Download Preparación de cultivos iniciadores. Optimización del sustrato

Resumen: E-060
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
Preparación de cultivos iniciadores.
Optimización del sustrato de crecimiento.
Rivas, Franco P. - Garro, Oscar
Facultad de Agroindustrias, UNNE.
Comandante Fernández 755, Sáenz Peña 3700, Chaco, Argentina.
[email protected]
Antecedentes
La principal característica de las bacterias lácticas del yogurt Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus y
a la cual deben su gran importancia en la industria alimenticia es la acidificación que producen en el medio debido a la
producción de ácido láctico (Becker ,1999; Tamime, 1991); propiedad que fue usada en este trabajo para seguir su
crecimiento.
En la bibliografía y páginas de Internet consultadas el medio de crecimiento mas comúnmente usado es la leche
(Bourgeois, 1995; Ramos, 2002; Beltran; García López; Valbuena, 2005).
Las temperaturas óptimas de crecimiento son de 37º-42ºC y de 42º-45ºC para S. thermophilus y L. bulgaricus
respectivamente.
Las bacterias S. thermophilus y L. bulgaricus se desarrollan en una verdadera simbiosis. En esta simbiosis es el S.
thermophilus el que inicia la fermentación láctica y que se desarrolla muy intensamente hasta un pH de 5,5. La acidez,
el consumo de oxigeno y la liberación de sustancias volátiles, por ejemplo ácido fórmico, que produce crea las
condiciones ideales para que se desarrolle L. bulgaricus. Normalmente se utilizan en una relación cuantitativa de 1:1 a
1:3, aproximadamente.
La actividad proteolítica de los lactobacilos estimula, a su vez el crecimiento y la actividad acidificante de los
estreptococos. Los lactobacilos desarrollan aparte una actividad lipolítica, por lo que se liberan ácidos grasos y
producen además acetaldehído, constituyéndose así en los principales productores de aroma del yogurt.
Observados bajo el microscopio se ve que S. thermophilus crece formando pares o cadenas mediante células esféricas
o elipsoides. L. bulgaricus presenta forma de bastoncillo relativamente largo con tendencia a formar cintas (Cayré,
2000; Briceño, 2001; Holt, 2000).
A partir de estos datos se procedió al reconocimiento, aislamiento e investigación sobre medios de cultivos óptimos
para el desarrollo de dichas bacterias.
Materiales y Métodos
Aislamiento de las bacterias del yogurt: se procedió según el método de diluciones sucesivas en agua peptonada y
siembra en medio agarizado de LAPTg y MRS en placa, se utilizó yogures comerciales de varias marcas hasta lograr el
aislamiento de ambas bacterias. Al medio de cultivo se adicionó sorbato de potasio (0.02%) para evitar el crecimiento
de hongos.
Selección de colonias: se seleccionó según la forma de la colonia en placa. S. thermophilus forma colonias típicas
circulares o lenticulares, compactas y con bordes uniformes (1 a 3 mm. de diámetro) y L. bulgaricus forma colonias de
aspecto rugoso con bordes irregulares. Esto no fue comprobado en la práctica en su totalidad debido a las formas de las
colonias y sobre todo al tamaño muy reducido (un mm. aproximadamente), lo cual dificultó su extracción, por lo cual se
precedió a su elección al azar eligiendo las colonias de mayor tamaño.
Se realizó el pasaje individual a nuevas placas y luego a LAPTg y MRS caldos.
Comprobación de la presencia de S. thermophilus y L. bulgaricus: se realizó la tinción de gram, prueba de la catalasa
y observación de la morfología en microscopio.
Comparación de las medios de cultivos: a efectos de determinar que medio es más óptimo para el crecimiento de
dichas bacterias procedimos a la construcción de curvas de crecimiento con sus correspondientes duplicados, cada
bacteria sola y combinadas para comprobar así también la simbiosis, para lo cual se extraían muestras cada dos horas a
las cuales se les realizaron las pruebas:
Acidez: mediante una titulación con NaOH 0,1N con fenoftaleina como indicador. El volumen gastado en
ml (V) se reemplaza en la fórmula para pasar a grados Dornic (ºD) y dividiendo por 100 obtenemos el
porcentaje de ácido láctico formado durante la fermentación:
% Ác.Láctico =
9 ×V
100
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pH: con peachímetro digital.
Densidad óptica: en el caso de que la transparencia del medio lo permita con el espectrofotómetro a 560
nm.
Los resultados fueron colocados en las tablas y representados gráficamente.
Dicho procedimiento fue repetido con leche y con LAPTg como medios de cultivo.
Medios de cultivo (Cayre, 2004):
LAPTg: composición en g/litro: extracto de levadura, 10g; peptona, 15g; triptona, 10g; glucosa, 10g; tween 80, 1ml;
agar, 12g; agua destilada, 1 litro. pH final 6,8. Disolver completamente y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15
minutos.
MRS: composición en g/litro: polipeptona, 10g; extracto de carne, 10g; extracto de levadura, 5g; glucosa, 20g; tween
80, 1.08ml; fosfato de potasio, 2g; acetato de sodio, 5g; citrato de amonio, 2g; sulfato de magnesio, 0.2g; sulfato de
manganeso, 0.05g. El pH del medio a una temperatura de 25ºC es de 6.4± 0.2
Leche: se utilizó leche comercial larga vida. Para la preparación de los inóculos, se dosificó en los tubos y esterilizó
en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
Discusión de los resultados
Cuando se realizó el aislamiento de las bacterias S. thermophilus y L. bulgaricus se encontró que no se encontraban
ambas en todos los yogures, o lo hacían en muy bajas concentraciones, y dependía de la marca. Se logró aislar ambos
microorganismos de uno de ellos. Se recurrió al medio MRS para favorecer el crecimiento de los bacilos frente al de
los cocos, facilitando la distinción y aislamiento de cada especie.
Las bacterias aisladas resultaron gram positivas y en la prueba de catalasa, todas catalasa negativas.
Cuando las colonias se cultivaron en los tubos de ensayo se observó que los cocos sedimentaban en forma compacta,
mientras que los bacilos lo hacían en forma esponjosa y en mayor cantidad.
En los ensayos realizados se observó mayor crecimiento en las muestras que contenían ambas bacterias y en segundo
lugar el desarrollo varia de acuerdo al medio de cultivo utilizado.
Las mediciones de densidad óptica no pudieron realizarse en la leche; y en el medio LAPTg luego de 12 h de cultivo
se detuvo el crecimiento de las bacterias, pero si continua la acidificación del medio con la generación de ácido láctico.
También fue analizado el efecto de la temperatura en el crecimiento bacteriano realizándose ensayos a las
temperaturas de 37ºC y luego a 40ºC. A la temperatura de 37ºC el pH del medio bajo a 4.4 en un período de 49 horas,
mientras que a 40ºC se llegó al mismo pH en sólo 14 horas, usando LAPTg como medio de cultivo.
Se puede observar en las gráficas que no se presenta la fase lag o de retraso, esto se debió a que el inóculo crecía ya
bajo las mismas condiciones y el mismo medio en el que se realizó el ensayo, el crecimiento continúa a la misma
velocidad. Sin embargo, si el inóculo se toma de un cultivo viejo se presenta una fase lag,
La fase de crecimiento exponencial se dio en horas de la noche, momentos en los que las mediciones no fueron
tomadas, a esto se debe la forma tomada por el recorrido de la curva en las horas comprendidas entre 0 y 12
aproximadamente.
Luego de las 12 horas observamos la fase estacionaria en la cual el crecimiento exponencial se detiene, por la
presencia del ácido láctico que es una sustancia tóxica para los microorganismos. La producción de ácido continúa hasta
las 20 horas de cultivo, a partir de allí se observó una disminución de la viabilidad de las células. El % de ácido láctico
continuó aumentando hasta las 48 horas pero en muy baja proporción.
Fig 1: Curvas de Crecimiento correspondientes a cada bacteria en los diferentes medios de cultivo a 40ºC:
Crecimiento de Bacilos
7
6
5
pH en Leche
4
3
%Ác. Láctico en Leche
2
1
%Ác. Láctico en LAPTg
0
0:00:00
pH en LAPTg
12:00:00
24:00:00
Tiempo (h)
36:00:00
48:00:00
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Crecimiento de Cocos+Bacilos
7
6
5
pH en Leche
4
%Ác. Láctico en Leche
3
pH en LAPTg
2
1
%Ác. Láctico en LAPTg
0
0:00:00
12:00:00
24:00:00
36:00:00
48:00:00
Tiempo (h)
Crecimiento de Cocos
7
6
5
pH en Leche
4
%Ác. Láctico en Leche
3
pH en LAPTg
2
1
%Ác. Láctico en LAPTg
0
0:00:00
12:00:00
24:00:00
36:00:00
48:00:00
Tiempo (h)
Conclusiones
A través de las sucesivas mediciones se iba confirmando el hecho de un elevado crecimiento relativo del ensayo que
contiene ambas bacterias respecto a los que contenían una sola especie, comprobándose así la simbiosis que se produce
entre el Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus; y dependiendo del medio, las bacterias por separado
lograban un desarrollo más rápido, en leche la mayor y más rápida acidificación la produjeron los cocos, mientras que
en el medio LAPTg los bacilos se desarrollaron más rápido.
El descenso de pH no se correlaciona linealmente con el ácido producido esto es debido a la capacidad buffer de los
medios de cultivo por lo que es importante seguir los dos parámetros durante el desarrollo del ensayo.
Se confirmó también que el medio leche fue el mejor debido a varias cualidades como ser su accesibilidad, economía,
ser práctico, ser el medio natural de crecimiento y tener todos los nutrientes que las bacterias necesitan para su
desarrollo, esto se observa claramente en los gráficos . Así también ha de destacarse las cualidades del medio LAPTg,
como ser la fácil manipulación debido al no solidificarse al momento de la acidificación, mayor visibilidad de los
procesos de crecimiento, como así también permite realizar mediciones de la densidad óptica del cultivo.
La temperatura fue también una variable muy importante, debido que un pequeño aumento en la temperatura desde
37ºC a 40ºC produjo una gran reducción en el tiempo de crecimiento,
Bibliografía:
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Maria E Cayré, Oscar A Garro. (2000). Guía de Trabajos Prácticos de Laboratorio de la cátedra Microbiología de los
Alimentos. Facultad de Agroindustrias. UNNE.
Roberto Ramos, (2002). http://www.geocities.com/roberto_raul/crecimiento.html
Daniel Beltran. http://www.freewebs.com/biotecvida9/lactica.htm