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AGRADECIMIENTOS
Dra. Cecilia Rojas de Gante, autora intelectual del tema de tesis. Por su paciencia, apoyo y comprensión
durante la investigación. Gracias por guiarme en esta etapa de mi vida.
FUNDACION PRODUCE DE NUEVO LEON, A.C., por el apoyo económico para la realización de esta
investigación (Proyecto 165).
Dr. Sergio O. Serna Saldívar y Dr. Manuel Zertuche Guerra, por su participación como sinodales en la defensa
de tesis.
A la Q.B.P. María Isabel García, M.C. Juan Gerardo Cantú y Q. Mireya Zavala, por el apoyo técnico y moral
durante la investigación.
Y a todas aquellas personas que de una u otra forma colaboraron en la realización de esta investigación, hago
extenso mi más sincero agradecimiento.
i
Antecedentes
Capitulo 1.- Antecedentes
1.1.
Probióticos.
La palabra probiótico proviene del griego y significa “Por la vida” (Torres, 2002). El concepto de probiótico
ha evolucionado probablemente desde la teoría propuesta por el científico ruso, Eli Metchnikoff, quien en
1908, atribuyo la extraordinaria longevidad de los pobladores de los Balcanes, al consumo de productos
lácteos fermentados. El termino probiótico fue usado por primera vez por Lilly and Stillwell en 1965,
quienes lo definieron como, sustancia secretada por un microorganismo, el cual estimula el crecimiento de
otros (Fioramonti et. al., 2003). La definición de probióticos ha sido modificada en innumerables ocasiones
(Fioramonti et. al., 2003), la última definición fue publicada por Reid et. al. (2003), quien define a los
probióticos como: “microorganismos vivos, los cuales al ser administrados en cantidad adecuada,
confieren beneficios fisiológicos al hospedero”. Esta definición involucra tanto la dosis, la viabilidad de los
microorganismos, así como los beneficios fisiológicos que confieren estos al hospedero.
Actualmente, herramientas y conocimientos científicos, han quedado disponibles para evaluar
adecuadamente los efectos de los probióticos en la salud humana, así como, su potencial en la prevención
y tratamiento de enfermedades.
1.2.
La Flora Intestinal Humana, Fuente de Probióticos.
Aproximadamente, 100 trillones de microorganismos colonizan el tracto gastrointestinal humano. Esa
cantidad de microorganismos representa 10 veces más el número total de células en el cuerpo humano.
Muchos de estos microorganismos, están localizados en la porción baja del intestino delgado y el colon.
El estómago y la porción alta del intestino delgado, contienen ácido gástrico y sales biliares, además de
estar en constante movimiento, lo que ocasiona que la flora se mantenga disminuida, alrededor de 103
microorganismos por mililitro.
A lo largo del intestino delgado, la flora se va incrementando gradualmente. A la mitad del intestino
delgado, es la zona de transición entre la escasa población de microorganismos que residen en la parte
alta del intestino delgado y la exuberante población encontrada en le intestino grueso.
1
Antecedentes
Se ha estimado que en la flora intestinal humana existen mas de 500 especies de microorganismos, que
pertenecen principalmente a los géneros: Bacteroides, Lactobacillus, Clostridium, Fusobacterium,
Bifidobacterium, Eubacterium, Escherichia y Veillonella (Isolauri et. al., 2002; Robinson et. al., 2000 y
Rolfe, 2000).
La flora intestinal humana, actúa como una barrera para proteger al hospedero contra enfermedades. La
interrelación entre la flora intestinal y el huésped se lleva a cabo mediante procesos simbióticos y
antagonistas. Un desequilibrio en la flora intestinal, puede incrementar la susceptibilidad a enfermedades
infecciosas, inmunoinflamatorias, entre otras (Rolfe, 2000).
Antes del nacimiento, el intestino humano es estéril. La colonización microbiana inicia inmediatamente
después del nacimiento. La flora intestinal y vaginal materna, constituyen una fuente de colonización
bacteriana para el recién nacido. La colonización microbiana también esta determinada, por el contacto del
recién nacido con el medio ambiente (Robinson et. al., 2000 y Rolfe, 2000).
La alimentación, ejerce efectos en la composición y actividad de la microflora del intestino. En infantes
alimentados con leche materna, predomina el género Bifidobacterium, mientras que infantes alimentados
con leche de fórmula, presentan una composición bacteriana similar a los adultos, predominando los
géneros: Enterobacterium, Lactobacillus, Bacteroides, Clostridium, Bifidobacterium y Streptococcus. En
adultos sanos, la composición de la flora intestinal se mantiene casi invariable durante la vida.
Los géneros Bifidobacterium, Lactobacillus y Streptococcus, son microorganismos considerados como
probióticos en humanos, su origen es el tracto gastrointestinal humano.
1.3.
Microorganismos Probióticos
Actualmente, los probióticos más estudiados son las Bacterias Ácido Lácticas (BAL), particularmente,
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei y las bacterias del yogurt, Lactobacillus delbrueckii spp.
bulgaricus y Streptococcus salivarius spp. thermophilus; aunque también ha habido considerable interés
en el género Bifidobacterium spp. (Harsharnjit, 2003 y García Garibay et. al., 2002). Las BAL, se
caracterizan por su capacidad de fermentar glúcidos produciendo ácido láctico.
2
Antecedentes
Debido a esta capacidad, las BAL se han utilizado ampliamente en la producción de leche y otros
productos lácteos fermentados. Se reconocen en todo el mundo más de 20 especies diferentes de
microorganismos probióticos en humanos (Torres, 2002) (Tabla 1).
Tabla 1. Especies de microorganismos usados como probióticos en humanos
Microorganismos usados como probióticos en humanos
ƒ Lactobacillus acidophilus
ƒ Bifidobacterium bifidum
ƒ Lactobacillus plantarum
ƒ Bifidobacterium infantis
ƒ Lactobacillus casei
ƒ Bifidobacterium adolescentes
ƒ Lactobacillus casei spp. rhamosus
ƒ Bifidobacterium longum
ƒ Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus
ƒ Bifidobacterium breve
ƒ Lactobacillus fermentum
ƒ Streptococcus salivarius spp. thermophilus
ƒ Lactobacillus reuteri
ƒ Enterococcus faecalis
ƒ Saccharomyces boulardii
ƒ Enterococcus faecium
ƒ Lactococcus lactis spp. lactis
ƒ Lactococcus lactis spp. cremoris
Fuente: Torres, 2002.
En general, las BAL, se caracterizan por producir importantes cantidades de ácido láctico; son bacterias
gram positivas, inmóviles, no forman esporas, oxidasa negativo, catalasa negativo, generalmente nitrato
reductasa negativo y anaerobias facultativas. Requieren una mezcla compleja de aminoácidos y factores
de crecimiento., especialmente Vitaminas del complejo B (Leveau y Bouix, 2000).
En base a su morfología, las BAL pueden clasificarse en cocos y bacilos. En función de su temperatura
óptima de crecimiento, se dividen en microorganismos mesófilos, que crecen rápidamente a 20 – 30 ºC y
microorganismos termófilos, que lo hacen a 35 – 45 ºC. En base a la ruta metabólica que siguen para
metabolizar carbohidratos, se dividen en: microorganismos homofermentativos y microorganismos
heterofermentativos. En la figura 1, se muestra las rutas que siguen las BAL para metabolizar la lactosa.
Los microorganismos que siguen la vía homofermentativa, degradan la lactosa por la ruta de EmbdenMeyerhof-Parnas o hexosas difosfato. El principal producto del metabolismo es el ácido láctico. Esta vía
homofermentativa es utilizada por los géneros Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, entre otros.
3
Antecedentes
Los microorganismos que siguen la vía heterofermentativa, degradan la lactosa por la ruta de Warburrg
Dickens o pentosa fosfato. Los principales productos del metabolismo son ácido láctico, etanol y otros
ácidos orgánicos de cadena corta como ácido acético, propiónico y succínico. Esta vía heterofermentativa
es utilizada por el género Bifidobacterium (Walstra et. al., 2001; Leveau y Bouix, 2000 y Law, 1997).
Figura 1. Rutas metabólicas utilizadas por las Bacterias Ácido Lácticas para la degradación de la lactosa.
En la tabla 2, se presentan las características diferenciales entre géneros considerados como probióticos
empleados para consumo humano. Se puede observar la morfología celular, temperatura óptima de
crecimiento, tipo de respiración, ruta metabólica para degradación de lactosa y los productos del
metabolismo de la lactosa.
Tabla 2. Características diferenciales entre géneros considerados como probióticos en humanos.
Característica
Temperatura de
crecimiento
Tipo de respiración
Bacilos bifurcados
Termófilos
35 – 45 ºC
Anaerobio
Ruta de Warburrg Dickens ó Ácido láctico, acético,
pentosa fosfato
propiónico, succínico,
etanol.
Lactobacillus spp.
Bacilos
Termófilos
35 – 45 ºC
Anaerobio
Ruta de Embden-MeyerhofParnas ó hexosas difosfato
Ácido láctico
Lactococcus spp.
Células en forma ovoide
en pares o cadenas
Mesófilos
20 – 30 ºC
Anaerobio facultativos
Ruta de Embden-MeyerhofParnas ó hexosas difosfato
Ácido láctico
Cocos en cadena
Termófilos
35 – 45 ºC
Anaerobio
Ruta de Embden-MeyerhofParnas ó hexosas difosfato
Ácido láctico
Microorganismo
probiótico
Bifidobacterium spp.
Streptococcus spp.
Fuente: (Walstra et. al., 2001; Leveau y Bouix, 2000 y Law, 1997).
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Ruta metabólica
Producto del
metabolismo de
carbohidratos
Morfología celular
Antecedentes
1.4.
Criterios para la Selección de un Microorganismo Probiótico
En la actualidad existen o se utilizan criterios de selección muy estrictos para obtener cepas funcionales
de probióticos. Los criterios de selección de los microorganismos probióticos utilizados en humanos, son
los siguientes (Robinson et. al., 2000):
•
Las cepas deberán ser de origen humano.
•
Cepas no patogénicas.
•
Cepas no toxigénicas.
•
Estabilidad de las cepas en ácido gástrico y bilis.
•
Antagonismo contra bacterias patógenas y carcinogénicas.
•
Producción de sustancias antibacteriales.
•
Capacidad de adherirse a células intestinales humanas.
•
Capacidad de colonizar en tracto intestinal humano.
•
Excelente crecimiento in vitro.
•
Cepas seguras para su uso clínico y en alimentos.
1.5.
Dosis Efectiva de Microorganismo Probióticos.
Se han realizados estudios para establecer la dosis mínima efectiva de los probióticos, para que ejerzan
beneficios fisiológicos en el hospedero. Se ha establecido que el consumo de una dosis diaria de 1 x 108-10
bacterias viables/mL, es necesario para que ejerzan adecuadamente su función. Actualmente, se
recomienda que los microorganismos probióticos vayan estabilizados en la matriz del alimento o
encapsulados, como en el caso del producto comercial Yoplus de la marca comercial Yoplait®, con la
finalidad de aumentar su sobrevivencia al paso por el tracto gastrointestinal (Reid et. al., 2003).
1.6.
Efectos Benéficos de los Microorganismos Probióticos.
Los efectos benéficos que un determinado microorganismo probiótico puede conferir al huésped, se
resumen a continuación (Torres, 2002):
•
Mejoramiento a la resistencia contra patógenos.
•
Estimulación del sistema inmunológico.
•
Disminución de síntomas de la intolerancia a la lactosa.
5
Antecedentes
•
Mantener en equilibrio la flora intestinal y urogenital.
•
Prevención y reducción de la diarrea.
•
Reducción de los niveles de enzimas fecales relacionadas con el cáncer.
•
Reducción del síndrome de colon irritable.
•
Reducción del colesterol sérico.
Innumerables estudios e investigaciones se han realizado con la finalidad de comprobar los efectos
benéficos que proporcionan los microorganismos probióticos.
Artículos prometedores presentan la evidencia de la modulación inmunológica en el hombre, después de
la ingesta de probióticos. Diversos grupos científicos, coinciden en que el consumo de productos lácteos
fermentados con bacterias probióticas, principalmente Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus,
aumenta la actividad inmune fagocítica no específica de granulocitos circulantes en sangre periférica, lo
que ocasiona un aumento en la concentración de inmunoglobulina IgA sérica (Yan, 2002; Roberfroid,
2000; Rolfe, 2000 y Roos y Katan, 1999).
La intolerancia a la lactosa es un problema que afecta a más del 70% de la población mundial. Los
pacientes que presentan este problema, tienen baja cantidad de β-galactosidasa, enzima que permite la
digestión de lactosa (Roberfroid, 2000). Montes et. al. (1995), demostraron que la ingesta de productos
lácteos fermentados con bacterias probióticas, disminuían los síntomas de la intolerancia a la lactosa.
La diarrea es causa de muerte y enfermedad, principalmente en niños. En México, la diarrea ocupa el
primer lugar como causa de mortalidad en niños en edad preescolar. Un estudio realizado en niños
hospitalizados, que presentaban diarrea causada por rotavirus, demostró que, los niños que consumieron
un producto lácteo fermentado con probióticos, presentaron un aumento en la concentración sérica de
anticuerpos IgA contra rotavirus, además de disminuir el tiempo de duración del período de la diarrea de
3.5 a 2.5 días, en comparación con los niños que consumieron un placebo (Roos y Katan, 1999; Donnet –
Hughes et. al., 1998).
En cuanto a la prevención de cáncer, los microorganismos probióticos disminuyen la producción de
procarcinógenos como las enzimas glicosidasa, β-glucoronidasa, azoreductasa y nitroreductasa. Lo que
beneficia, disminuyendo la incidencia de padecer cáncer (Robinson et. al., 2000; Hosoda et. al., 1996).
6
Antecedentes
Los efectos benéficos de los probióticos en la reducción de colesterol sérico, aún causa controversia. Xiao
et. al. (2003) demostraron la reducción de colesterol sérico en adultos sanos. A dos grupos se les
administraron productos lácteos fermentados. Al grupo uno, se les administró un producto lácteo
fermentado con bacterias del yogurt y al grupo dos, se les administró un producto lácteo fermentado con
B. longum. Al grupo que recibió el producto lácteo fermentado con bífidobacterias, presentaron
reducciones marcadas en los niveles séricos de colesterol, en comparación con el grupo dos, quienes
mantuvieron invariables los niveles de colesterol sérico (Anderson y Guilliland, 1999).
1.7.
Mecanismos de Acción de Microorganismos Probióticos.
Los mecanismo de acción por los cuales los microorganismos probióticos protegen al hospedero de
desordenes intestinales, son cambios que producen las bacterias probióticas en el sitio de colonización.
Los mecanismos pueden ser (Rolfe, 2000 y Torres, 2002):
•
Producción de sustancias antimicrobiana. Las bacterias probióticas producen una gran variedad
de sustancias antimicrobianas, que tienen la capacidad de inhibir el crecimiento tanto de bacterias
gram positivas como gram negativas. Estas sustancias inhibitorias incluyen ácidos orgánicos, peróxido
de hidrógeno y bacteriocinas.
•
Competencia por receptores de adhesión. Las bacterias probióticas mantienen una inhibición
competitiva con bacterias patógenas, por sitios de adhesión a células epiteliales del intestino humano.
•
Competencia por nutrientes. La competencia por nutrientes se ha propuesto como mecanismo de
acción de probióticos. Los probióticos pueden consumir los nutrientes utilizados por bacterianas
patógenas.
•
Estimulación inmunológica. Evidencias recientes sugieren que la estimulación de inmunidad
específica y no específica, pueden ser otro mecanismo de acción por el cual los probióticos podrían
proteger al hospedero de enfermedades intestinales, aumentando los niveles séricos de
inmunoglobulinas o anticuerpos.
7
Antecedentes
1.8.
Vehículos Utilizados para Consumo Humano de Probióticos.
Las bacterias probióticas han atraído un gran interés tanto en el ámbito científico como en el comercial.
Los productos lácteos fermentados han sido el principal vehículo utilizado para el consumo humano de
probióticos (Torres, 2002). Actualmente, se comercializan productos probióticos, utilizando diferentes
vehículos como: cápsulas, polvos, leche en polvo para lactantes adicionadas con probióticos, quesos,
helados, preparaciones grado farmacéutico, entre otros (Roos y Katan, 1999 y Law, 1997).
1.9.
Productos Probióticos.
Como ya se había mencionado, los productos lácteos fermentados han sido utilizados tradicionalmente
como vehículo para el consumo de bacterias con características probióticas en humanos.
A partir de la década pasada, hubo un marcado incremento de los productos probióticos en el mercado
Europeo, América del Norte y muchos otros países. Estos productos contienen principalmente bacterias
del género Bifidobacterium spp. y Lactobacillus spp. (Law, 1997) y garantizan cierta cantidad de bacterias
viables por mililitro de producto. En la Tabla 3, se presenta los principales productos lácteos fermentados
con bacterias probióticas, comercializados en Europa.
Tabla 3. Productos fermentados probióticos comercializados en Europa.
Producto
®
Cultura AB , Biomild ®, Diphilus ®
y Lunebest ®
Acidophilus bifidus yogurth
Microorganismos
B. bifidum, L. acidophilus
B. bifidum, B. longum, S. thermophilus,
L. delbrueckii y L. acidophilus.
108
Acidophilus milk®
L. acidophilus.
>108
Bifidus Milk
Bifidus yogurth, Mil-mil E ® o
Biobest ®
Bifigurth ®
Biogarde ® o ABT
Yakult®
B. bifidum, B. longum,
B. bifidum, B. longum, S. thermophilus,
L. delbrueckii
B. longum, L. delbrueckii
B. bifidum, L. delbrueckii y L.
acidophilus.
B. bifidum, S. thermophilus, L.
acidophilus.
B. longum, Lac. lactis sub
diacetalylactis, Lac. lactis suc cremoris.
L. paracasei
Yoke®
L. acidophilus, L. paracasei
Ofilus nature ®
Progurth ®
Fuente: Law, 1997.
8
Bacterias viables (ufc/mL)
108
108 – 109
108 – 109
107
107 - 108
>108
108
>108
>108
Antecedentes
En México está iniciándose un importante auge en el consumo de productos fermentados con probióticos.
Comparativamente con los productos comercializados en Europa, en el mercado mexicano, existen pocos
productos probióticos. Se fabrica industrialmente el Yakult, el yogurt y las leches fermentadas con
probióticos. El Yakult, es uno de los productos probióticos más antiguos y con más éxito en nuestro país,
contiene Lactobacillus casei shirota, 106 ufc por mililitro de producto.
En la Tabla 4, se presentan los principales productos probióticos comercializados en México. Los
productos probióticos Europeos garantizan la cantidad de bacterias viables por mililitro de producto, en
comparación con los productos mexicanos, los cuales no garantizan la cantidad de bacterias viables
requeridas para considerar a un producto como probiótico, pero si indican en la etiqueta es el género
bacteriano y que las bacterias que contiene el producto, están viables. El género más empleado en los
productos probióticos mexicanos, es Lactobacillus spp. Solo tres productos emplean el género
Bifidobacterium spp.
Tabla 4. Productos probióticos disponibles en el mercado mexicano.
Nombre del Producto
Marca
Activia
Danone®
Actimel
Danone ®
Tipo de Producto
Yogurt
Bacteria
Bifidus essencis ®
Bebida fermentada
Bio4
Lala ®
Bebida fermentada
L. casei ®
L. casei ®
LC1
Yogurt
L. johnsonii ®
Sofúl
Nestle ®
Yakult ®
Gelatina de yogurt
Vivendi
Alpura®
Yogurt
Yakult
Yakult ®
Yoplait®
Bebida fermentada
L. casei shirota ®
L.acidophilus, S. thermophilus,
L. delbruecki y Bifidobacterias ®
L. casei shirota ®
Yogurt
Bificapsulas ®
Yoplus
Los productos probióticos más recientes en el mercado mexicano ofrecen otros beneficios a parte de los
que confieren los microorganismos probióticos al hospedero. Algunos emplean técnicas para estabilizar
los microorganismos a la matriz del alimento o los encapsulan, con la finalidad de aumentar su
sobrevivencia al paso por el tracto gastrointestinal, tal es el caso del producto comercial Yoplus de la
marca comercial Yoplait®. A otros productos probióticos se les adicionan ingredientes como vegetales
(apio, nopal, zanahoria y betabel), frutas (piña, naranja, entre otros) y fibra; tal es el caso del yogurt
Vivendí de la marca comercial Alpura®, único producto en el mercado que contiene 4 cepas de bacterias
probióticas, L. acidophilus, S. thermophilus, L. delbrueckii y Bífidobacterias.
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Antecedentes
Otro de los vehículos muy recurrido para el consumo de probióticos en humanos, son los productos
farmacéuticos. A nivel mundial se comercializan una gran cantidad de productos probióticos en cápsulas o
comprimidos. Las bacterias probióticas más utilizadas son los géneros Bifidobacterium spp. y Lactobacillus
spp. En la Tabla 5, se muestran los productos farmacéuticos comercializados en países como Alemania,
Estados Unidos, Francia, Japón, Reino Unido, Suiza y Yugoslavia (Law, 1997). En México, se
comercializan dos productos farmacéuticos, Sinuberase® y Bioflora®. El producto farmacéutico
Sinuberase® contiene >106 UFC de L. acidophilus por comprimido. Bioflora® son comprimidos
masticables que garantizan 1 billón (1x109) de Lactobacillus (L. acidophilus, L. rhamanosus y B. longum)
por comprimido.
Tabla 5. Productos farmacéuticos probióticos comercializados a nivel mundial
País
Producto farmacéutico
Microorganismo
Alemania
Eugalan® y Lactopriv®
Omniflora®
Bifidobacterium spp.
Life Start two®
B. bifidum
Lactinex®
L. acidophilus y L. delbrueckii
Megadophilus®
L. acidophilus
Bifidogene®
Bifidobacterium spp.
Synerlac®
B. bifidum y L. acidophilus
B. bifidum
Reino Unido
Bifider®
Enpac® y Laccinilla®
L. acidophilus
Suiza
Infloran Berna®
B. bifidum y L. acidophilus
Ribolac®
L. acidophilus
Liobif®
B. bifidum
Estados Unidos
Francia
Japón
Yugoslavia
B. longum, L. acidophilus, E.coli.
Fuente: Law, 1997.
1.10. Bacterias Probióticas Utilizadas en esta Investigación
En esta investigación se trabajo con dos bacterias probióticas: Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus
acidophilus. Como ya se había mencionado, estas dos especies, son los principales microorganismos
estudiados por los efectos benéficos que confieren al hospedero. Estas bacterias probióticas, se han
utilizado para producir alimentos fermentados en leche de vaca. Nuestra investigación se orienta a
estudiar su comportamiento en subproductos lácteos de leche de cabra. A continuación se detallan las
principales características de cada especie utilizadas en esta investigación.
10
Antecedentes
1.10.1. Bifidobacterium bifidum
Fue descubierta por Tissier en 1900, a partir de heces de recién nacidos. Su nombre se deriva de las
formas con dos ramas en Y o en V que pueden presentar bajo ciertas condiciones de cultivo. Las
características mas importantes de esta bacteria son: bacilos gram-positivos, de forma curva o bifurcada,
inmóviles, no esporulados, anaerobios estrictos, temperatura óptima de crecimiento de 37 – 41ºC, pH
óptimo de crecimiento de 6.6 – 7 (Leveau y Bouix, 2000).
Son bacterias heterofermentativas, degradan la lactosa por la ruta de Warburrg Dickens ó pentosa fosfato
hasta ácido acético, láctico, propiónico, succínico, etanol y CO2. Las bífidobacterias utilizan la glucosa por
la vía de la fructosa-6-fosfato, es una vía completamente original de degradación de las hexosas. La
glucosa se convierte en fructosa-6-fosfato bajo la acción de la hexoquinasa y de la glucosa-6-fosfato
isomerasa. La fructosa-6-fosfato se transforma en eritrosa-6-fosfato con la fructosa-6-fosfato cetolasa
como catalizador, la reacción prosigue a gliceraldehído-3-fosfato. La transformación del gliceraldehído-3fosfato en piruvato y posteriormente a ácido láctico, se realiza por la Ruta de Embden-Meyerhof-Parnas ó
hexosas difosfato. (Walstra et. al., 2001; Leveau y Bouix, 2000; Robinson et. al., 2000 y Law, 1997). En
estas condiciones, la fermentación de lactosa sigue esta reacción:
Lactosa + 2H3PO4 + 2ADP ⇒ 2 Ácido láctico + 3 Ácido acético + 2CO2 + 2ATP + 2H2O + 2H
El equilibrio de la fermentación esta desplazado a favor de la producción de ácido acético. B. bifidum
produce mas ácido acético que láctico, en una relación 3:2. (Walstra et. al., 2001; Leveau y Bouix, 2000;
Robinson et. al., 2000). En la figura 2, se muestran las reacciones que sufre el ácido pirúvico para la
obtención de otros ácidos de cadena corta, durante una fermentación heterofermentativa. El exceso de
ácido acético proviene de la hidrólisis del ácido pirúvico a ácido fórmico y acético. El ácido succínico
también proviene del ácido pirúvico y se convierte en ácido propiónico posteriormente, tras una
descarboxilación. El etanol se obtiene tras la reducción del acetaldehído formado a partir de la
descarboxilación del ácido pirúvico.
11
Antecedentes
Glucosa
C6H12O6
Ácido acético
+ Ácido fórmico
CH3COOH + HCOOH
Ácido succínico
HOOCCH2CH2COOH
Ácido pirúvico
CH3COCOOH
Ácido propiónico
CH3CH2COOH + CO2
H2 + CO2
Acetaldehído
CH3CHO + CO2
Ácido Láctico
CH3CHOHCOOH
Etanol
CH3CH2OH
Figura 2. Reacciones que sufre el ácido pirúvico durante una fermentación heterofermentativa.
Al nacimiento, B. bifidum es uno de los primeros microorganismos que se establecen en el tracto
gastrointestinal. En recién nacidos alimentados con leche materna se han encontrado niveles de 1010-1011
bacterias/gr de heces, en contraste con recién nacidos alimentados con leche de fórmula, en los que se ha
observado un log10 menos, esto es debido a que la leche materna contiene factores de crecimiento
indispensables para el desarrollo de las bífidobacterias. Algunos autores aseguran que este factor de
crecimiento es un carbohidrato como la N-acetil-D-glucosamina o una glucoproteína (Robinson et. al.,
2000; Badui, 1999).
Las bífidobacterias, tienen la capacidad de sobrevivir el paso por el trato digestivo, gracias a su resistencia
a condiciones ácidas, enzimas proteolíticas y sales biliares, e implantarse en el intestino, debido a los
ácidos orgánicos que produce, los cuales disminuyen el pH del intestino, permitiendo que bacterias
patógenas no resistan medios ácidos y permitan la adhesión de las bífidas a las células del intestino
(Robinson et. al., 2000).
Los principales beneficios que confiere B. bifidum al hospedero son (Robinson et. al., 2000):
•
Estabilización de la flora normal.
•
Resistencia a patógenos.
•
Mejora de tolerancia a la lactosa.
12
Antecedentes
•
Prevención y/o tratamiento de diarrea.
•
Prevención de constipación.
•
Disminución de los niveles de colesterol sérico.
•
Disminución de enzimas procancerígenas.
•
Inducción de inmunidad mediada por células.
Tabla 6. Características de Bifidobacterium bifidum.
Bacteria
Característica
Origen
Generalidades
Morfología
Temperatura óptima
pH óptimo
Tipo de respiración
Ruta Metabólica
Productos de Metabolismo
Bifidobacterium bifidum
Tracto intestinal de lactantes
Bacilos gram positivos, inmóviles y no esporulados,
catalasa negativos, no produce CO2
Su morfología es muy variable: pequeña y regular, larga
con una protuberancia distal, curvada.
37 – 41ºC
6.6 – 7
Anaerobia estricta
Ruta de Warburrg Dickens ó pentosa fosfato
Ácido acético, láctico, propiónico y succínico, etanol y CO2.
Relación ácido acético láctico es de 3:2.
1.10.2. Lactobacillus acidophilus
Fue aislado por Moro en 1900 a partir de heces de infantes alimentados con leche de fórmula.
Históricamente, L. acidophilus es la especie del género Lactobacillus, que con mayor frecuencia ha sido
clasificada como microorganismo probiótico, gracias a la teoría propuesta por el científico ruso Metchnikoff
en 1908, en la que atribuía la extraordinaria longevidad de los pobladores de los Balcanes, al consumo de
productos lácteos fermentados tipo yogurt que contenían L. acidophilus, ya que esta especie era capaz de
soportar el paso por el tracto digestivo (Robinson et. al., 2000).
Las características principales de esta especie son: anaerobios facultativos, bacilos gram positivos, no
esporulados, catalasa negativo, ácido tolerante, pH óptimo de crecimiento de 5.4 – 5.8, temperatura
óptima de crecimiento de 37- 45 ºC (Leveau y Bouix, 2000).
13
Antecedentes
Son bacterias homofermentativas, es decir, degradan la lactosa por la ruta de Embden-Meyerhoff-Parnas
o hexosas difosfato, hasta ácido láctico. La glucosa se transforma en fosfatos de hexosa mediante la
acción de las enzimas hexoquinasa, fosfohexosa isomerasa y fosfofrutoquinasa. Los fosfatos de hexosa
se convierten a gliceraldehído-3-fosfato mediante la acción de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa.
La conversión de gliceraldehído-3-fosfato a piruvato se realiza principalmente por la acción de la piruvato
quinasa. Una molécula de lactosa, rinde dos moléculas de glucosa. A partir de una molécula de hexosa, se
forman dos moléculas de gliceraldehído-3-fosfato. En estas condiciones, la fermentación de la lactosa
sigue esta reacción (Walstra et. al., 2001; Robinson et. al., 2000 y Law, 1997):
Lactosa + 4H3PO4 + 4ADP ⇒ 4Ácido láctico + 4ATP + 4H2O + 2(2H)
A parte del ácido láctico, L. acidophilus produce otras sustancias antimicrobianas como: peróxido de
hidrógeno y una variedad de bacteriocinas (Lactacina B, acidocina A, acidocina B y acidophilucina A). En
algunos estudios, la bacteriocina acidocina B, mostró actividad contra Listeria monocytogenes, Clostridium
sporogenes y Bronchothrix thermosphacta pero no contra otros lactobacilos (Walstra et. al., 2001; Leveau
y Bouix, 2000; Robinson et. al., 2000).
L. acidophilus se establece en el tracto intestinal del infante en los primeros meses posteriores al
nacimiento y persiste en los adultos. En niños alimentados con leche de fórmula, se han encontrado una
cantidad de 106 - 108 bacterias/gr de heces (Robinson et. al., 2000).
Los principales beneficios que confiere L. acidophilus al hospedero son (Robinson et. al., 2000):
•
Estabilización de la flora normal.
•
Resistencia a patógenos.
•
Mejora de tolerancia a la lactosa.
•
Prevención de diarrea.
•
Disminución de los niveles de colesterol sérico.
•
Disminución de enzimas procancerígenas.
•
Inmunomodulación e inmunoestimulación.
•
Desconjugación de ácidos biliares.
14
Antecedentes
Tabla 7. Características de Lactobacillus acidophilus.
Bacteria
Característica
Origen
Generalidades
Morfología
Temperatura óptima
pH óptimo
Tipo de respiración
Ruta Metabólica
Productos de Metabolismo
Lactobacillus acidophilus
Tracto intestinal de lactantes
Bacilo gram positivo, no esporulado, catalasa negativo,
ácido tolerante.
Células en forma de bastoncillos, a menudo agrupadas
en cadenas.
37- 45 ºC
5.4 – 5.8
Anaerobios facultativos
Ruta de Embden-Meyerhoff-Parnas o hexosas difosfato.
Ácido láctico
1.11. Importancia de la Leche de Cabra y sus Subproductos como Sustrato para las
Bacterias Probióticas.
La leche es el líquido segregado por las hembras de los mamíferos a través de las glándulas mamarias,
cuya finalidad es alimentar a su cría durante un determinado tiempo. Su importancia se basa en su valor
nutritivo, ya que sus componentes se encuentran en la forma y proporciones adecuadas, de tal manera
que la leche representa el alimento más balanceado y propio para sus correspondientes crías. La leche
esta compuesta por agua, grasa, proteínas, azucares, vitaminas y minerales (Badui, 1999).
En general, la designación comercial de leche, se refiere al producto procedente de la vaca; la leche
derivada de otras especies va siempre seguida con la consignación de la hembra productora: “Leche de
cabra”, “Leche de oveja”, etc. En la tabla 8, se muestran la composición promedio de la leche de diversos
mamíferos.
Tabla 8. Porcentaje promedio de la composición de la leche de diversos mamíferos.
Especie
Agua (%)
Grasa (%)
Proteína (%)
Lactosa (%)
Minerales (%)
Humana
Vaca
Cabra
Oveja
Búfalo
Camello
Caballo
Llama
87.43
87.20
87.00
80.71
82.76
87.61
89.04
86.55
3.75
3.70
4.25
7.90
7.38
5.38
1.59
3.15
1.63
3.50
3.52
5.23
3.60
2.98
2.69
3.90
6.98
4.90
4.27
4.81
5.48
3.26
6.14
5.60
0.21
0.70
0.86
0.90
0.78
0.70
0.51
0.80
Fuente: FAO, 1990.
15
Antecedentes
La leche de vaca, es ampliamente conocida y aceptada, sin embargo, la leche de cabra constituye una
alternativa a la leche de vaca muy benéfica en ciertos aspectos de la alimentación humana. A diferencia
de la leche de vaca, la de cabra tiene mayor cantidad de grasa y menos lactosa.
La grasa de la leche de cabra se compone de ácidos grasos de cadena corta como el butírico, cáprico,
caprílico y capróico (responsables del aroma característico de la leche de cabra); estos ácidos de cadena
corta producen glóbulos de grasa pequeños (comparados con los de la leche de vaca), los cuales no
requieren sales biliares para su digestión y absorción, esto beneficia al consumidor ya que se metabolizan
rápidamente, produciendo energía de forma inmediata, evitando que se acumulen y aumenten los niveles
de colesterol.
La proteína de cabra es más fina y delicada. La proporción de caseínas-proteínas del suero es diferente
entre la leche de cabra y vaca. En la leche de vaca es de 80:20 y en la leche de cabra es de 75:25, esto
afecta el rendimiento quesero durante su fabricación, lo que se refleja en costos elevados del queso de
cabra en el mercado.
En cuanto a la lactosa, la leche de cabra contiene 0.6% menos que la leche de vaca, esta diferencia es
mínima en cuanto a aporte nutricional, sin embargo este porcentaje puede favorecer su consumo por
personas intolerantes a la lactosa (Scholz, 1997).
A partir de leche fresca de cabra se elaboran diversos productos (derivados) ampliamente aceptados en la
mayoría de la población. Algunos de los derivados lácteos de cabra son: quesos, cajeta, helados, yogurt,
mantequilla, leches en polvo, dulces de leche, entre otros. Durante la elaboración de los derivados lácteos
de cabra, se obtienen subproductos lácteos, como el suero de leche de cabra, suero de mantequilla, entre
otros (Badui, 1999).
El común denominador para utilizar la leche de cabra, derivados y subproductos, como sustrato para
elaborar productos lácteos fermentados con probióticos, es la lactosa, principal carbohidrato presente en
estos alimentos.
16
Antecedentes
1.11.1. Problemática de la Caprinocultura en Nuevo León.
Las cabras son una explotación tradicional en el campo mexicano, la cabra se puede adaptar a terrenos
áridos y semiáridos, pudiendo aprovechar una enorme variedad de arbustos, matorrales, hierbas y
zacates, que otros tipos de ganado no pueden utilizar. En el estado de Nuevo León las zonas áridas
abarcan 17,377 km2, representando el 29% de la superficie total del Estado. El 82% de las zonas áridas se
dedican al subsector pecuario, el 8% al subsector agrícola, el 6% la forman bosques y el 4% son áreas
improductivas. La vegetación que predomina en estas áreas es la palma, el maguey, el nopal, la
lechuguilla, la candelilla, la jojóba, el mezquite y las especies animales que se explotan son
primordialmente la especie caprina, seguida por la porcina y bovina en grado de subsistencia (Cervantes,
2002).
Los caprinocultores del Estado son en su mayoría ejidatarios, con una condición económica familiar muy
precaria y en su mayor parte no están afiliados a ninguna asociación u organización; Al ser productores
independientes no tienen la oportunidad de eficientizar su sistema de producción por la nula gestión para
adquisición de insumos y venta de sus productos. Los caprinocultores se dedican preferentemente a la
explotación con doble propósito con venta de leche y cabrito. La problemática de la caprinocultura radica
principalmente en (Cervantes, 2002):
•
Organización. La nula organización y la participación concurrente de factores detrimentales como
la mínima alfabetización de los productores, la falta de asistencia técnica o capacitación y los
deficientes canales de comercialización.
•
Sanidad. Aun con campañas de aplicación de vacunas, la problemática persiste debido a la
compleja concurrencia de factores como la comercialización del ganado, las deficientes prácticas de
manejo y la nula presencia de instalaciones para el ganado, que promueven que la infección
permanezca y se transmita continuamente entre los animales y hacia los humanos, principalmente por
la ingestión de queso fresco procedente de leche sin pasteurizar.
•
Comercialización. No existen prácticas de manejo que permitan programar la producción de tal
manera que los cabritos se encuentren disponibles todo el año, tengan un precio justo en el mercado y
se eviten las fluctuaciones de precio durante la época en que existe sobreproducción. En cuanto a la
comercialización de la leche, el área de oportunidad se encuentra en la zona de producción del Norte
y Sur del Estado, donde no existe un comercializador de la leche, por lo que los acopiadores se tienen
que trasladar a grandes distancias lo que repercute en un precio bajo de compra al productor.
17
Antecedentes
A partir de datos obtenidos en un estudio sobre la recolección de información e identificación de cadenas
productivas prioritarias, en el estado de Nuevo León; se dio a conocer que las cadenas productivas de
caprinos resultó ser una cadena de alta prioridad estratégica, expresando alta importancia socioeconómica
y de competitividad, tanto para el sistema agroalimentario (matriz primaria), como para el sistema
agroindustrial (matriz secundaria) (Poledo et al. 2002).
La producción nacional de leche de cabra en el 2003 fue de 150.3 millones de litros. Mientras que Nuevo
León, contribuyo hacia el 2001, con una producción de 5.6 millones de litros, con un crecimiento de 1995
al 2001, de un 150.85% (Tabla 9) (SAGARPA, 2004).
Si bien, el volumen de producción de la leche de cabra en el estado de Nuevo León ha aumentado en los
últimos años, su aprovechamiento para el procesamiento y comercialización todavía no esta muy
difundido. Este producto es muy importante para la economía estatal, ya que su producción impacta el
Producto Interno Bruto (PIB) (Poledo et al., 2002).
En conclusión, debido al incremento en la producción de leche de cabra en el estado y su respectiva
repercusión económica, se plantea incorporar alternativas para el consumo de leche de cabra, sus
derivados y subproductos, elaborando productos lácteos fermentados con probióticos. En esta
investigación se propone utilizar el suero de leche de cabra como sustrato para el desarrollo de un
producto fermentado probiótico con Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus.
Tabla 9. Producción anual de leche de cabra a nivel nacional y en el Estado de Nuevo León.
Producción de leche de
Producción Nacional de
cabra en el estado de Nuevo
Año
leche de cabra
León
(millones de litros)
(millones de litros)
1995
139.1
2.0
1996
122.9
0.6
1997
120.5
3.7
1998
127.7
5.0
1999
131.0
5.5
2000
131.2
5.5
2001
139.9
5.6
2002
146.5
N.R.
2003
150.3
N.R.
Fuente: Sistema de información y estadística agroalimentaria y pesquera (SIAP), Sagarpa 2004.
No reportado: N.R.
18
Antecedentes
1.12. Suero de Leche de Cabra
El suero de leche de cabra, es el líquido resultante de la coagulación de la leche de cabra durante la
elaboración del queso. Se obtiene tras la separación del coágulo (compuesto principalmente por caseínas
y grasa). Contiene la mayor parte de los compuestos hidrosolubles de la leche como, proteínas del suero
(lactoalbúmina y lactoglobulina), lactosa, minerales y vitaminas. (García Garibay et. al., 2002; Badui;
1999).
Debido a que no se encontró información reportada sobre características, producción nacional o estatal de
derivados y subproducto lácteos de cabra, la información y análisis que se presentan están enfocados a
los derivados y subproducto de leche de vaca.
Durante la elaboración de queso se producen 9 litros de suero de leche por kilogramos de queso,
partiendo de 10 litros de leche (García Garibay et. al., 2002; Badui; 1999). El suero de leche o lactosuero,
se divide en tres tipos, según su acidez (Badui, 1999; Madrid, 1990):
•
Suero dulce, con pH mayor a 5.8
•
Suero medio ácido con pH entre 5.8 a 5.0
•
Suero ácido con pH menor a 5.0
En México, el suero de leche que se produce es principalmente dulce y medio ácido (García Garibay et.
al., 2002).
El suero de leche es uno de los materiales más contaminantes que existen en la industria alimentaria.
Cada 1,000 litros de lactosuero generan cerca de 35 kg de demanda biológica de oxígeno (DBO) y cerca
de 68 kg de demanda química de oxígeno (DQO). Esta fuerza contaminante es equivalente a la de las
aguas negras producidas en un día por 450 personas (Inda, 2000).
Más aún, no emplear el suero de leche como alimento, es un enorme desperdicio de nutrimentos; el
lactosuero contiene un poco más del 25 % de las proteínas de la leche, cerca del 8 % de la materia grasa
y cerca del 95 % de la lactosa. Por lo menos el 50 % en peso de los nutrimentos de la leche se quedan en
el lactosuero (Inda, 2000).
19
Antecedentes
Los mismos 1,000 litros de lactosuero a los que nos referimos arriba contienen más de 9 kg de proteína de
alto valor biológico, 50 kg de lactosa y 3 kg de grasa de leche. Esto es equivalente a los requerimientos
diarios de proteína de cerca de 130 personas y a los requerimientos diarios de energía de más de 100
personas (Inda, 2000).
No existen estadísticas que den a conocer la producción nacional de lactosuero, pero se podría estimar,
ya que sabemos que la producción de suero de leche durante la elaboración de queso, corresponde al
90% del volumen de la misma que entra al proceso. La producción de queso fresco en México durante el
2001 fue de 140,000 toneladas, por lo tanto, la producción de suero se estimaría en 1,260,000 toneladas
en el 2001 (Castro, 2003). En México se estima que alrededor del 10% de la producción de suero se utiliza
en alguna tecnología que permita la transformación de los componentes de este, en productos de mayor
valor agregado (García Garibay et. al., 2002).
Por lo tanto, es importante que la industria quesera, cuente con diferentes opciones para emplear el suero
de leche como base de alimentos, preferentemente para el consumo humano, con el fin adicional de no
contaminar el medio ambiente y de recuperar, el valor monetario del lactosuero.
1.12.1 Composición del Suero de Leche de Cabra
La composición del suero de leche varia dependiendo de la leche y tipo de queso de que provenga. En
general, el suero de leche esta compuesto por: agua, lactosa, proteínas, grasa y sales minerales (Madrid,
1990; Badui, 1999). En la literatura con la que se contaba no se encontraron reportes sobre la composición
del suero de leche de cabra, pero si del suero de leche de vaca. En la tabla 10, se presenta la composición
del suero de leche de vaca. Entre los compuestos que constituyen el lactosuero, sobresalen las proteínas
solubles y la lactosa, ya que tanto la grasa como las caseínas de la leche, se separan al cuajarse la leche
durante la elaboración del queso.
Tabla 10. Composición del suero de leche de vaca.
Componente
Suero de leche de vaca
Humedad (%)
93 – 94
Proteínas (%)
0.8 – 1.0
Grasa (%)
0.2 – 0.7
Lactosa (%)
4.5 – 5.0
Sales minerales (%)
0.05
Fuente: Madrid, 1990.
20
Antecedentes
La lactosa es el principal carbohidrato de la leche, en donde se encuentra en dispersión molecular. Es un
disacárido, integrado por la condensación de una molécula de galactosa y otra de glucosa mediante un
enlace glucosídico β (1,4) (Badui, 1999; Keating, 1986) (Figura 3).
Figura 3. Estructura química de la lactosa
Molécula de β-D-galactosa unida a una molécula de β-D-glucosa mediante un enlace glucosídico β (1,4) para formar la molécula de lactosa.
La lactosa, es fermentada por BAL produciendo ácido láctico principalmente. Por lo tanto, la lactosa, es el
sustrato necesario para el desarrollo de BAL, ya que toman este disacárido como fuente de carbono
(Badui, 1999; Keating, 1986).
Las proteínas séricas de la leche son las α-lactoalbúmina, β-lactoalbúmina y lactoglobulínas. Sus
características principales son: proteínas compactas, globulares, con un peso molecular que varía entre
14,000-1,000,000 daltons, son solubles en un intervalo de pH muy amplio y muy sensibles a altas
temperaturas (>70ºC) (Badui, 1999; Keating, 1986).
En la leche de cabra estas proteínas séricas, se encuentran en mayor proporción que en leche de vaca.
En la leche de vaca la relación de caseínas y proteínas séricas, es de 80:20, mientras que en la leche de
cabra, la relación es de 75:25 (Scholz, 1997).
Las sales minerales que contiene el lactosuero son principalmente fosfato de potasio, cloruro de sodio,
citratos de sodio, potasio, calcio, fósforo, cloro, flúor, zinc, cobre, hierro, magnesio, manganeso, yodo y
níquel. No existen variaciones en cuanto a la composición y contenido de las sales minerales de la leche
de cabra y vaca (Scholz, 1997).
21
Antecedentes
1.12.2. Usos del Lactosuero.
El suero tiene un alto valor nutritivo, por lo que a nivel mundial se han realizado considerables esfuerzos
dirigidos a su aprovechamiento, tanto a nivel de investigación tecnológica como a políticas
gubernamentales que alienten o presionen a los industriales a hacer uso de este subproducto evitando
que sea vertido en mantos acuíferos donde resulta altamente perjudicial.
En México, no existen cifras respecto a la utilización del suero, pero algunos cálculos estiman que es
alrededor del 10%, respecto al total obtenido en la industria.
A nivel mundial, existe una gran variedad de tecnologías para la utilización del suero de leche, sin
embargo, recientemente la biotecnología ha abierto alternativas interesantes para ello, fundamentalmente
porque permite la transformación de la lactosa, sólido más abundante en el suero, en productos de mayor
valor agregado (Tabla 11).
Tabla 11. Usos del lactosuero.
Usos del lactosuero
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
Productos tradicionalmente obtenidos a partir de suero.
El suero como medio de cultivo
Propagación de inóculo en las queserías
Producción de ácidos orgánicos
Producción de alcohol
Bebidas fermentadas
Producción de enzimas
Jarabes de suero.
Producción de biopelículas a partir proteínas del suero.
Producción de probióticos y bacteriocinas.
Estas alternativas se discuten a continuación (Pastrana et. al., 2004; Balagtas et. al., 2003; García Garibay
et. al., 2002; Madrid, 1990):
1)
Productos tradicionalmente obtenidos a partir de suero. Los productos que tradicionalmente se
han obtenido a partir del lactosuero, han sido:
• Suero en polvo, a base de concentrar los sólidos por evaporación y secado.
• Suero en polvo desmineralizado, se eliminan previamente las sales minerales por intercambio
iónico o por electrodiálisis, se evapora el agua y se aplica el secado.
22
Antecedentes
• Lactosa, obtenida por concentración, cristalización y separación.
• Concentrados protéicos, obtenidos por ultrafiltración del suero.
Estos productos se utilizan principalmente en confitería, alimentos infantiles, concentrados de
proteína, productos farmacéuticos, entre otros; en donde contribuyen al sabor, color, olor, textura,
valor nutritivo y costos de producción.
2)
Suero como medio de cultivo. Es un excelente medio de cultivo, es por que se utiliza como
sustrato para la obtención de un buen número de productos obtenidos a través de fermentación. Al
ser la lactosa, la principal fuente de carbono, parecería que solamente puede emplearse
microorganismos capaces de utilizar este disacárido; pero también se puede hidrolizar la lactosa en
sus componentes galactosa y glucosa, o mediante una hidrólisis ácida, de esta manera las
perspectivas son infinitas.
3)
Propagación de inóculo en las queserías. Es práctica común en las cremerías e industrias
afines, utilizar suero para la conservación y propagación de cultivos de BAL pertenecientes a los
géneros Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp. y Leuconostoc spp. El suero
también se utiliza como base para medios inhibidores de fagos, los cuales contienen sistemas
amortiguadores del pH y compuestos que ligan calcio para evitar la infección por los bacteriófagos
a las BAL.
4)
Producción de ácidos orgánicos. Un uso industrial importante e implementado hace años, es la
obtención de ácido láctico a partir de suero a través de una fermentación con BAL. Las especies
más importantes para esta fermentación son Lactobacillus delbrueckii ss. bulgaricus, Lactobacillus
delbrueckii ss. delbrueckii y Lactobacillus helveticus. Normalmente entre 85-90% de la lactosa, es
convertida a ácido láctico en 24 hrs. También se obtienen, ácido acético y propiónico, pero con
rendimientos bajos.
5)
Producción de alcohol. La producción de etanol a partir de suero ha sido ampliamente estudiada
y se han implementado procesos industriales en algunos países desarrollados.
23
Antecedentes
La principal limitante de este proceso es la baja concentración de etanol que se obtiene por la
intolerancia de algunas cepas y la baja concentración de lactosa, genera como máximo entre 2-3%
de etanol al final de la fermentación.
6)
Bebidas fermentadas. Cabe la posibilidad de obtener bebidas alcohólicas a partir del suero,
principalmente cerveza y vino. Otras bebidas fermentadas con bacterias lácticas o mezclas de
estas con levaduras han sido desarrolladas en varios países, las cuales generalmente se mezclan
con jugos de frutas u otros saborizantes. Una compañía finlandesa llamada Valio, puso en el
mercado una bebida con el nombre de “Gefilus” elaborada con suero, lactosa hidrolizada y
fermentada con una bacteria denominada “Lactobacillus GG”, la cual tiene propiedades probióticas.
7)
Producción de enzimas. Varias enzimas microbianas pueden obtenerse al utilizar el suero como
sustrato. La más importante de todas, es la β-galactosidasa, cuya producción es un proceso
altamente rentable para el aprovechamiento del mismo. También ha sido estudiada la posibilidad
de producir enzimas pectinolíticas de los hongos Sclerotinia sclerotiorum y Aspergillus awamori
utilizando suero como sustrato.
8)
Jarabes de suero. Cuando se hidroliza la lactosa del suero y el hidrolizado se concentra en 60% a
70% de sólidos, se obtiene lo que se conoce como jarabe de suero o jarabes dulces de suero.
Estos han adquirido una gran importancia comercial en la última década, y en virtud de que tienen
un poder edulcorante considerable pueden utilizarse como sustitutos parciales de sólidos de leche
y azúcar en helados, confitería, productos lácteos endulzados, aderezos, productos de panadería,
yogurt y bebidas refrescantes de alto valor nutritivo, donde además las proteínas del suero pueden
sustituir parcialmente a las proteínas del huevo que se utilizan en algunos de estos alimentos.
9)
Producción de biopelículas a partir proteínas del suero. Las nuevas aplicaciones de los
aislados y concentrados de proteínas del lactosuero, es la producción de biopelículas y coberturas
en superficies de objetos. Actualmente, se exploran varias aplicaciones:
• Capas protectoras contra grasa en papel. Las biopelículas son usadas para envasar productos
como comida rápida o comida para mascotas.
24
Antecedentes
• Capas que proporcionen brillo a productos de panificación. Se propone utilizar estas biopelículas
en productos de panificación a base de chocolate.
• Capas protectoras contra la permeabilidad al oxigeno en plásticos. Muchos plásticos son buenas
barreras contra la humedad pero, no contra el oxígeno. Los plásticos son revestidos con estas
biopelículas, con la finalidad de obtener una buena barrera contra el oxígeno.
• Capas protectoras contra la permeabilidad al oxígeno en alimentos. Se propone recubrir los
alimentos con estas biopelículas, con la finalidad de evitar la oxidación del producto y prolongar
su vida útil. Estas biopelículas se podrían ingerir junto con el alimento y de esta manera eliminar
el uso de plásticos sintéticos para estas aplicaciones.
• Capas protectoras contra la humedad en alimentos. Estas biopelículas pueden ser usadas para
prevenir la transferencia de humedad de un componente a otro, prevenir condensación de la
humedad, reacciones químicas indeseables y crecimiento microbiano, de esta manera extender
la vida útil del producto.
• Capas antimicrobianas en queso. Las biopelículas también pueden ser usadas para recubrir los
quesos y retener los compuestos antimicrobianos en la superficie, esto podría reducir la cantidad
de compuestos antimicrobianos usados.
10) Producción de probióticos y bacteriocinas.
Los microorganismos probióticos, producen
bacteriocinas, familia de péptidos extracelulares con actividad bacteriostática o bactericida. En
estudios recientes, Pastrana et al. (2004), demostró con bastante éxito, que el suero de leche
podría utilizarse para producir probióticos y adicionalmente bacteriocinas.
1.13. Fermentaciones Ácido Lácticas.
Una fermentación ácido láctica se define como una oxidación parcial de los átomos de carbono de un
azúcar, acoplada a la reducción de un compuesto orgánico generado, ácido láctico principalmente, a partir
del catabolismo del sustrato inicial por las enzimas de un microorganismo (Quintero, 1981).
Las diferencias en las fermentaciones lácticas residen en la especie de la que procede la leche, el
tratamiento térmico de la misma, la temperatura de fermentación, el porcentaje de inoculo y la
concentración de la leche; dependiendo de estas condiciones predomina un tipo de bacteria láctica u otro
que, generan distintos componentes aromáticos.
25
Antecedentes
Los microorganismos involucrados pueden provenir de cultivos mixtos o puros. Un cultivo mixto, está
constituido por una mezcla indefinida de cepas de distintos tipos de bacterias. La composición de estos
cultivos se basa en un equilibrio dinámico entre las diferentes bacterias del cultivo. Un cultivo puro, está
constituido por una única cepa (Walstra et. al., 2001).
La transformación bioquímica de los componentes de la leche de cabra, sus derivados y subproductos, por
las BAL produce importantes cambios en los productos fermentados. Estos cambios dependen de las
bacterias del cultivo y del tipo de producto elaborado. Las principales consecuencias del desarrollo de las
BAL en la leche de cabra y sus subproductos, son (Walstra et. al., 2001; Varnam, 1995):
•
Producción de ácido a partir de la lactosa. El ácido formado interviene en:
a. La conservación del producto. El ácido producido (especialmente el ácido láctico), en
combinación con el bajo pH, es un factor esencial en la vida útil y en la seguridad de todos
los productos lácteos fermentados.
b. La textura del producto. El pH modifica considerablemente las propiedades reológicas.
c. El sabor del producto.
•
Formación de otros compuestos durante la fermentación de la lactosa y el metabolismo del
ácido cítrico.
a. Componentes del sabor.
b. Dióxido de carbono.
c. Exapolisacáridos bacterianos.
Las transformaciones que llevan a cabo las BAL, determinan la vida útil, seguridad, consistencia y
desarrollo de sabor y textura de los productos lácteos fermentados.
El común denominador para utilizar la leche de cabra y sus subproductos como medio para una
fermentación ácido láctica, es debido al principal carbohidrato presente en estos alimentos, la lactosa, el
cual es utilizado por lo microorganismos como fuente de carbono.
26
Antecedentes
El éxito de las fermentaciones ácido lácticas depende de las tecnologías de proceso utilizadas, pero es la
correcta selección, conservación, manejo, resiembra y propagación de los cultivos iniciadores o también
denominados inóculos de trabajo, lo que permite estandarizar y mantener una calidad uniforme del
producto final. Los cultivos microbianos se conservan en pequeñas cantidades conocidas como cultivos de
reserva. Cuando estos cultivos se reactivan para su utilización en la industria láctea, se recurre a sistemas
de resiembra a gran escala con objeto de obtener el volumen necesario de inóculo. Las etapas del
proceso de siembra hasta la obtención del inóculo se llevan a cabo a nivel laboratorio, partiendo de un
inoculo del 5%, son:
Cultivo Reserva
5%
1mL de medio
de cultivo
Tubo
5%
20mL de medio
de cultivo
Matraz
5%
Cultivo Madre
100mL de medio
de cultivo
5%
Inoculo de trabajo
500mL de sustrato
a fermentar
(leche)
5%
10,000mL
de sustrato
a fermentar
(leche)
Fermentador nivel
laboratorio o industrial
El cultivo madre debe reunir las siguientes características (Tamime y Robinson, 1991):
• Contener un máximo de bacterias viables en un volumen mayor al del cultivo de reserva,
• Estar libre de contaminantes, como coliformes, mohos o levaduras,
• Debe presentar actividad en las condiciones de procesado, además,
• Estar sembrados en el sustrato de trabajo estéril, en este caso leche, productos o subproductos
lácteos,
• Mantener su actividad a bajas temperaturas (refrigeración) esto ayuda reducir o controlar la actividad
metabólica de los microorganismos, lo cual es aplicable solamente en periodos de almacenamiento
cortos, permitiendo la viabilidad de los cultivos durante una semana.
El inoculo de trabajo, es la fracción del cultivo madre con el cual se siembra el biorreactor, debe reunir las
siguientes características para que no exista inhibición por sustrato (Varnam, 1995; Tamime y Robinson,
1991):
• Contener un número de células viables conocido (≥ 107 UFC/mL)
• Estar libre de contaminantes
• Estar en una relación mínima con respecto al volumen del reactor del 5%
27
Antecedentes
Un factor clave en las fermentaciones ácido lácticas es la preparación de cultivos activos, es decir, el
cultivo madre debe estar constituido por un gran numero de células viables para que al añadirlo al
sustrato, el proceso de fermentación comience lo antes posible. Durante el cultivo de los microorganismos,
las células se dividen, aumentando el número total hasta cierto nivel y, posteriormente comienzan a morir.
Se puede suponer con seguridad que existe una relación directa entre la actividad de los cultivos madre y
su edad. Un cultivo activo se encuentra en la curva de crecimiento entre la región superior de la fase
logarítmica y el comienzo de la fase estacionaria. Por lo tanto, el tipo más activo de iniciador son los
cultivos caracterizados por una fase de latencia breve o inexistente seguida de una tasa de producción de
ácido láctico. En términos medios el tamaño de inóculo puede ser de un 3-10% y debe contener más de
107 microorganismos viables por mililitro. Una fase de latencia larga incrementa el tiempo de proceso, lo
cual disminuye el atractivo para las grandes industrias (Robinson et. al., 2000; Tamime y Robinson, 1991;
Quintero, R.R., 1981).
En el caso particular de fermentaciones ácido lácticas con bacterias probióticas, tanto del género
Bifidobacterium spp. como L. acidophilus, para conseguir que el producto final contenga la concentración
mínima terapéutica, se debe cumplir lo siguiente para una fermentación a nivel industrial:
• Tamaño de inóculo del 10-20%
• Mantener el valor final de pH por arriba de 4.6, se puede optar por utilizar soluciones buffer en el
producto de fermentación o finalizar la incubación a un pH de 4.9-5.0 (Varnam, 1995).
1.14. Trabajos Previos
En la literatura con la que se contaba no se encontraron trabajos previos reportados en los que se utilice el
suero de leche de cabra como sustrato para la producción de probióticos. Los trabajos encontrados se
enfocan al aprovechamiento del suero de leche de vaca, a la producción de probióticos en suero de leche
de vaca, producto probiótico en suero de leche de vaca y el trabajo de nuestro grupo de investigación de
probióticos en leche de cabra.
¾
Aprovechamiento del suero de leche de vaca.
Ramírez Saldívar (1994) en su trabajo “Aprovechamiento del suero de quesería para la producción de
dulce de leche”, aprovechó este subproducto lácteo en la elaboración de dulces tradicionales de leche de
cabra utilizando mezclas de lactosuero y leche de cabra.
28
Antecedentes
Se utilizaron dos tipos de suero de leche, suero de leche obtenido en la elaboración de queso panela y
obtenido en la elaboración de queso asadero. Se mezclaron en proporción 0, 25, 75 y 100% suero de
leche con leche de cabra. Se elaboraron los dulces de leche con estas mezclas, se determinaron los
sólidos totales. Ramírez Saldívar (1994) encontró que, el tipo de suero utilizado en la producción de la
pasta de dulce no influye en su rendimiento de elaboración; al incrementar el contenido de suero en la
mezcla para la elaboración de la pasta de dulce el rendimiento se redujo y que el uso de una mezcla 25%
suero y 75% leche de cabra, independientemente del tipo de suero, es la mezcla más adecuada para la
producción de dulce de leche, sin afectar su valor nutritivo y rendimiento.
En el trabajo de González Moreno (1992) se buscaba aprovechar el suero de leche en productos
alimenticios. Se desarrollaron algunos productos cuyo ingrediente principal fuera el suero de leche, que
fueran nutritivos, de buen sabor y de bajo costo. Los productos que se desarrollaron fueron: bebidas de
chocolate, bebida fermentada y helado. Se realizaron evaluaciones sensoriales. Las formulas alimenticias
desarrolladas tuvieron una buena aceptación, lo que demostró la gran posibilidad de explotación del suero
de leche.
Aunque por varios años se han estado buscando formas de aprovechamiento del suero de leche de vaca,
no se ha probado el suero de leche de cabra en diferentes productos como bebidas, helados, dulces, etc.
Se ha investigado la factibilidad de producir bebidas fermentadas a base de suero de leche de vaca, pero
no se ha probado la obtención de bebidas fermentadas y/o probióticas, a base de suero de leche de cabra.
¾
Producción de probióticos a partir de suero de leche de vaca.
En estudios recientes, Pastrana et al. (2004), demostró con bastante éxito, que el suero de leche de vaca,
podría utilizarse como medio de cultivo para producir probióticos y adicionalmente bacteriocinas. Utilizaron
suero de leche de vaca concentrado y diluido; y dos bacterias probióticas Lactococcus lactis y
Pediococcus acidilactici. Se comparó el desarrollo de las dos bacterias probióticas, tanto en suero
concentrado como diluido y en medio MRS. Se obtuvieron mejores rendimientos de bacterias y
bacteriocinas en medio MRS, que en suero concentrado y diluido. Pastrana et al. (2004) mencionan, que
estos resultados se deben los sueros contienen una composición inadecuada de fuente de nitrógeno y que
las dos cepas empleadas tienen cierta preferencia por la glucosa como fuente de carbono y menos
preferencia por la lactosa, fuente de carbono presente en el suero de leche.
29
Antecedentes
Aunque la producción de probióticos en suero de leche de cabra, no fue la esperada, si se logro el
desarrollo de las cepas empleadas y la producción de las bacteriocinas.
Desde este punto, se tiene un área de oportunidad que se puede aprovechar, ya que no se ha evaluado el
desarrollo de microorganismos probióticos en suero de leche de cabra.
¾
Producto probiótico en suero de leche de vaca.
Como ya se había mencionado, existe en el mercado una bebida elaborada con suero llamada “Gefilus” la
cual tiene propiedades de probiótico (García Garibay et. al. 2002). En el mercado mexicano no se
comercializan actualmente productos probióticos en suero de leche de cabra, desde este punto, se tiene
un área de oportunidad que se puede aprovechar.
¾
Trabajo de nuestro grupo de investigación de probióticos en leche de cabra.
Solís, N. (2004), investigo nuevas formas de aprovechamiento de la leche de cabra, desarrollando
productos probióticos. Su trabajo consistió en determinar que la leche de cabra es un sustrato favorable
para el desarrollo de Bifidobacterium infantis, Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus bajo
condiciones de anaerobiosis utilizando CO2, adicionalmente implementó una técnica mediante reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) para la identificación de Bifidobacterium infantis.
Debido a lo antes mencionado y al incremento en la producción de leche de cabra en el estado y su
respectiva repercusión económica, se plantea incorporar alternativas para el consumo de leche de cabra,
sus derivados y subproductos, elaborando productos lácteos fermentados con probióticos. En esta
investigación se propone utilizar el suero de leche de cabra como sustrato para el desarrollo de un
producto fermentado probiótico con Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus.
30
DEDICATORIA
A Dios por permitirme vivir estos momentos.
A mi madre:
Aún las más bellas palabras que hoy escribiera, nunca podrían traducir mis sentimientos hacia ti. Por el amor y apoyo
incondicional que me has dado a cada paso que doy. Por todo lo que hiciste y dejaste de vivir por mí. Todo lo que soy
hasta el día de hoy, es por ti.
A Raúl por entender mi profesión, por estar conmigo en los momentos difíciles cuando el trabajo y los estudios me
angustiaban, por mostrarme el mundo que hay afuera de mis cuatro paredes, por amarme.
A mis hermanas, Magaly por ser pilar en mi vida y Judith por venir a dar la mayor alegría a nuestra pequeña familia; las
quiero mucho.
A mi hermana de profesión, Araní Casillas Ramírez, por animarme cada vez que mis alas han querido dejar de aletear,
por estar conmigo en los momentos más difíciles y felices de mi vida, por su amistad incondicional.
A mi tía Marina, por enseñarme indirectamente, que hacer lo que a uno le apasiona te da satisfacciones personales,
superiores a cualquier otra cosa. A mi tía Elida, por su apoyo y comprensión en cada etapa de mi vida. Las quiero
mucho.
A la Dra. Paula Cordero Pérez, por sembrar en mí la semilla de la investigación.
A Verónica Díaz Avilés, por ser mi cómplice en esta aventura, brindarme su amistad incondicional y hacer esta etapa
inolvidable.
A mis amigas, Irma, Gloria y Mine, por su amistad y apoyo. Por esperar y comprenderme cuando no he podido estar con
ustedes. Con todo mi corazón.
A todas mis compañeras de la Maestría, Judith, Ana, Gaby, Irasema, María José, Marisol, Verónica, Yadhira y Citlali, por
brindarme su amistad, apoyo y consejos. Por hacer que la estancia en el TEC, fuera inolvidable.
ii
ABREVIATURAS
AOAC
ATCC
BAL
CAE
CBA
DBO
DEQ
DIA
DO
DQO
FAO
gr
HA
H0
hrs
IgA
INEGI
ITESM
kg
km2
L
ln
Log10
log
min
mL
MRS
NADH
nm
NMP
NOM
No.
NR
PIB
rpm
SAGARPA
SIAP
SSA
t
td
ufc
UV
α
°C
µ
µL
µ
%
®
Association of Official Analytical Chemist
American Type Culture Collection
Bacterias Ácido Lácticas
Campo Agrícola Experimental
Columbia Base Agar
Demanda Biológica de Oxígeno
Desarrollo de Especialidades Químicas, S.A. de C.V.
División de Ingeniería y Arquitectura
Densidad óptica
Demanda Química de Oxígeno
Organización de las Naciones Unidad para la Agricultura y la Alimentación
Gramo
Hipótesis alterna
Hipótesis nula
Horas
Inmunoglobulina A
Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática
Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey
kilogramos
kilometros cuadrados
Litro
logaritmo natural
logaritmo base 10
logarítmica
Minutos
Mililitro
Man Rogose Sharpe
Dinucleotido de nicotinamín adenina
Nanómetros
Número más probable
Norma Oficial Mexicana
Número
No reportado
Producto Interno Bruto
Revoluciones por minuto
Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación
Sistema de Información y Estadística Agroalimentaria y Pesquera
Secretaría de Salubridad y Asistencia
Tiempo
Tiempo de duplicación
Unidades formadoras de colonia
Ultravioleta
Nivel de significancia
Grados Celsius
Promedio o media
Microlitro
Velocidad específica de crecimiento
Porciento
Marca registrada
iii
Objetivos
Capitulo 2.- Objetivos
2.1. Objetivo General.
2.1.1. Evaluar la calidad del suero de leche de cabra obtenido de queserías a nivel laboratorio, como
sustrato potencial para el desarrollo de Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus, en una
fermentación ácido láctica y demostrar que es un producto probiótico.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1. Estandarizar un proceso a nivel laboratorio para obtener suero de leche de cabra, proveniente de la
elaboración de un queso fresco.
2.2.2. Caracterizar la composición del suero de leche de cabra como sustrato, en relación a la cantidad de
lactosa disponible, grasa y proteínas residuales.
2.2.3. Evaluar si el suero de leche de cabra obtenido de queserías, es un sustrato adecuado para el
crecimiento de Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus, mediante la realización de
fermentaciones ácido lácticas con ambas bacterias o en fermentaciones con una de ellas separadamente
y evaluando las cinéticas de crecimiento de Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus, consumo
de lactosa, desarrollo de acidez titulable y pH.
2.2.4. Demostrar la presencia de una concentración mínima de 1x108 a 1x1010 ufc/mL de ambas
bacterias en los productos fermentados, provenientes de fermentaciones ácido lácticas con ambas
bacterias o de fermentaciones con una sola bacteria, a fin de garantizar el carácter probiótico del mismo.
31
Hipótesis
Hipótesis
Para alcanzar los objetivos anteriores, se plantearon las siguientes hipótesis:
H1
El suero de leche de cabra proveniente de la elaboración de queso fresco, es un adecuado sustrato
para la obtención de un producto probiótico con Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus.
H2
En una fermentación mixta utilizando suero de leche de cabra como sustrato y dos bacterias
probióticas (Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus), se obtiene una mayor cantidad de
unidades formadoras de colonia de cada bacteria, que en una fermentación simple utilizando suero
de leche de cabra como sustrato y una de las dos bacterias probióticas anteriores.
H3
En una fermentación ácido láctica utilizando suero de leche de cabra suplementado con otra fuente
de carbono, se obtiene una mayor cantidad de unidades formadoras de colonias de Bifidobacterium
bifidum, que en una fermentación ácido láctica utilizando suero de leche de cabra.
32
Estrategia Experimental
Capitulo 3.- Estrategia Experimental
Para probar las hipótesis planteadas, se propuso una estrategia experimental basada en la fermentación
de suero de leche de cabra con Bifidobacterium bifidum y/o Lactobacillus acidophilus. La estrategia
experimental se dividió en 4 etapas:
1. Obtención y caracterización del suero de leche de cabra.
A partir de leche de cabra adquirida en el CAE del ITESM, se elaboró queso fresco, para obtener el suero
de leche de cabra. Tanto la leche como el suero, recibieron tratamiento térmico para eliminar posibles
riesgos de contaminación microbiana, antes de su empleo en las fermentaciones ácido lácticas. Se
caracterizó la composición del suero de leche de cabra como sustrato, en relación a la cantidad de lactosa
disponible, grasa y proteínas residuales. En la figura 4, se presenta el diagrama de flujo de la estrategia
experimental 1, para la obtención del suero de leche de cabra.
2. Preparación del inóculo de trabajo.
Las bacterias probióticas utilizadas en esta investigación, se adaptaron al suero de leche de cabra para la
obtención de los inóculos de trabajo. Previo a esto, se determinaron los parámetros cinéticos (td y µ) de
ambas bacterias, tras repiques sucesivos de las mismas en medio MRS. En la figura 5, se presenta el
diagrama de flujo de la estrategia experimental 2, para la preparación de los inóculos de trabajo.
3. Fermentaciones de suero de leche de cabra con B. bifidum y/o L. acidophilus.
Se llevaron a cabo fermentaciones ácido lácticas utilizando suero de leche de cabra como sustrato. Las
fermentaciones ácido lácticas fueron designadas como: mixtas (contenían B. bifidum y L. acidophilus) y
simples (contenían B. bifidum o L. acidophilus). En las fermentaciones simples con B. bifidum, se
elaboraron fermentaciones en suero de leche de cabra y en suero de leche de cabra suplementado con
2% de glucosa, para facilitar la comprensión de esta variable (glucosa), se les designo como
fermentaciones tipo 1 y 2 respectivamente. Se evaluaron 4 cinéticas en las fermentaciones mixtas y
simples: consumo de sustrato, pH, producto formado y unidades formadoras de colonias por mililitro de
producto de fermentación en el tiempo. En la figura 6, se presenta el diagrama de flujo de la estrategia
experimental 3, para la realización de las fermentaciones ácido lácticas.
33
Estrategia Experimental
4. Caracterización del suero de leche de cabra fermentado por microorganismos probióticos.
Se evaluaron 4 parámetros en el producto final, obtenido en las fermentaciones ácido lácticas mixtas y
simples: sustrato remanente, pH, acidez desarrollada y unidades formadoras de colonias por mililitro de
producto de fermentación. En la figura 7, se presenta el diagrama de flujo de la estrategia experimental 4,
para la caracterización del producto fermentado.
34
Estrategia Experimental
Recepción de Leche
de Cabra
CAE del ITESM
Pruebas de
plataforma
Leche
Rechazada
pH (Método Potenciométrico)
Acidez titulable (A.O.A.C. 947.05)
Esterilización
Leche
Aceptada
Corte de la cuajada
Variable:
Temperatura de coagulación
Moldeado
del coágulo
Desuerado
Recuperación del
Suero de leche de cabra
Pasteurización del suero de leche de cabra
70ºC ± 2ºC / 30 min.
98ºC ± 1ºC / 4 min.
Coagulación
Variable: Tiempo de coagulación
Resultados
Positivos
Leche
Rechazada
Adición de cuajo
microbiano
Variable:
Cantidad de cuajo
Salado
del queso
Prensado
Resultados
Negativos
Leche
Aceptada
Análisis
Microbiológicos
NOM-112-SSA1-1994
Proceso de obtención
de queso fresco
Calentamiento
Variable: Temperatura
Envasado
del queso
Almacenamiento a 4ºC±1
Caracterización del suero de leche de cabra
pH
Acidez
Proteínas
Grasa
Lactosa
Rendimiento del suero
Potenciométrico
947.05 A.O.A.C.
930.29 A.O.A.C.
NOM -F-387-1982
984.15 A.O.A.C.
Figura 4. Estrategia Experimental Etapa 1: Obtención y caracterización del suero de leche de cabra.
35
Estrategia Experimental
Cepas Criopreservadas
Bifidobacterium bifidum ATCC 11863
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356
Reactivación de cepas criopreservadas en tubo
Medio MRS, Volumen 20mL, Anaerobiosis total., 37ºC.± 1
Medición de la D.O. a 660nm hasta alcanzar la fase log.
Determinación de constancia en td y µ.
Escalar a nivel de matraz.
Medición de la D.O. a 660nm hasta alcanzar la fase log.
Medio MRS, Volumen 100mL, Anaerobiosis total, 37ºC. ± 1
Determinación de constancia en td y µ.
Resguardo de cepas
En tubos criogénicos de 1mL, 15% Glicerol a -86ºC ± 1
Cultivo Madre
Adaptación de cada bacteria en suero de leche de cabra
Cuenta de ufc en placa
NOM – 092 – SSA1 – 1994
NOM – 110 – SSA1 – 1994
Inóculo de trabajo
Fraccionamiento del cultivo madre y conservación a 4ºC ± 1
Figura 5. Estrategia Experimental Etapa 2: Preparación del inóculo de trabajo.
36
Estrategia Experimental
Suero de leche de cabra pasteurizado
Calentamiento
37ºC ± 1
Preparación de inóculos
• B. bifidum
• L. acidophilus
Inoculación
Frascos de 500mL estériles, Inoculación de suero pasterizado.
Fermentación Mixta
con B. bifidum y L. acidophilus
Fermentación Simple
con B. bifidum
Condiciones:
• Anaerobiosis total.
• Temperatura: 42ºC± 2ºC
• Volumen 500mL
• Suero de leche de cabra
Variables:
• Inoculo (%)
• Tiempo de fermentación (hrs).
Condiciones:
• Anaerobiosis total.
• Temperatura: 42ºC± 2ºC
• Volumen 500mL
Variables:
• Inoculo (%)
• Tiempo de fermentación (hrs).
• Suero de leche de cabra con y sin
adición de otra fuente de carbono.
Fermentación Simple
con L. acidophilus
Condiciones:
• Anaerobiosis total.
• Temperatura: 42ºC± 2ºC
• Volumen 500mL
• Suero de leche de cabra
Variables:
• Inoculo (%)
• Tiempo de fermentación (hrs).
Muestreo cada 1.5hrs.
Determinación de cinéticas
•
•
•
•
pH
Formación de Ácidos Orgánicos (% Ácido láctico)
Consumo de Lactosa
Crecimiento microbiano (UFC/mL)
Enfriamiento a 4ºC±1.
Figura 6. Estrategia Experimental Etapa 3:
Fermentaciones de suero de leche de cabra con B. bifidum y/o L. acidophilus.
37
Estrategia Experimental
Producto
fermentado
Almacenamiento a 4ºC ±1
Caracterización del Producto
fermentado
Determinación de:
ƒ pH
ƒ Lactosa remanente
ƒ Acidez desarrollada
ƒ Cuenta de viables (UFC/mL)
Figura 7. Estrategia Experimental Etapa 4:
Caracterización del suero de leche de cabra fermentado por microorganismos probióticos.
38
INDICE
Agradecimientos
Dedicatoria
Abreviaturas
Índice
Índice de Figuras
Índice de Tablas
Capítulo 1.- Antecedentes
1.1.
Probióticos.
1.2.
La Flora Intestinal Humana, Fuente de Probióticos.
1.3.
Microorganismos Probióticos.
1.4.
Criterios para la Selección de un Microorganismo Probiótico.
1.5.
Dosis Efectiva de Microorganismo Probióticos.
1.6.
Efectos Benéficos de los Microorganismos Probióticos.
1.7.
Mecanismos de Acción de Microorganismos Probióticos.
1.8.
Vehículos Utilizados para Consumo Humano de Probióticos.
1.9.
Productos Probióticos.
1.10. Bacterias Probióticas Utilizadas en esta Investigación.
1.10.1.
1.10.2.
1.11.
Importancia de la Leche de Cabra y sus Subproductos como Sustrato para las
Bacterias Probióticas.
1.11.1.
1.12.
Bifidobacterium bifidum.
Lactobacillus acidophilus.
Problemática de la Caprinocultura en Nuevo León.
Suero de leche de cabra.
1.12.1
1.12.2.
Composición del Suero de Leche de Cabra.
Usos del Lactosuero.
1.13. Fermentaciones Ácido Lácticas.
1.14. Trabajos Previos.
Capitulo 2.- Objetivos
2.1
Objetivo General.
2.2
Objetivos Específicos.
Capitulo 3.- Estrategia Experimental
Capitulo 4.- Materiales y Métodos
4.1.
Recepción de la Leche de Cabra.
4.2.
Muestreo de la Leche de Cabra para Pruebas de Plataforma.
4.3.
Pruebas de Plataforma.
4.3.1.
4.3.2.
4.4.
4.5.
4.6.
4.7.
Esterilización de la Leche de Cabra.
Análisis Microbiológicos.
Elaboración de Queso Fresco de Leche de Cabra.
Caracterización del Suero de Leche de Cabra.
4.7.1.
4.7.2.
4.7.3.
4.7.4.
4.7.5.
4.7.6.
4.8.
4.9.
Determinación de pH
Determinación de Acidez Titulable
Determinación de pH.
Determinación de Acidez titulable.
Determinación de Proteínas.
Determinación de Grasa.
Determinación de Lactosa.
Rendimiento de Suero de leche de cabra.
Pasteurización del suero de leche de cabra.
Cepas Probióticas.
iv
i
ii
iii
iv
vi
vii
1
1
2
5
5
5
7
8
8
10
11
13
15
17
19
20
22
25
28
31
31
33
39
39
39
39
40
40
40
41
42
42
42
42
42
42
43
43
43
4.9.1.
4.9.2.
4.9.3.
4.10.
Cultivo Madre.
4.10.1.
4.11.
4.12.
Cálculos para la Determinación de los Parámetros Cinéticos td y µ.
Reactivación de Bifidobacterium bifidum ATCC No.11863 y Lactobacillus
acidophilus ATCC No. 4356.
Resguardo de Bifidobacterium bifidum ATCC No.11863 y Lactobacillus
acidophilus ATCC No. 4356
Cuenta en Placa de las Unidades Formadoras de Colonias en el Cultivo Madre.
Inóculos de Trabajo.
Fermentaciones Ácido Lácticas en Suero de Leche de Cabra.
4.12.1.
Fermentaciones Ácido Lácticas Mixtas
4.12.1.1.
Caracterización del Producto Final de Fermentación.
4.12.2. Fermentaciones Ácido Lácticas Simples con Bifidobacterium bifidum.
4.12.3. Fermentaciones Ácido Lácticas Simples con Lactobacillus acidophilus.
Análisis Estadístico entre Tratamientos de Fermentaciones Ácido Lácticas Mixtas
y Simples.
Capítulo 5.- Resultados y Discusión
5.1.
Pruebas de Plataforma.
5.2.
Esterilización de la Leche de Cabra.
5.3.
Análisis Microbiológicos.
5.4.
Elaboración de Queso Fresco.
5.5.
Caracterización del Suero de Leche de Cabra.
44
45
45
46
47
47
47
49
50
50
51
4.13.
5.5.1.
5.5.2.
5.5.3.
5.5.4.
5.5.5.
5.5.6.
5.6.
5.7.
Pasteurización del Suero de Leche de Cabra.
Cepas Probióticas.
5.7.1.
5.7.2.
5.8.
Reactivación de Bifidobacterium bifidum ATCC No.11863.
Reactivación de Lactobacillus acidophilus ATCC No. 4356.
Cultivo Madre.
5.8.1.
5.9.
5.10.
Determinación de pH.
Determinación de Acidez titulable.
Determinación de Proteínas.
Determinación de Grasa.
Determinación de Lactosa.
Rendimiento de Suero de Leche de Cabra.
Cuenta en Placa de las Unidades Formadoras de Colonias en el Cultivo Madre.
Inóculos de Trabajo.
Fermentaciones Ácido Lácticas en Suero de Leche de Cabra.
5.10.1.
Fermentaciones Ácido Lácticas Mixtas.
5.10.1.1.
5.10.2.
Fermentaciones Ácido Lácticas Simples con Bifidobacterium bifidum.
5.10.2.1.
5.10.3.
Caracterización de los Productos Finales de Fermentación.
Fermentaciones Ácido Lácticas Simples con Lactobacillus acidophilus.
5.10.3.1.
5.11.
Caracterización del Producto Final de Fermentación.
Caracterización del Producto Final de Fermentación.
Análisis Estadístico entre Tratamientos de Fermentaciones Ácido Lácticas Mixtas
y Simples.
5.11.1. Análisis Estadístico entre Tratamientos de Fermentaciones Mixtas y Simples
con B. bifidum.
5.11.2. Análisis Estadístico entre Tratamientos de Fermentaciones Mixtas y Simples
con L. acidophilus.
5.11.3. Análisis Estadístico entre Tratamientos de Fermentaciones Simples de B. bifidum,
con Diferente Fuente de Carbono.
Capítulo 6. - Conclusiones
Capítulo 7.- Recomendaciones
Resumen
Referencias
v
51
53
54
54
55
60
61
61
61
62
62
62
62
63
63
65
66
66
68
68
68
73
73
77
78
82
82
83
85
86
88
89
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Rutas metabólicas utilizadas por las Bacterias Ácido Lácticas para la degradación de la lactosa.
Figura 2. Reacciones que sufre el ácido pirúvico durante una fermentación heterofermentativa.
Figura 3. Estructura química de la lactosa.
Figura 4. Estrategia Experimental Etapa 1: Obtención del suero de leche de cabra.
Figura 5. Estrategia Experimental Etapa 2: Preparación del inóculo de trabajo.
Figura 6. Estrategia Experimental Etapa 3: Fermentaciones.
Figura 7. Estrategia Experimental Etapa 4: Caracterización del producto fermentado.
Figura 8. Proceso de esterilización a nivel laboratorio de la leche de cabra.
Figura 9. Diagrama de flujo del proceso estandarizado para la elaboración de queso fresco de leche de
cabra a nivel laboratorio.
Figura 10. Proceso de elaboración del queso fresco de leche de cabra a nivel de laboratorio.
Figura 11. Queso fresco de leche de cabra elaborado durante la investigación.
Figura 12. Pasteurización del suero de leche de cabra.
Figura 13. Curvas de crecimiento de Bifidobacterium bifidum ATCC No.11863.
Figura 14. Curvas de crecimiento de Lactobacillus acidophilus ATCC No. 4356.
Figura 15. Cinética de pH en una fermentación ácido láctica mixta en suero de leche de cabra con
B. bifidum y L. acidophilus.
Figura 16. Cinética de Consumo de Lactosa en una fermentación ácido láctica mixta en suero de leche de
cabra con B. bifidum.
Figura 17. Cinética de Formación de Ácidos Orgánicos en una fermentación ácido láctica mixta en suero
de leche de cabra con B. bifidum y L. acidophilus.
Figura 18. Cinética de crecimiento de B. bifidum (BB) y L. acidophilus (LAC) en una fermentación ácido
láctica mixta en suero de leche de cabra.
Figura 19. Cinéticas de pH de fermentaciones simples en suero de leche de cabra con B. bifidum.
Figura 20. Cinéticas de Consumo de Lactosa de fermentaciones simples en suero de leche de cabra con
B. bifidum.
Figura 21. Cinéticas de Formación de Ácidos Orgánicos de fermentaciones simples en suero de leche de
cabra con B. bifidum.
Figura 22. Cinéticas de crecimiento de B. bifidum en fermentaciones simples en suero de leche de cabra.
Figura 23. Cinética de pH durante una fermentación simple en suero de leche de cabra con L. acidophilus.
Figura 24. Cinética de Consumo de Lactosa durante una fermentación simple en suero de leche de cabra
con L. acidophilus.
Figura 25. Cinética de Formación de Ácidos Orgánicos durante una fermentación simple en suero de leche
de cabra con L. acidophilus.
Figura 26. Cinética de crecimiento de fermentaciones simples en suero de leche de cabra con
L. acidophilus.
Figura 27. Análisis estadístico entre tratamientos de fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples con
B. bifidum.
Figura 28. Análisis estadístico entre tratamientos de fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples con
L. acidophilus.
Figura 29. Análisis estadístico entre tratamientos de fermentaciones simples con B. bifidum, con
diferente fuente de carbono.
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79
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85
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Especies de microorganismos usados como probióticos en humanos.
Tabla 2. Características diferenciales entre géneros considerados como probióticos en humanos.
Tabla 3. Productos fermentados probióticos comercializados en Europa.
Tabla 4. Productos probióticos disponibles en el mercado mexicano.
Tabla 5. Productos farmacéuticos probióticos comercializados a nivel mundial.
Tabla 6. Características de Bifidobacterium bifidum.
Tabla 7. Características de Lactobacillus acidophilus.
Tabla 8. Porcentaje promedio de la composición de la leche de diversos mamíferos.
Tabla 9. Producción anual de leche de cabra a nivel nacional y estatal.
Tabla 10. Composición del suero de leche de vaca.
Tabla 11. Usos del lactosuero.
Tabla 12. Pruebas microbiológicas presuntivas y confirmatorias para determinar coliformes.
Tabla 13. Condiciones para las Fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples en suero de leche
de cabra.
Tabla 14. Variables para las Fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples en suero de leche de
cabra.
Tabla 15. Pruebas de plataforma realizadas a la leche de cabra.
Tabla 16. Prueba de Coliformes totales de la leche de cabra esterilizada.
Tabla 17. Caracterización de suero de leche de cabra.
Tabla 18. Comparación entre valores obtenidos de suero de leche de cabra Vs. valores reportados
para el suero de leche de vaca..
Tabla 19. Parámetros cinéticos obtenidos para B. bifidum ATCC No.11863.
Tabla 20. Parámetros cinéticos obtenidos para L. acidophilus No. 4356.
Tabla 21. Cuenta en placa de UFC en los cultivos madre de B. bifidum y L. acidophilus usados para
fermentar suero de leche de cabra.
Tabla 22. Características del producto de una fermentación mixta en suero de leche de cabra con
B. bifidum y L. acidophilus.
Tabla 23. Comparación entre características de productos fermentados procedentes de fermentaciones
tipo 1 y 2.
Tabla 24. Características del producto fermentado procedente de fermentaciones simples en suero de
leche de cabra con L. acidophilus.
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INSTITUTO TECNOLOGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY
CAMPUS MONTERREY
DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA
PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA
“Aprovechamiento del suero de leche de cabra como sustrato para el desarrollo de
un producto fermentado probiótico con: Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus
acidophilus”
TESIS
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA
OBTENER EL GRADO ACADEMICO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS
ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGIA
POR
YAJAIRA GABRIELA LOMAS DE LEON
MONTERREY, N. L.
MAYO 2005
INSTITUTO TECNOLOGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY
CAMPUS MONTERREY
DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA
PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERIA
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
Los miembros del comité de tesis recomendamos que el presente proyecto de tesis presentada por la
Q.C.B. Yajaira Gabriela Lomas De León sea aceptado como requisito parcial para obtener el grado
académico de:
Maestro en Ciencias
Especialidad en Biotecnología
Comité de tesis:
_____________________________
Cecilia Rojas de Gante, Ph. D.
Asesora
____________________________
Sergio O. Serna Saldívar, Ph. D.
Sinodal
____________________________
Manuel Zertuche Guerra, Ph. D.
Sinodal
Aprobado
______________________________
Federico Viramontes Brown, Ph. D.
Director de Graduados en Ingeniería y Arquitectura.
Mayo 2005
Materiales y Métodos
Capitulo 4.- Materiales y Métodos
4.1.
Recepción de la Leche de Cabra
La leche de cabra fue adquirida en el CAE del ITESM, procedente de ordeñas de marzo a diciembre del
2004 de cabras de la raza nubia. Se recibió en el Laboratorio del Biotecnología del ITESM, envasada en
recipientes de polietileno de alta densidad con capacidad de un galón, con tapa de rosca del mismo
material, el mismo día de la ordeña.
4.2.
Muestreo de la Leche de Cabra para Pruebas de Plataforma
El muestreo se realizó homogenizando el galón de leche por inversión durante 5 min, en seguida se
tomaron 100mL de la leche y el resto se almacenó a 4ºC±1, hasta conocer los resultados de las pruebas
de plataforma.
4.3.
Pruebas de Plataforma
Las pruebas de plataforma indican el estado en el que se encuentra la leche en el momento de la
recepción, es decir, si la leche es apta para su uso o no. Las pruebas más importantes son la
determinación de pH y acidez.
4.3.1. Determinación de pH
La leche normal se comporta como un compuesto anfotérico, lo que significa que se puede comportar
como ácido y como base. Los valores normales de pH en la leche están en un rango entre 6.4 a 6.8; en
casos graves de mastitis el pH puede llegar a un valor de 7.5 y en presencia de calostro puede disminuir
hasta un valor de 6 (Revilla, 1982). Esta determinación se realizó mediante un electrodo de cloruro de
plata del potenciómetro Beckman (Φ50 Meter Beckman Instruments, Fullerton, CA, EUA), previamente
calibrado con buffers de fosfato de pH 4 y 7 .
39
Materiales y Métodos
4.3.2. Determinación de Acidez Titulable
La acidez natural de la leche se encuentra en un rango de 0.15% a 0.18% y va aumentando conforme la
actividad de los microorganismos transforman la lactosa en ácido láctico (Revilla, 1982). La determinación
de acidez se realizó siguiendo el método 947.05 de la A.O.A.C. (1990).
4.4.
Esterilización de la Leche de Cabra
La carga microbiana presente en la leche de cabra se eliminó mediante un tratamiento de esterilización.
Este consistió en someter la leche a un choque térmico. Primeramente se trasvaso la leche de cabra a un
vaso de precipitado de 2L, se realizó un calentamiento directo en una plancha de calentamiento
(Thermolyne Mirak, Iowa), una vez alcanzada la temperatura de 98ºC±2, se mantuvo esta temperatura
durante 4 min, posteriormente se provocó el choque térmico, colocando el vaso de precipitado en un baño
con hielo. Posteriormente se conservó a 4ºC±1 en un refrigerador Fisher Scientific Isotemp 176G-2,
Hayward, CA.
4.5.
Análisis Microbiológicos
Para confirmar que el tratamiento de esterilización al que se sometió la leche de cabra para eliminar una
posible contaminación microbiana, fue efectivo, se realizaron pruebas microbiológicas, específicamente,
se determinaron bacterias coliformes, por la técnica del número más probable, descrita en la NOM – 112 –
SSA1 – 1994. El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ±
1ºC durante 24 a 48 horas, resultando una producción de ácido y gas, el cual se manifiesta en las
campanas de fermentación. La técnica del número más probable, proporciona una estimación estadística
de la densidad microbiana presente, con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento
positivo, disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado.
La técnica del número más probable se realiza en dos etapas. La primer etapa, se denomina pruebas
microbiológicas presuntivas, empleando como medio caldo lactosado (Merck, Lote: VM946861). La
segunda etapa, se denomina pruebas microbiológicas confirmatorias, empleando como medio caldo bilis
verde brillante (Bioxon, Lote: 09E11522).
40
Materiales y Métodos
El procedimiento que se siguió para inocular los tubos con la muestra se describe en la tabla 12. Para
expresar los resultados se siguieron las indicaciones de la NOM – 112 – SSA1 – 1994. Si los resultados son
negativos, la leche puede ser utilizada en la elaboración del queso fresco.
Tabla 12. Pruebas microbiológicas presuntivas y confirmatorias para determinar coliformes.
Serie
Caldo lactosado (mL)
Leche (mL)
Caldo bilis verde brillante (mL)
Leche (mL)
A (3 tubos)
20
10
20
10
B (3 tubos)
10
1.0
10
1.0
C (3 tubos)
10
0.1
10
0.1
Se incuban a 35±1ºC por 24±2 horas, se observa si hay formación de gas, si en ese tiempo no se observa la formación de
gas se prolonga la incubación por 24 horas más. Si hay formación de gas se continúa con las pruebas confirmatorias.
4.6.
Elaboración de Queso Fresco de Leche de Cabra
El suero de leche de cabra, se obtuvo tras la elaboración del queso. Se eligió elaborar queso fresco, para
esto se siguió el proceso general mostrado en la figura 4, el cual se adapto a nivel de laboratorio.
Proceso general de elaboración del queso fresco (Muñoz, 1985):
a) Calentamiento.- La leche se calienta hasta la temperatura óptima de la enzima quimosina (renina; E.C.
3.4.23.4) que se emplee.
b) Adición de cuajo.- Se añade la cantidad de enzima quimosina necesaria para cuajar el volumen de leche
sometido al proceso y se agita suavemente.
c) Coagulación.- Se deja reposar hasta que coagule.
d) Verificación de la firmeza del coagulo formado.- Se verifica la formación de un coagulo firme, para
posteriormente cortarlo.
e) Corte de la cuajada.-. Se corta la cuajada con una lira, de manera que se formen cubos de cuajada.
f)
Sinéresis.- Se deja reposar la cuajada a la misma temperatura de coagulación, para favorecer el
desuerado.
g) Desuerado.- Separa el queso y el suero, drenando la cuajada.
h) Moldeado del queso.- La cuajada se coloca en un molde de acero inoxidable.
i)
Salado del queso.- Se añade sal a la cuajada.
j)
Prensado del queso.- Se prensa la cuajada durante 12-18hrs.
41
Materiales y Métodos
k) Envasado del queso.- Se envasa al vacío.
l)
Almacenamiento.- Se almacena a 4ºC±1 en refrigeración.
La elaboración del queso fresco de leche de cabra, es el paso determinante para la obtención de la
materia prima de esta investigación, el suero de leche de cabra. Por lo tanto, el proceso anteriormente
mencionado, se adaptó a nivel laboratorio.
4.7.
Caracterización del Suero de leche de Cabra.
Para verificar el estado del suero de leche de cabra en el momento de la recolección, es decir, saber si
este es apto o no para su empleo en una fermentación ácido láctica, se determinaron pH, %Acidez total; y
para conocer su composición, en relación a la cantidad de lactosa disponible, grasa y proteínas residuales;
se determinaron Proteínas totales, %Grasa y %Lactosa.
4.7.1. Determinación de pH
Se realizó mediante un electrodo de cloruro de plata del potenciómetro Beckman (Φ50 Meter Beckman
Instruments, Fullerton, CA, EUA), previamente calibrado con buffers de fosfato de pH 4 y 7.
4.7.2. Determinación de Acidez Total
La determinación de acidez se realizó siguiendo el método 947.05 de la A.O.A.C. (1990).
4.7.3. Determinación de Proteínas
La determinación de Proteínas totales de realizó por el Método Kjeldahl, método 930.29 de la A.O.A.C.
(1990).
4.7.4. Determinación de Grasa
La determinación de grasa se realizó por el Método de Gerber, descrito en la NOM -F-387-1982.
4.7.5. Determinación de Lactosa
La determinación de lactosa se realizó por el método 984.15 A.O.A.C. (1990). Se utilizó el kit de
Lactosa/D-galactosa (Boheringer Manheim, Germany), el cual se fundamenta en:
42
Materiales y Métodos
La lactosa se hidroliza en D-glucosa y D-galactosa a pH 6.6 en presencia de la enzima β-galactosidasa en
medio acuoso.
(1) Lactosa + H2O
β-galactosidasa
D-glucosa + D-galactosa
D-galactosa es oxidada a un pH de 8.6 por NAD+ a ácido galacturónico en la presencia de la enzima βgalactosa deshidrogenasa (β-Gal-DH).
(2) D-galactosa + NAD+
ácido galacturónico + NADH + H+
β-Gal-DH
La cantidad de NADH formada en la reacción 2 es estequiométricamente igual a la cantidad de lactosa
presente. El incremento de NADH se midió a 340nm en un espectrofotómetro marca Beckman modelo DU
650, Fullerton, CA.
4.7.6. Rendimiento de Suero de Leche de Cabra
El suero de leche de cabra recolectado, se midió en una probeta, para conocer el volumen de suero
obtenido por litro de leche sometido al proceso de elaboración de queso fresco.
4.8.
Pasteurización del Suero de Leche de Cabra
Para eliminar contaminación microbiana, que pudiera haber adquirido el suero de leche de cabra al
manipularlo, se realizó una pasteurización lenta. Está consistió en someter el suero de leche de cabra a un
calentamiento directo en un plancha de calentamiento (Thermolyne Mirak, Iowa) manteniendo la
temperatura a 70ºC±1 por 30 min, posteriormente se provocó un choque térmico, colocando el recipiente
en un baño con hielo. Se conservó a 4ºC±1 en un refrigerador Fisher Scientific Isotemp 176G-2, Hayward,
CA.
4.9.
Cepas Probióticas
Las cepas probióticas que se seleccionaron para este estudio fueron 2 cepas adquiridas en ATCC:
Bifidobacterium bifidum No. 11863 y Lactobacillus acidophilus No. 4356. Aunque ambas bacterias son
altamente probióticas, existe un particular interés en la cepa de B. bifidum, ya que existen pocos productos
en el mercado que empleen esta bacteria.
43
Materiales y Métodos
Lo anterior se debe a las características de crecimiento de B. bifidum, ya que para su desarrollo requiere
de condiciones de anaerobiosis estrictas, pero a la ves proporciona ventajas como, la utilización de
fuentes de carbono diferentes a lactosa, ya que es una bacteria heterofermentativa, por lo que pueden
emplearse un sin fin de sustratos para su desarrollo. Debido a lo antes mencionado, trabajar con B.
bifidum, confiere una área de extensa de innovación y desarrollo de productos a nivel comercial.
4.9.1. Cálculos para la Determinación de los Parámetros Cinéticos td y µ.
Los parámetros cinéticos calculados en cada cultivo fueron: tiempo de duplicación (td) y velocidad
específica de crecimiento (µ). El td, se refiere al tiempo entre una división y otra de una bacteria. La µ,
indica la velocidad con que se realiza esta división.
El tiempo de duplicación se calculó a partir de la siguiente fórmula:
td = ln 2 = 0.6931
µ
µ
Donde:
td = tiempo de duplicación
µ = velocidad específica de crecimiento
ln = logaritmo natural
La velocidad específica de crecimiento se calculó a partir de la curva de crecimiento microbiano, siguiendo
la formula:
µ = ( log10 D.O. final - log10 D.O. final) 2.303
t final – t inicial
Donde:
µ = velocidad especifica de crecimiento
log10 = logaritmo base 10
DO = densidad óptica
t = tiempo
44
Materiales y Métodos
4.9.2.
Reactivación de Bifidobacterium bifidum ATCC No.11863 y Lactobacillus acidophilus ATCC No. 4356.
Se reactivaron las cepas de B. bifidum y L. acidophilus con la finalidad de activar el metabolismo de cada
bacteria, que al estar en criopreservación se mantienen desactivados.
Se recibieron en el laboratorio de Centro de Biotecnología, dos viales de 1mL congelados de
Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus para su reactivación. El procedimiento se realizó
dentro de la campana de seguridad biológica (Backer modelo 4-TX, Sandford, MA). Los viales se
colocaron en un baño de agua a 37ºC±1, hasta su descongelación; se transfirió el contenido de cada vial
en tubos independientes, que contenía 19mL de medio de cultivo, caldo Man Rogosa Sharpe (MRS, Difco
Lote: 3342214). El volumen final del cultivo fue de 20mL. La incubación se realizó en una incubadora
(Sheldon Manufacturing Inc. Modelo A-141, Cornelius, OR), a 37ºC±1, anaerobiosis total. La anaerobiosis
total se logro creando vació en la incubadora anaeróbica y posteriormente se aplicó nitrógeno (Nitrógeno
comprimido ONU1066 Praxair, Lote 04086493, Grado 4.8). Durante la incubación se registraron los
cambios de densidad óptica (DO) a 660nm respecto al tiempo en un espectrofotómetro Beckman modelo
DU 650, Fullerton, CA. Al iniciar la fase logarítmica, se realizaron recambios sucesivos de los cultivos en el
mismo volumen de medio MRS fresco. Esto se logro traspasando 5% del cultivo a 19mL medio MRS
fresco, esta operación se repitió hasta que se logro una disminución constante en la fase de adaptación o
latencia de cada cultivo (fase lag) y se obtuvo constancia en td y µ, ya que, como se había mencionado,
los cultivos más activos son los caracterizados por una fase de latencia breve, de lo contrario una fase de
latencia larga incrementa el tiempo de procesado, lo cual disminuye su rendimiento a nivel industrial
(Tamime y Robinson, 1991).
Posteriormente se procedió a adaptar los cultivos a un volumen mayor de medio. Se traspaso 5% de los
cultivos a 95mL de medio MRS. El volumen final del cultivo fue de 100mL. Se realizó el mismo
procedimiento que se empleó para los cultivos en 20mL, hasta obtener una fase lag corta, además de
obtener constancia en los parámetros cinéticos.
4.9.3.
Resguardo de Bifidobacterium bifidum ATCC No.11863 y Lactobacillus acidophilus ATCC No. 4356.
Después de haber logrado constancia en los parámetros cinéticos, se procedió a resguardar los cultivos.
Este procedimiento consistió en recuperar las bacterias por centrifugación. Se vertió cada cultivo en tubos
de 50mL estériles, se centrifugaron a 4000rpm durante 20 min, el cultivo de B. bifidum y a 5000rpm
durante 10 min el cultivo de L. acidophilus.
45
Materiales y Métodos
Se utilizó una centrifuga IEC HN-SII (Internacional Equipment Co., Needham Hts., MA, EUA).
Posteriormente se resuspendió el pellet de cada cepa en 50mL de medio de cultivo fresco MRS,
agregando 15% de glicerol (DEQ Lote: G040330-0), como crioprotector. Esta mezcla se homogenizó y se
fraccionó en viales criogénicos de 1mL, congelándose en un ultracongelador Fisher Scientific modelo
1821UA12, Hayward, CA a -86 ± 2ºC.
4.10. Cultivo Madre
Los cultivos madre de cada bacteria se obtuvieron inoculando el suero de leche de cabra pasteurizado con
las cepas. Los recambios en suero de leche de cabra pasteurizado, para adaptar a las bacterias, se llevo a
cabo a una escala de 5, es decir, 5 veces más el volumen anterior de adaptación. En la bibliografía se
sugiere emplear un porcentaje de inóculo en un rango de 3 al 10% del volumen final de fermentación, para
estos recambios se utilizó el 5% de inóculo (Robinson et. al., 2000; Tamime, 1991; Quintero, R.R., 1981).
El procedimiento se realizó dentro de la campana de seguridad biológica (Backer modelo 4-TX, Sandford,
MA), bajo condiciones de esterilidad. Se tomo un vial de cada cepa, se descongelaron en un baño de agua
a 37ºC±1. Se transfirió el contenido del vial a un tubo con 19mL de medio MRS (el volumen final del cultivo
fue de 20mL), se incubó a 37ºC±1, en anaerobiosis total, en una incubadora Sheldon Manufacturing Inc.
Modelo A-141, Cornelius, OR. La anaerobiosis total se logro creando vació en la incubadora anaeróbica y
posteriormente se aplicó nitrógeno (Nitrógeno comprimido ONU1066 Praxair, Lote 04086493, Grado 4.8).
Se incubó hasta que el cultivo alcanzó la fase logarítmica (log). Una vez que alcanzó la fase log, se inoculó
5% del cultivo en 95mL de suero de leche de cabra pasteurizado, se incubó bajo las mismas condiciones,
durante el tiempo en que alcanza la bacteria la fase log. El volumen final del cultivo fue de 100mL. Se
repite esta operación una vez más. Posteriormente, se inocula 5% del cultivo en suero de leche de cabra
en 475mL de suero de leche de cabra pasteurizado, se incubó bajo las mismas condiciones, durante el
tiempo en que alcanza la bacteria la fase log. El volumen final del cultivo fue de 500mL. Los cultivos madre
de ambas cepas, se conservó a 4ºC±1, en un refrigerador Fisher Scientific Isotemp 176G-2, Hayward, CA,
por una semana.
46
Materiales y Métodos
4.10.1. Cuenta en Placa de Unidades Formadoras de Colonias del Cultivo Madre
Se realizó conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) del cultivo madre, siguiendo los
procedimientos descritos en las NOM-092-SSA1-1994 y NOM-110-SSA1-1994.
Como medio de cultivo se utilizó, agar para métodos estándar (Bioxon, Lote: 30J13472); peptona (Difco
Lote: 747667) para diluir la muestra. Se vertió 1mL de muestra de cada dilución en cajas petri estériles, se
añadió el agar para métodos estándar y se mezcló. Se realizó por triplicado cada dilución. Se incubaron a
37ºC±1, en anaerobiosis total, durante 72 hrs. Se leyeron las placas que contenían de 25-250 colonias. Se
contaron las colonias y se multiplicaron por la dilución correspondiente. Posteriormente se preparó un
frotis teñido por la técnica de Gram, seguido de una observación en microscopio (Zeiss Standard 25), con
el objetivo 40X, para la identificación morfológica de las colonias que crecieron en las placas.
4.11. Inóculos de Trabajo
El inoculo de trabajo, es la fracción del cultivo madre con el cual se siembra el tanque de fermentación,
debe contener un número de células viables conocido y estar libre de contaminantes (Varnam, 1995;
Tamime, 1991). Se obtienen al fraccionar el cultivo madre de cada cepa probiótica. Esto se realizó,
fraccionando el cultivo madre en frascos estériles de 100mL. El volumen dependió del porcentaje de
inóculo a emplear en cada fermentación. Los inóculos de trabajo se almacenaron a 4ºC±1 en un
refrigerador Fisher Scientific Isotemp 176G-2, Hayward, CA.
4.12. Fermentaciones Ácido Lácticas en Suero de Leche de Cabra
Para comprobar que el suero de leche de cabra, fue un buen sustrato para el desarrollo de bacterias
probióticas, se realizaron fermentaciones ácido lácticas, mixtas y simples.
Las fermentaciones mixtas contenían las dos bacterias probióticas estudiadas, Bifidobacterium bifidum y
Lactobacillus acidophilus. Las fermentaciones simples, contenían solo una de las bacterias probióticas
estudiadas, Bifidobacterium bifidum ó Lactobacillus acidophilus. En las Tablas 13 y 14, se presentan las
condiciones y variables estudiadas para las fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples.
47
Materiales y Métodos
Tabla 13. Condiciones para las fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples en suero de leche de cabra.
Condiciones de Fermentación
Fermentación Mixta
Fermentación Simple
Fermentación Simple
Bifidobacterium bifidum y
Bifidobacterium
Lactobacillus
Lactobacillus acidophilus
bifidum
acidophilus
Volumen de fermentación (mL)
500
500
500
Temperatura de fermentación (ºC)
42±2
42±2
42±2
Anaerobiosis total (vacio)
Si
Si
Si
Fuente de carbono: solo suero de
leche de cabra.
Si
Si
Si
Tabla 14. Variables para las fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples en suero de leche de cabra.
Variables de Fermentación
Inoculo (%)
Tiempo de fermentación (hrs)
Fuente de carbono alterna: suero
de leche de cabra adicionado con
glucosa.
Fermentación Mixta
Bifidobacterium bifidum y
Lactobacillus acidophilus
Variable (en función de td y µ)
Fermentación Simple
Bifidobacterium bifidum
Fermentación Simple
Lactobacillus acidophilus
Variable (en función de td y µ)
Variable (en función de td y µ)
Variable (≥ 1x108 ufc/mL)
Variable (≥ 1x108 ufc/mL)
Variable (≥ 1x108 ufc/mL)
No
Si
No
Las condiciones para las fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples fueron: anaerobiosis total,
temperatura de incubación y volumen final de fermentación de 500mL.
Uno de los grandes retos en las fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples, fue lograr la obtención de
un producto probiótico utilizando suero de leche de cabra como sustrato, siendo indispensable una
concentración ≥ 1x108 UFC/mL de B. bifidum y L. acidophilus en el producto (Reid et al, 2001); por lo que
se establecieron condiciones de anaerobiosis en atmósfera de nitrógeno durante el proceso de
fermentación, para el mantenimiento y desarrollo de principalmente de B. bifidum, ya que es una bacteria
anaerobia estricta, a diferencia de L. acidophilus que es anaerobias facultativas (Robinson et al, 2000).
Las temperaturas óptimas de crecimiento reportadas para B. bifidum es de 37–41ºC y para L. acidophilus
es de 37-45°C (Robinson et al, 2000).Por lo tanto, la temperatura de fermentación se fijó en 42 ± 1°C. Ya
que a esta temperatura se puede lograr el crecimiento de ambas bacterias.
48
Materiales y Métodos
Únicamente para las fermentaciones mixtas y simples con L. acidophilus, tenían como condición emplear
para la fermentación suero de leche de cabra pasteurizado, sin la adición de otra fuente de carbono, ya
que esta bacteria es homofermentativa, es decir, utiliza la lactosa como única fuente de carbono.
Las variables evaluadas en las fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples fueron: el tamaño del
inóculo (porcentaje V/V con respecto al volumen total de fermentación) y el tiempo de fermentación. El
primero, estuvo en función de los parámetros cinéticos evaluados durante la reactivación de las cepas (td
y µ) y de la concentración de bacterias viables de los cultivos madre.
El segundo, fue el indicador para conocer el tiempo en que las bacterias crecieron y alcanzaron la
concentración mínima para considerar como probiótico el suero de leche de cabra. La duración del
proceso de fermentación se trató de optimizar en un estimado de 6 horas como máximo, ya que procesos
largos no son considerados rentables a nivel industrial.
Ya que B. bifidum es una bacteria heterofementativa, por lo tanto, tiene la capacidad de metabolizar
diferentes azucares como fuente de carbono (Leveau y Bouix, 2000), la variable que se probo en las
fermentaciones ácido lácticas simples con esta bacteria, fue la adición de otra fuente carbono. Se empleó
glucosa, como fuente de carbono adicional.
4.12.1. Fermentaciones Ácido Lácticas Mixtas
Las fermentaciones mixtas contenían las dos bacterias probióticas estudiadas, Bifidobacterium bifidum y
Lactobacillus acidophilus, siguiéndose las condiciones y variables presentadas en las Tablas 13 y 14
respectivamente.
El procedimiento de inoculación se realizó dentro de la campana de seguridad biológica (Backer modelo 4TX, Sandford, MA). La fermentación se llevo a cabo en una incubadora anaeróbica (Sheldon
Manufacturing Inc. Modelo A-141, Cornelius, OR), la anaerobiosis total se logró creando vacío en la
incubadora anaeróbica e introduciendo nitrógeno a la misma posteriormente (Nitrógeno comprimido
ONU1066 Praxair, Lote 04086493, Grado 4.8). Se tomaron muestras cada 1.5 horas durante 7.5 horas,
para determinar las cinéticas de pH, Consumo de Lactosa, Formación de Ácidos Orgánicos (% ácido
láctico) y Unidades Formadoras de Colonias por mililitro de producto de fermentación.
49
Materiales y Métodos
Para determinar las primeras tres cinéticas, se siguieron los procedimientos descritos en el apartado 4.7.
En este primer trabajo es importante dar seguimiento detallado a la evolución de las unidades formadoras
de colonias (UFC) durante el proceso de fermentación. El conteo de UFC se realizó, siguiendo las NOM092-SSA1-1994 y NOM-110-SSA1-1994. Para las fermentaciones mixtas se utilizaron como medios de
cultivo, medio Columbia Base Agar (CBA, Oxoid Lote: CH-B-12954504) suplementado con L-císteina
(Sigma Lote: 95F-0615), Lactosa (Productos Químicos Monterrey, Lote: 23-19), Cloruro de litio y
Propionato de sodio (Reuter et. al., 2002; Nebra y Blanch, 1999; Dave y Shah, 1996; Lim et. al., 1995; Lim
et. al., 1993) y Agar para métodos estándar (Bioxon, Lote: 30J13472).
El medio CBA es un medio selectivo para el crecimiento de Bifidobacterium bifidum, en el agar para
métodos estándar crecen ambas bacterias. La incubación se realizó en una incubadora anaeróbica
(Sheldon Manufacturing Inc. Modelo A-141, Cornelius, OR), a 37ºC±1, anaerobiosis total, durante 72 hrs.
La anaerobiosis total se logro creando vacio primeramente, seguido de aplicación de nitrógeno gaseoso
(Nitrógeno comprimido ONU1066 Praxair, Lote 04086493, Grado 4.8).
El conteo de Lactobacillus acidophilus, se realizó por sustracción de las colonias que crecieron en agar
para métodos estándar menos las colonias de Bifidobacterium bifidum que crecieron en el medio CBA.
Posteriormente se preparó un frotis teñido por la técnica de Gram, seguido de una observación en
microscopio (Zeiss Standard 25), con el objetivo 40X, para la identificación morfológica de las colonias que
crecieron en las placas.
4.12.1.1. Caracterización del Producto Final de Fermentación
Se evaluaron 4 parámetros en el producto final: Lactosa remanente, pH, Acidez desarrollada y UFC/mL de
producto de fermentación; siguiendo los procedimientos descritos en el apartado 4.7. El producto
fermentado se almacenó a 4ºC±1 en un refrigerador Fisher Scientific Isotemp 176G-2, Hayward, CA.
4.12.2. Fermentaciones Ácido Lácticas Simples con Bifidobacterium bifidum.
Para las fermentaciones simples con Bifidobacterium bifidum, se siguieron las condiciones y variables
presentadas en las tablas 13 y 14 respectivamente. Se realizaron fermentaciones en suero de leche de
cabra pasteurizado y en suero de leche de cabra pasteurizado suplementado con 2% de glucosa; para
facilitar la comprensión de esta variable se les designo como fermentaciones simples tipo 1 y 2.
50
Materiales y Métodos
Se realizaron los mismos procedimientos descritos en el apartado 4.12.1., para la incubación, muestreo y
determinación de las cinéticas de pH, Consumo de Lactosa y Desarrollo de Acidez, para ambas
fermentaciones. El conteo de UFC se realizó, siguiendo las NOM-092-SSA1-1994 y NOM-110-SSA1-1994.
Se utilizó como medio de cultivo agar para métodos estándar (Bioxon, Lote: 30J13472). La incubación se
realizó en una incubadora anaeróbica (Sheldon Manufacturing Inc. Modelo A-141, Cornelius, OR), a
37ºC±1, anaerobiosis total, durante 72 hrs. Posteriormente se preparó un frotis teñido por la técnica de
Gram, seguido de una observación en microscopio (Zeiss Standard 25), con el objetivo 40X, para la
identificación morfológica de las colonias que crecieron en las placas. La caracterización del producto final
de fermentación se realizó de la misma manera que en las fermentaciones mixtas.
4.12.3. Fermentaciones Ácido Lácticas Simples con Lactobacillus acidophilus.
Para las fermentaciones simples con Lactobacillus acidophilus, se siguieron las condiciones y variables
presentadas en las tablas 13 y 14 respectivamente. Se realizaron los mismos procedimientos descritos en
el apartado 4.12.1., para la incubación, muestreo y determinación de las cinéticas de pH, Consumo de
Lactosa, Desarrollo de Acidez, UFC/mL de producto fermentado y caracterización del producto final de
fermentación.
4.13. Análisis Estadístico entre Tratamientos de Fermentaciones Ácido Lácticas Mixtas y Simples.
Como ya se mencionó, para comprobar las hipótesis planteadas, se realizaron fermentaciones ácido
lácticas mixtas y simples. Las fermentaciones mixtas contenían las dos bacterias probióticas estudiadas,
Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus. Las fermentaciones simples, contenían solo una de las
bacterias como, B. bifidum ó L. acidophilus. Tanto para las fermentaciones mixtas como en las simples, se
realizaron cuenta en placa de UFC. Las diferencias encontradas en las medias del conteo de UFC
obtenidas en las fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples, fueron analizadas estadísticamente
mediante el programa MINITAB Release 14. Se realizaron pruebas de hipótesis entre las medias con
varianzas desconocidas, mediante la prueba t de dos poblaciones.
51
Materiales y Métodos
La prueba t, proporciona dos indicadores para rechazar o aceptar la hipótesis nula, el valor p y el grafico
de intervalos. Las medias comparadas fueron:
•
Las medias de ufc de B. bifidum y L. acidophilus, obtenidas en fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples.
•
Las medias de ufc de B. bifidum, obtenidas en dos tipos de fermentaciones ácido lácticas simples con diferente
fuente de carbono.
52
Resultados y Discusión
Capítulo 5.- Resultados y Discusión
5.1. Pruebas de Plataforma de la Leche de Cabra
Se realizaron 9 determinaciones independientes por triplicado tanto de pH como de % acidez total. El valor
de pH promedio de la leche de cabra del CAE fue de 6.66±0.047, este valor se encuentra dentro del rango
de valores reportados en la literatura para la leche de cabra, que es de 6.4 – 6.8. Valores altos de pH
indican afecciones mamarias en las cabras (pH=7.5) y en presencia de calostro puede disminuir hasta un
valor de 6, en ambos casos la leche es rechazada (Revilla, 1986).
El valor promedio de acidez total de la leche de cabra del CAE fue de 0.15%±0.010 de ácido láctico, este
valor se encuentra en el límite inferior del rango de valores reportados en la literatura como aceptables
para la leche de cabra, que es de 0.15 % – 0.18%. Valores menores a 0.15% nos indicaría que las cabras
pueden padecer mastitis. Debido a lo anterior y al valor obtenido, se le cuestiono al encargado del CAE, el
estado de salud del hato, a lo que respondieron que ningún animal presentaba afecciones mamarias. La
leche es rechazada al obtener valores superiores a 0.18%, ya que son indicador de contaminación
microbiana (Revilla, 1986).
En la tabla 15, se resumen los resultados obtenidos en las pruebas de plataforma realizadas a la leche de
cabra.
Tabla 15. Pruebas de plataforma realizadas a la leche de cabra.
Pruebas de plataforma
Promedio1
Desviación estándar
pH
6.66
0.047
Acidez total (% de Ácido láctico)
0.15
0.010
1) Promedio de 9 determinaciones independientes realizadas por triplicado
Los valores de pH y % de acidez total obtenidos durante las pruebas de plataforma, indican que la leche
de la que se parte para la obtención de la materia prima en esta investigación, es leche fresca, en
excelente estado.
53
Resultados y Discusión
5.2. Esterilización de la Leche de Cabra
La leche de cabra fue esterilizada a 98ºC±2 durante 4 minutos y posteriormente fue enfriada provocando
un choque térmico, colocando el recipiente en un baño con hielo. En la figura 8, se presentan fotografías
del proceso de esterilización a nivel laboratorio de la leche de cabra.
A. Tratamiento térmico de la leche de cabra.
B. Choque térmico.
Figura 8. Proceso de esterilización a nivel laboratorio de la leche de cabra.
5.3. Análisis Microbiológicos.
Se comprobó la efectividad del tratamiento térmico al que se sometió la leche de cabra, ya que se realizó
la determinación de bacterias coliformes, por la técnica del número más probable. La técnica del número
más probable, proporciona una estimación estadística de la densidad microbiana presente, con base a que
la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo, disminuye conforme es menor el volumen de
muestra inoculado. El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a
35ºC±1 durante 24 a 48 hrs, resultando una producción de ácido y gas, lo cual se manifiesta en las
campanas de fermentación.
Se realizaron 6 determinaciones independientes por triplicado, en las cuales no se observó formación de
gas en ninguna dilución del análisis presuntivo, por lo tanto, no fue necesario utilizar el análisis
confirmativo. Para expresar los resultados obtenidos, se tomó como referencia la tabla de resultados de la
técnica, presentada en la NOM – 112 – SSA1 – 1994.
54
Resultados y Discusión
El resultado para coliformes totales fue de <0.03 NMP/gramo de muestra. Los resultados obtenidos fueron
negativos, para la presencia de coliformes totales, por lo tanto, la leche de cabra pudo ser empleada en la
elaboración del queso fresco (Tabla 16).
Tabla 16. Prueba de coliformes totales de la leche de cabra esterilizada.
Caldo lactosado (mL)
Leche (mL)
Tubos positivos
Índice del NMP/gr de muestra
A (3 tubos)
20
10
0
< 0.03
B (3 tubos)
10
1.0
0
< 0.03
C (3 tubos)
10
0.1
0
< 0.03
Serie
Determinaciones realizadas en 6 eventos independientes por triplicado.
5.4. Elaboración de Queso Fresco de Leche de Cabra
Para poder contar con el suero de leche de cabra, se tuvo que obtener y estandarizar el proceso de
elaboración de queso fresco a nivel laboratorio, partiendo del proceso general de elaboración del mismo,
cuyo diagrama de flujo se presenta en la figura 4. Se estandarizaron las condiciones del proceso general
a nivel de laboratorio, elaborando queso fresco en 9 eventos independientes por duplicado.
Se utilizó una renina (enzima microbiana), con una fuerza de 1:30000 según el proveedor Lactilab de
México, S.A. de C.V. Esta fuerza de 1:30000, indica que un mililitro de enzima, es suficiente para cuajar
30000 mililitros de leche. Tomando como base de cálculo 1000mL de leche, se calculó el uso de 0.033mL
o 33µL de enzima, para lograr cuajar la leche. El proveedor de la enzima recomienda que esta, se diluya
en un pequeño volumen de agua destilada fría, con la finalidad de que la cantidad de enzima requerida
pueda disolverse completamente posteriormente en la leche. Se preparó una solución de 33µL/mL, en un
volumen final de 25mL. En un matraz de aforación de 25mL, se diluyeron 825µL en 25mL de agua, se
conservó a 4ºC±1. Un mililitro de esta dilución cuajará 1L de leche.
Los pasos del proceso de elaboración del queso fresco que se estandarizaron a nivel laboratorio, fueron
los siguientes:
• Calentamiento.- La leche de cabra estéril, se vertió en un vaso de precipitado de 2L, se calentó a la
temperatura óptima de la enzima microbiana renina, en un baño de agua (Fisher Scientific Isotemp
Waterbath 228).
55
Resultados y Discusión
El rango de temperatura de la enzima microbiana renina era de 35-45ºC. La temperatura a la que se
elevó la leche de cabra estéril, fue a 38ºC±2.
• Adición de cuajo.- Se añadió 1mL de dilución de la enzima (33µL de enzima /mL de agua destilada
fría), por cada litro de leche sometido a la elaboración de queso fresco. Se agitó lentamente.
• Coagulación.- Se dejó reposar hasta que cuajó la leche a la temperatura óptima de acción de la
renina. Se obtuvo menor tiempo de coagulación a una temperatura de 38ºC.
• Verificación de la firmeza del coagulo formado.- Se verificó introduciendo una espátula en el coagulo.
Si la espátula salía limpia, sin fragmentos de cuajada en ella, era indicio de un coagulo firme, listo
para ser cortado. El tiempo de coagulación óptimo a una temperatura de 38ºC±2 con esa fuerza de
cuajo fue de 45min±2.
• Corte de la cuajada.-. Con la misma espátula se cortó la cuajada de manera que se formaran cubos
de la misma.
• Sinéresis.- Se dejó reposar la cuajada a la misma temperatura de coagulación, para favorecer el
desuerado durante 30 min.
• Desuerado.- Para separar la cuajada y el suero, se empleó manta. Las mantas se sanitizaron
previamente a su uso, remojándolas en solución acuosa con cloro al 0.5% por 45min. La cuajada se
vertió sobre la manta y se recuperó en un recipiente de vidrio, el suero que se filtró a través de ella,
sin necesidad de presionar la cuajada.
• Recuperación del suero.- El suero recuperado se vertió en un frasco estéril.
• Moldeado del queso.- La cuajada se colocó en un molde de acero inoxidable.
• Salado del queso.- Se añadió 2% de sal a la cuajada y se incorporó masajeando.
• Prensado del queso.- Se prensó la cuajada durante 12-18hrs, empleando pesas de 1kg. en
refrigeración a 4ºC±1.
• Envasado del queso.- Se envasaron al vacio en envases de plástico.
• Almacenamiento.- Se almacenaron a 4ºC±1 en refrigeración.
Ya estandarizado el proceso, se obtuvieron 18 quesos frescos con un peso promedio de 280gr±0.577. Las
características de los quesos obtenidos, fueron: quesos blandos, color blanco, olor agradable, pero sin olor
característico a cabra.
56
Resultados y Discusión
El volumen promedio de suero de leche de cabra obtenido fue de 400mL±0.667 por litro de leche
empleado. Las características del suero de leche de cabra obtenido, fueron: color amarillo verdoso, turbio,
contenía pequeñas partículas en suspensión, olor agradable, pero no tenía olor característico a cabra.
Teóricamente de cada litro de leche empleada en la elaboración de queso, 900mL es suero de leche de
cabra y se obtendrá un queso de 100gr aproximadamente (García Garibay et. al., 2002).
En este proceso se recolectó el 45% de la cantidad total de suero, que teóricamente se debería obtener,
esto se debió a que, al verter la cuajada sobre la manta, únicamente se recupero el suero que se filtró
sobre la manta, sin necesidad de presionar la cuajada; este paso se realizaba de esta manera, ya que se
pretendía evitar que fragmentos de la cuajada, se filtraran en el suero, ya que el objetivo fue tener un
suero lo más límpido posible, que no tuviera que pasar por varias manipulaciones donde pudiera haber
riesgos microbiológicos. El resto de suero de leche de cabra, se quedó atrapado en la cuajada y se
eliminaba durante las etapas de moldeado y prensado.
En cuanto al peso de los quesos frescos de leche de cabra elaborados, se obtuvieron quesos con un peso
180% más, en relación al peso teórico. Esto se debe a que, faltó prensar más los quesos y estos
quedaron con mayor humedad final.
En la figura 9, se presenta el diagrama de flujo con las condiciones del proceso estandarizado para la
elaboración de queso fresco de leche de cabra a nivel de laboratorio. En la figura 10, se presentan
fotografías del proceso de elaboración del queso fresco de leche de cabra a nivel de laboratorio. En la
figura 11, se presenta una fotografía del queso fresco de leche de cabra elaborado durante la
investigación.
Por lo tanto, nosotros obtuvimos mayor rendimiento quesero pero menos rendimiento de suero (50%
menor). Mediante la estandarización del proceso de elaboración de queso fresco de leche de cabra a nivel
de laboratorio, se obtuvo la materia prima de nuestro estudio, el suero de leche de cabra, para emplearlo
como sustrato en las fermentaciones ácido lácticas con Bifidobacterium bifidum y/o Lactobacillus
acidophilus.
57
Resultados y Discusión
Leche de cabra esterilizada
Calentamiento
Temperatura: 38ºC± 2
Adición de cuajo microbiano
Cantidad de cuajo: 1mL dil 1:30
Coagulación
Temperatura de coagulación: 38ºC± 2
Corte de la cuajada
Tiempo de coagulación: 45 ± 2 min.
Desuerado
Recuperación del
Suero de leche de cabra
Moldeado de la cuajada
Salado del queso
2% de sal
Prensado
En refreigeración a 4ºC±1 durante 12-18hrs.
Envasado del queso
En envases flexibles para vacio
Almacenamiento a 4ºC±1
Figura 9. Diagrama de flujo del proceso estandarizado para la elaboración de queso fresco de leche de
cabra a nivel laboratorio.
58
Resultados y Discusión
A. Calentamiento de la leche de cabra esterilizada a 38ºC±2.
B. Adición de cuajo microbiano.
C. Coagulación a 38ºC±2 por 45min±2.
D. Corte de la cuajada.
E. Desuerado.
F. Moldeado y Prensado de la cuajada.
G. Suero de Leche de Cabra recuperado.
Figura 10. Proceso de elaboración del queso fresco de leche de cabra a nivel de laboratorio.
59
Resultados y Discusión
Figura 11. Queso fresco de leche de cabra elaborado durante la investigación.
5.5. Caracterización del Suero de Leche de Cabra.
No se observaron diferencias significativas entre los valores promedio obtenidos en la composición del
suero de leche de cabra en comparación con los reportados para suero de leche de vaca (Tabla 17 y 18).
Se observó que los valores promedio de pH, grasa y lactosa del suero de leche de cabra, fueron similares
a los valores reportados para el suero de leche de vaca.
Tabla 17. Caracterización de suero de leche de cabra.
Parámetro
Promedio
pH1
Acidez total1 (% de ácido láctico)
Proteínas2 (%)
Grasa2 (%)
Lactosa2 (%)
Rendimiento de suero1 (%)
Desviación estándar
6.47
0.07
0.55
0.67
4.4
0.060
0.007
0.021
0.068
0.085
45
0.667
1) Promedio de 9 determinaciones independientes realizadas por triplicado.
2) Promedio de 6 determinaciones independientes realizadas por triplicado.
Tabla 18. Comparación entre valores obtenidos de suero de leche de cabra Vs. valores reportados para el suero de leche de vaca.
Valores experimentales promedio
Parámetro
Valores reportados para
obtenidos en suero de leche de cabra
suero de leche de vaca
pH
Acidez total (% de ácido láctico)
Proteínas (%)
Grasa (%)
Lactosa (%)
Rendimiento de suero (%)
6.47
0.07
0.55
0.67
4.4
6.4(1)
0.2(2)
0.8 – 1.0(1)
0.2 – 0.7(1)
4.5 – 5.0(1)
45
90(2)
1) Fuente: Madrid, 1990. Valores reportados para suero de leche de vaca.
2) Fuente: García-Quintero, 2002. Valor reportado para suero de leche de vaca.
60
Resultados y Discusión
5.5.1. Determinación de pH.
El suero de leche de cabra tuvo un valor de pH promedio de 6.47±0.060. Este valor es casi idéntico al
reportado en la literatura para el suero de leche de vaca de 6.4 (Madrid, 1990).
5.5.2. Determinación de Acidez Titulable.
La literatura reporta valores de acidez para el suero de leche de vaca de 0.2% de ácido láctico (GarcíaQuintero, 2002); el valor promedio obtenido de acidez total para el suero de leche de cabra fue de
0.07%±0.007 de ácido láctico. Este valor obtenido en el suero de leche de cabra fue 65% menor al
reportado para suero de leche de cabra, esto se puede deber al tipo de tratamiento térmico empleado para
eliminar posible carga microbiana, ya que las proteínas séricas que le confieren acidez natural al suero,
son degradadas a altas temperaturas (≥70ºC). Por lo tanto, se desconoce el tratamiento que pudo haber
recibido el suero de leche de vaca con un valor de 0.2% de ácido láctico. Comparando este valor de
acidez del suero de leche de cabra con la acidez natural de la leche de 0.15 - 0.18% de ácido láctico, la
cual proviene de las proteínas y/o péptidos presentes, este valor fue 42% menor al de la leche, esto se
debe a que el 75% de las proteínas totales de la leche de cabra junto con la grasa, son retenidas en la
cuajada durante la elaboración del queso fresco, por lo tanto en el suero de leche de cabra, queda un
porcentaje mínimo de proteínas que le proporcionen acidez natural.
5.5.3. Determinación de Proteínas.
Se realizaron 6 determinaciones independientes por triplicado. El porcentaje promedio de proteínas
obtenido en el suero de leche de cabra fue de 0.55%±0.021, 61% menor al rango reportado en la literatura
de 0.8 – 1.0% (Madrid, 1990). La fracción proteica del suero de leche esta compuesta por las proteínas
solubles, que son la lactoalbúmina y la lactoglobulina; estas proteínas solubles son muy sensibles al
incremento de la temperatura, se desnaturalizan a temperaturas superiores a 70ºC (Badui, 1999). La
disminución esta fracción proteica en el suero de leche de cabra, pudo haberse debido a los diferentes
tratamientos térmicos (esterilización de la leche a 98ºC±2 durante 4 min; calentamiento de la leche a
38ºC±2 por 45min±2 en la coagulación) que se emplearon para la eliminación de contaminación
microbiana, ya que estas pueden estar atrapadas en el queso o las altas temperaturas pueden causar
desestabilización y floculación de las proteínas solubles.
61
Resultados y Discusión
5.5.4. Determinación de Grasa.
Se obtuvo un porcentaje promedio de grasa en el suero obtenido, de 0.67%±0.068. El valor obtenido esta
dentro del rango reportado en la literatura para suero de leche de vaca de 0.2 – 0.7% (Madrid, 1990). En
general, estos valores de porcentaje de grasa son pequeños, debido a que la mayor cantidad de grasa
presente en la leche, junto con las caseínas, son retenidas en la cuajada durante la elaboración del queso
fresco.
5.5.5. Determinación de Lactosa.
La cantidad de lactosa presente en el suero de leche de cabra fue de 4.4%, los valores reportados para el
lactosuero de leche de vaca es de 4.5 – 5% (Madrid, 1990). El valor obtenido en el suero de leche de
cabra es 0.1% menor al reportado. La FAO (1999), reporta valores de lactosa de 4.27% para la leche de
cabra y de 4.9% para la leche de vaca. Los valores de lactosa de la leche y suero de leche de cabra son
similares, difieren en 0.13%, lo que indica que este componente soluble en la leche es conservado
prácticamente completo en el suero. Este valor también indica indirectamente un excelente control
microbiológico, ya que el contenido de lactosa no ha sido utilizado aún por microorganismos.
5.5.6. Rendimiento de Suero de Leche de Cabra.
Se reportó en el apartado 5.4.
5.6.
Pasteurización del Suero de Leche de Cabra
Una vez obtenido el suero de leche de cabra, se pasteurizó a una temperatura de 70ºC±1 durante 30 min,
provocando un choque térmico, colocando el recipiente en un baño con hielo, transcurrido este tiempo. Se
conservó a 4ºC±1 en refrigeración. Para evitar cualquier contaminación del suero de leche de cabra
posterior a la pasteurización, el recipiente que se utilizó para este procedimiento fue un matraz erlenmeyer
de 2L, al cual se le adapto un tapón con un orificio para introducir un termómetro y poder monitorear la
temperatura. En la figura 12, se presentan fotografías de dicho tratamiento.
62
Resultados y Discusión
A. Calentamiento del suero de leche de cabra.
B. Monitoreo de la temperatura durante la Pasteurización
del suero de leche de cabra.
Figura 12. Pasteurización del suero de leche de cabra.
5.7. Cepas Probióticas
5.7.1. Reactivación de Bifidobacterium bifidum ATCC No.11863
Se realizó una curva de crecimiento de Bifidobacterium bifidum ATCC No.11863, en la cual la bacteria
mostró una fase lag o de adaptación al medio de 28 horas (Figura 13). A partir de esta curva de
crecimiento realizada inicialmente, se calcularon los parámetros cinéticos td y µ (Tabla 19). Para disminuir
el tiempo de adaptación de la bacteria al medio y que esta, alcance la fase logarítmica en un tiempo
menor, se realizaron recambios sucesivos del cultivo en medio. Se realizaron un total de 18 recambios en
medio MRS fresco, 13 en un volumen final de 20mL de medio MRS y 5 en un volumen final de 100mL de
medio MRS.
Este tipo de trabajo microbiológico es esencial en cualquier planta industrial, para eficientizar tiempos de
proceso y contar con su propio material biológico.
Posteriormente a los recambios del cultivo en medio MRS fresco, se realizó una curva de crecimiento de
Bifidobacterium bifidum ATCC No.11863 adaptada (Figura 13), en la cual la bacteria mostró una fase lag
corta, de 1 hora, prácticamente la bacteria inicia en la fase logarítmica.
63
Resultados y Discusión
Esta fase lag obtenida, favorece la fermentación ácido láctica, ya que, la bacteria al alcanzar la fase
exponencial iniciará rápidamente su duplicación. A partir de esta curva de crecimiento adaptada, se
calcularon los parámetros cinéticos td y µ (Tabla 19).
1.4
B. bifidum inicial
D.O. a 660nm
1.2
B. bifidum adaptada
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
Tiempo (hrs)
Figura 13. Curvas de crecimiento de Bifidobacterium bifidum ATCC No.11863.
Tabla 19. Parámetros cinéticos obtenidos para B. bifidum ATCC No.11863.
1
Bacteria
td (hrs)1
µ (hrs- )1
4.31
1.79
B. bifidum ATCC No. 11863 no adaptada
B. bifidum ATCC No. 11863 adaptada
0.16
0.39
(1) Promedio de 6 determinaciones independientes.
Tras los recambios del cultivo en medio fresco, se logro una disminución del tiempo de duplicación (td) en
un 58.5% y un aumento en la velocidad de crecimiento (µ) en un 143.75%. Esta disminución en td y
aumento en µ, implicaría durante la fermentación ácido láctica, que la bacteria se pueda dividir en menor
tiempo y a mayor velocidad, lo que beneficiaría, obteniendo mayor cantidad de bacterias y productos de
fermentación en menos tiempo y por lo tanto la fermentación se eficientizaría.
64
Resultados y Discusión
5.7.2. Lactobacillus acidophilus ATCC No. 4356
La curva de crecimiento de Lactobacillus acidophilus, mostró una fase lag de 4 horas (Figura 14)
inicialmente. Los resultados de los parámetros cinéticos se presentan en la tabla 20. Se realizaron
recambios sucesivos del cultivo en medio MRS fresco, con la finalidad de disminuir la fase lag de L.
acidophilus y que alcance la fase logarítmica en un tiempo menor. Se realizaron un total de 16 recambios
en medio MRS fresco, 11 en un volumen final de 20mL de medio MRS y 5 en un volumen final de 100mL
de medio MRS. Posteriormente a los recambios del cultivo en medio MRS fresco, se realizó una curva de
crecimiento de Lactobacillus acidophilus ATCC No. 4356 adaptada (Figura 14), en la cual la bacteria
mostró una fase lag de 2.16 hrs. Esta fase lag obtenida, favorece la fermentación ácido láctica, ya que, la
bacteria al alcanzar la fase exponencial iniciará rápidamente su duplicación.
1.4
D.O. a 660 nm.
1.2
1.0
0.8
0.6
LAC inicial
0.4
LAC adaptada
0.2
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12 13
14 15
Tiempo (hrs)
Figura 14. Curvas de crecimiento de Lactobacillus acidophilus ATCC No. 4356.
Tabla 20. Parámetros cinéticos obtenidos para L. acidophilus ATCC No. 4356.
Bacteria
td (hrs)1
µ (hrs 1)1
L. acidophilus ATCC No. 4356 no adaptada
3.28
0.21
L. acidophilus ATCC No. 4356 adaptada
1.95
0.36
(1) Promedio de 6 determinaciones independientes.
65
-
Resultados y Discusión
Los resultados de los parámetros cinéticos de la curva de crecimiento adaptada, se presentan en la tabla
20. Se logro una disminución del td en un 40.55% y un aumento en µ en un 71.4%, después de los
recambios del cultivo en medio fresco. Esta disminución en td y aumento en µ, implicaría durante la
fermentación ácido láctica, que la bacteria se pueda dividir en menor tiempo y a mayor velocidad, lo que
beneficiaría, mayor cantidad de bacterias y se obtendrían los productos de fermentación en menos tiempo
y por lo tanto la fermentación se eficientizaría.
5.8. Cultivo Madre
Se obtuvieron los cultivos madre de ambas cepas probióticas, siguiendo el procedimiento del apartado
4.10. Debido a la turbidez del suero de leche de cabra, no fue posible monitorear las DO durante la
incubación de los cultivos madre, por lo tanto, se asumió que las cepas probióticas, tendrían un
comportamiento similar en cuanto a su comportamiento y parámetros cinéticos, como los obtenidos en
medio MRS.
5.8.1. Cuenta en Placa de las Unidades Formadoras de Colonias en el Cultivo Madre
Los resultados del conteo de ufc de los cultivos madre de Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus
acidophilus, se presentan en la tabla 21.
Tabla 21. Cuenta en placa de UFC en los cultivos madre de B. bifidum y L. acidophilus usados para
fermentar suero de leche de cabra.
Cepa
B. bifidum ATCC No. 11863
Promedio ufc por placa1
82±3
Concentración (ufc/mL)
8.2 x 107
L. acidophilus ATCC No. 4356
26±5
2.6 x 108
(1) Promedio de 3 eventos independientes por triplicado.
Se realizó el conteo en placa en 3 eventos independientes por triplicado, para los cultivos madre de ambas
bacterias probióticas. En el cultivo madre de B. bifidum, contenía una población de 8.2 x 107 ufc/mL y 2.6 x
108 ufc/mL de L. acidophilus.
La bibliografía sugiere, el empleo de un porcentaje de inóculo del 3 al 10% del volumen total de
fermentación (Robinson et. al., 2000; Quintero, 1981).
66
Resultados y Discusión
Teóricamente los cultivos madre óptimos se caracterizan por una fase de latencia breve seguida de una
tasa de producción de ácido. Además el tamaño de inóculo en una fermentación con probióticos puede ser
de un 10-20% y debe contener más de 107 UFC/mL (Robinson et. al., 2000; Varnam, 1995; Tamime, 1991;
Quintero, R.R., 1981).
En esta investigación, se calculó el tamaño de inóculo (%V/V con respecto al volumen total de
fermentación) que se utilizaría en las fermentaciones en función de los parámetros cinéticos evaluados
durante la reactivación de las cepas (td y µ) y de la concentración de bacterias viables de los cultivos
madre. Además si se toma en cuenta los pH óptimos de cada cepa, la primer bacteria que empezaría a
desarrollarse rápidamente seria B. bifidum (pH óptimo de crecimiento 6.6 – 7), ya que el pH del medio es
cercano al óptimo de esta bacteria (pH inicial del suero de leche de cabra pasteurizado fue de 6.3), a un
tiempo de duplicación de 1.79 hrs y a una velocidad de 0.39 hrs-1. Una vez que los productos del
metabolismo de los carbohidratos de B. bifidum disminuyeron el pH del medio, L. acidophilus iniciaría su
crecimiento (pH óptimo de crecimiento 5.4 – 5.8), con un tiempo de duplicación de 1.95 hrs y a una
velocidad de 0.36 hrs-1. Por lo anterior, se decidió que las fermentaciones iniciarán con una concentración
de 1 x 107 UFC/mL de suero de leche de cabra en un volumen final de 500mL.
Se calculó el tamaño de inoculo (%) necesario para que las fermentaciones iniciarán con una
concentración de 1 x 107 UFC/mL de suero de leche de cabra. El cultivo madre de B. bifidum, contenía 8.2
x 107 UFC/mL, se calculó que con 60mL, la fermentación iniciaría con 1 x 107 UFC de B. bifidum/mL de
suero de leche de cabra, en un volumen final de 500mL, este volumen corresponde al 12% del volumen
total de sustrato a fermentar.
El cultivo madre de L. acidophilus, contenía 2.6 x 108 UFC /mL, se calculó que con 44mL, la fermentación
iniciaría con 1 x 107 UFC de L. acidophilus /mL de suero de leche de cabra, en un volumen final de 500mL,
este volumen corresponde al 9% del volumen total de sustrato a fermentar.
Por lo tanto, los tamaños de inoculo empleados para las fermentaciones ácido lácticas con B. bifidum y L.
acidophilus, fueron 12% y 9% respectivamente, del volumen total de sustrato a fermentar.
67
Resultados y Discusión
5.9. Inóculos de trabajo
Los inóculos de trabajo se obtuvieron fraccionando el cultivo madre de cada bacteria probiótica, en frascos
estériles de 100mL. Debido a que, el volumen en que se fraccionaron cada cultivo madre, dependía del
porcentaje de inóculo a emplear en la fermentación, los inóculos de trabajo de B. bifidum, se fraccionaron
en volúmenes de 70mL, ya que por fermentación se requerirían 60mL de inoculo; para L. acidophilus se
fraccionaron en volúmenes de 50mL, ya que por fermentación se requerirían 44mL de inoculo. Los
inóculos de trabajo se almacenaron a 4ºC±1.
5.10. Fermentaciones Ácido Lácticas en Suero de Leche de Cabra
En las tablas 13 y 14, se presentan las condiciones y variables para las fermentaciones ácido lácticas
mixtas y simples.
5.10.1. Fermentaciones Ácido Lácticas Mixtas
Se inoculo con 12% de B. bifidum y 9% de L. acidophilus, para que la fermentación iniciara con 1x107
bacterias de cada cepa por mililitro de suero de leche de cabra. Se realizaron 6 fermentaciones
independientes por duplicado.
Determinación de las cinéticas durante las fermentaciones mixtas.
Variación de pH.
El pH inicial del suero de leche de cabra en la fermentación fue de 6.3±0.007. Este disminuyó hasta
4.8±0.06, después de 7.5 horas de fermentación. El pH óptimo de crecimiento para B. bifidum es de 6.6 –
7 y el de L. acidophilus es de 5.4 – 5.8. Tomando en cuenta los pH óptimos de crecimiento de ambas
probióticas, la bacteria que crecería en un inicio de la fermentación sería B. bifidum y posteriormente, al
acidificar el medio con los productos del metabolismo de la misma, el pH disminuiría hasta alcanzar el pH
óptimo de crecimiento de L. acidophilus. En la figura 15, se presenta el gráfico de la disminución de pH
durante la fermentación mixta. Teóricamente, B. bifidum cesa su crecimiento a pH menores a 5, pero
puede sobrevivir. Mientras que L. acidophilus puede seguir creciendo a pH alrededor de 4, pero a menor
velocidad (Robinson et. al., 2000).
68
Resultados y Discusión
6.5
6.3
6.1
5.9
pH
5.7
5.5
5.3
5.1
4.9
4.7
4.5
0
1.5
3
4.5
6
7.5
Tiempo (hrs.)
Figura 15. Cinética de pH en una fermentación ácido láctica mixta en suero de leche de cabra con B. bifidum y L. acidophilus.
Consumo de Lactosa
La fermentación mixta, inició con 4.39%±0.01 de lactosa y descendió a 4.19%±0.018. La cantidad de
lactosa presente en el suero de leche de cabra, su consumo por parte de las bacterias fue mínimo, lo que
no corresponde al observar la concentración de UFC que se obtienen durante la fermentación.
Comparando los resultados obtenidos en esta investigación, con trabajos anteriores del grupo de
investigación, como en la investigación de Solís (2004), se reporta un consumo de cerca del 2% de
lactosa, se utilizaron dos cepas de bacterias ácido lácticas (S. thermophilus y L. delbrueckii) y B. infantis,
además como sustrato se utilizó leche de cabra. A pesar, de que no se trata de las misma especies de
microorganismos, la cantidad de lactosa tanto en leche como en suero de leche de cabra es prácticamente
la misma, además las dos cepas empleadas en esta investigación pertenecen a dos de los mismo géneros
de la investigación de Solís, Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium bifidum, por lo tanto, se esperaría
un consumo de sustrato mayor al observado, en esta fermentación ácido láctica. En la figura 16, se
muestra el gráfico de consumo de sustrato en el tiempo durante la fermentación mixta.
El método 984.15 A.O.A.C. (1990), kit de Lactosa/D-galactosa (Boheringer Manheim, Germany), utilizado
para la determinación de lactosa en muestras lácteas ya sea leche o productos fermentados como yogurt,
es el método oficial recomendado por la A.O.A.C, este método enzimático se utiliza tambien para
determinar galactosa en el medio.
69
Resultados y Discusión
Debido a lo anterior, los resultados de las mediciones de lactosa pudieron verse afectadas por la presencia
de galactosa producida por la actividad de los microorganismos como producto de su propio metabolismo
de azucares durante la fermentación, por lo que se recomienda en un futuro, emplear otros métodos más
sensibles que discriminen entre ambos azúcares, como pudiera ser el empleo de métodos de separación
como, HPLC acoplado a un detector de índice de refracción o analizar las estructuras mediante
Espectrometría de Infrarrojo, a fin de determinar las proporciones tanto de los monómeros como del
dímero.
4.5
Lactosa %
4.4
4.3
4.2
4.1
4.0
0
1.5
3
4.5
6
7.5
Tiempo (hrs)
Figura 16. Cinética de Consumo de Lactosa en una fermentación ácido láctica mixta en suero de leche de cabra con B. bifidum.
Formación de Ácidos Orgánicos.
La lactosa, es el principal sustrato como fuente de carbono, utilizado por las bacterias ácido lácticas,
produciendo como producto principal ácido láctico. Las bacterias homofermentativas (Lactobacillus
acidophilus) metabolizan la lactosa hasta ácido láctico y las heterofermentativas (Bifidobacterium bifidum)
la metabolizan hasta ácido láctico, etanol, ácido acético y dióxido de carbono (Leveau y Bouix, 2000). La
concentración inicial de ácido láctico en el suero de leche de cabra fue 0.09%±0.008, esta acidez se
determinó después de añadir al suero de leche de cabra fresco, los inóculos correspondientes, de esta
manera la acidez inicial en la fermentación ácido láctica mixta, es más alta que la acidez natural del suero
de leche de cabra reportada en el apartado 5.5.2. de 0.07%±0.007. Después de 7.5 horas de fermentación
se incremento a 0.24%±0.01 de ácido láctico.
70
Resultados y Discusión
En la figura 17, se presenta el gráfico de la evolución de producto en el tiempo durante una fermentación
ácido láctica mixta.
A pesar de que el consumo de lactosa durante la fermentación fue mínimo, la formación de producto
incremento hasta 0.15% de ácido láctico. Este desarrollo de acidez no necesariamente proviene de los
ácidos orgánicos producto del metabolismo de la lactosa, también puede provenir de péptidos o productos
de proteólisis de la fermentación.
0.26
0.24
% Acidez titulable
0.22
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0
1.5
3
4.5
6
7.5
Tiempo (hrs.)
Figura 17. Cinética de Formación de Ácidos Orgánicos en una fermentación ácido láctica mixta en suero de leche de
cabra con B. bifidum y L. acidophilus.
Unidades Formadoras de Colonias.
Se realizó el conteo de las unidades formadoras de colonias descrito en el punto 4.12.1. Después de las
etapas de adaptación de las cepas probióticas, se obtuvo para B. bifidum, una fase lag de 1 hora y para L.
acidophilus de 2.16 hrs. En la figura 18, se presenta los resultados de la cuenta de UFC/mL en el tiempo
de las fermentaciones ácido lácticas mixtas, donde se puede observar la duración de las fases lag de
ambas bacterias. B. bifidum inició la fase logarítmica, después de 1.5 hrs. y L. acidophilus después de 3
hrs. Comparando la duración de las fases lag obtenidas tanto en suero de leche de cabra como en medio
MRS. En suero de leche de cabra, la cepa de B. bifidum, se tardó 50% más del tiempo, en iniciar la fase
logarítmica, del que requiere la misma en medio MRS.
71
Resultados y Discusión
El mismo caso se tuvo para la cepa de L. acidophilus, que en suero de leche de cabra, se tardó 38% más
del tiempo que requiere para iniciar la fase logarítmica en medio MRS, esto se debe a la calidad del
sustrato, ya que aunque existe lactosa, las bacterias requieren de cofactores de crecimiento como lo son
las vitaminas y minerales; y el suero de leche de cabra una vez que ha pasado por dos tratamientos
térmicos, ha perdido estos y de ahí la diferencia entre la respuesta ante un medio ideal y uno mas pobre
en tales cofactores de crecimiento.
B. bifidum, inició su desarrollo primero, debido al pH inicial de la fermentación, que es más cercano al
óptimo para su crecimiento; L. acidophilus inició su desarrollo posteriormente, cuando los ácidos
producidos por B. bifidum, acidifican el medio, hasta valores cercanos al óptimo para su crecimiento. La
literatura considera un producto como probiótico, si este contiene de 1x108-10 UFC/mL de producto (Reid
et. al., 2003). Al final de la fermentación ácido láctica mixta, tras 7.5 horas, B. bifidum obtuvo la cantidad
de ufc necesarias para considerar al producto como probiótico; una cantidad de 1.03x108 UFC de B.
bifidum por mililitro de suero de leche de cabra. L. acidophilus alcanzó la cantidad de bacterias necesarias
para considerar al producto como probiótico a las 4 horas de fermentación, obteniendo 1x108 UFC de L.
acidophilus por mililitro de suero de leche de cabra y al final de la fermentación obtuvo 6 x108 UFC de L.
acidophilus/mL.
UFC/mL
1.E+09
1.E+08
LAC
BB
1.E+07
0
1.5
3
4.5
6
7.5
Tiempo (hrs.)
Figura 18. Cinética de crecimiento de B. bifidum (BB) y L. acidophilus (LAC) en una fermentación ácido láctica mixta en suero de
leche de cabra.
72
Resultados y Discusión
5.10.1.1. Caracterización del Producto de Fermentación
En la tabla 22, se resumen las características del producto final después de 7.5 hrs. de fermentación. El
producto final presentaba un color amarillo, con sólidos en suspensión, los cuales se precipitaban en el
producto en refrigeración, olor característico a cabra. En conclusión, a pesar de que a las 4 hrs. de
fermentación, se obtiene la cantidad necesaria de L. acidophilus para considerar como probiótico un
producto fermentado, la fermentación mixta tendría que durar 7.5 hrs., ya que hasta el termino de la
misma, es cuando se obtiene la cantidad de ufc de B. bifidum, para considerar al producto fermentado
como probiótico, en particular esta bacteria representa un interés y reto tanto biotecnológico, industrial y
nutracéutico, por la rareza de encontrarlas en nuestra dieta y solo a través de la ingesta de este tipo de
productos es que se podría obtener.
Tabla 22. Características del producto de una fermentación mixta en suero de leche de cabra
con B. bifidum y L. acidophilus.
Parámetro
pH
Acidez (%)
Lactosa (%)
UFC/mL
Valor obtenido1
4.8±0.060
0.24±0.01
4.19±0.018
1.03 x108 UFC de B. bifidum/mL
6 x108 UFC de L. acidophilus/mL
1) Valores obtenidos de 6 fermentaciones independientes por duplicado.
5.10.2. Fermentaciones Ácido Lácticas Simples con Bifidobacterium bifidum
En ambos tipos de fermentaciones ácido lácticas simples con B. bifidum, se empleó un tamaño de inóculo
del 12% del volumen final de fermentación. Se realizaron 3 eventos independientes por duplicado, de cada
tipo de fermentación, bajo las condiciones presentadas en la tabla 13 y 14.
Determinación de cinéticas durante la fermentación.
Variación de pH.
El pH inicial del suero de leche de cabra en los dos tipos de fermentaciones fue de 6.3±0.007, este valor
descendió hasta 5.84±0.02 en la fermentación tipo 1 y 5.58±0.05 en la fermentación tipo 2, después de
7.5 horas de fermentación. En la figura 19, se presenta el gráficos de variación de pH durante las
fermentaciones tipo 1 y tipo 2.
73
Resultados y Discusión
El comportamiento en ambas fermentaciones es similar. El pH óptimo de crecimiento de B. bifidum es de
6.6 -7, cercano a la neutralidad; el pH inicial en ambas fermentaciones, es cercano al óptimo para esta
cepa. Se esperaba un descenso más fuerte en el pH en ambos tipos de fermentaciones, debido a los
productos del metabolismo de carbohidratos como, etanol, ácido acético, láctico, propiónico y succínico.
pH
La mayoría de estos ácidos son fuertes, lo que ocasionaría una disminución del pH en el medio.
6.4
6.3
6.2
6.1
6
5.9
5.8
5.7
5.6
5.5
Tipo 2
Tipo 1
0
1.5
3
4.5
6
7.5
9
Tiempo (hrs)
Figura 19. Cinéticas de pH de fermentaciones simples en suero de leche de cabra con B. bifidum.
Consumo de Lactosa
La cantidad de lactosa en el suero de leche de cabra al inicio de las fermentaciones tipo 1 y 2 fue de
4.4%±0.03. Este valor descendió después de 7.5 horas a, 4.37%±0.06 en la fermentación tipo 1 y de
4.34%±0.06 para la fermentación tipo 2. En ambas fermentaciones, la cantidad de lactosa presente en el
suero de leche de cabra, aparentemente no fue el principal sustrato consumido por B. bifidum, ya que su
disminución fue mínima. B. bifidum es una bacteria heterofermentativa, es decir, la lactosa no es la única
fuente de carbono, también puede utilizar otros carbohidratos, como la glucosa (Leveau y Bouix, 2000). En
la figura 20, se muestran los gráficos de Consumo de Lactosa en el tiempo de ambos tipos de
fermentaciones.
74
Resultados y Discusión
Debido a los resultados de las mediciones de lactosa, se recomienda en un futuro, emplear otros métodos
más sensibles que discriminen entre ambos azúcares, lactosa y galactosa, como pudiera ser el empleo de
métodos de separación como, HPLC acoplado a un detector de índice de refracción o analizar las
estructuras mediante Espectrometría de Infrarrojo, a fin de determinar las proporciones tanto de los
monómeros como del dímero.
4.50
Lactosa %
4.40
4.30
4.20
Tipo 1
Tipo 2
4.10
4.00
0
1.5
3
4.5
6
7.5
9
Tiempo (hrs)
Figura 20. Cinéticas de Consumo de Lactosa de fermentaciones simples en suero de leche de cabra con B. bifidum.
Formación de Ácidos Orgánicos.
La acidez inicial del suero de leche de cabra en estas fermentaciones fue de 0.09%±0.008 de ácido láctico
para la fermentación tipo 1 y de 0.1%±0.012 para la fermentación tipo 2. Después de 7.5 horas de
fermentación alcanzaron una acidez de 0.12%±0.001 y 0.14%±0.002 de ácido láctico respectivamente.
Una lenta formación de producto en ambas fermentaciones, corresponde al poco consumo de lactosa
durante las fermentaciones. Los valores bajos de acidez obtenidos son congruentes con los valores de pH
bajos obtenidos en las fermentaciones. En la figura 21, se muestran los gráficos de Formación de Ácidos
Orgánicos de ambas fermentaciones en el tiempo.
75
Resultados y Discusión
0.15
%Acidez titulable
0.14
0.13
0.12
Tipo 1
0.11
Tipo 2
0.10
0.09
0
1.5
3
4.5
6
7.5
9
Tiempo (hrs)
Figura 21. Cinéticas de Formación de Ácidos Orgánicos de fermentaciones simples en suero de leche de
cabra con B. bifidum.
Unidades Formadoras de Colonias.
Se realizó el conteo de ufc siguiendo lo descrito en el apartado 4.12.2. En la figura 22, se muestran los
gráficos del conteo de ufc en el tiempo de las fermentaciones simples tipo 1 y 2.
UFC/m L
1.E+09
1.E+08
Tipo 2
Tipo 1
1.E+07
0
1.5
3
4.5
6
7.5
Tiempo (hrs)
Figura 22. Cinéticas de crecimiento de B. bifidum en fermentaciones simples en suero de leche de cabra.
76
Resultados y Discusión
A pesar del bajo descenso de lactosa y contrariamente a la fermentación mixta, después de 7.5 hrs. de
fermentación, se obtuvo una cantidad de 8.33 x 108 UFC de B. bifidum por mililitro, en la fermentación tipo
1 y 1.04 x 109 UFC B. bifidum por mililitro, en la fermentación tipo 2.
En la fermentación tipo 1, la fase lag duró 1.5hrs. y se obtuvieron 3 x 108 UFC B. bifidum por mililitro a las
4.5 hrs. de fermentación. Alrededor de 3 hrs. después de iniciada la fermentación se obtendría 1 x 108
UFC B. bifidum por mililitro y el pH en este punto de la fermentación estaba muy cerca al pH óptimo de
crecimiento (6.6 – 7) para esta bacteria, fue de 6.29 y a las 4.5 hrs. fue de 6.14, también cercano al
óptimo. La fermentación tipo 2, la fase logarítmica se alcanzó alrededor de 1 hora después de iniciada la
fermentación, lo cual puede estar relacionado a la presencia de glucosa disponible. Se obtuvieron 1.9 x
108 UFC B. bifidum por mililitro a las 3 hrs. de fermentación. El pH en este punto de la fermentación estaba
muy cerca al pH óptimo de crecimiento (6.6 – 7) para esta bacteria, fue de 6.21.
En ambos tipos de fermentaciones simples con B. bifidum, se obtuvieron las concentraciones de bacterias,
para considerar el producto fermentado como probiótico. En la fermentación tipo 2, en la cual se utilizó
suero de leche de cabra pasteurizado suplementado con 2% de glucosa, se obtuvo tal concentración en
menor tiempo de fermentación que en la tipo 1.
Por lo tanto, se puede concluir, que la adición de otra fuente de carbono al suero de leche de cabra, ejerce
una influencia positiva en el crecimiento de B. bifidum, pudiéndose obtener tiempos de proceso más
cortos.
5.10.2.1. Caracterización de los Productos Finales de Fermentación.
Se evaluaron 4 parámetros en los productos finales de ambos tipos de fermentaciones: sustrato
remanente (%Lactosa), pH, acidez desarrollada y unidades formadoras de colonias por mililitro de
producto de fermentación; siguiendo los procedimientos descritos en el apartado 4.12.2. En la tabla 23, se
presentan las características de los productos finales de ambos tipos de fermentaciones. Los productos
finales presentaba un color amarillo; con sólidos en suspensión, los cuales se precipitaban en el producto
en refrigeración; olor picante y característico a cabra.
77
Resultados y Discusión
En conclusión, se obtuvieron las concentraciones necesarias para obtener un producto fermentado
probiótico, alrededor de las 3 hrs. después del inicio de la fermentación y los pH en ese punto de ambas
fermentaciones es cercano al óptimo de crecimiento de B. bifidum. Después de 7.5 hrs. se obtiene mayor
concentración de bacterias en la fermentación tipo 2. En ambas fermentaciones todavía queda lactosa
disponible.
Tabla 23. Comparación entre características de productos fermentados procedentes de
fermentaciones tipo 1 y 2.
Parámetro1
Características Fermentación
Características Fermentación
simple con B. bifidum tipo 1
simple con B. bifidum tipo 2
pH
5.84
5.58
Acidez (%)
0.12
0.14
Lactosa (g/L)
4.37
4.34
UFC/mL
1.04x109 UFC de B. bifidum/mL
8.33 x108 ufc de B. bifidum/mL
1) Resultados de 3 fermentaciones independientes por duplicado.
5.10.3. Fermentaciones Ácido Lácticas Simples con Lactobacillus acidophilus
Para las fermentaciones ácido lácticas simples con Lactobacillus acidophilus, se utilizo un inoculo del 9%,
con la finalidad de iniciar la fermentación con 1x107 UFC/mL. Se realizaron 3 eventos independientes por
duplicado, bajo las condiciones y variables presentadas en la tabla 13 y 14. El procedimiento que se
siguió en esta fermentación se describió en el apartado 4.12.3.
Determinación de cinéticas durante la fermentación
Variación de pH
Al inicio de la fermentación, el suero de leche de cabra tenía un valor de pH de 6.38±0.01. Después de 7.5
horas de fermentación se obtuvo un valor de pH de 4.1±0.018. El pH óptimo de crecimiento de L.
acidophilus es de 5.4 – 5.8. Después de 3 hrs. de fermentación se alcanzaron valores de pH cercanos al
óptimo de crecimiento para esta bacteria. En la figura 23, se muestra el gráfico de pH en el tiempo en una
fermentación ácido láctica simple en suero de leche de cabra con Lactobacillus acidophilus. El pH ácido,
obtenido al final de la fermentación se debe al ácido láctico, producto del metabolismo de la lactosa por
Lactobacillus acidophilus. Como se observa, hay un descenso más pronunciado y rápido de pH que en el
caso de B. bifidum.
78
Resultados y Discusión
7
6.5
6
pH
5.5
5
4.5
4
3.5
0
1.5
3
4.5
6
7.5
Tiempo (hrs.)
Figura 23. Cinética de pH durante una fermentación simple en suero de leche de cabra con L. acidophilus.
Consumo de Lactosa
La cantidad de lactosa en el suero de leche de cabra al inicio de la fermentación con L. acidophilus fue de
4.43%±0.08. El consumo de lactosa después de 7.5 horas de fermentación fue de 4.26%±0.01. La lactosa
presente en el suero de leche de cabra, aparentemente no fue el principal sustrato consumido por la
bacteria, ya que su descenso fue mínimo. En la figura 24, se muestra el gráfico de Consumo de Lactosa
en el tiempo de una fermentación simple en suero de leche de cabra con L. acidophilus.
4.5
4.4
Lactosa %
4.3
4.2
4.1
4.0
0
1.5
3
4.5
6
7.5
Tiempo (hrs.)
Figura 24. Cinética de Consumo de Lactosa durante una fermentación simple en suero de leche de cabra con L. acidophilus.
79
Resultados y Discusión
Debido a los resultados de las mediciones de lactosa, se recomienda en un futuro, emplear otros métodos
más sensibles que discriminen entre ambos azúcares, lactosa y galactosa, como pudiera ser el empleo de
métodos de separación como, HPLC acoplado a un detector de índice de refracción o analizar las
estructuras mediante Espectrometría de Infrarrojo, a fin de determinar las proporciones tanto de los
monómeros como del dímero.
Formación de Ácidos Orgánicos
El ácido láctico es el único producto del metabolismo de la lactosa por L. acidophilus (Leveau y Bouix,
2000). Al inició de la fermentación se tenía un valor de acidez de 0.09%±0.008, después de 7.5 horas de
fermentación, se obtuvó una acidez de 0.3%±0.01. En el punto de la fermentación donde se alcanza el pH
óptimo de crecimiento de esta bacteria, la acidez desarrollada fue de 0.15%. En la figura 25, se muestra el
gráfico de Formación de Ácidos Orgánicos en el tiempo durante la fermentación simple en suero de leche
de cabra con L. acidophilus.
0.34
%Acidez titulable
0.29
0.24
0.19
0.14
0.09
0
1.5
3
4.5
6
Tiempo (hrs.)
7.5
Figura 25. Cinética de Formación de Ácidos Orgánicos durante una fermentación simple en suero de leche de
cabra con L. acidophilus.
80
Resultados y Discusión
Unidades Formadoras de Colonias
Se realizó el conteo de UFC, siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 4.12.3. En la figura 26, se
muestran el gráfico del conteo de UFC en el tiempo durante las fermentaciones simples en suero de leche
de cabra con L. acidophilus. Después de 7.5 horas de fermentación, se obtuvo una cantidad de 8.27 x 108
UFC de L. acidophilus por mililitro. La fase logarítmica se alcanzo después de 3 hrs. de fermentación a un
pH de 5.5; este pH esta dentro del rango de pH óptimo de crecimiento de esta bacteria (5.4 – 5.8). A las
4.5 hrs. ya se tenía una concentración de 1.13 x 108 UFC de L. acidophilus por mililitro, en este punto el
pH se encontraba en 4.9.
Comparando las fermentaciones simples con B. bifidum y L. acidophilus se puede comprobar, tomando en
cuenta los parámetros cinéticos calculados para ambas bacterias, que efectivamente, B. bifidum se
desarrolla en menor tiempo a mayor velocidad que L. acidophilus, ya que, en la fermentación simple con
bífidobacterias después de 3hrs, se obtuvo una concentración de 1 x 108 UFC/mL, mientras que en la
fermentación simple con Lactobacillus, a las 4.5 hrs. se tenía una concentración de 1.13 x 108 UFC/mL.
Por lo tanto, se obtuvo una concentración de L. acidophilus suficiente, para considerar al producto como
probiótico, a las 4.5 hrs., en consecuencia no seria necesario, para una aplicación industrial o de un
proceso industrial una fermentación de más de 7 hrs.
ufc/mL
1.E+09
1.E+08
1.E+07
0
1.5
3
4.5
6
7.5
Tiempo (hrs.)
Figura 26. Cinética de crecimiento de fermentaciones simples en suero de leche de cabra con L. acidophilus.
81
Resultados y Discusión
5.10.3.1. Caracterización del Producto Final de Fermentación
En la tabla 24, se presentan las características del producto final de fermentación. El producto final
presentaba un color amarillo, con sólidos en suspensión, los cuales se precipitaban en el producto en
refrigeración, olor característico a cabra. En conclusión, se obtuvo la concentración necesaria para
considerar a un producto fermentado como probiótico, a las 4.5 hrs. después del inicio de la fermentación,
la cantidad de bacterias fue de 1.13 x 108 UFC/mL y el pH estaba dentro del rango óptimo de crecimiento
para L. acidophilus.
Tabla 24. Características del producto fermentado procedente de
fermentaciones simples en suero de leche de cabra con L. acidophilus.
Parámetro1
Resultado
pH
4.1
Acidez (%)
0.3
Lactosa (g/L)
4.26
Ufc/mL
8.27 x108 UFC de L. acidophilus/mL
1) Resultados de 3 fermentaciones independientes por duplicado.
5.11.
Análisis Estadístico entre Tratamientos de Fermentaciones Ácido Lácticas Simples y Mixtas.
Se realizó una prueba de hipótesis entre las medias con varianzas desconocidas, mediante la prueba t de
dos poblaciones, utilizando el programa MINITAB Release 14. La prueba t de dos poblaciones,
proporciona dos indicadores para rechazar o aceptar la hipótesis nula.
El primer indicador es el valor p, que se define como el valor más pequeño del nivel de significancia para
el que debe rechazarse la hipótesis nula. El nivel de significancia (α), designa el área bajo la curva de
distribución, que constituyen la región de rechazo. Esta prueba indica si las medias de las poblaciones son
iguales o existen diferencias significativas entre ellas. Si el valor p es menor o igual que α, es posible
rechazar la hipótesis nula. Si el valor p es mayor que α, no es posible rechazar la hipótesis nula. Se eligen
valores pequeños de α para hacer que la probabilidad de rechazo de la hipótesis nula sea pequeña. Los
valores de α que se encuentran con más frecuencia son 0.01, 0.05 y 0.1. El valor de α que se utilizó para
los tres análisis fue de 0.05.
82
Resultados y Discusión
El segundo indicador es el grafico de intervalos, que en un intervalo del 95% de confianza, da a conocer si
las medias de las poblaciones son iguales o diferentes. Si los intervalos del grafico se traslapan, indica que
no existen diferencias significativas para considerar diferentes las medias de las poblaciones, por lo tanto
no se puede rechazar la hipótesis nula; si los intervalos del grafico no se traslapan, indica que existen
diferencias significativas para considerar diferentes las medias de las poblaciones, es decir, es posible
rechazar la hipótesis nula.
5.11.1. Análisis Estadístico entre Tratamientos de Fermentaciones Mixtas o Simples con B. bifidum.
Para comprobar la segunda hipótesis de esta investigación, se establecieron las hipótesis nula y alterna:
H0 = µ1 ≥ µ2
HA = µ1 < µ2
Donde:
H0 es la hipótesis nula que establece que la media de las UFC de B.bifidum, obtenida en fermentaciones
ácido lácticas mixtas (µ1), es mayor o igual a la media de las UFC de B.bifidum, obtenida en
fermentaciones ácido lácticas simples (µ2).
HA es la hipótesis alterna que establece que la media de las UFC de B.bifidum, obtenida en
fermentaciones ácido lácticas mixtas (µ1), es menor a la media de las UFC de B.bifidum, obtenida en
fermentaciones ácido lácticas simples (µ2).
En la figura 27, se presentan los resultados obtenidos para este análisis. El valor p obtenido en este
análisis fue de 0.001, por lo tanto, es posible rechazar la hipótesis nula. Se acepta la hipótesis alterna con
un nivel de significancia de 0.05, que establece que la media de las ufc de B .bifidum, obtenida en
fermentaciones ácido lácticas mixtas (µ1), es menor a la media de las ufc de B. bifidum, obtenida en
fermentaciones ácido lácticas simples (µ2). En el grafico de intervalos con un 95% de confianza, se
pueden observar que los intervalos de las dos poblaciones no se traslapan. Por lo tanto, existen
diferencias significativas para considerar diferentes las medias de las poblaciones, es decir, es posible
rechazar la hipótesis nula.
83
Resultados y Discusión
En conclusión, en una fermentación ácido láctica mixta, no se obtuvo, a las condiciones empleadas en
esta investigación, una mayor concentración de B. bifidum.
Descriptive Statistics: UFC/ML
Variable
UFC/ML
FERMENTACIONES
BB
MIXTA BB
N
3
6
N*
0
0
Mean
833333333
623333333
SE Mean
14529663
25385910
StDev
25166115
62182527
Variance
6.33333E+14
3.86667E+15
Two-Sample T-Test and CI
Sample
1
2
N
6
3
Mean
623333333
833333333
StDev
62182527
25166115
SE Mean
25385910
14529663
Difference = mu (1) - mu (2)
Estimate for difference: -210000000
95% CI for difference: (-300705105, -119294895)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -5.47
Both use Pooled StDev = 54248107.2862
P-Value = 0.001
DF = 7
Interval Plot of UFC/ML vs FERMEN TACIO N ES
95% CI for the Mean
900000000
850000000
UFC/ML
800000000
750000000
700000000
650000000
600000000
550000000
BB
MIX TA BB
FERMENTA CIONES
Figura 27. Análisis estadístico entre tratamientos de fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples con B. bifidum.
5.11.2. Análisis Estadístico entre Tratamientos de Fermentaciones Mixtas y Simples con L. acidophilus.
Para comprobar la segunda hipótesis de esta investigación, pero comparando fermentaciones ácido
lácticas mixtas y simples con L. acidophilus, se procedió de la misma manera que en el apartado 5.11.1.
Se establecieron las hipótesis nula y alterna:
H0 = µ1 ≥ µ2
HA = µ1 < µ2
84
Resultados y Discusión
En la figura 28, se presentan los resultados obtenidos para este análisis. El valor p obtenido en este
análisis fue de 0.000, por lo tanto, es posible rechazar la hipótesis nula. Se acepta la hipótesis alterna con
un nivel de significancia de 0.05, que establece que la media de las ufc de L. acidophilus, obtenida en
fermentaciones ácido lácticas mixtas (µ1), es menor a la media de las ufc de L. acidophilus, obtenida en
fermentaciones ácido lácticas simples (µ2). En el gráfico de intervalos con un 95% de confianza, se
pueden observar que los intervalos de las dos poblaciones no se traslapan. Por lo tanto, es posible
rechazar la hipótesis nula.
En conclusión, en una fermentación ácido láctica mixta, no se obtuvo, a las condiciones empleadas en
esta investigación, una mayor concentración de L. acidophilus.
Descriptive Statistics: UFC/ML
Variable
UFC/ML
FERMENTACIONES
LAC
MIXTA LAC
N
3
6
N*
0
0
Mean
986666667
100166667
SE Mean
16666667
2713137
StDev
28867513
6645801
Variance
8.33333E+14
4.41667E+13
Two-Sample T-Test and CI
Sample
1
2
N
6
3
Mean
100166667
986666667
StDev
6645801
28867513
SE Mean
2713137
16666666
Difference = mu (1) - mu (2)
Estimate for difference: -886500000
95% CI for difference: (-959154834, -813845166)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -52.50
P-Value = 0.000
DF = 2
Interval Plot of UFC/ML vs FERMENTACIONES
95% CI for the Mean
1200000000
1000000000
UFC/ML
800000000
600000000
400000000
200000000
0
LAC
MIXTA LAC
FERMENTA CIONES
Figura 28. Análisis estadístico entre tratamientos de fermentaciones ácido lácticas mixtas y simples con L. acidophilus.
85
Resultados y Discusión
5.11.3. Análisis Estadístico entre Tratamientos de Fermentaciones Simples de B. bifidum, con Diferente
Fuente de Carbono.
Para comprobar la tercera hipótesis planteada en esta investigación, se procedió de la misma manera que
en el apartado 5.11.1. estableciéndose las hipótesis nula y alterna:
H0 = µ1 ≥ µ2
HA = µ1 < µ2
Donde:
H0 es la hipótesis nula que establece, la media de las ufc de B. bifidum, obtenida en fermentaciones ácido
lácticas simples utilizando suero de leche de cabra pasteurizado (µ1), es mayor o igual a la media de las
ufc de B. bifidum, obtenida en fermentaciones ácido lácticas simples utilizando suero de leche de cabra
pasteurizado suplementado con otra fuente de carbono (µ2).
HA es la hipótesis alterna que establece, la media de las ufc de B. bifidum, obtenida en fermentaciones
ácido lácticas simples utilizando suero de leche de cabra pasteurizado (µ1), es menor a la media de las ufc
de B. bifidum, obtenida en fermentaciones ácido lácticas simples utilizando suero de leche de cabra
pasteurizado suplementado con otra fuente de carbono (µ2).
En la figura 29, se presentan los resultados obtenidos para este análisis. El valor p obtenido en este
análisis fue de 0.002, por lo tanto, es posible rechazar la hipótesis nula. Se acepta la hipótesis alterna con
un nivel de significancia de 0.05, que establece que la media de las ufc de B. bifidum, obtenida en
fermentaciones ácido lácticas simples utilizando suero de leche de cabra pasteurizado (µ1), es menor a la
media de las ufc de B. bifidum, obtenida en fermentaciones ácido lácticas simples utilizando suero de
leche de cabra pasteurizado suplementado con otra fuente de carbono (µ2). En el grafico de intervalos con
un 95% de confianza, se pueden observar que los intervalos de las dos poblaciones no se traslapan. Por
lo tanto, existen diferencias significativas para considerar diferentes las medias de las poblaciones, es
decir, es posible rechazar la hipótesis nula.
86
Resultados y Discusión
En conclusión, en una fermentación ácido láctica simple utilizando suero de leche de cabra pasteurizado
suplementado con otra fuente de carbono (a las condiciones empleadas en esta investigación), se obtuvo
una mayor concentración de B. bifidum, comprobándose el carácter heterofermentativo de esta bacteria.
Descriptive Statistics: UFC/ML
Variable
UFC/ML
FERMENTACIONES
TIPO 1
TIPO 2
N
3
3
N*
0
0
Mean
833333333
1090000000
SE Mean
14529663
34641016
StDev
25166115
60000000
Variance
6.33333E+14
3.60000E+15
Two-Sample T-Test and CI
Sample
1
2
N
3
3
Mean
833333333
1090000000
StDev
25166115
60000000
SE Mean
14529663
34641016
Difference = mu (1) - mu (2)
Estimate for difference: -256666667
95% CI for difference: (-360963158, -152370176)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -6.83
Both use Pooled StDev = 46007245.8652
P-Value = 0.002
DF = 4
Interval Plot of UFC/ML vs FERMENTACIONES
95% CI for the Mean
1300000000
1200000000
UFC/ML
1100000000
1000000000
900000000
800000000
TIPO 1
TIPO 2
FERMENTACIONES
Figura 29. Análisis estadístico entre tratamientos de fermentaciones simples con B. bifidum, con diferente
fuente de carbono.
87
Conclusiones
Capítulo 6.- Conclusiones
En base a los resultados obtenidos podemos concluir:
I. El suero de leche de cabra, obtenido tras la elaboración de queso fresco, utilizando leche de cabra
procedente del CEA del ITESM, en el período de marzo a diciembre del 2004, contuvo los nutrientes
necesarios para permitir el desarrollo de Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus en
cantidades suficientes para que se le considere como probiótico.
II. Se obtuvieron productos probióticos, tanto en las fermentaciones ácido lácticas mixtas, como en las
simples, ya que se demostró que B. bifidum y L. acidophilus, están en una concentración ≥1 x 108
UFC/mL de producto fermentado.
III. Se obtuvó una mayor concentración de UFC/mL de ambas bacterias probióticas, en fermentaciones
ácido lácticas simples.
IV.
Se observó un mejor desarrollo de B. bifidum en suero de leche de cabra que de L. acidophilus; ya
que B. bifidum, se desarrollo a mayor velocidad y en menor tiempo, aprovechando oportunamente el
sustrato.
V. La fermentación ácido láctica simple con B. bifidum, en la que se utilizó suero de leche de cabra
suplementado con 2% de glucosa, proporcionó una mayor concentración de UFC/mL de producto
fermentado. Debido a que esta bacteria es heterofermentativa, es decir, tiene la capacidad de utilizar
otros carbohidratos diferentes a la lactosa como fuente de carbono.
Finalmente, considerando lo anterior, se concluye que el suero de leche de cabra puede ser considerado
como un sustrato para el desarrollo de productos probióticos. Este trabajo aporta las bases para el
escalamiento y la formulación de un producto probiótico utilizando suero de leche de cabra como sustrato.
88
Recomendaciones
Capítulo 7.- Recomendaciones
Considerando diversos factores que influyeron directamente en el desarrollo de esta investigación se
sugieren las siguientes recomendaciones:
• Variar condiciones de fermentación como: cantidad de nitrógeno durante la incubación, incremento de
temperatura de incubación; con la finalidad de potencializar el desarrollo de ambas bacterias
probióticas, en fermentaciones mixtas y simples.
• Desarrollar un método de cuantificación más rápido y específico, para estas dos especies de
probióticas, que nos permita obtener en menos tiempo resultados sobre la cantidad de bacterias
presentes en el producto.
• Debido a que ambas cepas son altamente probióticas y además se obtuvó una mayor concentración
de ufc/mL de estas, en fermentaciones ácido lácticas simples, se sugiere el desarrollo de productos
fermentados probióticos en suero de leche de cabra de cada una de las cepas.
• Utilizar prebióticos como la inulina, oligofructosa, entre otros, para potencializar el desarrollo de
ambas bacterias probióticas.
• Realizar un estudio de viabilidad de las bacterias probióticas durante el almacenamiento del producto
terminado.
• Formular el producto final, una bebida probiótica, para envasarlo y comercializarlo.
89
RESUMEN
Los probióticos son definidos como “microorganismos vivos, los cuales al ser administrados en cantidad adecuada, confieren
beneficios fisiológicos al hospedero”. Los géneros considerados con más alto potencial probiótico son Bifidobacterium spp. y
Lactobacillus spp. Los productos lácteos fermentados han sido el principal vehículo utilizado para el consumo humano de
probióticos. En México está iniciándose un importante auge en el consumo de productos lácteos fermentados con probióticos.
La leche de cabra constituye una alternativa a la leche de vaca muy benéfica en ciertos aspectos de la alimentación humana, su
volumen de producción en Nuevo León, ha aumentado en un 150.85% en los últimos años, pero su aprovechamiento para
procesamiento y comercialización todavía no es muy difundido. Este producto es muy importante para la economía nacional y
estatal, ya que su producción impacta el Producto Interno Bruto. Debido a lo anterior, es importante la creación de nuevas
alternativas para el consumo de leche de cabra, sus derivados y subproductos. El suero de leche de cabra, es un subproducto
lácteo, líquido resultante de la coagulación de la leche de cabra durante la elaboración del queso. No emplear el suero de leche
como alimento, es un enorme desperdicio de nutrimentos; ya que contiene un poco más del 25 % de las proteínas de la leche,
cerca del 8 % de la materia grasa y cerca del 95 % de la lactosa. Por lo menos el 50 % en peso de los nutrimentos de la leche
se quedan en el lactosuero. El suero de leche es uno de los materiales más contaminantes que existen en la industria
alimentaria. En México se estima que alrededor del 10% de la producción de suero se utiliza en alguna tecnología que permita
la transformación de los componentes de este, en productos de mayor valor agregado. Por lo que, es importante que la industria
quesera, cuente con diferentes opciones para emplear el suero de leche como base de alimentos, preferentemente para el
consumo humano, con el fin adicional de no contaminar el medio ambiente y de recuperar, el valor monetario del lactosuero. El
objetivo de esta investigación es evaluar la calidad del suero de leche de cabra obtenido de queserías a nivel laboratorio, como
sustrato potencial para el desarrollo de producto probiótico con Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus, en una
fermentación ácido láctica. Las cepas probióticas empleadas en este estudio fueron adquiridas en la ATCC, la leche de cabra
fue proporcionada por el CAE del ITESM y el suero de leche de cabra, se obtuvo tras la elaboración de queso fresco a nivel de
laboratorio. Se realizaron fermentaciones ácido lácticas mixtas (con B. bifidum y L. acidophilus) y simples (con B. bifidum o L.
acidophilus), utilizando suero de leche de cabra como sustrato. En las fermentaciones simples con B. bifidum, se evaluó el
desarrollo de la bacteria en suero de leche de cabra y en suero de leche de cabra suplementado con 2% de glucosa. Se
demostró que el suero de leche de cabra, obtenido tras la elaboración de queso fresco, contiene los nutrientes necesarios para
permitir el desarrollo de Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus. Se obtuvieron productos probióticos, tanto en las
fermentaciones ácido lácticas mixtas, como en las simples, ya que se demostró que B. bifidum y L. acidophilus, están en una
concentración ≥1x108 UFC/mL de producto fermentado. Se obtuvo una mayor concentración de ufc/mL de ambas bacterias
probióticas, en fermentaciones ácido lácticas simples. Se observo un mejor desarrollo de B. bifidum en suero de leche de cabra;
ya que el primero, se desarrollo a mayor velocidad y en menor tiempo, aprovechando oportunamente el sustrato. La
fermentación ácido láctica simple con B. bifidum, en la que se utilizo suero de leche de cabra suplementado con 2% de glucosa,
proporcionó una mayor concentración de UFC/mL de producto fermentado. Finalmente, se concluye que, el suero de leche de
cabra puede ser considerado como un sustrato para el desarrollo de productos probióticos. Este trabajo aporta las bases para el
escalamiento y la formulación de un producto probiótico utilizando suero de leche de cabra como sustrato.
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