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Tlamati Sabiduría Volumen 7 Número Especial 1, Septiembre 2016
3er. Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT
Acapulco, Guerrero 22-24 de Septiembre 2016
Memorias
Relación del grupo filogenético con la producción β-lactamasas de espectro
extendido en aislamientos de E. coli uropatogena
Cielo Apolonio Nava (Becario)
[email protected]
Unidad Académica Preparatoria No.12. Universidad Autónoma de Guerrero.
M. en C. Romina Belen Radilla Vázquez (Co-asesor)
Estudiante de Doctorado en Ciencias Biomédicas de la Facultad de Ciencias Químico
Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero.
[email protected]
Dra. Natividad Castro Alarcón (Asesor)
[email protected]
Profesor-Investigador del Laboratorio de Investigación en Microbiología, Facultad de Ciencias
Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero.
Introducción
Las infecciones de tracto urinario (ITUs) son una de las principales causas de muerte a
nivel mundial, estas son causadas por microorganismos patógenos que logran invadir y colonizar
alguna región de este aparato, ya sean las vías bajas (uretra, vejiga y próstata) o las altas
(riñones). El desarrollo de la infección puede ser sintomático o asintomático, con lo que se
dificulta su detección y por lo tanto el inicio de un tratamiento adecuado. Escherichia coli
uropatógena (UPEC) es responsable de más del 80% de las ITUs. La anatomía del aparato
genitourinario femenino es un factor que influye en que estas infecciones se desarrollen
mayormente en mujeres que, en hombres, entre el 16.8% y el 46% de las ITUs son observadas en
pacientes con anomalías del tracto urinario.
E. coli es un bacilo Gramnegativa que se encuentra en el tracto gastrointestinal de
humanos y animales de sangre caliente. Es la bacteria anaerobia facultativa comensal más
abundante de la microbiota intestinal; así mismo, es uno de los organismos patógenos más
relevantes en el hombre, tanto en la producción de infecciones gastrointestinales como de otros
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Memorias del 3er Encuentro de Jóvenes en la Investigación de Bachillerato-CONACYT
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sistemas
(urinario,
sanguíneo,
nervioso). Es anaerobio
facultativo,
móvil
por flagelos
peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas y es capaz de fermentar la glucosa.
E. coli puede ser clasificada en 8 grupos filogenéticos, dos de ellos propios de cepas comensales
y poco virulentas (A y B1) y los otros típicos de cepas extraintestinales y virulentas (B2, F y D).
Se ha reportado que las cepas pertenecientes al grupo B2 expresan una mayor cantidad de
factores de virulencia, lo que convierte a las cepas pertenecientes a este grupo en las más
frecuentes en casos de cistitis complicada, no complicada y la bacteriuria asintomática
complicada. Las cepas del grupo D también presentan factores de virulencia de UPEC, lo cual las
hace partícipes de las infecciones de tracto urinario, aunque con menor frecuencia que el grupo
B2. Se ha propuesto que los grupos B1 y C están estrechamente relacionados.
El uso de marcadores moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha
acelerado el proceso diagnóstico de las ITUs, de igual nos brinda información tanto para
administrar el tratamiento adecuado y para hacer estudios epidemiológicos (Landgraf et al. 2012).
Esto es de importancia ya que en tiempos recientes diversas cepas han desarrollado
multirresistencia hacia los fármacos usados en su tratamiento, esto por un diagnóstico tardío o un
tratamiento inadecuado. Dicha resistencia se ha reportado a nivel mundial, principalmente hacia
β-lactámicos (penicilina), aminoglucósidos (amikacina) y cefalosporinas (Cefotaxima, cefalotina
y ciprofloxacina). Las cepas pertenecientes al grupo filogenético B2, además de ser las más
representativas de UPEC, se han asociado con la formación de β-lactamasas.
El urocultivo es la forma rutinaria de identificar si el paciente sufre una infección en el
tracto urinario, este examen de laboratorio indica si hay bacterias u otros microbios en una
muestra de orina. En condiciones normales la orina es estéril, así que la forma de recolectarla
debe ser muy especial para evitar la contaminación con microbiota de la uretra distal, el perineo o
en su caso vagina. Para obtener la muestra de orina se utiliza un frasco estéril, boca ancha, tapa
de rosca, correctamente rotulado. La muestra se recoge del chorro medio, que consiste en recoger
la porción media del chorro de orina emitida en forma espontánea, descartando la porción inicial
para eliminar la microbiota. Las indicaciones generales que dan los analistas de laboratorio al
paciente son: lavar la zona genital con abundante agua y jabón, enjuagarse con abundante agua,
comenzar a orinar descartando el primer chorro, sin detener la micción recoger únicamente la
parte media del chorro de orina en el frasco sin tocar la piel, cerrar bien el frasco, rotularlo.
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Como en todos los casos, es preferible enviar la muestra al laboratorio de inmediato,
dentro de las dos horas, de lo contrario mantenerla refrigerada (4ºC a 8 ºC) no más de 24 horas,
para no alterar el recuento bacteriano. La interpretación del urocultivo por chorro medio implica
un resultado cuantitativo, por lo que es elemental sembrar un volumen conocido de orina. Esto se
logra mediante el uso de asas bacteriológicas calibradas que cargan un volumen conocido; por
ejemplo 10 o 100 microlitros. El número de colonias obtenidas (unidades formadoras de
colonias) es luego multiplicado por el número de veces que el inóculo entra en 1 ml. Después del
asilamiento del agente causal de la infección, comúnmente bacterias, se procede a identificar y
realizar una prueba denominada antibiograma., es una técnica microbiológica que se realiza para
determinar la susceptibilidad (sensibilidad o resistencia) de una bacteria a un grupo de
antibióticos.
La utilidad básica del antibiograma es la instauración de un tratamiento antibiótico
correcto al paciente. Es necesario conocer si el microorganismo responsable de la infección posee
mecanismos que le confieran inmunidad frente a algún antibiótico para no incluirlo como terapia,
también resulta útil en el seguimiento e incluso corregir el tratamiento en tratamientos empíricos.
Otra aplicación de las técnicas de estudio de resistencia es la epidemiología. Es necesario detectar
el aumento de los niveles de resistencia en los aislamientos clínicos para tomar medidas
correctoras. Por otro lado, también puede tener utilidad diagnóstica porque el perfil de resistencia
puede en algún caso orientar en la identificación bacteriana.
Los antibióticos más usados para tratar las infecciones de vías urinarias son el
trimetoprim, la amoxicilina y la ampicilina. También una clase de fármacos llamados quinolonas
han sido aprobados en los últimos años para el tratamiento de las infecciones del tracto urinario,
como son la ofloxacina, ciprofloxacina y trovafloxina.
La resistencia antimicrobiana es un problema continuo y en aumento. Se hace aun mayor
cuando un microorganismo presenta más de un mecanismo de resistencia y cuando tiene la
facultad de transmitirlo a otras bacterias de su misma o diferente especie. Los fenómenos de
resistencia antimicrobiana son variados, destacando entre ellos cuatro mecanismos principales: 1)
Enzimas hidrolíticas, 2) Modificación del sitio activo, 3) Disminución de permeabilidad de la
pared celular al ingreso del antimicrobiano y 4) Bombas de expulsión del antimicrobiano.
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Dentro de la producción de enzimas hidrolíticas encontramos la producción de β-lactamasas de
espectro extendido (BLEE), mecanismo importante de resistencia en los miembros de la familia
Enterobacteriaceae y otras bacterias gram negativas a los antibióticos beta-lactámicos.
La resistencia a los antibióticos constituye un problema serio de salud pública en el
mundo el cual se ha agudizado durante los últimos años, especialmente en los países
subdesarrollados donde carecen de políticas apropiadas para la utilización de estos fármacos,
contribuyendo a su uso indiscriminado y por consiguiente a la aparición de cepas bacterianas
multiresistentes a los antibióticos. Las cepas bacterianas son altamente transmisibles y se
diseminan rápidamente debido a la infraestructura ineficiente en la salud pública y las prácticas
de control erradas de las infecciones.
De hecho, uno grupo de antibióticos mayormente utilizados en la actualidad y con gran
significancia clínica es el llamado grupo de los beta-lactamicos, los cuales incluyen las
penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, carbapenems y monobactamicos, entre otros, los cuales
son ampliamente utilizados para el tratamiento de diversas infecciones bacterianas, debido a su
baja toxicidad y su amplio espectro de acción. Por todo lo anterior es importante seguir
investigando la relación entre el grupo filogenético y la producción de BLEE. Con ello lograr
una mejor calidad de vida a todas las personas que sufren o pueden estar sufriendo una ITU.
Objetivo
Analizar la relación entre el grupo filogenético y la producción de β-lactamasas de
espectro extendido en E. coli uropatógena.
Metodología
Se analizaron cepas de E. coli, previamente aisladas de pacientes con ITUs, los cuales
fueron captados en la clínica del ISSTE de Chilpancingo de los Bravo durante en el periodo
2013-2014. Las cepas fueron conservadas en congelación con glicerol a -80°C. Para ser utilizadas
fueron nuevamente sembradas en agar por estría cruzada e incubadas a 35°C durante 24 horas.
Prueba de BLEE (doble disco combinado). Se realizó con una suspensión al 0.5
Macfarlan a partir de un cultivo fresco (de 18 a 24 horas), para esto se tomó una asada de 2 a 3
colonias cultivadas en placas de agar MacConkey, poco a poco las colonias se disolvieron en
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solución salina fisiológica contenidos en tubos de 13x100mm, esto se realizó hasta alcanzar la
turbidez parecida al patrón de 0.5 de Macfarlan, lista la suspensión bacteriana se introdujo un
hisopo estéril, se escurrió muy bien por las paredes del tubo y se procedió a sembrar por estría
masiva en una caja de agar Mueller Hinton, la diseminación del inóculo en la caja se hizo tres
veces para lograr una siembra homogénea en el agar. Posteriormente se colocaron los discos con
antibióticos Ceftazidima (CAZ), CAZ + Ácido clavulámico, Cefotoxima (CTX), CTX + Ácido
clavulámico (AC), cada uno a distancia de 30 milímetros, figura 1.
Figura 1. Esquema para colocar los discos con
antibióticos para la prueba de BLEE.
La prueba se consideró positiva cuando hubo una diferencia de 5mm entre los discos de
CTX, CTX + AC y CAZ, CAZ + AC. Se consideró la prueba negativa cuando los halos de
inhibición fueron iguales. Es importante señalar que para validar la técnica se incluyó un control
positivo (Klepsiella pneumoniae ATCC 700603) y un control negativo (E. coli ATCC 25922).
Identificación del grupo filogenético
A todas las cepas utilizadas en este estudio previamente les realizó extracción de ADN
por choque térmico. Posteriormente se llevó a cabo una PCR cuádruple para identificación del
grupo filogenético. La reacción de PCR estuvo compuesta por 4.5 µl de agua, 2 µl de buffer 10x,
2.5 µl de dNTP´S (10 mM), 0.75 µl de MgCl2 (50 mM), 1 µl de cada oligonuclotido, 0.25 µL de
Taq polimerasa y 2 µl de ADN. Los oligonucleótidos chuA,yjA, TsPE, se trabajó a una
concentración de 20 pmol y los cebadores de Arpa a 40 pmol.
Para confirmar el grupo filogenético se realizó otra reacción de PCR para diferenciar el
grupo C del A y el grupo E del D, para ello se utilizaron diferentes juegos de oligonucleótidos
dirigidos al gen de Arpa y trpA. La PCR cuádruplex y de grupo C se corrieron bajo las siguientes
condiciones: Un ciclo a 94ºC x 4 min, 30 ciclos a 94ºC x5seg, 59ºC x 20 seg, 72ºC x 30 seg y un
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ciclo final de 72ºC x5min. Para la diferenciación entre el grupo E o D solo cambio la temperatura
de alineamiento a 59ºC.
Resultados
Producción de BLEE. En este verano se tuvo la oportunidad de aprender y practicar esta técnica
fenotípica. En la figura 2, se muestran imágenes de las pruebas realizadas. Por un lado, tenemos
una cepa BLEE (-) y otra BLEE (+).
A)
B)
Figura 2. A) Cepa BLEE.negativa y B) Cepa BLEE positiva
Se trabajaron con cepas de E. coli a las cuales previamente se les realizó la prueba de doble disco
combinado, obteniendo 70 (61%) aislamientos positivos a BLEE y 44 (39%) negativos a BLEE,
figura 3.
Figura 3. Porcentaje de cepas de E. coli BLEE positivas y negativas
Grupos filogenéticos. A todas las cepas de E. coli trabajadas en este verano se les determinó el
grupo filogenético, (mediante la amplificación de genes específicos: Arpa, chuA, yjaA y tspE4C).
El grupo más prevalente fue el B2, considerado el grupo más virulento (Tabla 1).
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Tabla 1. Grupo filogenético de cepas UPEC
Grupo filogenético
Frecuencia (n = 114)
A
11 (9.65 %)
B1
8 (7.02 %)
B2
55 (48.25 %)
C
10 (8.77 %)
D
5 (4.39 %)
E
1 (0.88 %)
F
19 (16.67 %)
5 (4.39 %)
Clado I
Relación del grupo filogenético con la producción de BLEE. Se buscó la asociación del grupo
filogenético de las cepas causantes de infecciones urinarias con la resistencia a antibióticos
mediada por enzimas BLEE, mediante una prueba estadística. Dando un valor de p= 0.010, lo
cual es estadísticamente significativo.
Tabla 2. Relación del grupo filogenético con la producción de BLEE
Grupo
Prueba de BLEE
filogenéticoa
n(%)
Total
Negativo
Positivo
A
1 (2.27)
10(14.29)
11(9.65)
B1
3(6.82)
5(7.14)
8(7.02)
B2
23(52.27)
32(45.71)
55(48.25)
C
5(11.36)
5(7.14)
10(8.77)
D
2(4.55)
3(4.29)
5(4.39)
E
1(2.27)
0(0.00)
1(0.88)
F
4(9.09)
15(21.43)
19(16.67)
Clado I
5(11.36)
0(0.00)
5(4.39)
Total
44(100)
70(100)
114(100)
aValor
de p calculado con la prueba exacta de Fisher, p= 0.010 (valor p estadísticamente significativo).
Aquí se muestran imágenes de todo el procedimiento realizado para la identificación de grupo
filogenético.
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1.- Preparación de la PCR
2.- Incubación de la PCR en el termociclador
4.-Gel de agarosa revelado (visualización de los
amplificados de la PCR cuádruplex y rectificación
del grupo filogenético)
3.- Cargando los productos de PCR para hacer la electroforesis.
Conclusiones
 Se encontró relación entre el grupo filogenético y la producción de betalactamasas de
espectro extendido en cepas de E. coli uropatógenas.
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 El grupo filogenético con mayor prevalencia fue el B2, el cual se ha relacionado con una
mayor expresión de factores de virulencia.
 Es importante seguir haciendo investigación sobre los mecanismos de resistencia
expresados en las diferentes bacterias aisladas en la comunidad para con ello informar a
los profesionales de la salud y con esto puedan retomar o emplear nuevas estrategias para
evitar su diseminación.
 La prueba de BLEE es una prueba de bajo costo estandarizada que permite determinar la
resistencia a cefalosporina de expectro extendido, con esto los tratamientos con
antibióticos resultarían más exitosos, ahorrando dinero y esfuerzo.
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http://www.dgcs.unam.mx/boletin/bdboletin/2012_443.html
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http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioAntibioticos.htm
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https://es.wikipedia.org/wiki/Antibiograma
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