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VIII-Capítulo 5
Obtención de plantas libres de virus
Conci, Vilma C.
1 Eliminación de virus
Los virus de plantas son responsables de
importantes pérdidas en los rendimientos,
llegando en algunos casos a ser limitantes
para el cultivo.
La mayoría de los virus no se transmiten
por semilla, por lo tanto, las especies que se
multiplican por esta vía tienen la posibilidad
de liberarse de ellos en forma natural.
Por otra parte, cuando las especies que
se propagan exclusivamente en forma
agámica son infectadas sistémicamente por
virus ellos son transmitidos, con alta eficiencia, desde la planta madre a la descendencia. Esta situación. que es normal en especies
que se multiplican por bulbos, tubérculos,
esquejes o estacas permite que la infección
continúe de generación en generación y se
disemine a diferentes regiones a través del
comercio de estos propágulos. Ejemplo de
ello son ajo, frutilla, frutales de carozo o pepita, yuca, papa, batata y numerosas especies ornamentales. En estos casos, la obtención y multiplicación de plantas libres de virus por medios artificiales juega un papel importante para mejorar la producción y calidad de estas especies. Existen numerosos
ejemplos respecto a los beneficios obtenidos
como consecuencia del empleo de plantas libres de virus, no sólo por los incrementos en
la producción sino que además ha permitido
la recuperación de áreas de cultivo que habían sido prácticamente abandonadas.
Una larga lista de especies han sido liberadas de virus a través de la regeneración de
plantas in vitro. El sistema más frecuentemente utilizado y con mayores éxitos es el
cultivo de meristema, suplementado en muchos casos por tratamientos de termoterapia
o quimioterapia.
1.2 Cultivo de meristemas
Esta técnica consiste en aislar el
meristema y sembrarlo en un medio de cultivo adecuado que posibilite el desarrollo de
una planta completa.
El término cultivo de meristema, por lo
general, no es correctamente empleado, ya
que en la mayoría de los casos se siembra el
domo meristemático acompañado por uno
o dos primordios foliares. El domo es una
estructura de menos de 0,1 mm de diámetro muy difícil de extraer con éxito en forma
aislada, y de la cual resulta con frecuencia complicado obtener plantas completas. Para ello
es necesario un medio de cultivo con una
concentración de nutrientes muy equilibrada y condiciones ambientales muy estrictas.
Por consiguiente los resultados en ese sentido han sido muy pobres. Por esta razón, en
la mayoría de los casos, se utiliza el domo
acompañado de uno ó más primordios
foliares. Tal vez lo más aconsejable sería utilizar el término cultivo de «yema», o «brote»,
o «tallo». A pesar de ello, en este capítulo
utilizaremos la denominación cultivo de
meristema por ser esta la terminología más
difundida, aunque no sea estrictamente correcta.
En general se considera que las plantas
provenientes del cultivo de meristema son
idénticas u homólogas a la planta madre de
donde se extrajo el explanto. Por el contrario, las plantas derivadas de otros tejidos
como callos, nucela, primordios florales o
protoplastos, usualmente presentan distintos grados de variabilidad. Esto último no es
deseable para la producción de plantas libres
de virus, donde el objetivo que se persigue
es mejorar la sanidad de la planta pero conservar el resto de sus características
agronómicas.
Sin embargo, es importante aclarar que
han sido señaladas ciertas mutaciones en
plantas provenientes de cultivo de
meristema, pero con mucha menos frecuencia y menos importantes que las detectadas
con otros sistemas de obtención de plantas
in vitro.
El cultivo de meristema ha sido utilizado
con éxito para distintos objetivos, entre ellos
los más frecuentes son la rápida clonación de
material deseable (micropropagación), conservación de germoplasma a baja temperatura o criopreservación y para la obtención
de plantas libres de patógenos sistémicos,
entre ellos los virus, que son el objetivo de
este capítulo.
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2 Distribución de los virus en la planta
Los virus en la planta no están uniformemente distribuídos. En las infecciones
sistémicas algunos están limitados al floema
o a pocas células parenquimáticas adyacentes; otros involucran a todas, o casi todas,
las células de la planta. Existen otros virus que
dejan sectores de tejidos sin infectar y sólo
unos pocos invaden los nuevos tejidos
meristemáticos.
Los meristemas suelen tener pocos o ningún virus. Las razones para que ello ocurra
no están esclarecidas completamente pero
se mencionan como posibles las siguientes:
1.- Sistema vascular poco diferenciado. Los
virus son rápidamente transportados a lo largo de toda la planta por el floema y así se
distribuyen sistémicamente. Los meristemas
no tienen tejido vascular formado, por lo
tanto, el avance es solamente a través del
movimiento célula a célula. Se comprobó que
el Tobacco mosaic virus (TMV) y el Potato
virus X (PVX) avanzan 1 a 8 cm/h por el tejido vascular y 5 a 15 µ/h de célula a célula. Por
esta razón se supone que las células
meristemáticas no están completamente invadidas por virus cuando están en activo crecimiento.
2.- Elevada actividad metabólica.
Presumiblemente es más difícil para un virus
invadir células con elevada actividad
metabólica, como es el caso de las células
meristemáticas, donde tiene lugar una activa mitosis.
3.- Elevadas concentraciones de auxinas.
Se ha observado que elevadas concentraciones de 2,4-D en el medio de cultivo inhiben
la multiplicación de los virus. Por lo tanto se
puede suponer que las altas concentraciones
de auxinas endógenas existentes en los ápices meristemáticos pueden producir un efecto similar.
Primordios
foliares
Nudos
Figura 1: Esquema ilustrativo de la iniciación de la hoja
en el ápice del brote de dicotiledónea de hojas opuestas
(Esau, 1959).
4 Factores que pueden afectar la
producción de plantas libres de virus
3 Meristema apical
El meristema apical incluye las células
meristemáticas iniciales y sus derivadas inmediatas del ápice de la raíz o del brote. El número de células iniciales es variable y pueden
presentarse en una o más filas.
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Dentro del meristema apical se distinguen
dos zonas de tejido: la túnica, que consta de
una o más capas periféricas de células, y el
cuerpo, masa celular rodeada por la túnica.
La demarcación entre ambas zonas se deduce de las diferencias en la división de las células. Las capas de la túnica presentan predominantemente divisiones anticlinales, es decir, experimentan un crecimiento en superficie. Las células del cuerpo se dividen según
varios planos y la masa crece en volumen. El
concepto de túnica-cuerpo fue desarrollado
refiriéndose a las angiospermas pero resulta
poco apropiado para la caracterización del
meristema apical de las gimnospermas. En
este grupo se presentan comúnmente varias
zonas de crecimiento derivadas de un grupo
de células iniciales superficiales.
El diámetro de los ápices oscila entre 90µ
en algunas angiospermas a 3,5mm en el caso
de Cyca revoluta. La forma y el tamaño del
ápice cambian notoriamente durante el desarrollo de la planta.
Las hojas se inician mediante divisiones
periclinales de un pequeño grupo de células
situadas al lado del meristema y su situación
en relación al meristema apical varía en las
diferentes especies (Fig. 1).
Varios factores pueden afectar el buen
desarrollo in vitro de una planta a partir de
un meristema: el medio de cultivo empleado, el estado fisiológico del explanto, la concentración de hormonas endógenas del
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explanto, las contaminaciones internas o
externas producidas durante el desarrollo del
cultivo, el tamaño y localización del explanto,
etc. Mencionaremos aquí algunas consideraciones haciendo especial referencia a aquellas que afectan la obtención de plantas libres de virus.
- Localización del explanto: frecuentemente se utilizan meristemas apicales y
axilares con buenos resultados. Sin embargo
es aconsejable el uso de yemas terminales
ya que tienen un mayor crecimiento potencial que las yemas laterales. En general, los
meristemas más jóvenes se desarrollan mejor que los viejos y producen mayores cantidades de plantas libres de virus que las yemas laterales, probablemente porque tienen
un crecimiento más activo que las axilares. No
obstante, también es posible la obtención
de plantas sanas a partir de yemas axilares.
- Estación o momento de la extracción:
los meristemas en activo crecimiento son los
más recomendados por su alto potencial de
desarrollo, situación que favorece las posibilidades de obtener plantas libres de virus. Para
especies vegetales con períodos de
dormancia definidos los mejores resultados
se obtienen cuando los meristemas están
despiertos y comienzan a brotar. En el caso
de ser necesario se recomienda despertar el
material. Los tratamientos más usados consisten en someterlo a períodos de frío (variable según la especie) y/o el uso de ácido
giberélico.
- Tamaño del explanto utilizado: el
meristema tiene una serie de requerimientos
nutricionales para cumplir sus funciones de
autoperpetuación y de generar células para
formar tejidos definidos. Por lo tanto, al ser
retirado de la planta debe ser sembrado en
un medio de cultivo apropiado, así rápidamente desarrolla en una planta completa.
Cuanto más pequeño sea el meristema
(explanto) más difícil será encontrar el medio de cultivo adecuado que permita un buen
desarrollo. Se ha observado que sembrar sólo
el domo meristemático, en general no da
buenos resultados. En la mayoría de los casos no se desarrolla una planta, sólo produce callo que luego puede, o no, regenerar
plantas. Como se mencionó anteriormente,
la diferenciación a partir de callo implica un
incremento en la posibilidad de aparición de
mutaciones y de variabilidad no deseada
cuando se intenta obtener plantas
genéticamente iguales a las donantes de
explantos. Por esta razón generalmente se
cultiva el domo, con uno o dos primordios
foliares, a partir del cual se obtiene con frecuencia una planta completa.
El tamaño del explanto, así como el número de primordios que deba poseer, dependerá, en cada caso, del objetivo que se
persiga, la especie vegetal que se trate y el o
los virus involucrados. En términos generales,
cuanto más grande sea el explanto, mayor
será la posibilidad de regenerar plantas, pero
menor la posibilidad de obtener plantas libres de virus. Si por el contrario se parte de
plantas ya saneadas, o lo que se desea es
sólo la multiplicación del material in vitro, se
podrán usar yemas o brotes de mayor tamaño y asegurar así el desarrollo de una planta
sin mayores requerimientos nutricionales.
Existe un gradiente de incremento en la
concentración de virus desde el domo
meristemático hacia los sucesivos primordios
foliares coincidiendo con el grado de diferenciación. Esto significa que la probabilidad de
obtener plantas libres de virus es inversamente proporcional al tamaño del
explanto utilizado. Explantos de entre 0,2 y
0,5 mm son los que más frecuentemente producen plantas libres de virus. También se han
informado, sin embargo, buenos resultados
con el empleo de meristemas más grandes.
El tamaño recomendado es variable y depende del hospedante, de tratamientos previos
(termoterapia, quimioterapia, etc.) y del (o
los) virus involucrados. En algunos casos no
sólo es importante considerar la especie
hospedante sino también el cultivar, ya que
se han detectado notables diferencias entre
ellos.
Por otra parte, es probable que el tamaño del meristema por si solo no sea el factor
que determina el éxito en la obtención de
plantas libres de virus. Se han detectado numerosos virus en meristemas apicales de 0,10,5mm en diferentes especies (clavel, poroto, tabaco, tomate, petunia, papa, etc.). Sin
embargo se ha logrado la obtención de plantas sanas con explantos de esos tamaños o
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mayores, por lo que se podría suponer que
la eliminación de virus ocurre también durante el proceso de cultivo in vitro o por alguna
otra razón no aclarada todavía.
5 Desarrollo del cultivo
El primer paso es la extracción del
meristema o explanto. Para ello se corta una
porción de tejido de aproximadamente 1cm
que incluye el meristema y se desinfecta. Esto
frecuentemente se realiza mediante la inmersión en alcohol seguida de inmersión en
hipoclorito de sodio o calcio. Luego en la cámara de flujo laminar y con la ayuda de instrumental estéril y bajo microscopio
estereoscópico se procede a la escisión del
explanto. Una vez extraído se coloca en un
medio de cultivo adecuado en el cual es mantenido, para su desarrollo, bajo condiciones
apropiadas de luz, temperatura y humedad.
- Fase I: Etapa de iniciación: el objetivo
de esta primera etapa es iniciar el desarrollo
del explanto cultivado en forma aséptica. En
general ocurre primero un aumento del tamaño y luego el tejido puede ir adquiriendo
lentamente pigmentación verde. Posteriormente irán desarrollándose brotes o plantas
completas a partir de las cuales pueden
obtenerse yemas axilares.
- Fase II: Etapa de multiplicación: en esta
etapa el objetivo es la multiplicación activa
del explanto para la producción de numerosas plantas a partir de una, constituyendo
así un clon proveniente de un solo meristema,
denominado en este caso «mericlon». La
multiplicación o micropropagación puede
efectuarse por proliferación de brotes axilares,
brotes adventicios, formación de embriones
somáticos, etc., tratando siempre de evitar
la formación de callo como paso previo a la
diferenciación. La etapa de multiplicación
puede involucrar varios repiques del material
a medio de cultivo fresco. Se ha visto con frecuencia que la tasa de multiplicación varía con
el tiempo de permanencia del explanto en
el medio de cultivo. Es frecuente que después
de 2 o más subcultivos aumente el número
de yemas que se producen a partir de un
explanto. Sin embargo no es aconsejable
mantener el material indefinidamente en
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esta etapa, ya que se ha observado un aumento de la variabilidad cuando las plantas
son mantenidas por largos períodos en estas condiciones. En general, se considera que
10-12 subcultivos es lo máximo que debería
mantenerse el material en esta etapa.
- Fase III: Etapa de acondicionamiento
para el transplante a tierra: frecuentemente las plantas desarrolladas in vitro no poseen raíces o, si las tienen, muchas veces no
son funcionales. En general tienen malas conexiones vasculares entre la raíz y el tallo. A
nivel foliar puede estar alterada la producción de clorofila. Los estomas no funcionan
o lo hacen muy lentamente y la capa de cera
epicuticular es muy reducida.
La formación de raíces adventicias es relativamente fácil de conseguir en plantas
herbáceas, y dificultosa en leñosas. Existe una
etapa de inducción de raíces, de iniciación del
crecimiento y de elongación de las mismas.
En esta fase del crecimiento se suele incrementar la intensidad de luz para favorecer la rusticación de las plantas pero hay que
tratar de que la misma no afecte a las raíces.
Esto puede mejorarse cubriendo la base de
los tubos con papel de aluminio o usando
0,3% de carbón activado en el medio de cultivo para proporcionar sombra a las raíces.
Las plantas que se propagan por bulbos,
tubérculos, rizomas, etc., pueden ser inducidas a formarlos in vitro para mejorar la eficiencia en el transplante, ya que éstos pueden ser cosechados del tubo de ensayo y
sembrados directamente en tierra sin mayores dificultades.
-Transplante: en el momento del transplante es importante no dañar las raíces. Es
necesario lavarlas cuidadosamente para retirar los restos de agar, debido a que los medios de cultivo ofrecen un buen sustrato para
el desarrollo de hongos y bacterias que pueden afectar el desarrollo de la planta en el
suelo.
El mayor problema en esta etapa es la
deshidratación debida a algunas características anatómicas que presentan las plantas
creciendo in vitro (reducida cera epicuticular,
lentitud de movimiento estomático, abun-
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dantes espacios intercelulares, dificultades en
la conexiones entre el tallo y la raíz). Conviene transferir las plantas a macetas y mantenerlas con alta humedad relativa durante los
primeros 15 días. Se han observado buenos
resultados con el uso de rocío artificial o neblina. Otra práctica frecuente es cubrir las
plantas con polietileno o recipientes de vidrio transparente, a modo de cámara húmeda, y descubrirlas progresivamente hasta
destaparlas completamente al cabo de 3 ó 4
semanas.
ladas de focos de contaminación. Esta etapa se extiende todo el tiempo necesario hasta la obtención del número requerido de individuos para realizar la producción a nivel
comercial. Si el área protegida está lo suficientemente alejada de plantas infectadas y se
evita el acceso de los vectores, es posible
mantener las plantas libres de virus por muchos ciclos de cultivo. Son fundamentales los
análisis periódicos que permitan llevar un registro del estado sanitario del material.
6 Multiplicación del material libre de
virus ex vitro
7 Algunas alternativas para mejorar la
eficiencia en la producción de plantas
libres de virus
Las plantas libres de virus deben ser multiplicadas bajo condiciones controladas para
evitar su recontaminación. Una vez rusticadas
y adaptadas nuevamente a las condiciones
ex vitro ellas pueden ser multiplicadas bajo
jaulas antivectores todo el tiempo que se
considere necesario. En esta etapa es importante evitar que las plantas se reinfecten. Es
recomendable la esterilización del suelo para
evitar la contaminación con nematodes y
hongos, que en algunos casos son transmisores de virus. Las jaulas deben estar revestidas de una malla muy fina para evitar la entrada de los vectores. Es recomendable, para
evitar la entrada de los vectores, utilizar una
doble puerta que permita abrir una de las
hojas y recién cuando está cerrada, abrir la
otra. Periódicamente la malla debe ser controlada para detectar inmediatamente la
presencia de roturas que dejen expuestas a
las plantas. A pesar de estos cuidados, es recomendable aplicar insecticidas y mantener
libre de malezas dentro y fuera de la jaula,
ya que las mismas pueden actuar como
reservorios de vectores. Si bien la sanidad del
material introducido a las jaulas debe ser previamente controlada, es conveniente, en esta
etapa, repetir los análisis para detectar rápidamente la presencia de una infección a fin
de eliminarla antes de que se propague. En
estas condiciones es posible mantener como
«plantas madres», por mucho tiempo, un
stock de material libre de virus a partir del
cual se pueden hacer las sucesivas multiplicaciones.
La etapa de multiplicación masiva, o a
gran escala, se realiza a campo en áreas ais-
- Termoterapia: es la técnica más antigua
utilizada para la liberación de patógenos en
plantas. No obstante, es difícil la obtención
de plantas libres de virus con el empleo de
altas temperaturas solamente. Mantener las
plantas enfermas por períodos prolongados
en termoterapia disminuye la concentración
de virus, pero al llevar las plantas nuevamente a condiciones normales, en poco tiempo
recuperan la concentración original.
Una práctica muy usada es la combinación de la termoterapia y el cultivo de
meristemas. Esto implica mantener las plantas en termoterapia por un período variable
de tiempo y temperatura (generalmente
entre 34° y 38°C desde una a varias semanas), luego se realiza la extracción del
meristema, se siembra en el medio de cultivo y se continúa con los pasos convencionales para su desarrollo.
Esta práctica no es efectiva para todos
los virus por igual, depende del virus y del
hospedante. Se ha observado que un mismo virus en distintas especies se inactiva en
forma diferente. Generalmente, esta práctica ha resultado más efectiva en virus de partículas alargadas, y menos eficiente para virus poliédricos.
Podría suponerse que cuanto más largo
es el tratamiento de calor, resulta más efectivo; sin embargo, no siempre es así. En crisantemo y en ajo se ha mencionado, por
ejemplo, que tratamientos de 10-30 días
pueden ser efectivos para la liberación de algunos virus; en cambio, tratamientos más
prolongados no siempre producen mayor
porcentaje de plantas sanas. Estos tratamien-
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tos prolongados, por otra parte, dificultan
la implantación in vitro del tejido, lo cual se
traduce en un número más reducido de plantas obtenidas.
En algunos casos las bajas temperaturas
(5°C) seguidas del cultivo de meristemas fueron utilizadas con éxito para la eliminación
de virus. Esta práctica fue aplicada principalmente en el caso de viroides, los cuales se
desarrollan bien con altas temperaturas.
- Quimioterapia: el uso de antivirales sería la solución definitiva para estas enfermedades; sin embargo, hasta ahora no se ha
encontrado un producto que por sí solo cumpla esta función. Algunas sustancias químicas
ocasionan una disminución en la concentración de virus existentes en la planta y atenúan, o suprimen, los síntomas típicos de los
virus, pero, una vez suspendido el tratamiento se recupera la concentración original. Han
sido evaluadas diferentes sustancias pero la
más utilizada es el Ribavirin o Virazole (1-β-Dribofuranosyl-1, 2, 4 – triazole –3- carboxamide).
Un modo adecuado de emplear los antivirales es combinándolos con el cultivo de
meristemas. También han sido aplicados directamente a los meristemas in vitro. En este
caso, el antiviral es colocado en medio del
cultivo en concentraciones variables, que van
desde 10 a 50 mg/l, y en algunos casos hasta
100 mg/l. Las plantas son mantenidas bajo
la acción del antiviral por largos períodos que
incluyen varios subcultivos.
Un problema importante con el Virasole
es su fitotoxicidad, que a su vez depende de
la dosis empleada y de la especie de planta
utilizada. El éxito del proceso en muchos casos requiere de varios meses de tratamiento
y la fitotoxicidad del antiviral constituye una
dificultad.
También se han obtenido plantas libres
de virus a partir de callos a los que previamente se les aplicó Virasole, aunque esta
práctica no ha sido eficiente en todos los casos.
- Electroterapia: el método consiste en
aplicar corriente eléctrica a yemas por un
período variable de tiempo para obtener
plantas libres de patógenos. Se menciona
que la aplicación de electricidad produce de-
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gradación de las partículas y pérdida de
infectividad. Esta técnica ha sido citada para
liberar del mosaico al almendro cv
Caetanuccia. Para ello los brotes fueron sometidos a 500V por tiempos variables y luego injertados sobre pies sanos (obtenidos
por semilla). Se señaló que con 5 minutos de
tratamiento los resultados fueron buenos y
con 20 minutos se obtuvo completa
inactivación. El método también ha sido
empleado para eliminar bacterias de caña de
azúcar, Potato leaf roll virus de papa,
Dasheen mosaic virus de araceas y Banana
streak virus de banana, entre otras, aplicando 5-30V a las yemas por un período de 5
minutos. En este caso se obtuvo una eficiencia del 3 al 60%, dependiendo del cultivar y el
patógeno.
- Cultivo de domos proveniente del disco basal (stem-disc dome culture): el procedimiento consiste en la obtención de plantas libres de virus a partir del cultivo de estructuras con forma de domo, diferenciadas
a partir del cultivo del disco basal de dientes
de ajo.
Se ha informado la diferenciación de 2030 brotes a partir del cultivo del disco basal
de dientes de ajo en 1 mes de cultivo. Este
método fue designado por los autores
(Ayabe y Sumi, 1998) como cultivo del disco
basal (¨stem-disc culture¨). Una modificación
posterior de esta técnica consiste en la extracción de las estructuras con forma de
domo y su posterior cultivo en un medio adecuado para la obtención de plantas.
- Microinjerto de ápices caulinares in
vitro para obtención de plantas de naranjo libres de virus: consiste en extraer el ápice caulinar de la variedad a injertar,
constituído por el domo apical y primordios
foliares, y luego sembrarlo sobre la superficie
decapitada del epicótilo de una plántula de
2 semanas de edad (patrón) proveniente de
semilla crecida in vitro. Ver VIII-7 (plantas cítricas libres de enfermedades)
8 Análisis de las plantas obtenidas o
indexing
De lo expuesto previamente surge que
existen varias alternativas para obtener plantas libres de virus a partir del cultivo de
meristemas. Si bien existen algunos
CONCI, Vilma C.
lineamientos, o consideraciones generales
para tener más probabilidades de éxito, no
hay proceso que ofrezca total seguridad. La
etapa decisiva en este sistema es el análisis
que permite comprobar si realmente se ha
producido la total erradicación de los virus.
En la bibliografía se señalan distintos porcentajes de éxito en el proceso. Esto significa que
empleando el mismo protocolo, en el mismo momento, con el mismo material, se consiguen plantas sanas y plantas que aún permanecen infectadas. Por lo tanto, la única
forma de separar las plantas sanas de las
enfermas es un análisis que permita distinguirlas para luego multiplicar solo aquellas que
fueron liberadas de los virus. El éxito de un
programa de producción de plantas libres de
virus no depende de la obtención de un alto
porcentaje de plantas sanas en al primera
etapa, sino en la obtención de al menos unas
pocas plantas madres realmente libres de
patógenos. Si el número es escaso pueden
ser multiplicadas por diferentes sistemas,
pero si alguna de ellas está contaminada,
todo el trabajo será inútil, porque al final,
después de las multiplicaciones a campo, lo
más probable es que tengamos todas las
plantas enfermas.
Las plantas deben ser analizadas una por
una para hacer una buena selección de «plantas madres» a partir de las cuales se iniciarán
los procesos de multiplicación del material.
Es recomendable hacerle más de un análisis
para asegurar su sanidad, es preferible que
sea en etapas diferentes a lo largo del proceso, y en lo posible por técnicas distintas.
Para realizar un análisis confiable hay que
tener en cuenta varios factores que son específicos para cada combinación planta-patógeno. Es importante el empleo de sistemas de alta sensibilidad que nos permitan
detectar los virus aun en bajas concentraciones; sin embargo, no existe un sistema que
sea infalible, siempre hay un límite de concentración por debajo del cual el virus no
puede ser detectado. Para evitar errores en
este sentido es recomendable tener en cuenta algunos factores. Como ya se ha mencionado, la concentración de virus no es igual
en todas las partes de una planta; por lo tanto, si queremos hacer un análisis confiable hay
que establecer qué tejidos y órganos son los
que concentran más el patógeno y realizar
la prueba a partir de ellos. Del mismo modo
también se ha comprobado que existen fluctuaciones a lo largo del ciclo de cultivo; por lo
tanto, es conveniente realizar el análisis cuando la concentración de virus es mayor. Esto
es importante cuando se prueba el material
a campo.
La elección de la técnica de análisis dependerá del patógeno que se desea eliminar y de las posibilidades para realizarla.
Cuanto más temprano se descarten las
plantas contaminadas más seguro será el sistema. Una planta infectada siempre es un
foco de contaminación. Por más cuidados
que se tengan siempre se corren riesgos.
Cuando las plantas están in vitro, en general, la concentración de virus es muy baja,
probablemente debido a las condiciones de
cultivo, la concentración de hormonas en el
medio, u otros factores no bien establecidos.
Sin embargo, es recomendable hacer un análisis riguroso antes de empezar con la
micropropagación para hacer el primer descarte de individuos enfermos.
Frecuentemente se menciona en esta
etapa el empleo de la técnica inmunoenzimática de doble sándwich de anticuerpos
(DAS-ELISA). Esta prueba se realiza en una
placa de poliestireno con 96 celdillas en la cual
se lleva a cabo una prueba por celdilla. En el
primer paso cada celda es tapizada por el
anticuerpo específico para el patógeno que
se está analizando. Luego se coloca el extracto de la planta a probar. Si los virus están en
el mismo serán atrapados por el anticuerpo
previamente colocado. En el tercer paso se
aplica un anticuerpo combinado con una
enzima y en el último paso se coloca el
sustrato específico para la enzima. Si el virus
está presente en la muestra se produce el
sándwich anticuerpo-virus-anticuerpo conjugado con la enzima, el sustrato es desdoblado y la reacción vira al color amarillo (respuesta positiva, planta enferma). (Fig. 2).
Esta técnica tiene varias ventajas, ya que
permite el análisis simultáneo de muchas
muestras (96 celdillas por placa y se pueden
hacer varias placas simultáneamente). Es relativamente fácil de usar y de bajo costo. Sin
embargo, nuestra experiencia nos indica que
esta prueba no es lo suficientemente sensible para detectar los virus en algunos casos.
Muchas de las plantas in vitro que dan resul-
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309
tados negativos mediante DAS-ELISA resultan positivas cuando se prueban por otra
técnica. Algunas variantes, como ELISA en
membrana de nitrocelulosa o Dot Blot, han
sido empleadas con resultados más satisfactorios; sin embargo, estas técnicas por sí solas permiten el escape de muchas plantas
infectadas.
Figura 3: Extracto vegetal
conteniendo una mezcla
de virus probado por
ISEM-D con antisuero para
Garlic virus A. Izq.,
partícula viral decorada
con el antisuero utilizado.
Der., partícula viral no
decorada de una especie
viral diferente.
Mejores resultados se han obtenido con
el empleo de técnicas que combinan la
Figura 2: Placa de DAS-ELISA mostrando resultados
positivos (celdillas oscuras) y negativos (celdillas claras).
serología con la microscopia electrónica como
son la inmunoelectromicroscopía con o sin
decoración (ISEM o ISEM-D). En esta técnica
se tapiza una grilla porta especimen con anticuerpo y luego se coloca sobre ella el extracto de la planta a probar. Si las partículas virales
están presentes quedarán atrapadas al anticuerpo. Luego se contrasta y se observa por
el microscopio electrónico (ME), donde se
pueden ver las partículas de virus que han sido
selectivamente atrapadas. Esto es lo que se
llama ISEM. Si antes de contrastar se aplica
otra vez el antisuero y éste es atrapado por
las partículas virales las mismas se verán más
oscuras al ME, decoradas (ISEM-D) y serán
más fáciles de detectar (Fig. 3). Estas técnicas son altamente sensibles, permiten la observación directa del virus por lo cual no hay
falsos positivos y no se requiere un antisuero
de alta calidad para su desarrollo. El grave
inconveniente con ellas es que no son de uso
masivo, porque es engorroso analizar gran
cantidad de muestras, y por otra parte, se
requiere de un ME, que es un equipo altamente costoso.
310
Las técnicas basadas en la detección de
los ácidos nucleicos han mostrado un gran
desarrollo y evolución en la última década, y
son utilizadas con frecuencia debido a su alta
sensibilidad y especificidad. El uso de sondas
moleculares ha dado buenos resultados. Consiste en dar condiciones para que el ácido
nucleico del patógeno, fijado sobre un soporte sólido (membrana de nylon), se una con
un fragmento de ácido nucleico complementario, marcado con moléculas radioactivas, o
con un antígeno que luego será reconocido
por un anticuerpo específico que será detectado por colorimetría o fluorescencia. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
sus variantes son las técnicas de mayor sensibilidad con que se cuenta actualmente. Entre ellas se mencionan: PCR anidado, transcripción reversa (RT), inmuno captura (IC) PCR
post. transcripción reversa (RT-PCR), entre
otras. La PCR consiste en amplificar un fragmento del genoma del virus mediante la utilización de dos iniciadores que hibridan
específicamente en el genoma del patógeno. La técnica permite producir, en corto
tiempo, muchas copias del segmento del
genoma comprendido entre los 2 iniciadores, de tal forma que luego es posible observarlo con facilidad en un gel (Fig. 4). Esto
posibilita la detección de los virus, aun en
bajísimas concentraciones. Esta técnica además puede ser combinada con la serología y
ser realizada en placas como las de ELISA, lo
que permite el análisis simultáneo de muchas
plantas. Estas pruebas, si bien son altamente sensibles, no son aún de uso masivo porque tienen un costo muy elevado.
Para obtener resultados en forma práctica y confiable es posible también la combi-
CONCI, Vilma C.
Figura 4: Fragmentos
amplificados por IC-RTPCR. Líneas 1-4,
segmentos de 489pb
correspondientes a
Onion yellow dwarf
virus; líneas 4-5,
segmentos de 566pb
correspondientes a
Leek yellow stripe
virus; línea 6, marcador
de peso molecular.
nación de varias pruebas, pudiendo, por
ejemplo, aprovechar la practicidad del ELISA
y la sensibilidad de las técnicas moleculares,
o de ISEM u otras. En este caso, las plantas
que resultan negativas para el test de ELISA
pueden ser luego analizadas por una técnica
más sensible y disminuir así el número de pruebas complicadas o costosas. Esto depende
de la cantidad de plantas que ELISA sea capaz de detectar, porque si no es lo suficientemente sensible tendremos que repetir la
prueba con todas, o casi todas las muestras.
Como se mencionó anteriormente, la
concentración de virus en las plantas in vitro
en general es baja, por lo tanto, se corre el
grave riesgo de considerar como sanas plantas que, en realidad, están infectadas. Por
esta razón se hace casi obligatorio repetir los
análisis cuando las plantas son transferidas
al suelo. Es necesario dejar pasar cierto tiempo antes de hacer el análisis, para que si el
virus está presente, tenga la posibilidad de
incrementar su concentración y ser entonces
fácilmente detectado. En esta etapa se utiliza con frecuencia el test de ELISA en cualquiera de sus variantes, que generalmente conduce a resultados confiables.
En algunos casos el sistema que resulta
más eficiente para hacer el indexing es el
empleo de plantas indicadoras. El injerto es
la forma más segura de transmitir un virus y
esto es lo que se emplea como sistema de
diagnóstico. Se realiza un injerto desde la
planta que se desea probar a plantas que
son susceptibles al virus (planta indicadora) y
que desarrollan síntomas claros y evidentes
de la presencia del patógeno. El inconveniente, en este tipo de análisis, es que hay que
esperar que la planta obtenida in vitro sea
transferida al suelo, luego que se desarrolle
lo suficiente como para extraer una porción
de tejido (hoja, yema, brote, etc., según el
tipo de injerto). Se requiere además de un
operador con habilidad para realizar el injerto con éxito y luego mantener las plantas
injertadas en condiciones adecuadas hasta
la aparición de los síntomas. En algunos casos, este tiempo puede ser muy prolongado. A pesar de los inconvenientes que se mencionan, para algunas especies este sigue siendo el método más seguro. Por ejemplo la
frutilla, que es afectada por más de 20 enfermedades diferentes y que en muchos casos
ni siquiera ha sido todavía caracterizado el
agente causal, la transmisión del virus a plantas indicadoras resulta la prueba más efectiva. En este caso se injerta el folíolo medio de
una hoja perteneciente a la planta que se
desea probar en plantas indicadoras en las
cuales los patógenos van a dar síntomas claros. Algunos virus se van a manifestar después de 2 ó 3 semanas de realizado el injerto; en otros casos, la bibliografía menciona
que los síntomas aparecen entre los 6 y 12
meses. Con frecuencia, no es posible identificar que virus es el que está presente, pero es
posible determinar si la planta está infectada.
En vid, parte de los virus son analizados
mediante ELISA. Pero otros son probados por
injerto a plantas indicadoras. Algunos de los
virus pueden ser detectados en pocas semanas, pero para el stem pitting/grooving
sindrome, por ejemplo, es necesario esperar
entre 8 y 12 meses.
9 Algunas consideraciones respecto a los
análisis de virus
En general, cuando se habla de las plantas liberadas de virus se emplean términos
como «plantas libres de virus» «planta sana»
o «saneada» sin que se defina qué virus fueron eliminados ni qué pruebas se emplearon
para comprobar su eliminación. El concepto
de plantas libres de virus debería estar acotado al, o a los virus, analizados. En el caso
de plantas que son afectadas por un conjunto de virus diferentes sería necesario realizar
un análisis independiente para cada uno de
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal
311
ellos y señalar el o los virus de los cuales ha
sido liberada o probada. Por otra parte debe
definirse la técnica de análisis empleada.
Como se mencionó previamente pueden
emplearse diferentes métodos de diagnóstico con distintos grados de sensibilidad. Así,
por ejemplo, si se cuenta con un DAS-ELISA
calibrado para detectar hasta 10 ng/ml y un
RT-PCR que puede detectar 10 pg/ml y se
analiza una planta con 50 pg/ml; la técnica
de DAS-ELISA no va a detectar el patógeno y
el resultado será negativo, mientras que el
RT-PCR arrojará un resultado positivo. Todas
las técnicas tienen un límite de sensibilidad
por debajo del cual no son capaces de detectar la presencia del patógeno. Por consiguiente, dependiendo de la sensibilidad de
la técnica que se use, el porcentaje de plantas supuestamente «libres de virus» puede
variar. Lo correcto sería entonces hablar de
plantas negativas a un virus probado mediante una técnica determinada. Por ejemplo, «plantas negativas a Onion yellow
dwarf virus mediante DAS-ELISA», lo que no
significa que realmente está libre de virus sino
que la técnica no lo detectó. Por esa razón
se aconseja evaluar las plantas en más de una
oportunidad y repetir los análisis cuando las
plantas están a campo, para darle al patógeno, si está presente, la posibilidad de multiplicarse.
11 Lecturas Recomendadas
10 Agradecimientos
QUACQUARELLI, A., GALLITELLI, D., SAVINO, V., and
PIAZZOLLA, P. 1980. The use of electric current for
obtaining mosaic-free almonds. Acta Phytopathologica
Academiae Scientiarum Hungaricae, Vol, 15 (1-4):251-255.
A los Ing. Agr. MSc Delia Docampo, Sergio
Nome y al Dr. Luis Conci por la revisión del
presente manuscrito; y a la Ing. Agr. Eva
Cafrune por su colaboración en la búsqueda
de información.
312
AYABE, M. and SUMI, S. 1998. Establishment of a novel
tissue culture method, sem-disc culture, and is practical
application to micropropagation of garlic (Allium
sativum L.). Plant Cell Rep 17:773-779.
AYABE, M. and SUMI, S. 2001. A novel and efficient tissue
culture method-»stem-disc dome culture»-for producing
virus-free garlic (Allium sativum L.). Plant Cell Rep 20:503507.
ESAU, K. 1959. Anatomía Vegetal. Ed. Omega Barcelona.
FRACCIOLI, G. and MARANI, F. 1998. Virus elimination
by meristem tip culture and tip micrografting: 346-380
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virus deasease control. The American Phythopathology
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eliminates viral and bacterial infection from plant shoottip cultures. INIVIT Santo Domingo, Cuba.
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