Download Efecto de la densidad embrionaria sobre el desarrollo de embriones

Universidad Simón Bolívar
Decanato de Estudios de Postgrado
Maestría en Ciencias Biológicas
EFECTO DE LA DENSIDAD EMBRIONARIA SOBRE EL DESARROLLO DE
EMBRIONES DE RATÓN. FACTORES DE CRECIMIENTO IMPLICADOS
Trabajo de grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por
Ana Patricia Contramaestre Montezuma
Como requisito parcial para optar al grado de
Magíster en Ciencias Biológicas
Realizado con la tutoría de la Profesora María Isabel Camejo Bermúdez
Febrero, 2006
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Dedicatoria
Este manuscrito va dedicado a mi hija Patricia Alejandra, luz de mi existencia, alegría
permanente, aliento y equilibrio ante las dificultades, fuerza y determinación para seguir
adelante, fe en la vida y esperanza de un mundo mejor…
A ti -amada hija- una pequeña demostración de mi inmenso amor y agradecimiento.
iv
Agradecimientos
La culminación de la siguiente investigación, fue lograda gracias al apoyo recibido por
parte de personas e instituciones, que son nombradas a continuación.
En primer lugar, mi profundo agradecimiento a la Dra. María Isabel Camejo, profesora
del departamento de Biología de Organismos de la Universidad Simón Bolívar, tutora y
amiga, quien con su respaldo continuo, vocación de servicio y fuente inagotable de
conocimientos, hizo posible la culminación exitosa del presente trabajo de grado.
Al Dr. Freddy Sifontes, antiguo coordinador del Bioterio del Instituto Nacional de
Higiene y actual Jefe (e) de la División de Servicios Técnicos Auxiliares, quien muy
amablemente aportó sus conocimientos y pericia en el manejo de los animales utilizados en la
fase experimental de nuestra investigación. Sin su apoyo, hubiese sido sumamente difícil el
logro de los objetivos.
A la Dra. Lilian Spencer, profesora del departamento de Biología Celular de la
Universidad Simón Bolívar, quien desinteresadamente nos ayudó con la realización de la
electroforesis de proteínas (técnica SDS Page) para la confirmación del adecuado
funcionamiento de los reactivos del kit de ELISA.
A la Dra. Karen Noris, profesora del departamento de Biología Celular de la
Universidad Simón Bolívar, la cual atentamente, facilitó de manera temporal, las instalaciones
de su laboratorio, para el cultivo embrionario.
Al Bioterio del Instituto Nacional de Higiene, institución que proporcionó los ratones
de la cepa CD1 para la ejecución de los experimentos.
Por último, y no menos importante, a mis padres, cuyo apoyo personal y emocional
irrestricto y permanente, permitieron el desarrollo y culminación de mis estudios de postgrado.
v
RESUMEN
Durante el cultivo in vitro de embriones de mamíferos, existe un retraso evidente en su
desarrollo en comparación al desarrollo in vivo, fenómeno atribuido a condiciones subóptimas
de cultivo, entre otras causas. Diversos factores de crecimiento y citocinas producidas por la
madre y el embrión han sido involucrados en el desarrollo embrionario temprano
contribuyendo a mejorarlo. Por otra parte, algunas investigaciones se han enfocado en el
estudio de los cultivos en grupo, donde se observa un incremento de la calidad embrionaria,
debido –probablemente- a la concentración de ciertos factores embriotróficos. Los objetivos
de esta investigación fueron determinar si el cultivo de embriones en grupo genera embriones
murinos de mayor calidad; establecer la existencia de secreción embrionaria del Factor
Estimulador de Colonias de Granulocitos-Macrófagos (GM-CSF) y del Stem Cell Factor
(SCF) y analizar el efecto de su adición exógena sobre la calidad embrionaria. Se recuperaron
embriones en estadio de dos células de ratones hembras (cepa CD1), estimuladas
hormonalmente y se cultivaron aleatoriamente, en forma aislada o en grupo, durante cinco días
hasta alcanzar el estadio de blastocisto. La concentración de GM-CSF Y SCF se determinó en
la gota de cultivo con la técnica de ELISA. Además, se adicionaron –separadamente- ambos
factores al medio de cultivo de una segunda cohorte y se comparó su desarrollo con aquellos
cultivados en forma aislada. Los resultados demuestran que existe una variación significativa
entre la calidad de los embriones que fueron cultivados en forma aislada o en grupo. Se
estableció que GM-CSF y SCF son secretados por embriones murinos y por último, la adición
de ambos factores mostró una marcada mejoría de la calidad embrionaria, a partir del estadio
de ocho células, lo que confirma que GM-CSF y SCF actúan como factores de regulación
embrionaria en fases tempranas del desarrollo.
Palabras clave: blastocisto, cultivo embrionario, desarrollo embrionario preimplantación, GMCSF, SCF
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ÍNDICE GENERAL
Aprobación del Jurado
Dedicatoria
Agradecimientos
Resumen
Índice General
Índice de Figuras
Introducción
Marco Teórico
Requerimientos de nutrientes y metabolismo energético
Técnicas de cultivo y desarrollo embrionario
1. Cocultivo
2. Medios Secuenciales
3. Densidad Embrionaria
Factores de Crecimiento
1. Factores de crecimiento de origen embrionario
2. Efecto de los factores de crecimiento sobre el embrión
3. Factor de Estimulador de Colonias de Granulocitos-Macrófagos
4. Factor de Células Madre ó Stem Cell Factor
Objetivos
Materiales y Métodos
Resultados
Discusión y Conclusiones
Referencias Bibliográficas
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ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1. Etapas del desarrollo desde el ovocito maduro hasta el proceso de eclosión
Fig. 2. Recorrido del ovocito fecundado a través del tracto reproductor materno
Fig. 3. Etapa de activación y expresión del genoma embrionario
Fig. 4. Componentes celulares del blastocisto
Fig. 5. Rol de los aminoácidos durante el período de preimplantación en embriones de
Pág.
1
6
8
9
11
mamíferos
Fig. 6. Comunicación química entre el embrión y el tracto reproductor materno
Fig. 7. Comparación morfológica por microscopia electrónica de cultivos de
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18
monocapas de CEE de pacientes fértiles (n=10 A-C) y pacientes con fallos de
fertilización (n=10, D-F) cultivadas en presencia de blastocistos humanos
Fig. 8. Composición de los medios secuenciales desarrollados por Gardner y
21
colaboradores
Fig. 9. Cultivo embrionario en grupo
Fig. 10. Estructura del GM-CSF
Fig. 11. Eventos intracelulares que se desencadenan para que el SCF entre en contacto
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con el receptor de membrana c-kit
Fig.12. Estructura de los Receptores de membrana para GM-CSF y SCF
Fig. 13. Porcentaje de embriones que formaron Blastocisto y que eclosionaron
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45
(“hatching”) cuando fueron cultivados de forma aislada (n: 19) o en grupo (n: 112).
Fig. 14. Porcentaje de embriones que presentaron retraso en el crecimiento y arresto en
45
el desarrollo cuando fueron cultivados de forma aislada (n: 19) o en grupo (n: 112)
Fig. 15. Cultivos embrionarios aislados desde el estadio de 2 células hasta la formación
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de blastocisto
Fig. 16. Cultivos embrionarios aislados desde el estadio de 2 células hasta la
46
degeneración o muerte
Fig. 17. Cultivo embrionario en grupo
Tabla 1. Concentración de GM-CSF y SCF en las gotas de medio donde fueron
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49
cultivados los embriones murinos en forma individual o en grupo
Fig.18. Porcentaje de embriones que formaron Blastocisto y que realizaron “hatching”
51
cuando fueron cultivados en presencia de GM-CSF (n: 24) y SCF (n: 24), comparados a
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aquellos cultivados en forma aislada sin la adición de factores de crecimiento (n: 56)
Fig. 19. Porcentaje de embriones que presentaron retraso en el crecimiento o arresto en
51
el desarrollo cuando fueron cultivados en presencia de GM-CSF (n: 24) y SCF (n: 24),
comparados a aquellos cultivados en forma aislada, sin la adición de factores de
crecimiento (n: 56)
Tabla 2. Tasas de formación de blastocisto, “hatching”, retraso en el desarrollo y arresto
embrionario, en embriones cultivados en presencia de GM-CSF y SCF, comparados con
los embriones cultivados en forma aislada, sin la adición de factores de crecimiento
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1
INTRODUCCIÓN
El desarrollo embrionario de los mamíferos en fase de preimplantación es
marcadamente similar, e implica la división del ovocito fecundado, la formación y
compactación de la mórula y finalmente, la cavitación con la formación del blastocisto (Fig.1).
Fig. 1. Etapas del desarrollo desde el ovocito maduro hasta el proceso de eclosión
ovocito maduro
cigoto
1º división
2º división
3º división
mórula
compactación
blastocisto temprano
blastocisto cavitado
blastocisto expandido
eclosión o “hatching”
2
El embrión en período de preimplantación es único ya que él se desarrolla en ausencia
de contacto celular directo con el tracto reproductor materno, durante aproximadamente una
semana (en el caso de los humanos) antes de implantarse en el útero. Durante este período, el
embrión sufre divisiones celulares, apoptosis y diferenciación y es dependiente de las
secreciones luminales del oviducto y del útero para su nutrición. Se ha determinado que la
actividad celular del embrión (incluyendo la división celular, expresión génica y
metabolismo), está influenciada por varios factores como la calidad ovocitaria (Moor et
al.1998), las condiciones de cultivo -CO2 y temperatura entre otras- (Bavister et al 1995) y la
densidad embrionaria en el mismo (Lane y Gardner, 1992), así como la comunicación materno
embrionaria (Simon y Valbuena 1999).
Luego del advenimiento de las técnicas de fecundación in vitro en 1969 (Edwards et. al
1969), se ha evidenciado que en el desarrollo embrionario in vitro hay un retraso en la tasa de
crecimiento de los embriones, en relación al desarrollo in vivo, lo que puede comprometer el
potencial de desarrollo e implantación, (Bowman y Mc Laren, 1970; Papaioannou y Ebert,
1986). Más aún, en los blastocistos de ratón, los niveles de apoptosis son tres veces mayores
in vitro que in vivo (Brison y Shultz 1997). Esto sugiere que el tracto reproductor materno
produce importantes factores para el desarrollo embrionario, que actúan a través de una ruta
paracrina, los cuales se encuentran ausentes en condiciones de cultivo in vitro convencionales.
En los últimos años, se han utilizado con éxito, técnicas como el cocultivo de
embriones con monocapas de células epiteliales provenientes del endometrio, oviducto o
incluso células Vero, las cuales han demostrado un incremento en la formación del blastocisto
y número celular en los mismos (Mènezo et. al 1990; Vlad et. al 1996), así como un
incremento en las tasas de embarazo en humanos (Seta, 2001; Simon y Valbuena, 1999). Se
piensa que este fenómeno se debe tanto a la remoción de sustancias embriotóxicas del medio,
por parte de las células de soporte, como a la secreción de factores de crecimiento que mejoran
el desarrollo. Sin embargo, la técnica de cocultivo es extremadamente laboriosa para mantener
en un laboratorio de fecundación asistida y puede acarrear el riesgo de contaminación, por lo
que se ha enfocado la atención en el desarrollo de medios de cultivo definidos (Gardner et. al,
1998a), capaces de mantener la viabilidad de los embriones, sin necesidad de los cocultivos.
3
Por otra parte, hay evidencias importantes -que no escapan a la controversia- que
demuestran que la reducción del volumen de medio en el cual se cultiva al embrión o el
cultivo in vitro de embriones en grupo, mejora el desarrollo y reduce los niveles de apoptosis
(Paria y Dey, 1990; Stoddart et al, 1996; Brison y Shultz, 1997; O´Neill 1998; Lane y
Gardner, 1992), apuntando al hecho de que los embriones por si mismos, también producen
una serie de factores embriotróficos .
Un buen número de investigaciones demuestran que un conjunto de factores de
crecimiento son producidos tanto por el tracto reproductor materno como por el embrión en
fase de preimplantación y que muchos de sus receptores pueden ser detectados sobre la
superficie de este último, sugiriendo la presencia de vías de señalización tanto paracrinas
como autocrinas, respectivamente. Estos incluyen miembros de las familias de factor de
crecimiento insulínico, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento
epidermal (EGF), factor de crecimiento fibroblástico (FGF), factor de crecimiento derivado de
las plaquetas (PDGF), factor estimulador de colonias (CSF), factor estimulador de colonias de
granulocitos macrófagos (GM-SCF) y factor de necrosis tumoral (TNF) (Kane et. al, 1997).
Los estudios en donde se evalúan los efectos de los factores de crecimiento de origen
materno y embrionario in vitro, tanto en ratones como en otras especies, evidencian que estos
factores juegan un papel importante durante la fase de preimplantación (Kaye, 1997; Hardy y
Spanos, 2002), regulando el metabolismo (Ryan et. al, 1990) y la expresión génica (Babaola y
Shultz, 1995), así como la división celular (Robertson et. al 2001) y los niveles de apoptosis
(Wuu et. al 1999).
El efecto de los factores de crecimiento sobre la calidad embrionaria puede ser
analizado a través de diferentes aspectos, tales como la evaluación de embriones que alcanzan
el estado de blastocisto, tasa de desarrollo embrionario, metabolismo, número de células en el
blastocisto, incidencia de división y muerte celular, así como tasas de implantación, embarazo
y fetos nacidos.
4
Las bajas tasas de embarazo producto de los procedimientos de fecundación in vitro
(FIV) han llevado a la necesidad de evaluar y mejorar las condiciones de cultivo embrionario
entre la fase de fecundación y transferencia. Se espera que mejorando tales condiciones,
mejore la viabilidad embrionaria, junto con las tasas de embarazo. Esta es la razón principal
que nos motiva a la realización de la siguiente investigación, en la cual se valorará el efecto
que tiene la densidad embrionaria sobre la calidad del desarrollo de embriones en estadio de
preimplantación. Se determinará la presencia del Factor estimulador de colonias de
Granulocitos–Macrófagos y del Factor de células madre o Stem Cell Factor (GM-CSF y SCF
respectivamente, por sus siglas en inglés) en los medios donde se desarrollaron embriones
cultivados en forma aislada o en grupo, a través de técnicas de ELISA. Por último, se evaluará
el efecto que presentan estos factores sobre el embrión, a través de su adición exógena a los
medios de cultivo donde éstos se desarrollan in vitro. Como método de apreciación de la
calidad embrionaria, se utilizarán sistemas de clasificación y graduación morfológica
convencionales establecidos en la literatura especializada (Van Royen et. al, 1999; Gardner et.
al, 2000b; Fisch et. al, 2001).
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MARCO TEÓRICO
En condiciones naturales, la fecundación en el ser humano ocurre en la región ampularístmica de las trompas de Falopio; luego, el embrión es transportado a través de la trompa u
oviducto hasta el útero, con la ayuda de secreciones epiteliales tubáricas, cilios y
contracciones peristálticas de la musculatura local. Los primeros 3-4 días de desarrollo
embrionario desde la singamia al estadio de mórula, ocurren a nivel de la trompa. Durante
todo este tiempo, las blastómeras permanecen desunidas y se mantienen muy próximas entre
sí, gracias a la zona pelúcida.
Las blastómeras de los embriones tempranos tienen una fisiología análoga a los
organismos unicelulares y sólo después que sufren compactación y se genera el primer epitelio
de transporte, es cuando las células de la nueva mórula presentan una fisiología similar a la de
las células somáticas. (Gardner et. al, 1998b; Lane, 2001). En el estadio de mórula, el embrión
desciende al útero, donde –a través de un proceso dependiente de energía- ocurre la formación
del blastocele y la pérdida de la zona pelúcida, ya sea a través de la eclosión o “hatching” o
por la acción de proteasas uterinas. Una vez que el blastocisto queda libre de la zona pelúcida,
éste se adhiere e implanta en el endometrio del útero (fig. 2).
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Fig. 2. Recorrido del ovocito fecundado a través del tracto reproductor materno
Vitrolife, Closer to Nature (2002).
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REQUERIMIENTOS DE NUTRIENTES Y METABOLISMO
ENERGÉTICO
Conjuntamente con los cambios en la fisiología, el embrión de mamífero sufre cambios
en los requerimientos y utilización de nutrientes durante el período preimplantación. El
embrión humano, al igual que el de muchas otras especies de mamíferos, tienen una
preferencia inicial por el piruvato sobre la glucosa, como nutriente (Hardy y Hooper, 1989).
Sin embargo, durante el desarrollo progresivo del embrión, éste exhibe un incremento en su
capacidad para utilizar la glucosa y durante el proceso de compactación, éste es el principal
carbohidrato utilizado.
La razón para el cambio en la utilización de fuentes de energía, se puede explicar en
términos de cambio en la fisiología del embrión una vez que progresa el desarrollo (Gardner,
1997a).
Previo a la activación y expresión del genoma embrionario, el cigoto exhibe un bajo
nivel de biosíntesis, (Fig. 3). Como resultado directo, hay una alta proporción de ATP/ADP
dentro del embrión (Leese, 1984), la cual inhibe el flujo de glucosa a través de la vía
glicolítica. Una vez que el embrión comienza a incrementar su actividad transcripcional, la
síntesis proteica se incrementa y una vez que el blastocele se forma a través de la acción de las
ATPasas
basolaterales,
hay
un
incremento
en
la
demanda
de
energía
(ATP).
Consecuentemente, la proporción de ATP/ADP en los estadios más tardíos del embrión
disminuye y ocurre un incremento en el flujo glucolítico, lo que conlleva a un incremento en
la utilización de glucosa. (Gardner et. al, 2002)
8
Fig. 3.- Etapa de activación y expresión del genoma embrionario
Hardy y Spanos (2002)
Otro aspecto de la regulación intracelular del metabolismo del embrión, que ha sido
recientemente considerado, es el transporte de malato-aspartato (Lane y Gardner, 2005; Lane y
Gardner, 2000). Estos estudios han revelado que este transporte mitocondrial es fundamental
para controlar el sistema de oxidorreducción intracelular y la utilización de carbohidratos en el
embrión temprano.
Por otra parte, se ha establecido que los diferentes tipos celulares que componen el
blastocisto de ratón, presentan diferentes comportamientos metabólicos (Hewitson y Leese,
1993). Se ha determinado que mientras el trofoectodermo convierte cerca del 50 % de la
glucosa consumida a lactato, la masa celular interna (MCI) es totalmente glucolítica. En el
ratón (Lane y Gardner, 1997) y en el humano (Hardy et. al 1989), la MCI constituye cerca del
35% de las células del blastocisto (Fig. 4). Los análisis del consumo de nutrientes por
embriones individuales desarrollados in vitro han revelado que blastocistos provenientes del
mismo paciente, con características similares desde el punto de vista morfológico, pueden
presentar un amplio rango de consumo de nutrientes (Gardner et. al, 2000c). Esto ha llevado a
9
la hipótesis de que podría ser posible seleccionar blastocistos humanos para transferencia,
utilizando medidas de actividad metabólica no invasivas Gardner et. al, 2000a)
Fig. 4.- Componentes celulares del blastocisto
Hardy y Spanos (2002)
En contraste a la vasta literatura sobre el rol de los carbohidratos en el desarrollo
embrionario, el papel que juegan los aminoácidos (aa) ha recibido poca atención (Gardner et.
al, 2002). Incluso, hasta principios de los años 90, éstos se encontraban ausentes de los medios
de cultivo para embriones, a pesar del hecho de que los aa se encuentran presentes de forma
abundante en los fluidos del tracto reproductor femenino (Casslen, 1987). Más aún, el ovocito
y el embrión mantienen un pool endógeno de aa (Shultz, 1981) y poseen un sistema específico
de trasporte para tomarlos de su entorno (Van Winkle, 1988).
La primera indicación de que los aa jugaban un rol en el desarrollo embrionario, fue
apoyada por Gwatkin en 1966 quien demostró que se requería de ellos para el desarrollo de los
blastocistos de ratón. Cerca de 20 años después, Juetten y Bavister (1983) iniciaron las
investigaciones sobre los efectos de un grupo de aa en el desarrollo de embriones de hámster.
Estudios ulteriores en ratas (Zhang y Amstrong, 1990) y en ratones (Gardner y Sacas, 1993;
Gardner y Lane, 1993) mostraron que los aa no sólo son beneficiosos para los embriones en
cultivo, sino que incrementan significativamente la viabilidad de los mismos.
10
Otros estudios revelaron que los embriones de mamíferos exhiben un requerimiento
bifásico de aa durante el período de preimplantación (Steeves y Gardner, 1999). Por ejemplo,
el cigoto y el embrión temprano se benefician de la inclusión de aa no esenciales,
componentes de medio mínimo esencial de cultivo (MEM) denominado “Eagle” y glutamina.
Es importante señalar que esta composición de aa presenta una alta homología con
aquella presente en altos niveles a nivel del tracto reproductor femenino. Sin embargo,
después del estadio de 8 células, el embrión de mamífero se beneficia de la presencia de un
grupo más complejo de aa, encontrándose que aa esenciales “Eagle”, estimulan el desarrollo
de la MCI. Esta diversificación en la utilización de aa, refleja las necesidades específicas de
los dos tipos celulares dentro del blastocisto y el incremento general en la síntesis proteica
durante el progreso del desarrollo (Epstein y Smith, 1973).
En 1997, Lane y Gardner lograron tasas de implantación equivalentes a la de
embriones desarrollados in vivo, en cigotos de murinos cultivados con aa no esenciales hasta
el estadio de 8 células, seguido del cultivo hasta blastocisto en presencia de aa esenciales. En
2001 Devrecker y colaboradores, reportaron resultados similares con la utilización inicial de
aa no esenciales, seguido de un grupo más complejo de aa para mantener el desarrollo en
cultivo.
La utilización de aa por los embriones humanos ha sido confirmada con la medición de
la producción de amonio por blastocistos individuales, lo cual refleja la transaminación de los
aa. (Lane et. al, 2001). El rol de los aa ha sido el foco de atención de muchas investigaciones y
algunas de sus funciones durante el desarrollo embrionario están enumeradas en la figura 5.
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Fig. 5. Rol de los aminoácidos durante el período de preimplantación en embriones de
mamíferos
*Precursores de biosíntesis
*Buffer de pHi
*Fuente de energía
*Antioxidantes
*Reguladores del metabolismo energético
*Quelantes
*Osmolitos
Gardner et al, (2002) J Reprod Immunol
Se ha demostrado que aa como la glicina y la taurina, presentes a niveles relativamente
altos en el fluido del oviducto, ayudan al desarrollo de embriones en estadio de clivaje. Por lo
tanto, la diferencia en los nutrientes disponibles para el embrión durante su desarrollo y pasaje
a lo largo del tracto reproductor femenino parece confirmar los requerimientos estadioespecíficos del embrión.
12
TÉCNICAS DE CULTIVO Y DESARROLLO EMBRIONARIO
En los laboratorios de fecundación in vitro (FIV), los embriones en estado de
preimplantación, se transfieren rutinariamente al útero alrededor del estadio de dos a ocho
células (día 2 o 3 de cultivo), momento en el cual, en condiciones naturales, deberían estar
transitando por la trompa de Falopio. En estas condiciones, cerca del 90% de los embriones
aparentemente saludables, están destinados a morir (ASRM, 1994) por lo que se hace difícil
lograr la tasa de implantación cercana al 30%, presente en condiciones in vivo (Wilcox et. al,
1998).
Las tasas de implantación por embrión transferido varían entre el 10 y el 40%, lo cual
depende de la calidad morfológica de los embriones, el número de embriones transferidos, la
edad materna, la calidad del endometrio y de otros factores aún desconocidos (Giscard d
´Estaing et. al, 2001). Con el incremento del número de embriones transferidos, las tasas de
embarazos aumentan pero hay un concomitante aumento en el riesgo de multigestación.
Aún cuando la utilización de las Técnicas de Reproducción Asistida (ART) se ha
expandido rápidamente, las tasas de embarazos no han mejorado de manera importante
(aproximadamente 20%), debido a la baja calidad en el desarrollo de los embriones cultivados
in vitro. Muchos son los factores que se han implicado en este pobre desarrollo, entre los
cuales se encuentran la edad materna como factor más importante en lo referente a la
viabilidad embrionaria y desarrollo de blastocistos (Janny y Ménezo, 1996), factores paternos
(Janny y Ménezo 1994; Jones et. al, 1998b), así como la técnica de reproducción asistida
utilizada, ya sea IVF o ICSI (Shoukir y col., 1998). Otros factores, no menos importantes, se
refieren a las condiciones subóptimas de cultivo (medios no enriquecidos, alteraciones en el
CO2, factores embriotóxicos, etc.), así como al bajo potencial reproductivo que presenta la
especie humana (Edwards y Brody, 1995).
13
Debido a que el embrión humano –en condiciones naturales- entra a la cavidad
endometrial sólo después del día 5 post-fecundación, en estadio de mórula o blastocisto, lo
más fisiológico sería transferir embriones en este estadio, sin embargo, el problema principal
con este tipo de transferencia, ha sido el desarrollo de un sistema de cultivo consistente,
seguro y efectivo para obtener un adecuado porcentaje de blastocistos en el laboratorio.
En los últimos años se han desarrollado una serie de técnicas para lograr el cultivo de
embriones hasta el estadio de blastocisto. Las primeras investigaciones fueron realizadas en
animales y posteriormente, la técnica fue introducida en humanos al inicio de los años 90,
mostrando un éxito limitado (Bolton et. al, 1991), ya que se utilizaron medios de cultivo
simples que no cumplían con los requerimientos necesarios para la viabilidad del embrión. Sin
embargo, con la introducción del cocultivo embrionario con células de soporte, el porcentaje
de formación de blastocistos se incrementó hasta un 40-60 %. Subsecuentemente, la tasa de
embarazo por embrión transferido, así como la tasa de implantación (por número de embriones
transferidos) también se incrementó (Ménezo et. al, 1992; Olivennes et. al, 1994).
A finales de los años 90, Gardner y colaboradores (Gardner et. al, 1998a) reportaron
una tasa de formación de blastocistos mayor del 60%, con el uso de dos medios de cultivo
estadio-específicos que teóricamente, cumplen con los requerimientos en los cambios
fisiológicos y metabólicos durante el desarrollo de embriones in vitro. Scholtes y Zeilmaker
(1996) también reportaron una alta correspondencia con estos resultados, cuando sólo se
transfirieron blastocistos expandidos, utilizando medios definidos para su desarrollo.
Se ha sugerido que el incremento en las tasas de implantación con la transferencia de
blastocistos, se debe tanto a la selección natural de los embriones con mayor potencial
implantatorio, así como a su sincronización con el endometrio uterino.
Las condiciones óptimas de cultivo para lograr el desarrollo de blastocistos aún se
encuentra en investigación y desarrollo, por lo cual, aún queda mucho trabajo por realizar con
la finalidad de lograr la composición ideal necesaria para obtener altas tasas de formación de
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blastocistos y aumento en las tasas de implantación embrionaria hecho que podría permitir la
transferencia de menos embriones, evitando el riesgo de gestación múltiple.
1. Cocultivo
Se ha comprobado, que los embriones de mamíferos tienen la capacidad de crecer en
cultivo con células de soporte o “feeder cells” y que este fenómeno se traduce en un
incremento tanto en la formación de blastocistos (Mènezo et. al, 1990), como en las tasas de
embarazo en humanos (Seta, 2001, Simon et. al, 1999). Este hecho ha estimulado el desarrollo
de diversos sistemas de cocultivo; así, múltiples tipos celulares han sido utilizados para este
propósito, yendo desde tejido reproductor humano, como el de los oviductos, (Bongso et. al,
1992; Xu et. al, 2001) endometrio (Jayot et. al, 1995), cocultivo secuencial de oviductoendometrio (Bongso et. al, 1994) y células del cúmulo y la granulosa (Freeman et. al, 1995),
hasta tejidos y líneas celulares no humanas (Neimer et. al, 1993; Mènezo et. al, 1992), e
incluso, células de carcinoma ovárico (Ben-Chetrit et. al, 1996).
Desafortunadamente, no hay consenso general sobre la eficacia de los diferentes
sistemas de cocultivo (Bavister, 1995). Aún con los sistemas de cocultivo más utilizados,
como por ejemplo el de las células Vero, los resultados en los diversos estudios, son
discrepantes (Van Blerkom, 1993; Sakkas et al, 1994).
Se ha sugerido que los efectos benéficos de este sistema, incluyen la secreción de
factores embriotróficos, como nutrientes, substratos, factores de crecimiento y citocinas
(Sakkas et. al, 1994) y la remoción de sustancias potencialmente embriotóxicas como metales
pesados, amonio y formación de radicales libres, detoxificando el medio de cultivo. Por tanto,
el objetivo básico del sistema de cocultivo, es incrementar las oportunidades metabólicas del
embrión humano para alcanzar el estadio de blastocisto, y aumentar su potencial de
implantación.
15
Cabe señalar, que los resultados de un número importante de estudios han generado
evidencia de la existencia de comunicación bidireccional de tipo química entre el embrión y el
endometrio materno (Cross et. al, 1994; Edwards, 1995), la cual se da a través de factores de
crecimiento (Hardy y Spanos, 2002) (Fig. 6) secretados tanto por el tracto materno, como por
el embrión (Threadgill, 1995; Harvey et. al, 1995).
Fig. 6. Comunicación química entre el embrión y el tracto reproductor materno
Hardy y Spanos ( 2001)
Si bien es cierto que se ha demostrado que estos factores de crecimiento no son
imprescindibles por si solos (en la mayoría de los casos), en conjunto pueden coadyuvar en el
desarrollo embrionario adecuado. Estos hallazgos han provisto la base para estudios en el
desarrollo humano, con la idea futura de suplementar los medios de cultivo con estos factores
embriotróficos, lo que se traduciría en el mejoramiento de las condiciones de cultivo en
reproducción asistida.
Hace pocos años, el grupo del Instituto Valenciano de Infertilidad, demostró que el
sistema de cocultivo con células endometriales humanas autólogas, es beneficioso para el
blastocisto humano debido a la inducción de la secreción de moléculas embrionarias
16
paracrinas (Galan et. al, 2000). Más aún, el embrión cultivado en estas condiciones mejora la
receptividad de las células endometriales cultivadas in vitro, ya que induce la expresión de las
moléculas de adhesión en las células epiteliales endometriales (CEE), como la subunidad β3
de las integrinas (Simon et. al, 1997).
En 1999, Simón y colaboradores, publicaron una investigación donde se utilizaron
CEE autólogas para cocultivo embrionario, encontrando que en más del 88 % de los casos con
ovodonación y en el 91% de los pacientes en protocolos de FIV, se transfirieron más de dos
blastocistos, con porcentajes de formación de los mismos del 60,1% y 49,2 %
respectivamente, lo que avala la viabilidad clínica del cocultivo con CEE: La razón por la cual
se observa un incremento en la formación de blastocistos y en las tasas de embarazo en los
casos de ovodonación, en comparación con los pacientes FIV, se basa en que estos ovocitos
siempre provienen de mujeres jóvenes (menores de 35 años). Estos resultados confirman la
eficacia clínica de este sistema.
Por otra parte, estudios donde se ha comparado la eficacia del sistema de cocultivo con
el uso de medios estándar, han demostrado un incremento significativo en la calidad de los
embriones cocultivados con células endometriales, así como un aumento en la expresión de
factor inhibidor de leucemia (LIF) el cual se ha asociado con una mejoría en el desarrollo
embrionario y un aumento de embarazos clínicos (Spandorfer et. al, 2001).
Así mismo, Seta en el año 2001, demostró que comparando el cultivo estándar con el
cocultivo endometrial autólogo, las tasas de embarazo clínico fueron mucho más altas en el
segundo grupo (24,3% y 48,5% respectivamente), y las tasas de aborto fueron bastantes
menores. Sus datos confirmaron que el cocultivo con endometrio autólogo, también
incrementa las tasa de embarazo en pacientes que habían tenido al menos dos ciclos de FIV
fallidos anteriores, lo que sugiere que el cocultivo por si mismo, mejora la calidad embrionaria
y por ende, las tasas de éxito.
17
Cabe señalar que el cultivo secuencial con células epiteliales tubo-endometriales,
también ha demostrado eficiencia (Bongso et. al, 1994), sin embargo, el epitelio tubárico, no
es accesible de manera rutinaria, por lo tanto, no es práctico.
Con respecto al uso de líneas celulares no humanas, éste es un hecho que siempre
levanta controversias desde el punto de vista médico, debido a que estas células podrían ser
fuente de patógenos desconocidos (virus o priones). Finalmente, se podrían presentar
conflictos de tipo ético cuando se utilizan tejidos diferentes a los del paciente, ya que los
embriones se desarrollan e interactúan con este tipo celular.
Sólo el uso de CEE autólogas de un ciclo ovulatorio previo elimina totalmente el riesgo
de bacterias y virus exógenos conocidos o desconocidos, evitándose así, problemas de tipo
ético y médico.
También, hay algunos reportes concernientes al uso de células estromales
endometriales: Jayot y colaboradores (1995) publicaron los resultados obtenidos luego de la
realización de varios ciclos con cocultivo de embriones con estas células, realizando la
transferencia uterina en estadio de mórula (día 4). Ellos reportaron una tasa de embarazo de
21% en comparación a un 8% de ciclos previos. Resultados similares fueron obtenidos por
Prapas y colaboradores (1993), sobre una pequeña muestra, utilizando células endometriales y
transfiriendo en día 3.
El objetivo principal que se busca con el cultivo embrionario en monocapas de CEE
autólogas, es generar, no sólo el incremento de la tasa de formación de blastocistos, sino
también, la inducción de la secreción de moléculas embrionarias de tipo paracrinas, que en
algunos casos, regulan la secreción de moléculas de adhesión producidas por las células
endometriales (Simon et. al, 1997), y así, mejorar la receptividad uterina, una vez que el
embrión entre en contacto con este tejido, in vivo (Simon et. al, 1999) (Fig. 7).
18
Fig. 7.-Comparación morfológica por microscopia electrónica de cultivos de monocapas de CEE
de pacientes fértiles (n=10 A-C) y pacientes con fallos de fertilización (n=10, D-F) cultivadas en
presencia de blastocistos humanos
Simon et al. (1999)
Aún no se ha determinado en forma veraz si el cocultivo con CEE autólogas es más o
menos eficiente que los medios secuenciales para el desarrollo de blastocistos, pero el
argumento primordial para el uso de esta técnica se basa en que el cultivo embrionario se
realiza bajo condiciones más fisiológicas, muy similar al ambiente in vivo.
Sin embargo, la técnica de cocultivo es extremadamente laboriosa para mantenerse en
un laboratorio de fecundación asistida y puede acarrear el riesgo de contaminación, por lo que
la atención ha sido enfocada en el desarrollo de medios sintéticos definidos (Gardner et. al,
1997a), para mantener la viabilidad de los embriones, evitando la utilización del cocultivo.
19
2. Medios Secuenciales
Como se comentó anteriormente, cultivo de embriones de mamífero en estado de
preimplantación, representa un desafío importante para los embriólogos, debido a que éste
presenta cambios importantes en su fisiología durante su desarrollo y diferenciación. El
ovocito fecundado, específicamente, presenta modificaciones metabólicas durante su
desarrollo, comportándose al inicio, como un tejido quiescente mientras que unos pocos días
más tarde, el blastocisto se asemeja a un tumor invasivo, previo a la implantación (Gardner et.
al, 1997a). Estos cambios en la fisiología facilitan el desarrollo exitoso del embrión, a lo largo
del tracto reproductor femenino y lo prepara para implantarse en el endometrio uterino. Esta
dinámica en la fisiología ha llevado al desarrollo de medios de cultivo secuenciales capaces de
mantener el desarrollo de blastocistos humanos viables. El embrión humano sufre muchos
cambios en su fisiología durante los primeros 4 días de vida, es decir, se desarrolla y se
diferencia de un ovocito fertilizado o cigoto hasta llegar al estadio de blastocisto.
Como concomitante, el embrión está expuesto a gradientes de nutrientes en el tracto
reproductor femenino y exhibe cambios en los requerimientos y utilización de los mismos.
Determinando tanto la naturaleza de estos gradientes como el cambio en los requerimientos
del embrión, se ha facilitado la formulación de medios de cultivo estadio-específicos,
diseñados para mantener el desarrollo embrionario a través del período de preimplantación.
Las tasas de implantación alcanzadas con el cultivo y transferencia de blastocistos
humanos, son más altos que aquellos asociados con la transferencia uterina de embriones en
estadio de división temprana. Este incremento ha facilitado el establecimiento de altas tasas de
embarazo, reduciendo también, el número de embriones transferidos.
Con base en los datos crecientes sobre la composición de los fluidos del tracto
reproductor femenino y de los estudios en la dinámica de la fisiología del embrión, se ha
llegado a la conclusión que el cultivo extendido de embriones (cultivo hasta estadio de
blastocisto) debería llevarse a cabo con más de una formulación específica de medios de
cultivo (Gardner y Lane, 1998c). Los medios de cultivo secuenciales han sido desarrollados y
20
probados de manera extensa sobre modelos animales y luego, utilizados clínicamente (Gardner
y Lane, 1997a; Mènezo et. al, 1998; Alves et. al, 1998), con excelentes resultados.
El sistema de cultivo secuencial, fue utilizado inicialmente en pacientes con una buena
respuesta a las hormonas gonadotrópicas (Gardner et. al, 1997a; Gardner et. al, 1998 a, b), o
con más de 4 embriones en estadio de 8 células en el día 3 (Milki et. al, 1999). Esta
aproximación en pacientes de buen pronóstico llevó a un significativo incremento de las tasas
de implantación y facilitó el establecimiento de altas tasas de embarazo (70%) con una
concomitante reducción en el número de embriones transferidos. Por tanto, el uso de medios
secuenciales llevó a la reducción de gestaciones múltiples de alto orden. Subsecuentemente,
los medios secuenciales y la transferencia de blastocistos, han sido utilizados de manera
exitosa para tratar pacientes con embriones de mala calidad (Balaban et. al, 2001; Langley et.
al, 2001), pacientes con múltiples fallas de FIV (Cruz et. al, 1999) y en protocolos de
ovodonación (Schoolcraft y Gardner, 2000). En todas estas situaciones, el cultivo extendido de
embriones se asocia con un incremento en las tasas de éxito de FIV.
En investigaciones similares, Marek y colaboradores (1999), reportaron que la
utilización del cultivo extendido y la transferencia de blastocistos, en todos los pacientes que
consultaron por problemas de infertilidad, incrementó en un 20% la eficiencia total de un ciclo
de FIV establecido.
El grupo de Gardner cultiva rutinariamente en medios secuenciales G1.3 y G2.3, (Fig.
8. a.b.) a 6% CO2 / 5% O2 / 89% N2 en grupos de 4 embriones en gotas de 50 µl de medio,
bajo cubiertas de aceite mineral. Las macromoléculas escogidas son albúmina sérica
(preferiblemente recombinante) y hialuronan (Gardner y Lane, 2000).
21
Fig. 8. Composición de los medios secuenciales desarrollados por Gardner y
colaboradores
8 a. componentes del medio G-1.3 para el cultivo y desarrollo de embriones en estadio
temprano, hasta el estadio de 8 células
Vitrolife. Closer to nature. GIII series (2002)
8 b. componentes del medio G2.3, para el cultivo y desarrollo de blastocistos
Vitrolife. Closer to nature. GIII Series (2002)
22
La investigación realizada por Giscard d’Estaing y colaboradores en el año 2001,
donde se compara el método de cocultivo (utilizando células Vero), con medios secuenciales
para el cultivo extendido de embriones, confirma los estudios previos, indicando que ambos
sistemas pueden mantener el cultivo embrionario hasta este período.
Los resultados, según los autores, indican que los medios sintéticos responden
adecuadamente a las necesidades del embrión, a pesar de la ausencia de un ambiente más
fisiológico. Como se comentó anteriormente, durante el estadio de preimplantación, el
embrión humano presenta dos fases distintas antes y después de la activación del genoma. En
la fase previa a la activación del genoma (día 3 o estadio de 8 células) la síntesis proteica
depende de las reservas del RNA materno; este período requiere de una protección efectiva
contra la producción de radicales libres y de una concentración reducida de glucosa y fosfato
para balancear el déficit de mitocondrias. En el momento de la activación del genoma
embrionario, los requerimientos de éste se hacen mayores tanto cuantitativa como
cualitativamente, lo que confirma la necesidad de medios de cultivo con metabolitos
diferentes.
A pesar de que el sistema de cocultivo embrionario aporta un ambiente más fisiológico
para el desarrollo de los blastocistos, los medios secuenciales han demostrado ser tan efectivos
como aquellos, para permitir un adecuado desarrollo embrionario hasta el estadio de
blastocisto (Fong y Bongso, 1998), lo que sugiere que el sistema de medios secuenciales es
superior en cuanto a practicidad en el manejo en el laboratorio, siendo ésta una razón de peso
para reemplazar al sistema de cocultivo.
Los sistemas de cultivo secuenciales se han desarrollado tomando en cuenta la
dinámica de la fisiología del embrión y el ambiente materno. Los mismos han demostrado la
capacidad de lograr altas tasas de desarrollo de blastocistos humanos viables, a pesar de no
contar con los factores de crecimiento secretados por las células del tracto reproductor
materno.
23
Muchos pacientes se han beneficiado con los sistemas de cultivo extendido debido a
las altas tasas de implantación de los blastocistos cultivados in vitro, permitiendo la
transferencia de una menor cantidad de los mismos y evitando el riesgo de multigestación
(Gardner et. al, 1997; Veiga et al, 1999; Marek et. al, 1999).
Finalmente, la implementación exitosa del cultivo y transferencia de blastocistos se
facilita con la optimización tanto de los procedimientos clínicos como de laboratorio, por lo
que la utilización de un adecuado sistema de control de calidad es un requisito indispensable
para el éxito clínico, permitiendo el logro de tasas de formación de blastocistos del 50% y
tasas de implantación de hasta el 40%.
Es esencial que se considere el sistema de cultivo como un todo y no enfocarlo
simplemente sobre el medio de cultivo utilizado. Todos los aspectos del sistema como la fase
de gas, el volumen de incubación de los embriones, tamaño del grupo de embriones,
suplementación de macromoléculas, temperatura, adecuada inducción de la ovulación,
transferencia embrionaria óptima y buen soporte de la fase lútea (Gardner et. al, 2000),
interactúan entre sí para influir positiva o negativamente en los resultados.
24
3. Densidad Embrionaria
Es indiscutible el excelente resultado que diversas investigaciones han señalado con el
cultivo de embriones hasta el estadio de blastocisto, ya sea utilizando cocultivo de embriones
con células de soporte o medios secuenciales.
Fig. 9.- Cultivo embrionario en grupo
Olympus. Folleto demostrativo LCPlan F20X (2002)
Textbook of assisted reproductive techniques, (2001)
Sin embargo, otra línea de investigación muy interesante se fundamenta en la
influencia de factores de crecimiento producidos por los propios embriones, los cuales podrían
actuar a través de vías paracrinas y autocrinas (Hardy y Spanos, 2002). En referencia a este
fenómeno, estudios en blastocistos de ratones han reportado la influencia beneficiosa de los
micro cultivos y del cultivo en grupo (Fig. 9), sobres las tasas de embarazo e implantación, lo
cual se atribuye a estos factores embriotróficos (Paria y Dey, 1990; O'Neill 1997, 1998).
Datos publicados previamente, habían demostrado que los cultivos en gotas de
pequeño volumen (Gardner et. al, 1997), así como el cultivo de embriones en grupo (Wiley y
col., 1986; Lane y Gardner 1992; Moessner y Dodson, 1995; Almagor et. al, 1996), no sólo
pueden contribuir a mejorar el desarrollo embrionario, sino también a incrementar las tasas de
embarazo.
25
Se ha reportado que tanto el cultivo de embriones en grupo, así como una disminución
en el volumen de cultivo, facilitan la formación de blastocistos en el ratón (Wiley, 1986;
Gardner y Lane, 1992; Gardner et. al, 1997b). En humanos, el crecimiento embrionario en
grupo hasta el día dos (2) post inseminación, también parece influenciar positivamente las
tasas de clivaje y embarazo (Moessner y Dodson, 1996). Es especialmente notable que Paria y
Dey en 1990 sugirieron que el efecto primario fue ejercido entre el desarrollo de 8
células/mórula y estadio de blastocisto.
En 1992, Lane y Gardner (1992) demostraron un incremento significativo en la
formación de blastocistos incubados en comunas, independientemente del volumen utilizado
(5 y 320µl).
Adicionalmente, Almagor y colaboradores (1996) encontraron que los embriones
cultivados en grupo mostraban tasas de embarazo mayores a las observadas en aquellos que
fueron cultivados individualmente.
Sin embargo, existen controversias en cuanto a los beneficios del cultivo en grupos.
Rijnders y colaboradores (1999), realizaron un estudio prospectivo randomizado, en humanos,
donde no evidenciaron influencia significativa del cultivo en grupos ni del volumen del medio
de cultivo desde el día 3 hasta el estadio de blastocistos, sobre las tasas de formación de
blastocistos ni sobre las tasas totales de embarazo.
26
FACTORES DE CRECIMIENTO
Como se comentó anteriormente, se ha determinado a través de diversas
investigaciones, la existencia de comunicación bidireccional entre el embrión y el endometrio
materno, la cual es ejercida a través de ciertos factores de crecimiento que inciden en el
proceso de implantación (Ryan et. al, 1990). Por una parte, la síntesis de algunos factores
secretados por el embrión que actúan a nivel del endometrio (Galan et. al, 2000), interviniendo
directamente en el proceso de adhesión e invasión endometrial y por otra, la expresión de
factores de crecimiento por el tracto reproductor materno (Harvey et. al, 1995) y la existencia
de receptores a nivel del embrión, sugieren una comunicación paracrina (Stewart et. al, 1992;
Threadgill et. al, 1995).
Es importante recordar que el desarrollo embrionario in vitro, está retrasado en
comparación al desarrollo in vivo (Harlow y Quinn 1982). Más aún, los niveles de apoptosis
son tres veces mayores in vitro que in vivo (Brison y Shultz 1997). Esto sugiere que el tracto
materno produce factores importantes para el desarrollo embrionario (Kane et al. 1997).
Estos factores de origen materno probablemente sean los candidatos más importantes
para mejorar el desarrollo embrionario in vitro, sin embargo, es importante evaluar la
seguridad de su uso en forma exógena antes de su aplicación clínica, por lo que algunos
autores se han enfocado en el estudio de aquellos factores producidos por embrión en fase de
preimplantación.
27
1. Factores de Crecimiento de origen Embrionario
Haciendo referencia a los procedimientos de cultivo donde se aumenta la densidad
embrionaria y se reduce el volumen de medio en donde se cultivan los embriones -como ya se
dijo- se ha observado una mejoría en su desarrollo y una disminución en los niveles de
apoptosis (Paria y Dey 1990; Lane y Gardner 1992; O´Neill 1998), indicando que los
embriones per se, producen ciertos factores de crecimiento y que existen vías autocrinas y
paracrinas operando in vivo, las cuales no están presentes o se encuentran diluidas en
condiciones in vitro.
El rol de los factores de crecimiento en el desarrollo embrionario se ha sustentado en
una serie de estudios en ratones y otras especies, donde se demuestra que una gama de
ligandos polipeptídicos de factores de crecimiento son producidos por los embriones en
estadio de preimplantación, y muchos de sus receptores han sido detectados en la superficie
embrionaria. Estos incluyen miembros de la familia del Factor de Crecimiento Insulino
Similar (IGF), la familia del Factor de Crecimiento Fibroblástico (FGF), la familia del Factor
de Crecimiento derivado de las Plaquetas (PDGF) y la familia del Factor de Necrosis Tumoral
(TNF) (Kane et al. 1997).
La expresión de algunos factores de crecimiento y sus receptores, muestran un
interesante cambio tanto temporal como espacial, durante el desarrollo preimplantación: Así,
estudios de inmunohistoquímica han demostrado que TGF-β2 se expresa después de la
activación del genoma embrionario y sólo se localiza en el trofoectodermo (TE) durante el
estadio de blastocisto, sin expresión en la masa celular interna (MCI) (Slager et al. 1991) y el
mRNA para el receptor de insulina e IGF-I sólo se expresa después del estadio de 8 células,
entre otros ejemplos.
Otro punto importante a tratar, es el concerniente a la presencia de vías autocrinas y
paracrinas que actúan directamente sobre el desarrollo embrionario. Así, una vía paracrina
descrita es la de la insulina, cuyo receptor se encuentra localizado en la superficie apical del
trofoectodermo y sobre las células de la masa celular interna (Heyner, 1989); el embrión por si
28
mismo, no es capaz de producir insulina, pero responde a la hormona, apuntando a la
presencia de una vía paracrina en donde la insulina materna induce respuestas metabólicas y
mitogénicas en el embrión.
Un ejemplo de vía autocrina es provisto por el TGF-α en ratones. Este factor es
producido por la MCI y su receptor, el receptor para Factor de Crecimiento Epidermal (EGFR) está presente predominantemente en la superficie basolateral de la células del TE. La MCI
puede responder a TGF-α, lo que sugiere un “loop” o asa autocrina en el blastocisto (Dardik et
al. 1992).
2. Efectos de los Factores de Crecimiento sobre el Embrión
Un número importante de factores de crecimiento y citocinas han demostrado
promover la formación de blastocistos e incrementar la tasa de desarrollo en diferentes
especies mamíferas (Hardy y Spanos, 2002).
Factores como el EGF y EL TGF-α tienen efectos beneficiosos sobre el desarrollo
embrionario, aún en condiciones subóptimas como es el caso del cultivo individual en grandes
volúmenes de medio de cultivo (Paria y Dey, 1990).
La insulina, el IGF-I y el IGF-II, específicamente actúan sobre las células de la MCI,
aumentando su número (Harvey y Kaye, 1990, 1992a, 1992b) y el CSF-1 incrementa el
número celular del TE (Bhatnagar et. al, 1995). También se han reportado efectos sobre la
síntesis proteica (Dardik et. Al, 1992), transporte de glucosa (Robertson et. al, 2001),
metabolismo (Ryan et al, 1990) y apoptosis (O´Neill, 1998).
La suplementación de medios de cultivo con TGF-α, Factor activador de Plaquetas
(PAF) o IGF-I disminuye la apoptosis en blastocistos murinos, indicando que éstos podrían
actuar como factores de supervivencia durante el desarrollo preimplantación (Brison y Shultz,
29
1997). Por el contrario, algunos factores como el TNF-α, pueden inducir apoptosis en la MCI
de los blastocistos de ratón (Wuu et al 1999).
Los factores de crecimiento no son esenciales -por si mismos- para que se lleve a cabo
el desarrollo embrionario. Los embriones de ratón y de humanos son relativamente
autosuficientes y pueden sobrevivir aislados y crecer hasta el estadio de blastocisto en medios
de cultivo tan simples como solución salina suplementada con piruvato y albúmina (Devreker
et al. 1998). Más aún, estudios en ratones con un gen knockout para un factor de crecimiento
en particular, son capaces de completar su desarrollo e implantación. La única excepción se
presenta con el Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) y con el receptor para el Factor de
Crecimiento Epidermal (EGF-R) donde su ausencia genera fallos de implantación (Stewart et
al. 1992; Threadgill et al. 1995).
Otros estudios en ratones “Knockout” muestran que la ausencia de un factor de
crecimiento específico puede generar efectos sutiles sobre el desarrollo. Por ejemplo, ratones
deficientes en Factor Estimulador de Granulocitos-Macrófagos (GM-CSF) desarrollan
blastocistos con un número reducido de células (Robertson et al. 2001), mientras que los
blastocistos
de ratones deficientes en Factor Transformador de Crecimiento α (TGF-α)
presentan altos niveles de apoptosis, comparados con ratones “wild-type” (Brison y Schultz
1998).
Como hemos visto, una variedad de factores de crecimiento inciden en el desarrollo
embrionario preimplantación de diversas formas, sin embargo, en esta ocasión nos
enfocaremos en dos factores particulares: El Factor Estimulador de Granulocitos-Macrófagos
(GM-CSF), el Factor de Células Madre o “Stem Cell Factor” y sus receptores en el embrión de
ratón, los cuales han demostrado presentar efectos beneficiosos sobre el desarrollo y sobre el
potencial de implantación de los mismos (Hardy y Spanos, 2002).
30
3. Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos-Macrófagos
El GM-CSF es una citocina linfo-hematopoyética con efectos in vitro bien estudiados
sobre la supervivencia, proliferación y diferenciación de leucocitos mieloides y sus
precursores (Metcalf, 1989).
La estructura general del GM-CSF (recombinante) es
altamente
compacta
y
globular,
con
un
núcleo
predominantemente hidrofóbico. El rasgo estructural
principal de rhGM- CSF es un “racimo” de cuatro
hélices, la cual representa el 42% de la estructura.
Las hélices están dispuestas en un haz antiparalelo “left
handed”, con dos conexiones entrelazadas.
Fig. 10. Estructura del GM-CSF
(hp.vector.co.jp)
Entre las conexiones se encuentra una lámina-β antiparalela. En este “esquema de
cintas”, el N Terminal está representado por la esquina superior derecha (Walter et. al, 1992)
(Fig. 10).
La actividad hematopoyética in vivo de GM-CSF ha sido confirmada en modelos
murinos (Lang et. al, 1987), con la administración exógena de este factor (Metcalf et. al,
1987).
Experimentos in vivo e in vitro indican que la GM-CSF también modula la función de
monocitos-macrófagos, granulocitos y células dendríticas maduras, promoviendo la
presentación del antígeno, quimiotaxis, adhesión, fagocitosis e inducción de inmunidad
antitumoral (Gasson, 1991).
31
En las células hematopoyéticas, el GM-CSF ejerce sus efectos sobre la superficie de la
célula blanco a través de la unión a un complejo receptor de alta afinidad, compuesto de una
subunidad α específica para el GMCSF y una subunidad β de traducción de señal, compartida
con el receptor de la interleukina (IL)-3 y (IL)-5 (Hayashida et. al, 1990).
Células no linfohematopoyéticas que incluyen células endoteliales, oligodendrocitos,
ciertas células tumorales y células trofoblásticas, también pueden expresar receptores y
respuesta biológica a esta citocina (Baldwin, 1992).
En el tracto reproductor femenino murino (Robertson, 1992) y humano (Imakawa,
1993), el GM-CSF es sintetizado bajo la regulación del estrógeno producido por las células
epiteliales glandulares y luminales del útero (Giacomini, et. al, 1995). En ratones, se libera un
pico de este factor posterior al apareamiento (Robertson, 1992), el cual es inducido por
factores específicos presentes en el plasma seminal incluyendo el factor de crecimiento
transformador TGF-β1 (Robertson et. al, 1996; Tremellen, 1998). Este proceso se acompaña
de la infiltración del estroma endometrial, con la activación de leucocitos, incluyendo
macrófagos, células dendríticas, neutrófilos y eosinófilos (Mc Master et. al, 1992; Robertson
et. al, 1996). Se ha propuesto que esta respuesta inflamatoria modula tanto la remodelación
tisular, así como los cambios inmunológicos necesarios en el ambiente donde se implantará el
embrión (Robertson et. al, 1994, 1997).
También se ha reportado que el GM-CSF es un regulador del crecimiento y desarrollo
del producto de la concepción y de los tejidos derivados de éste (Sjöblom et. al, 2005).
Embriones murinos en estadio de preimplantación expresan receptores para este factor
y logran un mayor número celular (Robertson et. al, 2001), así como una mayor capacidad
para eclosionar y adherirse a la placa de cultivo, cuando son cultivados con medios
suplementados con GM-CSF (Sjöblom et. al, 1999). Behr y colaboradores (2005) hallaron que
los niveles de apoptosis disminuyeron significativamente en presencia de dosis exógenas de
GM-CSF agregadas al medio de cultivo embrionario, a través de la alteración en la expresión
32
de Bcl-2, lo que sugiere que este factor actúa como un regulador en el proceso de muerte
celular programada.
Los efectos embriotróficos del factor son más pronunciados en humanos (Sjöblom et.
al, 1999) y bovinos (de Moraes y Hansen, 1997), especies en las cuales, el desarrollo in vitro
es particularmente difícil, pero también se ha descrito en porcinos, donde este factor mejora la
viabilidad de los embriones desarrollados en medios de cultivo libres de proteínas (Cui et. al,
2004).
También se le ha implicado en el desarrollo morfológico y funcional de la placenta,
promoviendo la diferenciación y actividad secretora de las células del citotrofoblasto in vitro
(Armstrong y Chaouat, 1989; Garcia-Lloret et. al, 1994).
Hay evidencia importante del rol que juega la GM-CSF
durante el embarazo:
Experimentos en ratones han demostrado que cuando se administra esta citocina de manera
exógena, puede alterar dramáticamente el resultado del embarazo. La administración de dosis
únicas de GM-CSF protege contra la resorción fetal inducida por interferón γ y mejora el peso
fetal y placentario (Chaouat et. al, 1990). Más aún, la administración de pequeñas cantidades
durante el período de preimplantación puede revertir las altas tasas de fallo de implantación y
resorción fetal que se presenta en ratones con tumores productores de Factor Estimulador de
Colonias-1 (CSF-1) o en ratones inyectados con CSF-1 recombinante (Tartacovsky, 1991).
A pesar de que inicialmente no se había relacionado la deficiencia de GM-CSF con
alteraciones a nivel reproductivo, se ha evidenciado que ratones manipulados genéticamente
para que generaran deficiencia en GM-CSF, se presenta una disminución moderada en el
tamaño de la camada (Seymour et. al, 1997). Por otra parte, Robertson y colaboradores (1999),
demostraron que ratones con deficiencia genética de este factor, mostraron un retraso en la
formación de blastocistos, con una significativa disminución en el número de blastómeras, a
expensas del tamaño de la MCI. Los efectos en ratones “knockout” también incluyeron
disminución en el tamaño fetal e incremento tanto en las tasa de resorción fetal durante la
gestación tardía, como en la mortalidad durante la vida post-natal temprana.
33
En cuanto al receptor de la GM-CSF, éste está compuesto de dos sub-unidades, las
cuales pertenecen a la superfamilia de receptores de citocinas tipificados por el receptor de la
hormona de crecimiento (Fig. 12).
La cadena α (GM-Rα) confiere una unión de baja afinidad, mientras que la cadena βcomún (Bc) no se une a GM-CSF por si mismo, sino que forma un complejo de alta afinidad
cuando se asocia con el complejo ligando-cadena α (Lopez et. al, 1992). No existe referencia
acerca de la especificidad en la expresión de este receptor con respecto a los diferentes
estadios del desarrollo embrionario preimplantación.
En humanos, los embriones en estadio de preimplantación no expresan mRNA para
Bc en ningún momento del desarrollo, por lo que la regulación de la apoptosis es mediada sólo
por la interacción del ligando GM-CSF con el receptor GM-Rα, independientemente de Bc
(Sjöblom et. al, 2002).
4. Factor de Células Madre ó Stem Cell Factor
El Factor de Células Madre ó Stem Cell Factor (SCF) es un factor de crecimiento
relacionado en estructura al CSF-1 y actúa a través del receptor tirosina kinasa, c-kit. (fig. 9).
Durante investigaciones en ratones W, se evidenció que mutaciones en el locus W
generaban la aparición de manchas blancas en ratones pigmentados, defectos en el desarrollo
de células progenitoras y alteraciones en la hematopoyesis (Silvers, 1979). En 1988 se
determinó que este locus codificaba un receptor tirosina kinasa, conocido como c-kit (Chabot
et. al, 1988).
Luego del descubrimiento del locus W, se identificó una mutación en el locus S1 cuyo
fenotipo era prácticamente idéntico al presentado en los ratones W. Esto llevó a los
investigadores a elucubrar sobre la posible relación entre las proteínas codificadas en este
34
segundo loci. En 1990, la proteína codificada en el locus S1 fue denominada SCF ligando c-kit
(Zsebo et al, 1990).
En la médula ósea, SCF y CSF-1 trabajan sinérgicamente para promover la
proliferación y diferenciación de las células madre en colonias de macrófagos.
Durante el desarrollo embrionario, SCF y su receptor, c-kit (el mecanismo de acción
del ligando y el receptor se encuentran descritos en la Fig. 11) son imprescindibles para la
proliferación y supervivencia de las células germinales y de su migración a través de la
gónada. El mRNA de c-kit se expresa en las células primordiales germinales, mientras que el
transcripto de SCF se expresa a lo largo de la ruta migratoria hacia el canal genital (Matsui et.
al, 1990). En el ovario postnatal, el complejo ligando-receptor es importante para el buen
desarrollo folicular (Yoshida et. al, 1997).
Fig. 11. Eventos intracelulares que se desencadenan para que el SCF entre en contacto
con el receptor de membrana c-kit
Gewirtz A. (2001)
35
Durante el período periovulatorio, c-kit es expresado en las células de la teca y en el
ovocito, mientras que SCF es expresado en las células de la granulosa (Latinen et. al, 1995).
Después de la ovulación, se ha demostrado que en el ratón y en el humano, el c-kit
(Fig.12) se expresa durante el desarrollo preimplantación. Durante ciertos estadios, los
embriones humanos también expresan mRNA para SCF, sugiriendo que este factor podría
actuar a través de una ruta autocrina, lo cual contrasta con los hallazgos hechos en murinos,
donde no se ha detectado SCF en los embriones en período de preimplantación (Arceci et. al,
1992).
El mRNA para SCF se expresa en humanos en el estadio de 2 células, para luego
reaparecer en el estadio de 6-8 células, lo cual es consistente con la expresión genómica
embrionaria durante este período (Braude et. al, 1988).
Transcriptos de SCF también han sido detectados en el oviducto y en el útero (Arceci et
al, 1992), lo que sugiere que el embrión podría estar expuesto a dicho factor producido por las
células maternas. Por otra parte, estudios realizados por Kauma y colaboradores (1996)
demostraron la expresión de SCF en el endometrio humano y la expresión de c-kit en el tejido
placentario, durante el embarazo. La expresión del ligando y del receptor en la interfase fetoplacentaria sugiere que SCF juega un importante rol en el desarrollo embrionario post
implantación así como en el crecimiento placentario.
Investigaciones realizadas por Masahiro Mitsunari y colaboradores en 1999, detectaron
mRNA SCF y mRNA c-kit tanto en blastocistos eclosionados como en células endometriales.
Por otra parte, demostraron que la adición de SCF exógena a los medios donde cultivaron
blastocistos, promovió la expansión del área de superficie del trofoblasto, una vez que el
blastocisto eclosionó.
Sin embargo, es muy poca o casi nula la información disponible acerca del papel que
juega este factor de crecimiento durante el período preimplantacional temprano.
36
Con base en los hallazgos de la influencia que tienen ciertos factores de crecimiento
producidos por el embrión sobre su propio desarrollo preimplantacional y tomando en cuenta
que estos factores podrían ser secretados hacia el medio de cultivo in vitro, esta investigación
pretende demostrar que la técnica de cultivo en grupos de embriones puede ser beneficiosa
para la actividad celular del embrión, ya que bajo esta técnica, los factores de crecimiento
producidos por éste, podrían concentrarse y actuar de manera más eficaz, probablemente a
través de una vía de señalización de tipo paracrina.
Fig.12. Estructura de los Receptores de membrana para GM-CSF y SCF
www.mh-hannover.de
37
OBJETIVOS
Objetivos Generales
Determinar si el cultivo de embriones en grupo implica un beneficio en el potencial de
desarrollo de embriones de ratón, gracias a la presencia de factores de crecimiento secretados
por los embriones hacia el medio de cultivo. Y dilucidar si la adición exógena de los factores
de crecimiento en estudio proveen ayuda adicional al adecuado desarrollo embrionario durante
el cultivo in vitro.
Objetivos Específicos
1.- Determinar si existen diferencias en la calidad de los embriones de ratón, cuando estos se
cultivan en grupo o de manera aislada.
2. - Cuantificar la concentración de GM-CSF y SCF en los medios de cultivo donde se
encuentran los embriones aislados o en grupo, a través de la técnica de ELISA.
3. - Evaluar si las concentraciones de estos factores de crecimiento en el medio de cultivo
varían en base a la densidad embrionaria utilizada.
4. - Definir si la calidad de los embriones en cultivo se ve modificada por las concentraciones
de factores de crecimiento presentes en el medio.
5.- Establecer si la calidad embrionaria se ve influenciada por la adición exógena de GM-CSF
y SCF al medio de cultivo embrionario.
38
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Población
Se utilizaron ratones hembra pre-púberes de la cepa CD1, con un peso que oscilaba
entre los 17 y los 20 gr., aportadas por el Bioterio de Instituto Nacional de Higiene.
2. Inducción de la Ovulación
Se indujo superovulación en los ratones hembra con la inyección de 5 IU de Pregnant
mare’s serum gonadotropin (PMSG) Sigma, seguidas de inyección de 5 UI de Human
chorionic gonadotropin (hCG) Sigma, 48 horas después. La noche inmediatamente posterior a
la segunda inyección, se colocaron junto con machos de probada fertilidad.
El apareamiento se confirmó en ambos grupos, por la presencia del tapón vaginal en
las hembras, a la mañana siguiente.
3. Recolección
La recolección de embriones se realizó 46-48 horas después de la inyección de hCG,
mediante el lavado del oviducto resecado, posterior al sacrificio del animal, luego de lo cual se
lavaron en medio con buffer, Gamete (Vitrolife, Sweden). Posteriormente, los embriones
fueron colocados al azar en gotas de 20 µl de medio de cultivo IVF (Vitrolife, Sweden) bajo
una cubierta de aceite mineral testado en embriones (Sigma).
39
4. Cultivo Embrionario
Los embriones se dividieron en dos grupos en el día 1 (día de la recolección): Un grupo
fue colocado en forma individual en las gotas de cultivo, mientras que el otro grupo se
concentró en grupos de 5 por gota.
El modelo experimental se dividió en dos fases: en la primera fase, los embriones se
cultivaron hasta el día 5 post recolección, en la misma gota de medio de cultivo original y se
valoró el desarrollo embrionario a las 24h, 48h, 72h y 96 h.
La segunda fase del experimento, constó de dos etapas:
a) En la primera etapa, los embriones fueron lavados en el día 3 de cultivo (48 horas
post recuperación) y transferidos a nuevas gotas de medio (para evitar los efectos tóxicos del
amonio liberado debido al metabolismo aminoacídico) y se cultivaron durante 48 horas
adicionales (día 5) para permitir el desarrollo hasta estadio de blastocisto.
Las gotas de cultivo del día 3 y del día 5 fueron almacenadas para
medir
posteriormente los factores de crecimiento GM-CSF y SCF.
b) En la segunda etapa, los embriones fueron divididos en dos grupos y se cultivaron
en forma aislada en gotas de 20 µl, a las cuales se adicionó GM-CSF (PreproTech EC,
México) a una concentración de 50 ng/ml y SCF (PreproTech EC , México) a una
concentración de 2ng/ml, respectivamente. Las concentraciones utilizadas fueron tomadas en
forma arbitraria, tomando en cuenta lo reportado en la literatura.
5. Condiciones de cultivo
Todos los cultivos se realizarán bajo condiciones controladas de CO2 (5,3%),
temperatura (37ºC) y humedad (90%).
40
6. Sistema de clasificación morfológica
La clasificación embrionaria inicial (día 1: recuperación de embriones) se realizó
tomando en cuenta las siguientes características:
*Número y simetría de las blastómeras
*Fragmentación
*Multinucleación
Los embriones de ratón fueron evaluados diariamente hasta el día 5 post recolección,
evaluándose:
*Número y simetría de las blastómeras
*Porcentaje de fragmentación.
*Compactación
*Formación de blastocisto
*Expansión blastocélica
* Eclosión o “Hatching”
*Velocidad de clivaje/retraso en el desarrollo
*Arresto embrionario
*Muerte celular
41
7. Determinación de GM-CSF en las gotas de medio donde se realizaron los cultivos
embrionarios
Se determinó la presencia de GM-CSF, en las gotas donde se realizaron los cultivos
embrionarios, mediante un ELISA tipo sándwich de la casa PreproTech EC (Catalogo #900K55, México). Para ello se diluyó el anticuerpo monoclonal de captura contra murine GMCSF (anti-mGM-CSF) a una concentración de 2 µg/ml en buffer carbonato 0,1 M, pH.
Inmediatamente se adicionaron 100 µl de este anticuerpo a cada pozo de la placa de micro
titulación (Nunc Maxisorp Prod # 4420404) y se incubó durante toda la noche a 4ºC. Al día
siguiente se lavaron los pozos con 300µl de buffer de lavado (PBS-0.05% Tween 20) y se le
agregó 300µl de buffer de bloqueo (1% de BSA en PBS) y se dejo al menos 1 hora a
temperatura ambiente. Posteriormente se le realizaron 4 lavados con buffer de lavado y se
procedió a remover el exceso de buffer colocando la placa con los pozos hacia abajo en un
papel absorbente. La placa así preparada con el anticuerpo de captura fue sellada en una bolsa
y conservada en nevera hasta su uso.
Se preparó una curva estándar a partir de mGM-CSF de la casa PreproTech EC
(México), con los siguientes puntos: 3000, 2000, 1000, 500, 250 y 125 pg/ml. Las muestras de
medio de cultivo obtenidas de las gotas donde fueron cultivados los embriones fueron diluidas
1:5 en solución diluyente (PBS-0.05% Tween 20, 1% BSA) previo al ensayo de ELISA. Para
la realización del ensayo se adicionaron 100µl de cada uno de los puntos de la curva estándar
y de las muestras a cada pozo de la placa sensibilizada previamente (por triplicado). Se incubó
por dos horas a temperatura ambiente. Posteriormente se aspiró el contenido de los pozos y se
lavó 4 veces con el buffer de lavado. Luego se adicionó 100µl del anticuerpo de detección
biotinilado antígeno-afinidad purificado anti mGM-CSF (PreproTech EC) a una concentración
de 0,25µg/ml y se incubó 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente se aspiró en
contenido de los pozos y se lavó 4 veces con el buffer de lavado y se adicionó 100µl de avidin
peroxidasa (Avidin peroxidase conjugate, Sigma Cat. # A-4419), diluido 1:2000 en diluyente.
Se incubó 30 min. a temperatura ambiente. Se aspiraron y lavaron los pozos cuatro veces con
100µl de buffer de lavado y se le agregó 100µl de la solución sustrato a cada pozo (ABTS
liquid substrate solution, Sigma Cat. # A-3219). Se incubó a temperatura ambiente
en
42
oscuridad y se monitoreó el desarrollo de color cada 5 min. hasta aproximadamente 30 min.
utilizando un lector de ELISA (BioTek Instrument INC, ELx800 UV) a una longitud de onda
de 405 nm y una longitud de onda de corrección de 650 nm. Las concentraciones de GM-CSF
de las muestras problema fueron calculadas a partir de la ecuación de la recta obtenida de la
curva estándar.
8. Determinación de SCF en las gotas de medio donde se realizaron los cultivos
embrionarios
Se determinó la presencia de SCF, en las gotas donde se realizaron los cultivos
embrionarios, mediante un ELISA tipo sándwich de la casa PreproTech EC (Catalogo #900K78, México). Para ello se diluyó el anticuerpo monoclonal de captura contra murine SCF
(anti-mSCF) a una concentración de 1µg/ml en buffer carbonato 0,1 M, pH. Inmediatamente
se adicionaron 100µl de este anticuerpo a cada pozo de la placa de micro titulación (Nunc
Maxisorp Prod # 4420404) y se incubó la placa durante toda la noche a 4ºC. Al día siguiente
se lavaron los pozos con 300µl de buffer de lavado (PBS-0.05% Tween 20) y se le agregó 300
µl de buffer de bloqueo (1% de BSA en PBS) y se dejó al menos 1 hora a temperatura
ambiente. Posteriormente se le realizaron 4 lavados con buffer de lavado y se procedió a
remover el exceso de buffer colocando la placa con los pozos hacia abajo en un papel
absorbente. La placa así preparada con el anticuerpo de captura fue sellada en una bolsa y
conservada en nevera hasta su uso.
Se preparó una curva estándar a partir de mSCF de la casa PreproTech EC (México),
con los siguientes puntos: 5000, 4000, 3000, 2000, 1000 y 500 pg/ml. Las muestras de medio
de cultivo obtenidas de las gotas donde fueron cultivados los embriones fueron diluidas 1:5 en
solución diluyente (PBS-0.05% Tween 20, 1% BSA) previo al ensayo de ELISA. Para la
realización del ensayo se adicionaron 100µl de cada una de los puntos de la curva estándar y
de las muestras a cada pozo de la placa sensibilizada previamente (por triplicado). Se incubó
por dos horas a temperatura ambiente. Posteriormente se aspiró en contenido de los pozos y se
lavó 4 veces con el buffer de lavado. Luego se adicionó 100µl del anticuerpo de detección
43
biotinilado antígeno-afinidad purificado anti mSCF (PreproTech EC) a una concentración de
0,50 µg/ml y se incubó 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente se aspiró en contenido
de los pozos y se lavó 4 veces con el buffer de lavado y se adicionó 100µl de avidin
peroxidasa (Avidin peroxidase conjugate, Sigma Cat. # A-4419), diluido 1:2000 en diluyente.
Se incubó 30 min. a temperatura ambiente. Se aspiraron y lavaron los pozos 10 veces con
100µl de buffer de lavado y se le agregó 100µl de la solución sustrato a cada pozo (ABTS
liquid substrate solution, Sigma Cat. # A-3219). Se incubó a temperatura ambiente
en
oscuridad y se monitoreó el desarrollo de color cada 5 min. hasta aproximadamente 30 min.
utilizando un lector de ELISA (BioTek Instrument INC, ELx800 UV) a una longitud de onda
de 405 nm y una longitud de onda de corrección de 650 nm. Las concentraciones de SCF de
las muestras problema fueron calculadas a partir de la ecuación de la recta obtenida de la curva
estándar.
9. Análisis Estadístico
Los resultados fueron evaluados por el test de χ². Valores de p<0,05 fueron
considerados estadísticamente significativos. La comparación de los resultados obtenidos por
ELISA, en cuanto a la concentración de GM-CSF y SCF en las gotas de cultivo, fueron
evaluados por T Student. En ambas pruebas, se utilizó el programa estadístico “Statistica”.
44
RESULTADOS
Primera Fase Experimental
Una muestra total de 121 embriones en estadio de 2 células, provenientes de ratones
hembras de la cepa CD1, estimuladas hormonalmente, fueron utilizados en cultivos extendidos
hasta el día 5. En un 100% de los casos, hubo ausencia absoluta de fragmentación y la simetría
de las blastómeras estaba presente (grado 1).
En los embriones que se cultivaron en grupo (n: 102), el porcentaje total de formación
de blastocistos fue significativamente mayor (p<0,03) en comparación a aquellos que se
incubaron de manera individual (80,39% y 57,89% respectivamente). El porcentaje de
eclosión espontánea o “hatching” se comportó de manera similar, siendo –tambiénsignificativamente mayor (82,92% y. 45,45% respectivamente) (p<0,004). Para el porcentaje
de eclosión, se tomó en cuenta sólo a aquellos embriones que lograron llegar al estadio de
blastocisto (Fig.13).
En cuanto al número de blastocistos que no lograron la eclosión debido a un retraso en
la velocidad de desarrollo, se observó un aumento en su número en los embriones que fueron
cultivados en forma individual (p<0,004), comparados con aquellos cultivados en grupos
(54,54% y. 17,07%, respectivamente). Hecho similar ocurrió con respecto al arresto
embrionario, el cual fue mayor en el grupo de embriones incubados individualmente, en
comparación con los embriones incubados en comunas (42,11% y. 19,61%, respectivamente)
(p<0,03) (Fig.14).
Las figuras 15, 16 y 17 corresponden a imágenes demostrativas de los embriones
obtenidos en los cultivos embrionarios en grupo y aislados, donde se muestran el desarrollo
embrionario, dependiendo del tipo de cultivo seleccionado: en grupo o individual.
45
Fig. 13. Porcentaje de embriones que formaron Blastocisto y que eclosionaron (“hatching”)
cuando fueron cultivados de forma aislada (n: 19) o en grupo (n: 112).
90
*
**
80
Porcentaje (% )
70
60
50
Grupo
Aislado
40
30
20
10
0
Formación de
blastocisto
Hatching
Datos analizados por χ², * p<0,03, **p<0,004.
Fig. 14. Porcentaje de embriones que presentaron retraso en el crecimiento y arresto en el
desarrollo cuando fueron cultivados de forma aislada (n: 19) o en grupo (n: 112)
60
Porcentaje (%)
50
40
30
*
**
Retraso en el
crecimiento
Arresto en el
desarrollo
20
10
0
Datos analizados por χ², * p<0,004, **p<0,03
Grupo
Aislado
46
Fig. 15. Cultivos embrionarios aislados desde el estadio de 2 células hasta la formación de
blastocisto
Fig. 16. Cultivos embrionarios aislados desde el estadio de 2 células hasta la
degeneración o muerte.
47
Fig. 17. Cultivo embrionario en grupo
2 células
4 células
8 células
blastocistos expandidos
“Hatching”
48
Segunda Fase Experimental
Una muestra total de 944 embriones en estadio de 2 células, provenientes de ratones
hembras de la cepa CD1, estimuladas hormonalmente, fueron utilizados en cultivos extendidos
hasta el día 5. En un 100% de los casos, hubo ausencia absoluta de fragmentación y la simetría
de las blastómeras estaba presente el día de la recolección. Embriones que presentaban una
blastómera degenerada o alteraciones morfológicas de importancia, fueron excluidos del
presente estudio.
Hay que acotar de manera especial, que durante la segunda fase del experimento, se
presentaron una serie de inconvenientes con los ratones aportados por el Bioterio del INH.
Durante el último año, la respuesta de los animales a la hormona fue totalmente errática y el
porcentaje de supervivencia de los embriones cayó drásticamente hasta tal punto que en la
mayoría de los casos, éstos degeneraban a las 48 horas post recolección. Se notó que esta
variación en la respuesta de los ratones, estuvo relacionada con el alimento utilizado en dicho
bioterio. Así, mientras más tiempo ocurría entre el momento de la llegada de nuevos lotes y el
día de la recolección, peor era la respuesta y la calidad embrionaria (datos no mostrados). De
hecho, las estadísticas llevadas por el centro, en referencia al rendimiento reproductivo de
todas las cepas de ratones que allí habitan, muestran una caída de más del 50% en la
producción de animales, desde inicios del año 2005.
Esta disminución sostenida en la producción de ratones durante el último año, se vio
expresada en los resultados de cultivo embrionario de manera significativa, en comparación a
los resultados obtenidos en la primera fase experimental y en lo reportado en la literatura
especializada, en referencia al porcentaje de embriones murinos que logran avanzar hasta el
estadio de blastocisto, bajo condiciones básicas de cultivo.
Esta dificultad trajo como consecuencia, que a la hora de analizar los resultados sólo
pudieron ser incluidos 305 embriones de la muestra total inicial, Los resultados mostrados en
la segunda fase experimental de nuestro estudio, están basados en el desarrollo de este
subgrupo de embriones.
49
Los embriones fueron divididos en 3 grupos: Un grupo se cultivó en forma aislada (n:
72), el segundo grupo de cultivó en series de 5 por gota (n: 185) y el último grupo también se
cultivó de forma individual, pero se adicionó al medio de cultivo una concentración de 2 ng/ml
de GM-CSF (n: 24) y 50 ng/ml de SCF (n: 24), separadamente.
El día 3 post-recolección, los embriones de los dos primeros grupos, se lavaron y
cambiaron de medio de cultivo y se llevaron hasta el día 5. El grupo de embriones a los cuales
se les añadió GM-CSF y SCF en las gotas de cultivo, permaneció en sus medios originales.
Tanto en las gotas recolectadas el día 3 como en el día 5 post recolección, se evidenció
la presencia de GM-CSF y SCF, aún cuando no hubo diferencia estadísticamente significativa
en la concentración de ambos factores, con respecto al tipo de cultivo utilizado, ya sea aislado
o en grupo (Tabla 1).
Tabla 1. Concentración de GM-CSF y SCF en las gotas de medio donde fueron
cultivados los embriones murinos en forma individual o en grupo.
GM-CSF (ng/ml)
SCF (ng/ml)
Individual
En grupo
6004,8 ± 2735,3
6380,2 ±3036,4
112,7 ± 162,7
140,3 ± 113,1
Los valores se presentan como la media (x) ± la desviación estándar (SD). No se
observaron diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos.
En los embriones que se cultivaron en presencia de GM-CSF exógena, hubo un
incremento estadísticamente significativo de la formación de blastocistos en comparación al
grupo control (83,3% y 19, 44% respectivamente). En cuanto al proceso de “hatching”,
ninguno de los embriones logró eclosionar de manera espontánea (Fig.18).
En cuanto a los embriones que se cultivaron en presencia de SCF, también hubo un
incremento estadísticamente significativo en el porcentaje total de formación de blastocistos,
50
el cual fue mayor en comparación a aquellos que se incubaron individualmente (83,3% y 19,
44% respectivamente). El porcentaje de eclosión o “hatching” si mostró un incremento (20%)
en comparación al grupo control (Fig. 18), pero no fue estadísticamente significativo con el
método de χ².
En referencia al arresto en el desarrollo embrionario, hubo una disminución
estadísticamente significativa (p<0,0001) (Tabla 2). tanto con GM-CSF como con SCF,
comparados con aquellos embriones a los cuales no se les agregó factores de crecimiento a los
medios de cultivo donde se desarrollaban (16,67% y 80,56% respectivamente, para ambos
casos) (Fig.19)
Con respecto al retraso en el desarrollo, se pudo notar un hecho curioso desde el punto
de vista estadístico: Aún cuando se observó una disminución en la cantidad de embriones que
se retrasaron en su crecimiento, en presencia de SCF, la diferencia no fue significativa, dado
que en el grupo control, todos los embriones sufrieron retraso, por lo que al usar el método
estadístico, éste no reconoció la diferencia. En el caso de GM-CSF, no hubo variaciones con
respecto al grupo control. (Fig.19).
Cabe señalar que en este estudio, se definió “retraso en el crecimiento” como el
proceso por el cual, el embrión no logró la eclosión espontánea después del día 5 postrecuperación, a pesar de alcanzar el estadio de blastocisto y en muchos casos, la expansión del
mismo.
En cuanto al término “arresto en el desarrollo”, se definió éste como el proceso en el
cual el embrión detuvo su desarrollo en cualquier estadio, sin mostrar signos de degeneración
o muerte celular, en el momento de su evaluación.
51
Fig.18.Porcentaje de embriones que formaron Blastocisto y que realizaron “hatching” cuando
fueron cultivados en presencia de GM-CSF (n: 24) y SCF (n: 24), comparados a aquellos
cultivados individualmente sin la adición de factores de crecimiento (n: 56).
90
*
80
*
Porcentaje (%)
70
60
Blastocisto
Hatching
50
40
30
20
10
0
GM-CSF
SCF
Ais lado s in
factor
Los datos fueron analizados por χ² *p<0,03
Fig. 19. Porcentaje de embriones que presentaron retraso en el crecimiento o arresto en el
desarrollo cuando fueron cultivados en presencia de GM-CSF (n: 24) y SCF (n: 24), comparados
a aquellos cultivados individualmente, sin la adición de factores de crecimiento (n: 56).
100
Porcentaje (%)
90
80
70
60
Retraso en el
crecimiento
Arresto en el
desarrollo
50
40
30
20
*
*
10
0
GM-CSF
SCF
Aislado sin
factor
Los datos fueron analizados por χ² *p<0,0001
52
Tabla 2. Tasas de formación de blastocisto, “hatching”, retraso en el desarrollo y arresto
embrionario, en embriones cultivados en presencia de GM-CSF y SCF, comparados con los
embriones cultivados individualmente, sin la adición de factores de crecimiento.
Condición
n
Hatching
24
Formación
Blastocisto
20 (83, 33%)*
GM-SCF
0 (0)
Retraso en el
crecimiento
20 (100%)
Arresto en el
desarrollo
4 (16, 67 %)*
SCF
24
20(83, 33%)*
4 (20%)
16 (80%)
4 (16, 67 %)*
Individual sin
factor
72
14 (19, 44%)
0 (0)
14 (100%)
58 (80,56%)
Los valores fueron analizados por χ² *p< 0,0001
53
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
El objetivo principal de esta investigación, fue determinar si el cultivo de embriones en
grupo implicaba un beneficio en el potencial de desarrollo de embriones de ratón y si esta
contribución fue dependiente de la secreción de GM-CSF y SCF por parte de los embriones,
hacia el medio donde fueron cultivados.
Por otra parte, también se quiso establecer si existían cambios en la concentración de
dichos factores, dependiendo de la densidad embrionaria y si esta concentración, tuvo algún
efecto sobre la calidad de los embriones en cultivo.
Por último, se quiso establecer si la calidad embrionaria se ve modificada por la
adición exógena de GM-CSF y SCF al medio de cultivo embrionario.
Como comentamos anteriormente, la segunda fase experimental presentó problemas
graves en cuanto a la calidad embrionaria, ya que a pesar de que se mantuvieron las mismas
condiciones de cultivo durante toda la investigación, el progreso de los embriones en esta
segunda fase, fue bastante inadecuada. Aún cuando no se realizaron investigaciones formales
al respecto, existe la hipótesis que este fenómeno fue producto de alteraciones importantes en
el contenido nutricional del alimento aportado a los animales, idea compartida con el equipo
del bioterio del Instituto Nacional de Higiene.
Debido a este problema operacional, la segunda fase experimental fue prolongada por
más de un año, pero aún así, el fenómeno se repitió a todo lo largo de este período.
Se ha reportado que el cultivo de embriones en grupo, así como la disminución del
volumen de cultivo, facilita la formación de blastocistos en embriones de ratón (Wiley, 1986;
Gardner y Lane, 1992; Gardner et. al, 1997).
54
El crecimiento en grupos hasta el día 2 post inseminación en humanos, también parece
influenciar positivamente las tasas de clivaje y embarazo (Moessner y Dodson, 1996). Estos
efectos han sido atribuidos a factores de crecimiento liberados por los mismos embriones. Es
especialmente notable que Paria y Dey en 1990 sugirieron que el efecto primario fue operativo
entre el desarrollo de 8 células/mórula y estadio de blastocisto.
En el presente estudio, se evidenció un incremento en la formación de blastocistos
(estadísticamente significativo) cuando se cultivaron los embriones en grupo, así como un
incremento significativo en la aparición de eclosión o "hatching". Por otra parte, se observó
una disminución tanto en el arresto embrionario como en el número de embriones cuyo
desarrollo fue más lento, lo que sugiere la presencia de ciertos productos liberados por los
propios embriones, que presentes en mayores concentraciones en los medios de cultivo, cuya
densidad embrionaria era mayor, mejoran la calidad en el desarrollo embrionario hasta el
estadio de blastocisto, lo que concuerda con lo reportado por Lane y Gardner (1992) y O´Neill
(1998).
Estos resultados concuerdan con los de Lane y Gardner (1992), quienes no encontraron
una diferencia significativa en la formación de blastocistos de ratón en relación al volumen de
incubación, cuando los embriones fueron cultivados individualmente. Sin embargo, en el
cultivo de embriones en grupo, ellos encontraron un incremento significativo en la formación
de blastocistos incubados en comunas, independientemente del volumen utilizado.
En 1998, el mismo grupo de investigación (Gardner et. al, 1998b) publicaron un
estudio en donde los embriones fueron cultivados en grupos (3-4) en un gran volumen (1ml) y
la tasa total de formación de blastocistos fue de 45,6%, resultados que sugieren una mayor
importancia de la densidad embrionaria, más que el volumen de incubación.
Sin embargo, Rijnders y colaboradores (1999), realizaron un estudio prospectivo
randomizado, en humanos, donde no evidenciaron influencia significativa del cultivo en
grupos ni del volumen del medio de cultivo desde el día 3 hasta el estadio de blastocistos,
sobre las tasas de formación de blastocistos ni sobre las tasas totales de embarazo. Unas de las
55
sugerencias que estos investigadores aportan es la conveniencia de cultivar a los embriones en
forma individual, en pequeños volúmenes de medio de cultivo, para poder clasificarlos y
hacerles seguimiento durante el período de cultivo in vitro.
Nuestra investigación pone de manifiesto que hay un beneficio adicional en la técnica
de cultivo embrionario en grupos, ya que el porcentaje de formación de blastocisto y el
proceso de eclosión, fue significativamente mayor que en el grupo de cultivo individual,
fenómeno éste de vital importancia para que se lleve a cabo la implantación.
En cuanto a los factores de crecimiento, la presencia de un gran repertorio de éstos en
el tracto reproductor femenino durante el período de desarrollo del embrión en estadio de
preimplantación e implantación, indica que ellos podrían actuar de manera orquestada para
generar un desarrollo embrionario óptimo.
Se sabe que ciertos factores de crecimiento de carácter embriotrófico, son expresados
en el tracto reproductor femenino, los cuales promueven el desarrollo embrionario en varias
especies animales (Paria y Dey, 1990; O´Neill 1997; Kabe et. al, 1997; O´Neill, 1998; Hardy y
Spanos, 2002). Lo que aún no está claro es si los mecanismos por los cuales éstos actúan están
relacionados entre si, pero podría especularse, que juntos, tienen una influencia sobre la
actividad metabólica de la masa celular interna o del trofoectodermo del blastocisto, lo cual
llevaría a un aumento en la tasa de división celular y/o protección contra la apoptosis.
Los resultados de nuestra investigación demostraron, por una parte, que los embriones
murinos son capaces por sí mismos, de producir y secretar tanto el GM-CSF como el SCF, ya
que pudimos detectar la proteína en el medio donde se cultivaban los embriones, en los
diferentes estadios de desarrollo. No observamos diferencias significativas en la concentración
de ambos factores cuando el cultivo fue individual o en grupo.
Aún cuando este fenómeno nos llamó poderosamente la atención, pensamos que
podría explicarse por mecanismos de regulación interna, en donde cierta concentración de los
factores estudiados estaría actuando como señal de retroalimentación negativa, generando una
56
inhibición parcial o total en la transcripción de mayor cantidad de proteína (Behr et. al, 2005).
Por otra parte, recordemos que –aún cuando no fueron medidos en nuestra investigaciónexisten una serie de factores producidos a nivel del embrión, que modulan su desarrollo
preimplantación y que probablemente se encontraban en ciertas concentraciones en el medio
de cultivo en donde se desarrollaron nuestros embriones. Es posible pensar que estos otros
factores, también hayan tenido alguna o mucha influencia, tanto sobre el desarrollo
embrionario per se, como en la regulación de la producción de los factores de crecimiento
analizados en nuestra investigación.
Por otra parte, confirmamos que la adición exógena de los factores de crecimiento
analizados en este estudio, es decir, el Factor Estimulador de Granulocitos- Macrófagos y
Stem cell factor, produjo un efecto positivo sobre la supervivencia de los embriones, así como
un mayor desarrollo hasta estadio de blastocisto, lo cual podría deberse a aumento en el
número de blastómeras, ya sea por aceleración de la división celular o por disminución de la
apoptosis, aún cuando podría ser el resultado de otros efectos aún por definir (Robertson et al.,
2001).
A pesar de la mala calidad embrionaria con la que se trabajó durante este período
(segunda fase experimental), se observó una respuesta embrionaria efectiva a la presencia de
estos factores en el medio de cultivo donde se desarrollaron.
Debemos recordar, que en el caso del GM-CSF (una citocina multifuncional,
originalmente identificada como regulador de la proliferación y diferenciación en células
mieloides hematopoyéticas), se había descrito que sólo era secretado por las células del tracto
reproductor femenino (Giacomini et. al, 1995). Dentro de sus funciones hasta ahora
reconocidas, se distingue la promoción de la utilización de glucosa por el embrión (mayor
fuente de energía durante el período de compactación de la mórula), lo que se traduce en la
regulación de la actividad metabólica.
Esto podría explicar por qué los embriones cultivados en medios enriquecidos con
GM-CSF, mejoran su desarrollo hasta estadio de blastocisto, ya que, probablemente, al
57
aumentar la actividad metabólica, promueven mayor división celular y disminuyen la
apoptosis, fenómeno éste que podría estar relacionado con la deprivación metabólica en las
células embrionarias cultivadas en condiciones in vitro inadecuadas. (Sjöblom et.al, 1999).
Se ha sugerido que los factores de crecimiento son determinantes en el proceso de
muerte celular de las blastómeras durante el proceso de apoptosis. En el ratón, una oleada del
proceso de apoptosis, ocurre en el estadio de 60 a 110 células, durante la formación del
blastocisto, principalmente a nivel de la masa celular interna (Hardy K, 1997). La muerte de la
masa celular interna es el factor de mayor contribución en el retraso del desarrollo de los
blastocistos, durante el cultivo in vitro, particularmente cuando este ambiente no provee las
concentraciones óptimas de sustratos metabólicos (Brison y Shultz, 1997).
En nuestros experimentos, se evidenció que el efecto del GM-CSF exógeno fue
ejercido a partir del estadio de 8 células, lo que coincide con los hallazgos de Robertson y
colaboradores (2001). Este fenómeno está asociado, probablemente, al fomento de la
supervivencia de las blastómeras y/o su proliferación, predominantemente en las células del
blastocisto.
Los efectos embriotróficos del GM-CSF han sido descritos en otras especies,
incluyendo el ser humano (Sjöblom et. Al, 1999) y el ganado bovino (de Moraes et.al, 1997).
En ambas especies, la presencia de este factor incrementó al doble la proporción de embriones
que alcanzaron el estadio de blastocisto. En embriones humanos, este fenómeno se acompañó
de una rápida tasa de desarrollo, un incremento en el número de blastómeras, particularmente
de la masa celular interna y una progresión más frecuente al proceso de eclosión e
implantación.
El desarrollo embrionario in vitro es más difícil de lograr en ganado y en la especie
humana, en compasión a los ratones, por lo que no es sorprendente que los efectos de esta
citocina sean más dramáticos cuando el desarrollo constitutivo es más lento.
58
Así como otros factores de crecimiento implicados en el desarrollo embrionario
murino, GM-CSF tiene una función más facilitadora que esencial. Sin embargo, la importancia
fisiológica de estos factores en asegurar el desarrollo óptimo en el embrión en período de
preimplantación no debe ser subestimado, ya que las alteraciones en el desarrollo en estas
etapas tempranas del desarrollo, por más pequeñas que sean, pueden influenciar
negativamente los parámetros de crecimiento en el feto resultante, así como su salud y
viabilidad a largo plazo (Sjöblom, et.al, 2005).
En resumen, nuestros resultados muestran que GM-CSF no mejoró el desarrollo
embrionario desde el estadio de dos a ocho células, pero aumentó de manera significativa el
desarrollo de embriones de ocho células hasta el estadio de blastocisto, lo que sugiere que éste
podría regular la expresión de ciertos genes envueltos en el proceso de compactación y
formación de blastocisto.
Con respecto a Stem Cell Factor (factor que promueve la proliferación y supervivencia
de las células germinales durante el período embrionario) apenas se comienza a investigar
acerca de la función que juega en el período embrionario preimplantación. Así, Masahiro
Mitsunari y colaboradores (1999), evidenciaron que tanto el embrión como las células
epiteliales y estromales del útero, expresan mRNA SCF y mRNA de su receptor, c-kit, por lo
que sugirieron que este factor juega un rol importante en el período de implantación del
blastocisto. Por otra parte, notaron que al adicionar este factor de crecimiento a los medios de
cultivo in vitro, había un aumento en el área de superficie del trofoectodermo, lo que se
asociaba con su hipótesis acerca del papel que juega SCF durante el proceso implantatorio.
Se cree que este proceso, también está regulado por factores de crecimiento y citocinas,
por lo que estos investigadores se dieron a la tarea de detectar el SCF tanto en las células
embrionarias y en las células endometriales, logrando evidenciar su presencia en ambos casos.
La implantación embrionaria es un proceso complejo, el cual requiere de la interacción
del embrión y el endometrio. Aunque los detalles del mecanismo aún se mantienen poco
claros, la adjunción del embrión a las células epiteliales, adhesión y proliferación del
59
trofoblasto, y por último, la invasión de la células estromales, son pasos esenciales para que se
de una implantación exitosa.
Nuestra investigación demostró que el embrión, no sólo expresa el mRNA del factor y
el mRNA y la proteína de su receptor c-kit, hallazgo logrado por Mitsunari y colaboradores
(1999) durante el período preimplantación, sino que, por primera vez, se logra demostrar que
la proteína (SCF) es secretada al medio donde se cultiva in vitro. Adicionalmente se puso en
evidencia el efecto beneficioso sobre el desarrollo embrionario, a partir del estadio de ocho (8)
células, cuando fue adicionado en forma exógena.
Estos resultados ponen de manifiesto, que el SCF no sólo actúa a nivel de las células
del trofoectodermo y sobre las células endometriales involucradas en el proceso de
implantación, sino que también provee un efecto de tipo embriotrófico más temprano,
permitiendo el buen desarrollo de mayor número de blastómeras y así lograr el estadio de
blastocisto.
El número de células del blastocisto en el momento de la implantación, particularmente
el tamaño de la masa celular interna, ha sido identificado como factor determinante en el
desarrollo subsecuente de la placenta y del crecimiento fetal. Se ha reportado que el cultivo
embrionario in vitro está asociado con el retraso en el crecimiento fetal (Harlow y Quinn,
1982) y este efecto puede ser mejorado con la adición de factores de crecimiento que
promuevan la viabilidad celular.
En vista de estos hallazgos, es razonable proponer que el retraso en el desarrollo de
blastocistos cultivados in vitro, podría contribuir a alteraciones en la estructura placentaria,
disminuyendo el crecimiento fetal, así como incrementando la muerte fetal en estadios tardíos
de la gestación.
Las condiciones de cultivo in vitro para los embriones de mamíferos, en especial la del
ser humano, han sido generalmente consideradas como subóptimas; se cree que comprometen
la calidad de los embriones, lo que podría contribuir a las altas tasas de fallo de implantación
60
observadas en los procedimientos de fecundación asistida en la especie humana (Bavister,
1995).
El cultivo extendido hasta el estadio de blastocisto provee de un recurso para
seleccionar los embriones más competentes para ser transferidos a los pacientes, y se logra una
mejor sincronización entre el embrión y el tejido uterino receptor. Por tanto, la transferencia
de blastocistos al útero podría llevar a tasas mayores de implantación y ayudar a reducir el
número de embriones transferidos, contribuyendo así, a disminuir la tasa de nacimientos
múltiples producto de las técnicas de reproducción asistida.
Sin embargo, la aplicación clínica de la adición de factores de crecimiento a los medios
de cultivo en humanos, debe esperar por los resultados de posteriores experimentos donde se
dilucide el mecanismo de acción de estos factores sobre el embrión y en donde se evalúe los
efectos de su adición a los medios de cultivo, sobre el potencial de desarrollo de los
blastocistos en modelos animales.
Por último, aún cuando se ha comprobado el efecto beneficioso de GM-CSF y SCF
sobre el desarrollo embrionario in vitro, cualquier transferencia de blastocistos cultivados en
presencia de dichos factores, debe ser realizado con mucha precaución, dado que los eventos
que se presentan en el desarrollo embrionario temprano, podrían tener consecuencias a largo
plazo sobre la salud del individuo durante su niñez y su vida adulta.
Nuestra investigación demuestra que los embriones murinos son capaces por si
mismos, de producir GM-CSF y SCF, tanto en el período comprendido entre el desarrollo de 2
a 8 células, como en el estadio de 8 células hasta blastocisto. Estos embriones no sólo
expresan receptores para los factores de crecimiento producidos por el tracto reproductor
materno (Robertson et.al, 1992; Mitsunari et. al, 1999; Sjöblom et.al, 2002), sino que expresan
la proteína, la cual es secretada al medio de cultivo donde se desarrollan in vitro, lo cual
sugiere un potencial rol autocrino y paracrino para estos factores de crecimiento.
61
Hasta ahora, se había asociado el papel que juega GM-CSF y SCF durante el período
preimplantación, sólo con sus patrones de expresión temporal a nivel del tracto reproductor
materno, los cuales coinciden con el momento de la fecundación, desarrollo embrionario e
implantación (período secretor tardío del ciclo menstrual), ya que sólo se había demostrado su
secreción por parte de las células del oviducto y células endometriales (en el caso de GMCSF), pero esta investigación ha demostrado la secreción de ambos factores por parte del
embrión murino durante diferentes estadios durante el período preimplantación, lo que abre
una interrogante acerca de la función que ellos cumplen, ya sea directamente sobre el embrión
o sobre células que se encuentran en su recorrido por el oviducto, hasta llegar al útero donde
se implantan.
Cabe señalar que todas estas investigaciones en modelos animales -principalmente en
ratones- son realizadas con miras al mejoramiento de las tasas de éxito en reproducción
asistida, sobre todo para la especie humana. Aún cuando estamos de acuerdo en que el
potencial reproductivo de los ratones es mucho más eficiente que la del ser humano y que en
los problemas de infertilidad de éste, entran en juego una variedad de factores entre los cuales
se distingue las condiciones de cultivo in vitro, la posibilidad de mejorar las tasas de embarazo
con medidas tan sencillas como el cambio en la densidad embrionaria por gota, la
prolongación del cultivo hasta el estadio de blastocisto (en pacientes seleccionados) y la
introducción de mejoras significativas en la composición ideal de los medios a utilizar
(incluso, agregando factores de crecimiento que hayan demostrado tener efecto beneficioso y
seguro), abre las puertas para que en un futuro cercano, se disminuya de manera importante la
transferencia de más de dos embriones y evitar así, los altos riesgos de multigestación
presentes en la actualidad, con las consabidas repercusiones en la salud tanto de la madre
como de los fetos involucrados.
Es necesario tomar en cuenta que no todos los pacientes se benefician de la
prolongación del cultivo hasta el estadio de blastocisto. Desde que se desconoce los riesgos
para el embrión entre el día 3 y 5, los pacientes con limitado número de embriones de buena
calidad, pueden terminar sin blastocistos y por ende, sin transferencia. Es lógico pensar
entonces, que el uso de condiciones de cultivo subóptimas, producto del uso de medios
62
artificiales durante este período, podría imponer riesgos adicionales. Sólo 50 % de los
embriones de buena calidad y 20% de los de menor calidad (basados en la morfología del día
3) alcanzan el estadio de blastocisto (Rijnders y Jansen 1998).
La introducción de nuevos medios de cultivo, suplementados con aminoácidos
esenciales y no esenciales, así como de fuentes de energía ideales, han demostrado generar un
incremento importante en la formación de blastocistos y un aumento en las tasas de embarazo
(Gardner y col. 2000), lo que nos lleva a pensar que si se mejoraran estas condiciones, con la
adición de ciertos factores de crecimiento producidos tanto por la madre, como por los
embriones, el éxito en los procedimientos de ART aumentaría significativamente, sin tener
que recurrir a medidas especiales y laboriosas como las del cocultivo, para permitir un mejor
desarrollo embrionario in vitro.
Es importante notar, que antes de proponer esta opción, se requiere profundizar las
investigaciones en cuanto al papel de los factores de crecimiento en el desarrollo embrionario
preimplantación y así lograr el perfeccionamiento de medios de cultivos seguros que aumenten
las probabilidades de embarazos exitosos, sin aumentar –en consecuencia- el número de
embarazos cuyos productos, de otra manera, no fueran viables debido a la presencia de
anomalías estructurales y que pudieran desarrollarse gracias a la presencia de factores de
supervivencia en los medios utilizados.
Se piensa que la apoptosis es la ruta predeterminada de destino celular en los
embriones, al igual que en otros tipos celulares. El cultivo in vitro por si mismo, podría inducir
apoptosis en embriones de buena calidad. La suplementación de estos medios, con bajas
concentraciones de GM-CSF y SCF, podría proteger a los embriones de las condiciones de
stress metabólico. Por otra parte, la eliminación de células no deseadas es esencial en el
desarrollo, pero desafortunadamente, la apoptosis tiene el potencial de eliminar células
viables, llevando a la muerte del organismo (Brison y Shultz, 1998). Por lo tanto, parece que
este fenómeno es el indicador clave de la viabilidad y la competencia en el desarrollo de los
embriones (Kamjoo et. al, 2002).
63
En conclusión, nuestros resultados demuestran claramente que tanto el Factor
Estimulador de Colonias de Granulocitos-Macrófagos (GM-CSF), así como el Factor de
Células Madre ó “Stem Cell Factor” (SCF), tienen un efecto positivo sobre el desarrollo
embrionario a partir del estadio de 8 células, incrementando el número de embriones que
logran alcanzar el estadio de blastocisto.
El hecho de que se demuestre una mejoría significativa en el porcentaje de formación
de blastocistos con el cultivo embrionario en grupo y con la adición exógena de GM-CSF y
SCF, aunado al incremento significativo en la aparición de “hatching” cuando se aumenta la
densidad embrionaria, provee la base para estudios similares en el desarrollo humano, con la
idea futura de suplementar los medios de cultivo con estos factores embriotróficos y hacer de
rutina cultivos en comunas, lo que se traduciría en un progreso importante en las tasas de
implantación y niños nacidos vivos, producto de las técnicas de reproducción asistida.
64
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