, predominando: la asimetría en el tamaño y forma de
las blastómeras; la fragmentación y la pérdida de la relación blastómera/embrión
respectivamente.
2- Efecto de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α sobre la producción intracelular de
peróxido de hidrógeno (H2O2):
La figura 6, muestra embriones incubados con IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y
1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control) luego
de realizarles la técnica de DCHFDA, para evaluar la producción intracelular de H2O2,
45
mostrando que la intensidad de la fluorescencia fue directamente proporcional al aumento
en las concentraciones de IL-1β, IL-6 y TNF-α.
Control (-)
IL-1β [1pg/mL]
Control (+)
IL-6 [50 pg/mL]
IL-1β [10pg/mL]
IL-1β [100pg/mL]
IL-6 [500 pg/mL]
IL-6 [1000 pg/mL]
TNF- α [10 pg/mL] TNF- α [100 pg/mL] TNF- α [1000pg/mL]
Figura 6: Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio de fluorescencia
luego de realizar la prueba para determinar la producción intracelular de H2O2 (DCHFDA)
durante el desarrollo embrionario murino en presencia de con IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL),
IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas
(control).
46
La tabla 4 presenta la producción intracelular de H2O2 (DCHFDA) en embriones de ratón al
ser cultivados por 96 horas en presencia de IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y
1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control).
Para este ensayo fueron utilizados 10 embriones por condición y la tabla muestra la
estimación de la fluorescencia representada por un sistema de cruces (semi-cuantificación)
anteriormente mencionado; mostrando como la fluorescencia aumenta a medida que
aumenta la concentración de IL-1β, IL-6 y TNF-α.
Tabla 4: Semi-cuantificación de la producción intracelular de H2O2 (DCHFDA) durante el
desarrollo embrionario murino en embriones incubados en presencia de IL-1β (1, 10 y 100
pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las
mismas (control).
Producción de H2O2 semi-cuantitativa (N°, %)
Control
IL-1β
IL-6
TNF-α
Condición
N° de
[pg/mL]
embriones
0
+
++
+++
++++
0
10
10(100%)
-
-
-
-
1
10
-
9(90%)
1(10%)
-
-
10
10
-
-
-
10(100%)
-
100
10
-
-
-
-
10(100%)
50
10
4(40%)
6(60%)
-
-
-
500
10
1(10%)
9(90%)
-
-
-
1000
10
-
2(20%)
7(70%)
1(10%)
-
10
10
5(50%)
5(50%)
-
-
-
100
10
-
10(100%)
-
-
-
1000
10
-
-
-
1(10%)
9(90%)
47
Estos resultados indican que la incubación con IL-1β, IL-6 y TNF-α induce la producción
de H2O2 intracelular en embriones murino al compararlos con el grupo control y que el
efecto es dosis dependiente.
3-Efecto de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α sobre la producción intracelular de
anión superóxido (O2-):
La figura 7 muestra embriones incubados con IL-1β, IL-6 y TNF-α a diferentes
concentraciones luego de realizarles la técnica de NBT para evaluar la producción
intracelular de O2-, mostrando que la coloración violeta característica de la reducción del
formazan por el reactivo NBT fue observada solo en el grupo de embriones cultivados en
presencia de IL-1β en concentración de 1 pg/mL y en presencia de TNF- α a la
concentración de 10 pg/mL, mientras que en los incubados en presencia de IL-6 fue
observada en las concentraciones de 50, 500 y 1000 pg/mL, pero sin evidenciar diferencias
importantes.
La tabla 5 presenta la producción intracelular de O2- (NBT) en embriones de ratón al ser
cultivados por 96 horas en presencia de IL-1β, IL-6 y TNF-α en diferentes concentraciones.
Para este ensayo fueron utilizados 10 embriones por condición y la tabla muestra la
estimación de la coloración violeta representada por un sistema de cruces (semicuantificación) anteriormente mencionado; mostrando como la coloración violeta solo fue
evidente en embriones incubados con IL-1β y con TNF-α en las concentraciones más bajas
(1 y 10 pg/mL) respectivamente; mientras que en los incubados con IL-6 en todas las
concentraciones (50, 500 y 1000 pg/mL).
48
IL-1β [1pg/mL]
Control (-)
IL-6 [50 pg/mL]
IL-1β [10pg/mL]
IL-6 [500 pg/mL]
IL-1β [100pg/mL]
IL-6 [1000 pg/mL]
TNF-α [10 pg/mL] TNF-α [100 pg/mL] TNF-α [1000 pg/mL]
Figura 7: Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio óptico luego de
realizar la prueba para determinar la producción intracelular O2- (NBT) durante el
desarrollo embrionario murino en presencia de IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y
1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control).
49
Tabla 5: Semi-cuantificación de la producción intracelular de O2- (NBT) durante el
desarrollo embrionario murino en embriones incubados en presencia de IL-1β (1, 10 y 100
pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las
mismas (control).
Producción de O2- semi-cuantitativa (N°, %)
Control
IL-1β
IL-6
TNF-α
Condición
N° de
[pg/mL]
embriones
0
+
++
+++
++++
0
10
10(100%)
-
-
-
-
1
10
-
10(100%)
-
-
-
10
10
10(100%)
-
-
-
-
100
10
10(100%)
-
-
-
-
50
10
4(40%)
6(60%)
-
-
-
500
10
1(10%)
9(90%)
-
-
-
1000
10
-
2(20%)
7(70%)
1(10%)
-
10
10
-
-
10(100%)
-
-
100
10
10(100%)
-
-
-
-
1000
10
10(100%)
-
-
-
-
4- Efecto de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α sobre la producción y liberación de
óxido nítrico por embriones murino al medio de cultivo:
En orden de examinar el efecto de la IL-1β, IL-6 y TNF-α sobre la producción y liberación
de óxido nítrico al medio de cultivo por los embriones, evaluamos los niveles de óxido
nítrico tanto en el medio donde fueron cultivados los embriones del grupo control como en
el medio donde fueron cultivados los embriones expuestos a IL-1β, IL-6 y TNF-α durante
96 horas.
La tabla 6 y figura 8 muestran el efecto de la IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y
1000 pg/mL) y TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) sobre la producción y liberación al medio
50
de cultivo de óxido nítrico por los embriones murino, mostrando que no hay diferencia
estadísticamente significativa entre el grupo control y los embriones cultivados en
presencia de IL-1β, IL-6 y TNF-α; sin embargo en la figura 8 se evidencia una tendencia
que indica un aumento en las concentraciones de óxido nítrico que se correlaciona con el
aumento en las concentraciones de TNF-α.
Tabla 6: Efecto de la IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL) y TNF-α
(10, 100 y 1000 pg/mL) sobre la producción y liberación de óxido nítrico al medio de
cultivo por embriones de ratón.
Control
IL-1β
IL-6
TNF-α
Condición
Concentración de óxido nítrico
IL [pg/mL]
X +/- DS
0
5846,0 +/- 2220
1
5562,2 +/- 4009
0,9055
10
5392,7 +/- 1110
0,7275
100
5460,7 +/- 715
0,75524
50
9245,7 +/- 1869
0,0576
500
5997,0 +/- 1189
0,9085
1000
7090,5 +/- 1630
0,4011
10
3324,2 +/- 880
0,0792
100
6752,2 +/-2961
0,6417
1000
10084,2 +/- 3834
0,1043
P
Datos analizados por el Test de Student’n
Estos resultados indican que la incubación con IL-1β e IL-6 no induce mayor síntesis de
óxido nítrico en embriones cultivado in vitro al ser comparados con el grupo control,
mientras que TNF-α si pareciera tener un efecto inductor, ya que al realizarse un estudio de
correlación entre la concentración de ON y la concentración de TNF-α se obtuvo una
correlación de 0,82, la cual es estadísticamente significativa.
51
Concentración ON
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
0
1
10 100
IL-1B [pg/mL]
50
500 1000
10
100 1000
IL-6 [pg/mL]
TNF-alfa [pg/mL]
Figura 8: Concentraciones promedio de óxido nítrico liberadas al medio de cultivo por
embriones de ratón cultivados en presencia de IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y
1000 pg/mL), TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (grupo control).
5-Efecto de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF-α sobre la apoptosis (TUNEL):
Con la finalidad de evaluar el efecto de la IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000
pg/mL) y TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) sobre la apoptosis en embriones murino
estudiamos la apoptosis en los embriones expuestos a IL-1β, IL-6 y TNF-α en las distintas
concentraciones durante el cultivo de 72 horas y en los embriones cultivados en condición
control.
Las células o blastómeras del embrión fueron consideradas como TUNEL-positivo cuando
presentaron un patrón de marcaje verde fluorescente brillante.
52
Control (-)
Control (+)
IL-1β [1pg/mL]
IL-6 [50 pg/mL]
IL-1β [10pg/mL]
IL-6 [500 pg/mL]
IL-1β [100pg/mL]
IL-6 [1000 pg/mL]
TNF-α [10 pg/mL] TNF-α [100 pg/mL] TNF-α [1000 pg/mL]
Figura 9: Imágenes obtenidas al observar los embriones en microscopio de fluorescencia
luego de realizar la técnica para evaluar apoptosis (TUNEL) durante el desarrollo
embrionario murino en presencia IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL), IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL),
TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) y en ausencia de las mismas (control).
La figura 9 muestra imágenes de embriones incubados con la IL-1β (1, 10 y 100 pg/mL),
IL-6 (50, 500 y 1000 pg/mL) y TNF-α (10, 100 y 1000 pg/mL) luego de realizarles la
técnica de TUNEL para evaluar la apoptosis, mostrando que en todas las concentraciones
estudiadas los embriones presentaron fluorescencia y que la intensidad de la fluorescencia
53
fue directamente proporcional al aumento en las concentraciones de la IL-1β y TNF- α,
mientras que en embriones incubados con IL-6 no se observó este efecto dosis dependiente.
Estos resultados indican que la IL-1β, IL-6 y TNF-α inducen apoptosis en las células
embrionarias, lo cual no ocurre en los embriones control negativo. El estímulo que ejerce la
IL-1β y el TNF- α parece ser dosis dependiente, ya que aumenta con la concentración de la
IL, lo cual no ocurre con en la incubación con IL-6.
54
X- DISCUSIÓN
En condiciones in vivo, la fecundación ocurre en el ser humano en la región ampularístmica de las trompas de Falopio bajo el ambiente del fluido peritoneal; durante los
primeros 3 a 4 días de desarrollo, el embrión es trasportado a través de la trompa u
oviducto hasta que aproximadamente al día 5 post-fecundación entra en la cavidad
endometrial cuando se encuentra en estadio de mórula o blastocisto para la posterior
implantación (Thaler y col, 2003). Durante su trayectoria por la trompa, el embrión sufre
divisiones celulares, diferenciación y apoptosis y es dependiente de las secreciones
luminales tanto del oviducto como del útero para su nutrición.
Los componentes del fluido peritoneal tanto celulares como acelulares son dinámicos y
están en constante interacción, siendo influenciados tanto por eventos fisiológicos del ciclo
menstrual como por procesos patológicos, como la enfermedad inflamatoria pélvica
(Bedaiwy y col, 2007), por lo que diversos estudios han sido enfocados en la determinación
de los componentes del fluido peritoneal tanto en condiciones fisiológicas como
patológicas.
Se ha demostrado la presencia de diversos factores de crecimiento y citocinas en el fluido
peritoneal de mujeres sin patología pélvica (Buyalos y col, 1992; Taketami y col, 1992;
Podgaec y col, 2007; Bedaiwy y col, 2001), así como la expresión de sus respectivos
receptores en embriones pre-implantación, lo que sugiere una comunicación bidireccional
de tipo química entre el embrión y el endometrio materno, fundamental para el desarrollo
embrionario (Hardy y Spanos, 2002). Adicionalmente se ha demostrado que la expresión de
estos factores de crecimiento y citocinas como de sus receptores son estadio-específico
durante el desarrollo embrionario pre-implantación.
55
Procesos inflamatorios como la endometriosis, las infecciones y el hidrosalpinx pueden
activar una respuesta inmune local a nivel de la trompa provocando la liberación de
citocinas pro-inflamatorias (Díaz-Cueto y col, 2001; Fabián y col, 2004; Glabouski y col,
2005), lo que ha sido demostrado en el fluido peritoneal y tubárico de mujeres con
procesos inflamatorios en quienes se ha demostrado la presencia de concentraciones
elevadas de IL-1β (Taketami y col, 1992; Sokolov y col, 2005); IL-6 (Buyalos y col, 1992;
Sokolov y col, 2005) y TNF-α (Taketami y col, 1992; Bedaiwy y col, 2001).
Considerando que las citocinas son necesarias para la ovulación, fertilización y desarrollo
embrionario temprano no es difícil suponer que procesos inflamatorios puedan alterar las
concentraciones de las mismas y se correlacionen con la infertilidad (Vissiliadis y col,
2005).
Debido a lo anteriormente mencionado planteamos cultivar embriones de ratón en estadio
de pre-implantación en condiciones que asemejen un ambiente inflamatorio, caracterizado
por la presencia de niveles elevados de IL-1, IL-6 y TNF- en el medio de cultivo, para
evaluar el efecto de estas citocinas sobre el desarrollo embrionario, la producción de ROS y
potencial daño al ADN.
Es importante destacar que utilizamos citocinas humanas como ligando y los receptores de
embriones murino. Se ha descrito una alta homología estructural entre las citocinas
empleadas en este estudio y las de murino, así para IL-1β la homología es de76.6%, IL-6
de 77.0% y TNF-α de 82.1% según los datos reportados por UniGene, NCBL. Por otra
parte se ha indicado una alta homología estructural inter-especie entre IL-1 y TNF-.
Adicionalmente un estudio reportó una elevada interacción entre TNF- humano con
receptores de ratón, tanto para TNF-R1 y TNF-R2 (Bossen y col. 2006).
Como se indicó en la introducción la incubación de embriones de ratón con fluido
peritoneal o de hidrosalpix de mujeres con endometriosis y otras enfermedades
56
inflamatorias pélvicas provoca embriotoxicicidad en embriones murino, lo que podría
explicarse por la alta homología que existe entre las citocinas humanas y de ratón.
Para llevar a cabo esta investigación se utilizó un intervalo de concentración de las
diferentes citocinas tomando en cuenta diversas publicaciones que hacen referencia a los
valores determinados tanto en condiciones fisiológicas como inflamatorias (patológicas).
Las concentraciones seleccionadas para cada citocina fueron las siguientes: IL-1: 1,
10,100 pg/ml; IL-6: 50, 500, 1000 pg/ml y TNF-: 10, 100, 1000 pg/ml.
En condiciones in vitro solo algunos embriones se desarrollan con buena calidad, mientras
que un porcentaje muestran morfología anormal debido a una inadecuada división e
incremento de la fragmentación celular (Goyanes y col, 1990), sin embargo se ha sugerido
que el desarrollo inadecuado de los embriones in vitro podría deberse a condiciones
inapropiadas de cultivo (Yang y col, 1998).
Antes de entrar en discusión sobre los resultados de nuestro estudio hay que destacar que
nuestro trabajo fue llevado a cabo bajo condiciones de cultivo óptimas, las cuales son
fundamentales para el desarrollo embrionario pre-implantación, ya que es conocido que los
embriones in vitro tienen un desarrollo deficiente al ser comparados con aquellos
desarrollados in vivo. Los medios de cultivo óptimos deben basarse en el patrón básico de
los requisitos nutricionales del embrión, así como imitar con la mayor fidelidad el entorno
fisiológico del embrión durante su recorrido por el tracto reproductor femenino.
Entre los requerimientos básicos del embrión y por lo tanto los componentes básicos de un
medio de cultivo adecuado, se encuentran, altas concentraciones de piruvato y lactato y
bajas de glucosa durante las primeras divisiones celulares y después de alcanzar las 6-8
blastómeras, bajas concentraciones de piruvato y lactato y mayores de glucosa,
adicionalmente el medio debe tener aminoácidos que varían según el estadio embrionario,
sales minerales, enzimas, vitaminas, EDTA, albúmina sérica, también son fundamentales
57
aspectos del sistema como, la pureza del agua, la fase de gas, volumen de incubación,
temperatura, entre otros.
Las condiciones de cultivo sub-óptimas han sido señaladas como un factor determinante en
dos fenómenos presentes en el cultivo de embriones: el bloqueo o arresto en el desarrollo y
la fragmentación (Devreker y col, 1999; Lawitts y col, 1991). Adicionalmente, el bloqueo
en el desarrollo ha sido relacionado con factores como: fracaso en la activación del genoma
embrionario, desbalance en la concentración de ciertos constituyentes de medios de cultivo
(Lawitts y col, 1991), concentraciones de glucosa inadecuadas en cultivo (Leppens y col,
1997; Sakkas y col, 1993), concentraciones elevadas de oxígeno (Yang y col, 1998) y
niveles elevados de ROS (Favetta y col, 2007), entre otros.
Dado que las condiciones en nuestro estudio fueron óptimas, como lo demuestran los
resultados del grupo control, podemos asegurar que los resultados observados bajo las
diferentes condiciones experimentales fueron debido al efecto de las citocinas.
La calidad embrionaria puede evaluarse por diferentes indicadores. Entre ellos están el
índice de blastulación, el arresto y el retraso en el desarrollo y la fragmentación de las
blastómeras.
Se ha planteado que la fragmentación podría actuar como un mecanismo de defensa del
embrión para librarse de componentes citoplasmáticos dañinos o para mantener cierta
relación núcleo/citoplasma y se considera que la presencia de fragmentos podría tener un
efecto pernicioso por el secuestro de proteínas reguladoras al interferir entre las blastómeras
comprometiendo el proceso de compactación (Jurisicova y col, 2004).
Es conocido que los embriones fragmentados típicamente contienen blastómeras de
diferentes tamaños, con fragmentos celulares que parecen mantener la integridad de la
membrana. El promedio del tamaño de las blastómeras en embriones fragmentados esta
significativamente reducido por el grado de fragmentación conllevando a una disminución
del contenido celular y teniendo así un efecto perjudicial sobre la futura masa del embrión
(Jurisicova y col, 2004).
58
Se ha demostrado que el arresto embrionario temprano es disparado por la expresión de
genes asociados con elevados niveles de estrés oxidativo, encontrando una relación entre
niveles elevados de estrés oxidativo con una incidencia incrementada de arresto
embrionario temprano y la sobre regulación de la molécula adaptadora de estrés p66
(Favetta y col, 2007).
Los resultados de nuestro estudio demostraron que las citocinas pro-inflamatorias: IL-1β,
IL-6 y TNF- ejercen un efecto deletéreo sobre el desarrollo embrionario murino preimplantación cuando son adicionadas al cultivo en concentraciones consideradas como
patológicas. Sin embargo, en la primera concentración considerada como patológica (la
mas cercana a la fisiológica), el efecto no es tan evidente, lográndose la obtención de
blastocistos de calidad óptima (excepto en los embriones expuestos a IL-6, los cuales
alcanzaron el estadio de blastocisto pero con una calidad subóptima).
A medida que aumentan las concentraciones de las citocinas en cultivo disminuye
proporcionalmente el porcentaje de obtención de blastocistos y aumentan tanto el retraso y
el arresto en el desarrollo como los defectos morfológicos, predominando por la incubación
con IL-1: la asimetría en el tamaño y forma de las blastómeras; por la incubación con IL6: la fragmentación y el deterioro de la zona pelúcida y por la incubación con TNF-: la
pérdida de la relación del tamaño entre blastómera/embrión.
Estudios en roedores y otras especies sugieren que citocinas y factores de crecimiento
regulan la formación de blastocistos y el porcentaje de desarrollo de embriones preimplantación (Hardy y Spanos, 2002). Adicionalmente, se conoce que los embriones preimplantación expresan receptores para diferentes factores de crecimiento y citocinas
durante su desarrollo, así la adición de estos factores podría afectar el desarrollo de los
mismos (Hardy y Spanos, 2002).
Las citocinas ejercen sus funciones a través de la unión a receptores específicos comunes o
independientes presentes en las membranas celulares de las células blanco o en ocasiones el
receptor es liberado y se encuentra disuelto en el contenido extracelular (forma soluble).
59
Se ha descrito que existen dos tipos de receptores para TNF-α, el TNF-R1 y TNF-R2. El
TNF-R1 tiene un dominio intra-citoplasmático del receptor conocido como dominio de la
muerte, mientras que el TNF-R2 carece de este dominio. La activación de TNF-R1 por
TNF conduce al reclutamiento del dominio de la muerte y la activación de la cascada de
cisteína proteasas llamadas caspasas llevando a la inducción de la apoptosis (Kawamura y
col, 2007).
Kawamura y col (2007) describen que en embriones de ratón pre-implantación en los
estadios de dos y cuatro células se expresa el receptor TNF-R1 y esta expresión aumenta en
los estadios de blastocisto y blastocisto expandido, sin embargo no se expresa el receptor
TNR-F2. Estos resultados indican que el efecto del TNF-α observado en nuestro trabajo
debe ser mediado por el receptor TNF-R1, el cual activa la ruta de la apoptosis.
En cuanto a los receptores de IL-1 e IL-6 Hardy y Spanos (2002) indican que se expresan
en el embrión en los estadios de una, dos y 8 células, no se detectan en estadio de mórula y
se vuelven a detectar en estadio de blastocisto (Hardy y Spanos, 2002).
En el presente trabajo se evaluó el efecto de las citocinas sobre la producción de especies
reactivas al oxígeno y de oxido nítrico. Los ROS son los productos formados durante los
pasos intermediarios de la reducción del oxígeno: el radical anión superóxido (O2-), el
radical peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (OH·), correspondientes a los
pasos de la reducción por uno, dos y tres electrones respectivamente (Guerin y col, 2001).
Los ROS son producidos por el metabolismo normal embrionario por diversas rutas
metabólicas y enzimáticas, incluyendo la fosforilación oxidativa (OXPHOS), NADPH
oxidasa y xantina oxidasa, así como por el medio que lo rodea.
El anión superóxido y el radical hidroxilo son los dos principales ROS generados por los
embriones con el H2O2 como un intermediario (Guerin y col, 2001). La cantidad de ROS
producida por los embriones varia con el estadio de desarrollo (Nasr-Esfahani y col, 1991)
e incrementa cuando son producidos in vitro comparado con los derivados in vivo (Favetta
y col, 2007; Tranguch y col, 2003).
60
El efecto deletéreo que hemos evidenciado de las citocinas IL-1β, IL-6 y TNF- sobre el
desarrollo embrionario podría ser explicado por los hallazgos encontrados en otros tejidos
que demuestran que ciertas citocinas pueden inducir la producción de ROS en diversas
células (Volk y col, 2000; Sugino y col, 2002): por ejemplo, se ha demostrado que IL-1 y
TNF- pueden inducir la producción de ROS por las células endoteliales conllevando a
peroxidación lipídica y daño al ADN (Volk y col, 2000). IL-1 e IL-6 favorecen la
acumulación de peróxido de hidrógeno en la mitocondria y su posterior deterioro (MathyHartert y col, 2008).
Adicionalmente trabajos en embriones indican que TNF- puede inhibir el desarrollo de
embriones por activar mecanismos de apoptosis (Kawamura y col, 2007). En bovino la
adición al cultivo de TNF-α afecta negativamente el desarrollo embrionario y disminuye el
porcentaje de obtención de blastocisto lo que indica que en esta especie también podría
expresarse tempranamente los receptores para TNF-α (Soto y col, 2003).
En nuestra investigación evaluamos si la incubación de embriones de ratón con citocinas
pro-inflamatorias podría inducir la producción intracelular de peróxido de hidrógeno por
los embriones murino, encontrando que efectivamente, las citocinas en estudio: IL-1β, IL-6
y TNF-α en las concentraciones consideradas como patológicas inducen la producen H2O2
de una forma dosis dependiente, observándose un efecto menos notorio en los embriones
incubados con la IL-6.
El aumento en la producción de H2O2 en los embriones por la incubación con las citocinas
pro-inflamatorias (efecto dosis dependiente) se correlaciona con los resultados observados
en el desarrollo embrionario (que se ve afectado negativamente en las concentraciones
consideradas como patológicas, también con un efecto dosis dependiente), lo que nos
podría llevar a sugerir, que en concentraciones patológicas de citocinas pro-inflamatorias,
el aumento de las concentraciones de H2O2 podría estar afectando negativamente el
desarrollo de los embriones en cultivo.
61
Adicionalmente, se ha demostrado que IL-1 e IL-6 disminuyen las defensas antioxidantes
en el citocromo provocando acumulación de peróxido de hidrógeno en la mitocondria y su
posterior deterioro (Mathy-Hartert et al, 2008).
Otras investigaciones apoyan nuestros resultados y el hecho de que altas concentraciones de
ROS pudieran afectar el desarrollo embrionario pre-implantación, reportando que la
presencia de un desarrollo retrasado (menos de 7 células al día tres de cultivo), la alta
fragmentación (mas del 10%) y la formación reducida de blastocistos con características
normales están asociados con niveles de ROS incrementados al día 1 de cultivo (Bedaiwy
y col, 2004).
Adicionalmente evaluamos si la incubación de embriones de ratón con citocinas proinflamatorias podría inducir la producción intracelular de anión superóxido por los
embriones murino, encontrando que en los embriones incubados con IL-1β y TNF-α hubo
producción intracelular de este radical libre solo en la concentración mas baja considerada
como patológica, es decir, aquella cercana a la considerada como fisiológica y donde
encontramos que el desarrollo embrionario fue óptimo, alcanzando estadios de blastocistos
con una buena calidad, mientras que en las concentraciones superiores de ambas citocinas
(donde el desarrollo embrionario fue drásticamente afectado negativamente) no
evidenciamos la producción intracelular del anión superóxido como era de esperarse.
Li y col (2009), en un estudio reciente proponen un mecanismo por el cual IL-1β podría
generar ROS, indicando que la estimulación de esta citocina induce la endocitosis de IL-1
R1 dependiente de MYD88 y conlleva al reclutamiento de NOX2 (una oxidasa NADPH
fagocítica) en el compartimiento endosomal de forma dependiente de Rac1 (una GTPasa
fundamental en la producción de (O·) por oxidasas NADPH). Así el (O·) producido en el
compartimiento endosomal se dismuta espontáneamente hasta H2O2 para difundir fuera del
endosoma. Este estrés oxidativo local es el que dispara la activación de IKK y NF-kB (Li y
col, 2009).
62
Adicionalmente se ha propuesto que la estimulación de TNF-α en células deficientes de
NF-kB induce la producción de ROS causando la inactivación de las MKPs (fosfatasas
cinasas MAP), lo que conduce a la activación sostenida de la vía JNK y a la apoptosis; sin
embargo en células con presencia de NF-kB se induce la eliminación de ROS por la
codificación de genes para enzimas antioxidantes, lo que inhibe la activación de la vía JNK
y favorece la supervivencia celular (Gloire y col, 2006).
En los embriones incubados con IL-6 el patrón de producción del anión superóxido fue
totalmente diferente al que mostraron los embriones incubados tanto con IL-1β como con
TNF-α. En los embriones incubados con IL-6 se evidenció la producción intracelular del
anión superóxido en todas las concentraciones consideradas como patológicas, sin
encontrarse alguna diferencia importante entre las concentraciones estudiadas.
Nos parece importante destacar que el desarrollo embrionario se vió afectado
negativamente por la incubación con la IL-6, pero que sin embargo, hasta a la mayor
concentración considerada como patológica se logró la obtención de blastocistos, aunque se
observaron altos porcentajes de fragmentación, lo que podría indicar un efecto menos
embriotóxico sobre el desarrollo embrionario, o por lo menos en las concentraciones
estudiadas.
Por otro lado, el oxido nítrico (ON) ha sido identificado como una molécula mensajera de
difusión rápida que esta involucrada en algunos procesos fisiológicos y su síntesis a partir
de L-arginina es catalizada por la oxido nítrico sintasa (NOS) en tejidos mamíferos. La
NOS y el ON tienen importantes funciones en la reproducción: el ON regula la secreción de
las hormonas sexuales, los embriones murino pre-implantación producen ON y el
desarrollo normal de embriones es inhibido con inhibidores de (NOS) (Cao y col, 2007).
Dado que el ON es también un radical libre hemos determinado las concentraciones de ON
en el medio de cultivo donde fueron incubados los embriones con las citocinas proinflamatorias en concentraciones patológicas, sin encontrar diferencias estadísticamente
significativas entre los promedios de los grupos estudiados y el grupo control. Sin embargo,
en el medio de cultivo donde fueron incubados los embriones con TNF-α encontramos un
63
aumento en las concentraciones de ON que se correlacionó con el aumento en las
concentraciones de TNF-α, que aunque no fue significativo, al comparar en promedio con
el grupo control, si demostró una correlación positiva (0,82) al relacionar la dosis de TNF-α
con la concentración de ON, lo que nos permite inferir que esta citocina induce en el
embrión la producción intracelular de ON.
Adicionalmente, Gouge y col, 1998 también demostraron la producción de ON en
embriones de ratón pre-implantación, determinando los metabolitos del ON como nitrato y
nitrito en el medio de cultivo de los embriones por la reacción de Greiss (Gouge y col,
1998), como lo hicimos nosotros. Sin embargo, Athanassakis y col. (2000) no lograron
detectar la producción de ON en medio de cultivo de embriones por la reacción de Greiss
en el desarrollo normal, no obstante, cuando se aplicaba un estimulo tóxico al embrión, con
INF-γ, TNF-α y lipopolisacárido lograron detectar una inducción significativa de ON por
los embriones a una concentración detectada por la reacción de Greiss.
Sería importante en futuros estudios repetir los ensayos realizados en presencia de los
anticuerpos para cada una de las citocinas evaluadas, para comprobar que el incremento de
los ROS sea debido a las mismas. Por otra parte se podrían realizar ensayos empleando
enzimas antioxidantes, como por ejemplo la superoxido dismutasa, para evaluar si el efecto
observado en el desarrollo embrionario es mediado por la liberación de ROS.
Para complementar los datos aportados por los ensayos de ROS y poder explicar la acción
de estas moléculas sobre el embrión, realizamos la técnica de TUNEL para evidenciar la
posible presencia de apoptosis en los embriones incubados con las citocinas evaluadas en
las concentraciones consideradas como patológicas, encontrando que todos los embriones
sometidos a la incubación con las citocinas en estudio fueron apoptosis positivo. En la
mayoría de estudios donde han aplicado ensayos de apoptosis por TUNEL marcan las
células y posteriormente los núcleos fragmentados, nosotros no marcamos las células, sino
que evaluamos directamente las blastómeras con fragmentación de ADN, como lo hicieron
Yang y col, 1998.
64
Cabe destacar que la IL-1β y el TNF-α ejercieron un efecto dosis dependiente en la
apoptosis observada en los embriones, a diferencia de la IL-6. Encontramos una correlación
en nuestros datos con respecto a la producción de H2O2 y la presencia de apoptosis en los
embriones expuestos a las citocinas en concentraciones patológicas (efecto también
observado de forma dosis dependiente, exceptuando en los embriones incubados con IL-6).
Yang y col (1998), encontraron una relación directa entre las concentraciones elevadas de
H2O2 y un número elevado de embriones fragmentados, sugiriendo que los ROS podrían
también inducir apoptosis en los embriones, sin embargo, encontraron apoptosis solo en
embriones fragmentados, sugiriendo que los embriones humanos tempranos desarrollados
en altas condiciones de oxígeno in vitro sufren fragmentación citoplasmática debido a la
elevación de H2O2 y eventualmente sufren apoptosis (Yang y col, 1998).
Sin embargo, en nuestra investigación, evidenciamos apoptosis en todos los embriones
sometidos a la incubación con las citocinas pro-inflamatorias estudiadas (en
concentraciones consideradas como patológicas), tanto en los fragmentados como en los no
fragmentados, pero por supuesto, nuestros embriones habían sido sometidos a una
incubación previa con citocinas por 72 horas, lo cual indujo el aumento en la producción de
H2O2 que podría haber conducido a la posterior apoptosis.
Cabe destacar que en los embriones expuestos a IL-6, la fragmentación fue altamente
encontrada y en ellos la producción de H2O2 fue menos evidente que en los embriones
expuestos a las otras citocinas, adicionalmente en los embriones incubados con IL-6 la
apoptosis fue observada pero no de una forma dosis dependiente, esto nos hace asumir que
esta citocina actúa en los embriones murino pre-implantación por una vía y de una manera
distinta que la IL-1β y el TNF-α, los cuales si mantienen un patrón de comportamiento
bastante similar.
Se ha reportado que la respuesta de la célula contra el estrés oxidativo puede diferir
dependiendo de la intensidad del estrés y de su duración y esta respuesta varía desde la
estimulación de la proliferación celular al arresto o la muerte celular por apoptosis o
necrosis (Karja y col, 2006).
65
Nuestros resultados indican que el TNF-α podría tener un efecto inductor sobre el embrión
en la producción intracelular y liberación al medio de cultivo de ON que podría también
activar vías de señalización conducentes a la muerte celular programada, ya que el ON es
también un radical libre y un importante bio-regulador de apoptosis (Chung y col, 2001).
Algunos estudios indican que las altas concentraciones de ON podrían ser uno de los
factores que inducen la apoptosis en embriones y retarda el desarrollo embrionario bajo
condiciones de microgravedad simulada (Cao y col, 2007).
Es importante destacar que evidenciamos apoptosis en embriones desde estadios de 2
células hasta el estadio de blastocisto, mientras que en otros estudios han demostrado la
presencia de apoptosis solo en embriones en estadios avanzados del desarrollo embrionario,
mórula o blastocisto.
Algunos estudios han evidenciado que embriones tempranos arrestados (hasta 6 células) no
muestran cambios bioquímicos o morfológicos de apoptosis o características que
concuerden con la ruta apoptótica (Favetta y col, 2007), mientras que otro estudio ha
evidenciado cariólisis detectada por TUNEL en embriones murino en estadio temprano
luego de una incubación de 96 horas con TNF-α (Byrne y col, 2002). Las divergencias en
los resultados podrían deberse a diferencias en la especie o cepas utilizadas, así como a las
condiciones de cultivo, fuente de TNF-α o al sistema de evaluación de muerte celular
(Fabian y col, 2006).
Lo que si esta claro parece ser que ovocitos y embriones en proceso de división celular
poseen todos los componentes de la maquinaria apoptótica, tanto los miembros de la
familia Bcl-2 como las caspasas (Gjorret y col, 2007).
A nivel molecular se ha demostrado que el TNF-α es el principal efector en la respuesta
inflamatoria y que como las otras citocinas pro-inflamatorias al unirse a su receptor
específico de membrana puede activar diversas vías de señalización celular para regular
componentes de la inflamación e invasión, entre estas vías se encuentran: MEK, p38 y NFkB (Grund y col, 2008).
66
Así como recientemente se ha identificado la proteína p66Shc, que es una proteína
proveniente de la familia Shc que responde a señales de trasducción mitogénicas y
apoptóticas. La p66Shc es considerada un punto de integración en algunas rutas de
señalización que afectan la función mitocondrial y debido a que genera H2O2 mitocondrial
y dispara la apoptosis se ha considerado fundamental en la regulación de la ruta de
señalización en la disfunción celular mediada por ROS (Betts y col, 2008).
Basándonos en la ruta de señalización de la p66Shc propuesta por Betts y col, 2008,
proponemos que, las citocinas pro-inflamatorias al estar elevadas en los procesos
inflamatorios y al unirse a sus receptores específicos de membrana podrían activar
mecanismos que conlleven a la activación de varias cinasas que posteriormente podrían
activar la p66Sch (por la fosforilación de la serina 36), llevándola al espacio intermembrana mitocondrial donde interactúa con el citocromo c reducido para producir H2O2 y
abrir los poros de permeabilidad de transición, lo cual lleva a la generación y liberación de
ROS dentro del citosol. La producción intracelular de ROS mediada por p66Sch puede
conducir a arresto en los embriones cuando las concentraciones de ROS son moderadas o
inducir apoptosis si las concentraciones de ROS son elevadas (Betts y col, 2008).
En resumen los resultados del presente estudio indican que la incubación de embriones de
dos células con TNF-α provoca una disminución en el índice de blastulación, un
incremento en el arresto en el desarrollo, llegando al 100% en la concentración de 1000
pg/ml. Adicionalmente las concentraciones de 100 y 1000 pg/mL causaron un incremento
de la producción de H2O2, pero pocas modificaciones en la producción de radical
superoxido (O·). Adicionalmente se observó una correlación estadísticamente significativa
entre el aumento en la concentración de TNF-α y niveles de oxido nítrico en el medio de
cultivo.
Por su parte la incubación de los embriones con IL-1 arroja resultados muy similares a los
TNF-α en cuanto a la disminución de los índices de blastulación, producción de peróxido
de hidrógeno y anión superóxido. Todos estos hallazgos parecen indicar que la ruta por la
67
cual actúan estas dos citocinas puede ser muy similar, desencadenando en ambos casos las
rutas apoptóticas. Por su parte la IL-6 también estimula la producción de peróxido de
hidrógeno y además de anión superóxido, conllevando también a la apoptosis, sin embargo
el efecto de la IL-6 sobre la disminución en el índice de blastulación es menor, lográndose
un porcentaje mayor de blastocistos que con las otras citocinas, aunque los blastocistos
presentan una alta fragmentación. Estos resultados parecen indicar que el efecto perjudicial
las citocinas sobre el desarrollo embrionario es mediado por ROS y generación de
apoptosis.
En conclusión podemos decir que las citocinas pro-inflamatorias estudiadas: IL-1β, IL-6 y
TNF-α, en concentraciones que asemejan los procesos inflamatorios del tracto reproductor
femenino, afectan negativamente el desarrollo embrionario pre-implantación murino. La
IL-1β y el TNF-α estimulan en embriones pre-implantación murino la producción de
especies reactivas de oxígeno como H2O2 comprometiendo la integridad y las funciones del
embrión conduciendo a la apoptosis del mismo.
Sin embargo, estos resultados deben ser tomados con precaución debido a que in vivo hay
mas de una citocina y factores de crecimiento presentes en el tracto reproductor y es muy
difícil determinar cual de ellas podría ser responsable de un efecto u otro, particularmente si
consideramos que algunas citocinas pueden tener una acción inhibitoria o sinérgica sobre
otras citocinas. Además en condiciones in vivo el organismo cuenta con mecanismos
enzimáticos y no enzimáticos para defenderse de los radicales libres, lo que podría
modificar los resultados encontrados en este estudio. Por lo tanto, nuestras conclusiones se
limitan a describir el efecto de una citocina en particular, cuando se ha evaluado
individualmente.
Adicionalmente, es importante tener claro que no existe un modelo experimental capaz de
simular todo lo ocurrido in vivo en cuanto a los mecanismos de supervivencia del embrión,
ya que la interacción entre los factores de crecimiento es muy compleja y podría ser
influenciada tanto por ciertos estadios de desarrollo como por mecanismos hormonales.
68
XI-CONCLUSIONES
♦ La IL-1β, IL-6 y TNF-α afectan adversamente el desarrollo embrionario murino preimplantación de forma dosis dependiente.
♦ La IL-1β, IL-6 y TNF-α poseen la capacidad de inducir la producción intracelular de
peróxido de hidrógeno en embriones de ratón de forma dosis dependiente.
♦ La IL-1β y TNF-α poseen la capacidad de estimular la producción intracelular del anión
superóxido en embriones de ratón en concentraciones de 1 y 10 pg/mL respectivamente.
♦ La IL-6 es capaz de provocar la producción intracelular del anión superóxido en
embriones de ratón en todas las concentraciones consideradas como patológicas.
♦ La IL-1β e IL-6 no estimulan la producción de óxido nítrico en los embriones murino preimplantación.
♦ El TNF-α es capaz de inducir la producción de óxido nítrico en embriones de ratón en
cultivo.
♦ La IL-1β, IL-6 y TNF-α en las concentraciones consideradas como patológicas inducen la
apoptosis en los embriones de ratón en cultivo y de ellas solo la IL-6 no lo hace de manera
dosis dependiente.
♦ Estos resultados parecen indicar que el efecto perjudicial que ejercen las citocinas sobre
el desarrollo embrionario es mediado por ROS y generación de apoptosis.
69
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